Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Transkrypt

1 UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 2 ZASTOSOWANIE MIARECZKOWANIA DO OZNACZANIA ZAWARTOŚCI WITAMINY C Laboratorium przyrodnicze Gdańsk, 2011

2 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 2 I. Część teoretyczna 1. Wprowadzenie Witaminy są to niskocząsteczkowe związki organiczne, o różnorodnej budowie chemicznej, rozpowszechnione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Witaminy są katalizatorami ogólnych lub swoistych reakcji biochemicznych, wchodzą w skład enzymów i koenzymów, są niezbędne do wzrostu i podtrzymania funkcji życiowych. Dla wielu organizmów, w tym zwierząt i człowieka są to na ogół związki egzogenne i muszą być dostarczane z pożywieniem. Niektóre z nich okazały się również egzogennymi czynnikami wzrostowymi dla różnych drobnoustrojów, a dwie niezbędnymi biokatalizatorami, dostarczanymi przez bakterie glebowe roślinom wyższym (witamina B12) i niższym ( witamina B1). Aby odróżnić je od innych niezbędnych składników pokarmowych, witaminy rozważa się jako substancje działające w bardzo małych ilościach; z wyjątkiem kwasu askorbinowego, dzienne zapotrzebowanie na pozostałe witaminy jest istotnie bardzo małe nie przekracza 20 mg. Niektóre witaminy wytwarzają zwierzęta z odpowiednich związków syntetyzowanych przez rośliny. Takie związki nazywane są prowitaminami np. β-karoten. Źródłem witamin i prowitamin są rośliny i bakterie żyjące w przewodzie pokarmowym, a także tkanki zwierząt. Rzeczywiste zapotrzebowanie ilościowe na poszczególne witaminy jest trudne do określenia min. ze względu na synergiczne działanie wielu z nich. Zależy ono od cech osobniczych, stanu zdrowia i okresu życia człowieka. Objawy wywołane całkowitym brakiem witamin zwane są awitaminozami. We współczesnym świecie zwłaszcza w krajach rozwiniętych awitaminozy należą do rzadkości. Często występują z kolei niedobory witamin tzn. niekorzystne stany pośrednie między awitaminozą a optymalnym zaspokojeniem zapotrzebowania organizmu na określoną witaminę, czyli hipowitaminozy. Na ogół są one spowodowane niewłaściwym, jednostronnym odżywianiem, wadliwym przyswajaniem witamin z pokarmu oraz zniszczeniem bakterii w przewodzie pokarmowym (przez antybiotyki, sulfonamidy). Niedoborom witamin zapobiega spożywanie różnorodnych pokarmów. Z kolei nadmierne przyjmowanie preparatów witaminowych, głównie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, może prowadzić do szkodliwych dla organizmu objawów, zwanych hiperwitaminozami. Podstawową klasyfikacją witamin jest podział na: o witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (A 1, A 2, D 2, D 3, E, K 1, K 2, K 3 ); o witaminy rozpuszczalne w wodzie (B 1, B 2, B 3, B 5, B 6, B 9, B 12, H, C). 2

3 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C Kwas L-askorbinowy (witamina C) Przed poznaniem budowy chemicznej witamina C była nazywana czynnikiem przeciwgnilcowym. Zapobiegała bowiem szkorbutowi, który znali już Wikingowie i zwalczali za pomocą cebuli. W 1928 Szent-György uzyskał z wyciągów z nadnerczy, kapusty i pomarańczy związek, który wykazywał właściwości oksydoredukcyjne. Szent-György nie zdawał sobie sprawy, że związek ten to witamina C nazwana przez niego kwasem heksuronowym. W 1932 Wang i King otrzymali witaminę C z cytryny. W rok później Haworth, Hirst i współpracownicy ustalili budowę chemiczną witaminy C. W latach Reichstein i współpracownicy dokonali syntezy kwasu askorbinowego (nazwa ta pochodzi od szkorbutu). Własności witaminy C wykazuje kwas L-askorbinowy oraz jego forma utleniona - kwas L-dehydroaskorbinowy. Pod względem chemicznym kwas L-askorbinowy jest laktonem endiolu kwasu 2-okso-L-gulonowego, a kwas L-dehydroaskorbinowy laktonem kwasu 2,3- diokso-l-gulonowego (Rys. 1). Rys. 1. Struktury chemiczne: kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego Kwas L-askorbinowy jest związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym w wodzie a jego roztwory mają smak kwaśny. Wykazuje właściwości redukujące. W warunkach beztlenowych jest odporny na wysoką temperaturę. Kwas dehydroaskorbinowy jest mniej trwały w tych warunkach i tym tłumaczy się straty witaminy C podczas ogrzewania. W obecności tlenu obie formy ulegają nieodwracalnemu utlenianiu do produktów nieaktywnych biologicznie, zwłaszcza w obecności jonów niektórych metali, szczególnie Cu 2+ i Fe 3+. Biologiczne funkcje kwasu askorbinowego nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Układ oksydoredukcyjny kwas askorbinowy kwas dehydroaskorbinowy może uczestniczyć w regulowaniu potencjału oksydoredukcyjnego w komórce i brać udział w transporcie elektronów. Ponieważ witamina C występuje w znacznych ilościach w gruczołach nadnercza, przypuszcza się, że uczestniczy ona w syntezie hormonów sterydowych. Witamina C, uczestniczy w produkcji kolagenu i podstawowych białek w całym organizmie (kości, chrząstki, ścięgna, więzadła). Jako jeden z najważniejszych przeciwutleniaczy pełni także 3

