Współczesne możliwości szybkiego diagnozowania gruźlicy

Transkrypt

1 Współczesne możliwości szybkiego diagnozowania gruźlicy Ewa Augustynowicz-Kopeć Zakład Mikrobiologii Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc Warszawa

2 Czego oczekują klinicyści od laboratoriów prątka? 1. potwierdzenia metodami mikrobiologicznymi podejrzenia klinicznego 2. wykonania badania w najkrótszym czasie wstępną diagnostykę należy zakończyć po 2 dniach (bakterioskopia i badanie genetyczne) 21 dni identyfikacja gatunkowa 30 dni test lekooporności pełną diagnostykę

3 Zał. nr 1 Wykaz czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 25 marca 2014 r. w sprawie biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu, wzorów formularzy zgłoszeń dodatnich wyników badań w kierunku biologicznych czynników chorobotwórczych oraz okoliczności dokonywania zgłoszeń

4 Różna specyficzność i czułość w wykrywaniu prątkowania chorego Bakterioskopia Jakość próbki plwociny ilość prątków wykrywa około połowy wszystkich przypadków czynnej gruźlicy. mniej przydatny u zakażonych HIV i dzieci komórek/ 1ml Hodowla (L-J) Nowoczesne systemy > komórek / 1ml > 500 komórek / 1ml min 100 kom żywych Długi czas oczekiwania na wynik Czas generacji prątków 24 h Metody genetyczne w hodowli wykrycie obecność DNA M. tbc lub innych gatunków prątków komórek / 1ml

5 Rekomendacja 3 Pneumonol. Alergol.81, Na podstawie wyniku bakterioskopii nie można ani potwierdzić ani wykluczyć rozpoznania gruźlicy w dodatnim rozmazie mogą być obecne prątki środowiskowe. przy dodatnim rozmazie należy wykonać badanie genetyczne czułość metody około 45% wg World Health Organization (2012) Fact Sheet No. 104: Tuberculosis. Geneva: WHO = TB

6 Co oznacza wynik rozmazu? AFB (-) prątki nie obecne w wystarczającej liczbie, aby być widoczne pod mikroskopem silne podejrzeniu gruźlicy >niż trzy materiały zbierane i testowane w różnych dniach nie świadczy o braku prątkowania mała ilość bakterii potwierdzona hodowlą Chorzy HIV + postacie gruźlicy skąpopratkowe zakażenie spowodowane innym czynnikiem etiologicznym niż prątki Behr MA, Warren SA, Salamon H, et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acidfast bacilli. Lancet1999;353:

7 AFB + wynik 24 h Chory z aktywną postacią TB obficie prątkujący zalecane wykonanie badania genetycznego pomocne w podejmowaniu decyzji o włączeniu leczenia choremu

8 Metody genetyczne: mogą znacznie przyspieszyć diagnostykę gruźlicy płuc i postaci pozapłucnych nie powinny nigdy zastępować innych metod powinny być ich uzupełnieniem należy wykonywać je wyłącznie w zamkniętych systemach, wyposażonych w kontrolę procesów amplifikacji Gen-Probe ProbeTec GeneXpert- RNA 4h +opracowanie materiału DNA 6h +opracowanie materiału DNA 2h + R- RMP wstępny test diagnostyczny TB MDR zalecenia WHO PCR (home-made ) brakuje kalibracji nie rekomendowany do gruźlicy wykrywanie obcego DNA

9 Testy genetyczne Najnowsze testy molekularne są bardzo proste w wykonaniu nie wymagają spełniania kryteriów laboratorium molekularnego Czułość zależna o wyniku AFB i Hodowli Dodatni wynik % w przypadku pozytywnych AFB i hodowli 40-60% ww przypadku ujemnych wyników AFB i hodowli Khandekar P et al. (1994) Evaluation of PCR based test for the detection of Mycobacterium tuberculosis in coded sputum specimens. Indian J Med Res

10 RMP- R jako marker MDR -TB wg WHO RMP- R jako marker MDRTB Ale wartość predykcyjna wyniku dodatniego testu przekracza 90% gdy częstość występowania RMP R przekracza 15% co jest rzadkością w skali globalnej wynik pozytywnym wymaga testu potwierdzającego

11 mutacje rpob Leu533Pro, Leu511Pro, Asp516Tyr i His526Leu -mniej popularne, ich częstość występowania może osiągnąć jednak 10 do 22% Oporność na RMP nie zawsze surogatem oporność MDR Potrzeba szybkich testów na INH Kurbatova EV et all. Rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis: susceptibility to isoniazid and other anti-tuberculosis drugs. Int. J. Tuberc. Lung Dis :

12 m2000 RealTime System testów w kierunku HIV-1 i MTB na tej samej platformie Abbott Introduces New Molecular Test to Aid in the Diagnosis of Tuberculosis - October 08, 2014