4 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 4 istotną funkcję w reakcjach odtruwania i odporności organizmu chroniąc go przed procesami utleniania, uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu i kwasów żółciowych. Jest czynnikiem stabilizującym układ odpornościowy i immunologiczny, hamuje powstawanie w żołądku rakotwórczych nitrozoamin. Ma właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze w stosunku do niektórych drobnoustrojów chorobotwórczych. Dla większości ssaków kwas askorbinowy nie jest witaminą, gdyż mogą go samodzielnie syntezować. Jedynie człowiek, małpy człekokształtne i świnka morska nie produkują enzymu przekształcającego lakton kwasu L-gulonowego w kwas askorbinowy. Zapotrzebowanie człowieka na witaminę C jest bardzo duże, o około dwa rzędy wielkości większe niż na inne witaminy, wynosi średnio mg. Niedobór kwasu askorbinowego, objawiający się: wolniejszym gojeniem się ran, bladością skóry i błon śluzowych, zaburzeniami w przemianie kwasów tłuszczowych, osłabieniem naczyń włosowatych i możliwością powstawania mikrowylewów w różnych narządach, zmniejszeniem odporności na infekcje oraz występowaniem szkorbutu (obrzęki i krwawienie z dziąseł oraz wypadanie zębów), występuje dziś niezwykle rzadko. Nadmiar witaminy C jest usuwany z moczem, jednakże stosowanie wysokich dawek powoduje zakwaszenie moczu, upośledzając w ten sposób wydalanie stałych kwasów i zasad. Kwaśny odczyn moczu może powodować wytrącanie się moczanów i cystynianów oraz tworzenie się kamieni w drogach moczowych. Do głównych źródeł witaminy C należą owoce i warzywa, ponadto z uwagi na duże zapotrzebowanie organizmu na tę witaminę oraz straty w procesach kulinarnych i technologicznych duże znaczenie ma produkcja produktów wzbogaconych w witaminę C oraz witaminy syntetycznej Oznaczanie witaminy C Metody chemiczne metoda Tillmansa i jej modyfikacje Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas L- askorbinowy. Przebieg reakcji przedstawiono na Rys. 2. Rys. 2. Przebieg reakcji redukcji 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas L-askorbinowy 4

5 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 5 Metoda ta sprowadza się do miareczkowania roztworu kwasu L-askorbinowego barwnikiem Tillmansa do momentu pojawienia się jasno różowego zabarwienia. Jest to metoda prosta, ale tylko w przypadku roztworów bezbarwnych i niezawierających innych związków powodujących redukcję odczynnika Tillmansa. W praktyce wiadomo, że większość surowców roślinnych zawiera barwniki antocyjanowe, które nadają ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczany witaminę C, występują inne związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą do nich reduktony związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać obecności ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy sulfhydrylowe, które są utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi (pochodne cukrów, które powstają podczas obróbki termicznej). W przypadku roztworów silnie zabarwionych stosuje się modyfikację metody Tillmansa, tzn. miareczkowanie 2,6-dichlorofenoloindofenolem w obecności rozpuszczalnika organicznego (chloroform, ksylen). Wykorzystuje się tu fakt zróżnicowanej rozpuszczalności. Barwniki antocyjanowe, w odróżnieniu od barwnika Tillmansa, nie rozpuszczają się w rozpuszczalniku organicznym, natomiast barwnik Tillmansa rozpuszcza się. Nadmiarowa kropla 2,6-dichlorofenoloindofenolu przechodzi do warstwy rozpuszczalnika barwiąc go na różowo. Właściwości witaminy C ma również kwas L-dehydroaskorbinowy. W celu oznaczenia całkowitej zawartości witaminy C przeprowadza się redukcję kwasu L- dehydroaskorbinowego do kwasu L-askorbinowego za pomocą siarkowodoru. Nadmiar siarkowodoru usuwa się przy użyciu sublimatu, przy czym wytrąceniu ulegają również reduktony białkowe. Na wynik miareczkowania składa się zawartość kwasu L- dehydroaskorbinowego, kwasu L-askorbinowego i reduktonów cukrowych. W oznaczeniach witaminy C metodą Tillmansa w produktach spożywczych należy wykonać cztery następujące miareczkowania: 1. bezpośrednie miareczkowanie roztworu witaminy C na wynik składa się zawartość kwasu L-askorbinowego, reduktonów białkowych i cukrowych, 2. miareczkowanie badanego wyciągu po przeprowadzonej uprzednio redukcji kwasu L- dehydroaskorbinowego do kwasu L-askorbinowego na wynik składa się zawartość kwasu L-askorbinowego, kwasu L-dehydroaskorbinowego i reduktonów cukrowych, 5

6 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 6 3. miareczkowanie roztworu po uprzednim wytrąceniu kwasu L-askorbinowego i reduktonów białkowych wynikowi odpowiada zawartość reduktonów cukrowych, 4. miareczkowanie po wytrąceniu reduktonów białkowych na wynik miareczkowania mają wpływ zawartość kwasu L-askorbinowego i reduktonów białkowych. Wyniki czterech miareczkowań pozwolą na obliczenie całkowitej zawartości witaminy C po wyeliminowaniu wpływu obecności reduktonów białkowych i cukrowych. 2. Analiza miareczkowa pojęcia ogólne Analiza miareczkowa (analiza objętościowa) polega na oznaczaniu substancji badanej w roztworze za pomocą dodawania małych porcji roztworu odczynnika (titranta) o dokładnie znanym stężeniu (mianie). Obliczenia zawartości oznaczanej substancji dokonuje się na podstawie zmierzonej objętości roztworu miareczkującego w oparciu o równanie reakcji. Podstawowe pojęcia używane w analizie miareczkowej: Miano roztworu - jest to liczba gramów substancji rozpuszczonej, znajdująca się w 1 ml roztworu lub liczba gramów substancji oznaczanej reagująca z 1 ml danego roztworu mianowanego. Jednostka miana to g/ml. Roztwór mianowany - roztwór o dokładnie znanym stężeniu. Titrant - roztwór miareczkujący o dokładnie znanym stężeniu. Punkt równoważnikowy (PR, punkt nasycenia równoważnikowego) punkt miareczkowania, w którym została doprowadzona taka ilość titranta, która jest równoważna chemicznie ilości substancji oznaczanej. Punkt końcowy miareczkowania (PK) - punkt, w którym za pomocą metod instrumentalnych lub zmiany barwy wskaźnika można zaobserwować punkt równoważnikowy (koniec miareczkowania). Punkt końcowy powinien pokrywać się z punktem równoważnikowym. Błąd miareczkowania - różnica między punktem końcowym a punktem równoważnikowym. Powinno się tak dobrać wskaźnik lub metodę instrumentalną, by błąd miareczkowania był nie większy niż 0,05-0,1 %. W przypadku, gdy PK znajduje się za PR, otrzymujemy za duże wyniki (błąd dodatni), w przeciwnym przypadku wyniki są za małe (błąd ujemny). Indykator wskaźnik. Krzywa miareczkowania graficzny sposób przedstawienia przebiegu procesu miareczkowania. W układzie współrzędnych na osi odciętych przedstawia się objętość titranta 6

7 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 7 (ml) lub % zmiareczkowania, natomiast na osi rzędnych wartości liczbowe parametru odpowiadającego stężeniu substancji oznaczanej. Procent zmiareczkowania jest to stosunek ilości substancji miareczkowanej, która przereagowała z titrantem do całkowitej początkowej ilości tej substancji, wyrażony w %. Skok miareczkowania gwałtowna zmiana w pobliżu punktu równoważnikowego, spowodowana dodaniem jednej kropli roztworu miareczkującego. Podczas procesu miareczkowania powinny zostać spełnione cztery podstawowe warunki: o po dodaniu każdej porcji odczynnika reakcja powinna przebiegać z dużą szybkością; o reakcja powinna przebiegać stechiometrycznie, zgodnie z równaniem reakcji; o poza substancją oznaczaną, żadna inna znajdująca się w roztworze nie powinna reagować z odczynnikiem miareczkującym; o należy dobrać odpowiedni wskaźnik lub metodę instrumentalną, by koniec miareczkowania był wyraźnie widoczny. Podstawową jednostką miary i objętości jest litr = 1 l. Podczas analizy miareczkowej objętości roztworów wyraża się częściej w mililitrach (1 ml = 10-3 l) lub mikrolitrach ( 1 ml = 10-6 l). W celu dokładnego zmierzenia objętości cieczy używa się szklanych naczyń miarowych. Przed przystąpieniem do miareczkowania należy dokładnie umyć i wysuszyć szkło, które będzie używane czyli: biuretę, kolby stożkowe i pipety (woda musi równomiernie spływać po ich powierzchni, nie zostawiając żadnych kropel). Następnie trzeba za pomocą łap umocować biuretę w pozycji pionowej w statywie. Kolejnym krokiem jest sprawdzenie szczelności kranu. Gdy jest to konieczne, należy go posmarować niewielką ilością smaru do biuret (nie stosować w przypadku kranów teflonowych). Przed napełnieniem, biureta musi zostać najpierw przepłukana kilkakrotnie roztworem mianowanym. Podczas napełniania należy pamiętać, by wlać roztwór mianowany powyżej kreski, by móc przez szybkie otwarcie kurka wypchnąć powietrze z kurka i rurki znajdującej się poniżej. Należy doprowadzić poziom roztworu w biurecie do kreski zerowej i przy użyciu bibuły usunąć ewentualne krople roztworu z końca biurety. Objętość cieczy użytą podczas miareczkowania wyznacza się na podstawie różnicy początkowego i końcowego poziomu cieczy w biurecie. Dla ułatwienia odczytu można za biuretą umieścić białą kartkę papieru. W większości przypadków odczytuje się położenie najniższej części menisku. W przypadku, gdy nie jest to możliwe (miareczkowanie KMnO 4, I 2 ) odczytuje się menisk górny. Bardzo ważne jest, by podczas odczytywania nasze oko było dokładnie 7

8 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 8 na poziomie menisku (Rys. 3). a b Rys. 3. Odczytywanie poziomu cieczy w biurecie: a) odczyt przy różnym położeniu oka; tylko wynik 24,43 jest prawidłowy, pozostałe są nieprawidłowe (błąd paralaksy); b) biureta Schellbacha ma wzdłuż tylnej ścianki niebieski papierek na białym tle (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-wa 2000) 3. Podział metod miareczkowania 3.1. Podział według typu reakcji zachodzącej pomiędzy substancją oznaczaną a titrantem o Alkacymetria opiera się o reakcje kwas-zasada. Wyróżnia się dwa działy: Alkalimetria miareczkowanie wykonuje się mianowanym roztworem zasady; Acydymetria do miareczkowania używa się mianowanego roztworu kwasu. o Redoksymetria podstawą oznaczeń wykonywanych tą metodą są reakcje utleniania i redukcji. Obejmuje dwa działy: Oksydymetria do miareczkowania wykorzystuje się roztwory utleniaczy. W zależności od związku użytego jako titranta wyróżnić możemy kilka metod: manganometria - utleniacz KMnO 4 cerometria - utleniacz Ce(SO 4 ) 2 chromianometria - utleniacz K 2 Cr 2 O 7 lub K 2 CrO 4 bromianometria - utleniacz KBrO 3. Reduktometria miareczkowanie wykonuje się mianowanym roztworem reduktora. W tym przypadku również od nazwy roztworu mianowanego powstały nazwy poszczególnych metod zaliczanych do reduktometrii: ferrometria - reduktor FeSO 4 tytanometria - reduktor TiCl3 askorbinometria kwas askorbinowy (witamina C). Jodometria jest metodą miareczkową znajdującą się na pograniczu oksydymetrii 8

9 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 9 (miareczkowanie roztworem jodu lub KIO 3 ) i reduktometrii (miareczkowanie wydzielonego jodu roztworem Na 2 S 2 O 3 ). o Metoda wytrąceniowa polega na reakcjach tworzenia się trudno rozpuszczalnych osadów. argentometria - AgNO 3 merkurometria - Hg 2 (NO 3 ) 2. o Kompleksometria polega na tworzeniu rozpuszczalnych i trwałych (słabo zdysocjowanych) związków kompleksowych. Do kompleksometrii należą: Kompleksonometria jako titrantów używa się roztworów kompleksonów tworzących z metalem kompleksy chelatowe. Miareczkowanie kompleksometryczne w jego wyniku powstają proste związki kompleksowe a nie kompleksy chelatowe Podział w zależności od sposobu prowadzenia oznaczenia miereczkowego o Miareczkowanie bezpośrednie polega na wykorzystaniu do miareczkowania tylko jednego roztworu titranta, który bezpośrednio reaguje z substancją oznaczaną. o Miareczkowanie pośrednie podczas miareczkowania oznaczana substancja nie reaguje w sposób bezpośredni z roztworem miareczkującym a np. z inną substancją, którą się miareczkuje. Metodę tę możemy podzielić na: miareczkowanie odwrotne wymaga przygotowania dwóch roztworów mianowanych. Najpierw dodajemy w nadmiarze roztwór substancji reagującej z substancją oznaczaną, a w dalszej kolejności nadmiar miareczkuje się drugim roztworem mianowanym. miareczkowanie podstawieniowe (substytucyjne) nie miareczkuje się oznaczanego składnika, ale jego podstawnik, który może być produktem reakcji oznaczanego składnika z odpowiednim odczynnikiem Podział według sposobu wyznaczania punktu końcowego Metody wizualne - wyraźnie zauważalna zmiana barwy roztworu w wyniku zmiany barwy wskaźnika, utworzenia barwnego produktu przez nadmiar titrantu, bądź pojawienia się nadmiaru barwnego titranta. Metody instrumentalne polegają na pomiarze zmian właściwości fizycznych lub fizykochemicznych roztworu (np. miareczkowanie potencjometryczne, konduktometryczne, spektrofotometryczne). 9

10 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C Opis wybranych metod miareczkowania 4.1. Miareczkowanie alkacymetryczne Podstawą alkacymetrii są reakcje kwas-zasada. Podczas miareczkowania następuje ciągła zmiana stężenia jonów hydroniowych [H 3 O + ] czyli ph roztworu. Punkt końcowy możemy wyznaczać zarówno wizualnie (zmiana barwy wywołana obecnością wskaźnika) jak i metodami instrumentalnymi (np. potencjometrycznie lub konduktometrycznie). Możliwych jest kilka przypadków miareczkowania alkalimetrycznego (kwas oznaczamy mianowanym roztworem zasady): o miareczkowanie mocnego kwasu mocną zasadą H 3 O + + OH 2 H 2 O o miareczkowanie słabego kwasu (w tym kwasów wieloprotonowych) mocną zasadą HA + OH H 2 O + A o miareczkowanie mocnego kwasu słabą zasadą H 3 O + + B BH + + H 2 O o miareczkowanie słabego kwasu słabą zasadą HA + B BH + + A Podobnie jest w przypadku miareczkowania acydymetrycznego (zasadę oznaczamy mianowanym roztworem kwasu): o miareczkowanie mocnej zasady mocnym kwasem o miareczkowanie słabej zasady (w tym zasad wielowodorotlenkowych) mocnym kwasem o miareczkowanie mocnej zasady słabym kwasem o miareczkowanie słabej zasady słabym kwasem. Najistotniejsze są miareczkowania mocnego kwasu mocną zasadą, mocnej zasady mocnym kwasem, słabego kwasu mocną zasadą i słabej zasady mocnym kwasem Miareczkowanie mocnego kwasu mocną zasadą Jednym z najprostszych przykładów jest miareczkowanie 0,1 mol/l roztworu HCl (100 ml) za pomocą 0,1 mol/l roztworu NaOH. H 3 O + + Cl + Na + + OH 2 H 2 O + Cl + Na + H 3 O + + OH 2 H 2 O W punkcie 0 miareczkowania mamy tylko roztwór kwasu solnego, który jest całkowicie zdysocjowany (mocny kwas). 10

11 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 11 ph = -lg [H 3 O + ] = -lgc HCl = - lg10-1 = 1 Rys. 4. Krzywe miareczkowania: linia ciągła słabego kwasu mocną zasadą; linia przerywana mocnego kwasu mocną zasadą (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-w 2000) Przed PR (I etap) stężenia jonów hydroniowych maleje w miarę dodawania titranta (łączą się z OH ). Wartość ph rośnie powoli. Obliczmy przykładowo wartość ph po dodaniu 50 ml roztworu NaOH. c 1 : c 2 = V 1 : V 2 c 1 = 0,1 mol/l; V 1 = 50 ml; V 2 = 150 ml c 2 = 0,033 mol/l ph = -lg0,033 = 1,48 W pobliżu PR następuje gwałtowny wzrost ph. W punkcie równoważnikowym (II etap miareczkowania) dla obliczenia ph korzystamy z iloczynu jonowego wody: w PR [H 3 O + ]=[ OH ] [H 3 O + ][ OH ] = [H 3 O + ] 2 = ph = 7 11

12 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 12 Tab. 1. Obliczanie punktów krzywej miareczkowania mocnego kwasu mocną zasadą ml 0,1 mol/l HCl miareczkowany 0,1 mol/l NaOH; V 0 k- początkowa objętość kwasu (ml); V z - objętość zasady (ml); c z - stężenie zasady (mol/l); c k - stężenie kwasu (mol/l) (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-wa 2000) Za punktem równoważnikowym (III etap miareczkowania) mamy nadmiar jonów OH. Dla obliczenia wartości ph ponownie korzystamy z iloczynu jonowego wody: [H 3 O + ][ OH ] = [H 3 O + ] = / [ OH ] lg[h 3 O + ] = lg[ OH ] ph = 14- poh np. po dodaniu 101 ml roztworu NaOH (Tab. 1): c 1 = 0,1 mol/l NaOH; V 1 = 1 ml; V 2 = 201 ml c 2 = 0,00049 mol/l NaOH ph = 14 + lg0,00049 = 10,7 W analogiczny sposób wyznacza się punkty na krzywej miareczkowania mocnej zasady mocnym kwasem Miareczkowanie słabego kwasu mocną zasadą Przykładem takiego miareczkowania jest miareczkowanie kwasu octowego roztworem zasady sodowej. W miarę dodawania roztworu zasady następuje zobojętnianie roztworu, ale jest ono zakłócane przez dysocjację tworzącej się zasady anionowej, czyli inaczej mówiąc przez hydrolizę soli słabego kwasu i mocnej zasady: 12

13 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 13 CH 3 COOH + OH CH 3 COO + H 2 O CH 3 COO + H 2 O CH 3 COOH + OH Przykładowa krzywa miareczkowania przedstawiona jest na Rys. 4, a sposób obliczania poszczególnych punktów na krzywej zamieszczony jest w Tab. 2. Tab. 2. Obliczanie punktów krzywej miareczkowania słabego kwasu mocną zasadą ml 0,1 mol/l CH 3 COOH miareczkowany 0,1 mol/l NaOH; V 0 k- początkowa objętość kwasu (ml); V z - objętość zasady (ml); c z - stężenie zasady (mol/l); c k - stężenie kwasu (mol/l) (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-wa 2000) Przed rozpoczęciem miareczkowania mamy w roztworze tylko słaby kwas i punkt 0 krzywej obliczamy, korzystając z zależności opisującej ph słabego kwasu. W I etapie miareczkowania powstaje mieszanina buforowa złożona ze słabego kwasu i sprzężonej z nim zasady anionowej jonu octanowego. W PR w roztworze będzie obecna jedynie słaba zasada sprzężona z miareczkowanym kwasem, a jej dysocjacja powoduje, że odczyn roztworu będzie zasadowy. Po przekroczeniu punktu równoważnikowego o ph roztworu decyduje jedynie nadmiar dodanej mocnej zasady. Jak widać na Rys. 4, skok miareczkowania w przypadku miareczkowania mocnego kwasu mocną zasadą jest zdecydowanie większy niż, gdy miareczkuje się słaby kwas mocną zasadą Miareczkowanie słabej zasady mocnym kwasem W przypadku miareczkowania słabej zasady mocnym kwasem, podobnie jak w przypadku miareczkowania słabego kwasu mocną zasadą, równolegle z reakcją zobojętniania przebiega reakcja dysocjacji, ale tym razem powstającego kwasu kationowego. Przykładem 13

14 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 14 takiego miareczkowania może być miareczkowanie roztworu NH 3 H 2 O roztworem kwasu solnego. NH 3 H 2 O + H 3 O + + Cl NH H 2 O + Cl NH H 2 O NH 3 H 2 O + H 3 O + Przebieg krzywej miareczkowania przedstawia Rys. 5, a sposób obliczania punktów krzywej miareczkowania jest zamieszczony w Tab. 3. Rys. 5. Krzywe miareczkowania: linia ciągła słabej zasady mocnym kwasem; linia przerywana mocnej zasady mocnym kwasem (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W- wa 2000) Pierwszy punkt krzywej miareczkowania ( 0 ) wyznaczamy z zależności opisującej ph słabej zasady. Od momentu dodania pierwszej porcji titranta aż do osiągnięcia PR, w roztworze znajduje się bufor złożony ze słabej zasady i soli tej zasady z mocnym kwasem (kwas kationowy). Sposób obliczania zarówno zasady jak i powstającego kwasu kationowego jest taki sam, jak w opisanym wyżej przypadku miareczkowania kwasu octowego zasadą sodową (Tab. 3). W punkcie równoważnikowym w roztworze znajduje się sprzężony z miareczkowaną zasadą słaby kwas, którego dysocjacja decyduje o kwasowym odczynie roztworu. Kiedy znajdujemy się za punktem równoważnikowym, w roztworze obecny jest nadmiar mocnego kwasu cofający dysocjację kwasu kationowego. Obliczeń ph roztworu dokonuje się w taki sam sposób, jak w przypadku miareczkowania mocnej zasady mocnym kwasem. 14

15 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 15 Tab. 3. Obliczanie punktów krzywej miareczkowania słabej zasady mocnym kwasem ml 0,1 mol/l NH 3 x H 2 O miareczkowany 0,1 mol/l HCl; V 0 z- początkowa objętość zasady (ml); V k - objętość kwasu (ml); c z - stężenie zasady (mol/l); c k - stężenie kwasu (mol/l) (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-wa 2000) 4.2. Miareczkowanie redoksymetryczne Reakcje utleniania i redukcji, będące podstawą miareczkowania redoksymetrycznego, przebiegają znacznie wolniej od reakcji jonowych (np. alkacymetria). Wymiana elektronów pomiędzy jonami przebiega w kilku etapach, a najwolniejszy z nich decyduje o szybkości całego procesu. Ogólne równanie reakcji redoks można schematycznie zapisać: Ox 1 + n 1 e Red 1 n 2 Red 2 Ox 2 + n 2 e n 1 n 2 Ox 1 + n 1 Red 2 = n 2 Red 1 + n 1 Ox 2 Układ, w którym postać utleniona jest związana z postacią zredukowaną tylko wymianą elektronów, nazywany jest sprzężoną parą redoks (np. Fe 3+ /Fe 2+ ). Krzywą miareczkowania redoksymetrycznego wykreśla się na podstawie wartości potencjałów redoks obliczonych ze wzoru Nernsta. E = E 0 + 0,059 n [utl] lg [red] 15

16 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 16 W punkcie równoważnikowym E PR = E 1 = E 2 E PR = E 0 1 n 1 + E 0 2 n 2 n 1 + n 2 Przykładową krzywa miareczkowania redoksymetrycznego przedstawiono na Rys. 6, a obliczenia punktów krzywej miareczkowania w Tab. 4. Tab. 4. Miareczkowanie 10 ml 0,1 mol/l roztworu jonów Fe 3+ roztworem 0,1 mol/l jonów Ce 4+ w 1 mol/l HCl (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-wa 2000) Rys. 6. Krzywa miareczkowania jonów Fe 2+ roztworem jonów Ce 4+ 16

17 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 17 Zmiany zachodzące w roztworze podczas miareczkowania redoksymetrycznego można mierzyć potencjometrycznie lub, stosując barwne wskaźniki (Tab. 5). W miareczkowaniach manganometrycznych i jodometrycznych nie ma potrzeby stosowania dodatkowych wskaźników, gdyż manganian(vii) potasu i jod same odgrywają ich rolę. Tab. 5. Przykładowe wskaźniki redoks (pod. red. R. Kocjana, Chemia analityczna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, W-wa 2000) Miareczkowanie manganometryczne Jako roztworu miareczkującego używa się manganianu(vii) potasu o silnie fioletowym zabarwieniu, który w zależności od środowiska reakcji (ze zmianą ph zmienia się potencjał redoks układu) ulega różnym przemianom: o środowisko kwaśne - roztwór ulega odbarwieniu MnO H + +5 e Mn H 2 O (E = + 1,53 V) o środowisko obojętne lub słabo zasadowe lub słabo kwasowe - wytrąca się brunatny osad MnO 2 MnO H 2 O +3 e MnO OH (E = + 0,58 V) o środowisko mocno zasadowe - roztwór przybiera zieloną barwę 2 MnO 4 + e MnO 4 (E = + 0,56 V) 17

18 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 18 Metodą miareczkowania manganometrycznego można oznaczać żelazo w postaci jonów dwuwartościowych. Reakcję przeprowadza się w środowisku kwasu siarkowego(vi). 5 Fe 2+ + MnO H + 5 Fe 3+ + Mn H 2 O Sole żelaza(iii) mają intensywną żółtą barwę, która mogłaby zakłócić obserwację końca miareczkowania, dlatego też wiąże się je w bezbarwny kompleks z kwasem fosorowym(v). Duży wpływ na błędne oznaczenie ma obecność jonów chlorkowych w roztworze, które mogą utleniać się do wolnego chloru lub nawet chloranów(i), a oznaczane jony żelaza indukują tę reakcję. Aby zapobiec takim niepożądanym reakcjom, przed rozpoczęciem miareczkowania wprowadza się mieszaninę Zimmermana i Reinhardta, w której skład wchodzą: siarczan(vi) manganu(ii), kwas siarkowy(vi) i kwas fosforowy(v). Jeśli w miareczkowanym roztworze obecne są również jony Fe 3+, należy je zredukować do Fe 2+. W tym celu jako reduktorów używa się: chlorek cyny(ii), siarkowodór, kwas siarkowy(vi) lub niektóre metale (Zn, Cd, Al. często w postaci amalgamatów) Miareczkowanie jodometryczne Podstawą wszystkich oznaczeń jodometrycznych jest odwracalna reakcja I e 2 I (E = + 0,54 V) Miareczkowanie jodometryczne przeprowadza się w środowisku kwaśnym, ponieważ potencjał układu I 2 /2 I nie zależy od stężenia jonów wodorowych w zakresie do ph. W roztworach bardziej alkalicznych, potencjał ten maleje na skutek reakcji I OH IO + I + H 2 O 3 IO IO I Jodometria jest jedną z najważniejszych metod analizy miareczkowej. W zależności od wartości potencjału utleniającego substancji oznaczanych można podzielić ją na dwie grupy. Substancje, których potencjały utleniające są niższe od potencjału I 2 /2 I, można miareczkować bezpośrednio mianowanym roztworem jodu (siarczki, siarczany(iv), arsen(iii), cyna(ii), tiosiarczany). Substancje o wyższym potencjale utleniającym niż potencjał układu I 2 /2 I utleniają jony jodkowe do jodu, który następnie miareczkuje się mianowanym roztworem tiosiarczanu sodu. 2 I S 2 O I + S 4 O 6 W taki pośredni sposób oznacza się liczne substancje utleniające (bromiany, jodany, manganiany(vii), chlor, cer(iv), miedź(ii), żelazo(iii) ). Wskaźnikiem używanym w oznaczeniach jodometrycznych jest zawiesina skrobi, która tworzy z jodem połączenie o charakterze addycyjnym o intensywnym niebieskim 18

19 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 19 zabarwieniu. Przykładem bezpośredniego miareczkowania metodą jodometryczną jest oznaczanie kwasu askorbinowego (witaminy C). Kwas ten ma właściwości redukujące i utlenia się pod wpływem jodu do kwasu dehydroksyaskorbinowego. KWAS ASKORBINOWY (postać zredukowana) KWAS DEHYDROASKORBINOWY (postać utleniona) Jodometryczne oznaczanie dichromianu(vi) potasu w środowisku kwaśnym jest przykładem miareczkowania pośredniego. Roztwór dichromianu(vi) potasu zakwasza się kwasem siarkowym(vi), a następnie miareczkuje roztworem KI. 2 Cr 2 O I + 14 H + 2 Cr I H 2 O Wydzielony jod miareczkuje się następnie tiosiarczanem(vi) sodu, dodając pod koniec miareczkowania wskaźnika skrobiowego. Moment, w którym zanika barwa niebieska, a pojawia się barwa żółtozielona lub fioletowa kompleksów Cr(III), oznacza punkt końcowy miareczkowania. 19

20 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 20 II. Część doświadczalna 1. Wykonanie ćwiczenia Celem ćwiczenia jest: praktyczne zaznajomienie się z miareczkową metodą oznaczania zawartości witaminy C (bezpośrednia redukcyjność) w wybranym produkcie (w soku z kiszonej kapusty, soku z cytryny) Zasada metody Oznaczenie polega na redukcji barwnego roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu do bezbarwnego leukozwiązku przez kwaśny roztwór kwasu askorbinowego Odczynniki, sprzęt i aparatura o waga techniczna z dokładnością ważenia do 0,01 g o naczynko wagowe o łopatka o cylinder miarowy o pojemności 50 cm 3 o kolba miarowa o pojemności 50 cm 3 o biureta o pojemności 25 cm 3 o kolba stożkowa o pojemności 50 cm 3 o pipeta o pojemności 10 cm 3 o lejek o pipeta Pasteura o jodek potasu, o tiosiarczan sodu (0,001 mol/dm 3 ), o kwas siarkowy (1 mol/dm 3 ), o roztwór 2,6-dichlorofenoloindofenolu, o roztwór skrobi, o 2% roztwór kwasu solnego HCl. 1 szt, 1 szt., 1 szt., 2 szt., 2 szt., 2 szt., 6 szt., 4 szt., 2 szt., 1 szt., 1.3. Wykonanie oznaczenia Oznaczenie miana 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez miareczkowanie roztworem tiosiarczanu sodu: W kolbie stożkowej z doszlifowanym korkiem o pojemności 50 cm 3 rozpuścić 100 mg jodku potasu w 5 cm 3 kwasu siarkowego (VI) o stężeniu 1 mol/dm 3, dodać szybko 10 cm 3 roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu, kolbę zamknąć i pozostawić na 10 20

21 2. Laboratorium przyrodnicze Zastosowanie miareczkowania do oznaczania witaminy C 21 min w ciemnym miejscu. Wydzielony jod odmiareczkować roztworem tiosiarczanu sodu (0,001 mol/dm 3 ), dodając 1 cm 3 roztworu skrobi. Miareczkowanie powtórzyć 3 razy. Oznaczanie witaminy C w soku z kiszonej kapusty i soku z cytryny: 20 cm 3 soku z kapusty oraz 20 cm 3 soku z cytryny umieścić w probówkach wirówkowych i odwirować (8000obr./min., 10 min.). 10 cm 3 odwirowanego soku z cytryny rozcieńczyć 2% HCl w kolbie miarowej o pojemności 50 cm 3. Do trzech kolb stożkowych o pojemności 25 cm 3 pobrać po 10 cm 3 rozcieńczonego soku z cytryny, i miareczkować barwnikiem Tillmansa do barwy lekko różowej utrzymującej się 10 s. Opisaną procedurę przeprowadzić dla odwirowanego soku z kiszonej kapusty/ Wykonać ślepą próbę, w której zamiast rozcieńczonego soku pobrać wodę destylowaną. Do obliczeń przyjąć ilość zużytego roztworu barwnika pomniejszoną o ilość ml barwnika zużytą w próbie ślepej Opracowanie wyników o Obliczyć miano roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu. Za miano roztworu tego barwnika przyjmuje się ilość mg kwasu askorbinowego utlenianego przez 1 cm 3 tego roztworu. Aby obliczyć miano barwnika, w pierwszym etapie należy obliczyć jego stężenie molowe (C M ) na podstawie reakcji z tiosiarczanem sodu, w której na 1 mol barwnika przypadają 2 mole tiosiarczanu: ( VW VZ ) CT CM = 2V b V W objętość tiosiarczanu sodu zużytego do zmiareczkowania roztworu barwnika [ml], V Z objętość tiosiarczanu sodu zużytego do miareczkowania w próbie zerowej [ml], C T stężenie roztworu tiosiarczanu sodu [mol/l], V b objętość roztworu barwnika [ml]. Z równania reakcji między kwasem askorbinowym i 2,6-dichlorofenoloindofenolem wynika, że z 1 molem kwasu reaguje1 mol barwnika, masa molowa kwasu askorbinowego wynosi 176 g/mol. o Na podstawie ilości barwnika zużytego do miareczkowania rozcieńczonego soku z kapusty, obliczyć zawartość witaminy C (bezpośrednia redukcyjność) w soku z kiszonej kapusty i soku z cytryny Interpretacja wyników Uzyskany wynik odnieść do norm. 21