13 Czy wykonując badania molekularnego nadal musimy używać tradycyjnych metod? bezpośrednio w materiałach wykrywanie obecność M. tuberculosis i markerów genetycznych lekooporności RMP Potwierdzenie AFB + chory poddany leczeniu ALE hodowla i/lub AFB -MOTT -test genetyczny ujemny hodowla - identyfikacja M.tbc, test lekooporności hodowla -epidemiologiczne dochodzenia molekularne, śledzenie transmisji, badanie kontaktów

14 Jakie są korzyści z badań molekularnych? Szybkość uzyskania wyniku - bezpośrednio z materiału od chorego, szybka identyfikacją szczepu prątków włączenie natychmiastowego leczenia przeciwprątkowego, izolację chorych,zapobieganie transmisji, badanie kontaktów Informacja w postaciach skąpoprątkowych ( gruźlica pozapłucna, u dzieci ) w sytuacji kiedy konwencjonalne testy są ujemne np.z AFB (-) i hodowlą Umożliwiają diagnostykę chorego z podejrzeniem TB w sytuacji, materiał został wysłany tylko na badanie hist pat

15 RAPORT WHO GRUŹLICA OPORNA NA LEKI 2013 Globalnie, 3,6% chorych TB nowowykrytych i 20,2% wcześniej leczonych ma status MDR-TB Na podstawie danych z 92 krajów zakłada się, że 9,6% przypadków MDR-TB ma postać XDR-TB.

16 Gruźlica lekooporna MDR i XDR na świecie MDR-TB XDR-TB Federacja Rosyjska Peru Indie Chiny TDR TB Płd. Afryka ~ nowych przypadków MDR TB (3.6%) XDR TB 9.6 % wśród MDR TB Raporty z XDR TB 58 krajów (2009r), 77 krajów (2011r),92 krajów w 2013 TDR TB Iran 15 chorych (2009 r), Indie-4 chorych (2012 r) Indie Hospital in Andheri Dziecko z TDR (2013)

17 Koszt leczenia TB $ $ zmniejszenie wydajności w trakcie leczenia $ bezpośrednie koszty leczenia z uwzględnieniem Leczenie i diagnostyka Zarządzanie i opieka $ DS-TB MDR-TB XDR-TB leczenie 6-9 m-cy leczenie20-26 m-cy leczenie 32 m-ce Opieka domowa Hospitalizacja

18 Testy lekooporności U chorych po raz pierwszy diagnozowanych w kierunku gruźlicy należy wykonać badanie bakterioskopowe, molekularne, posiew na pożywkach płynnych i stałych, identyfikację oraz test lekooporności U chorych ze wznową gruźlicy należy uwzględnić możliwość wystąpienia lekooporności prątków i poza badaniami wymienionymi wykonać molekularny test w kierunku lekooporności Pneumonol. Alergol.81, Rekomendacja 8

19 MDR, XDR Testy lekooporności wykonywane na pożywkach płynnych 5 18 dni (mediana 6,8) L-J (mediana 29,1) Szczepy prątków gruźlicy zdiagnozowane w laboratoriach regionalnych muszą być weryfikowane w Krajowym Referencyjnym Laboratorium

20 GenoType Zestawy do oznaczania lekooporności Lekooporności Mycobacterium tuberculosis complex z uzyskanej hodowli lub próbki klinicznej AFB (+) GenoType MTBDRplus (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na RMP i INH) Czas badania 5 godzin GenoType MTBDRsl (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na fluorochinolony, aminoglikozydy i etambutol) Czas badania 5 godzin

21 Wyniki badań molekularnych lekooporności potwierdzone konwencjonalnymi metodami Dlaczego?? fenotyp lekooporności niewykrywany przez testy molekularne nie wszystkie mutacje powodujące oporność wykrywane w testach mutacja na zewnątrz regionu badanego inne nieznane mechanizmy oporności niektóre mutacje powodują tzw niskie miano oporności np. chinolony lek może być stosowany w wyższych dawkach Sekwencjonowanie całego genomu -porównanie genomu szczepów lekoopornych i wrażliwych wykrycie nowych mutacji

22 Zastosowanie testów molekularnych w diagnostyce TB Wykrywanie Lekooporność Identyfikacja Wykrycie obecności prątków gruźlicy w badanym materiale Wykrycie oporności na leki przeciwprątkowe, np. INH, RMP Identyfikacja gatunkowa prątków Celem jest wykrycie sekwencji specyficznych dla M. tuberculosis complex Celem jest wykrycie mutacji odpowiedzialnej za oporność na lek, np. mutacje w rpob oporność na RMP Amplifikacja specyficznych sekwencji dla danego gatunku prątków Pozytywny wynik testu świadczy o obecności prątków M. tuberculosis complex w materiale klinicznym Wykrycie mutacji w danym genie świadczy o oporności prątków na badany lek Identyfikacja do gatunku prątków MOTT oraz w obrębie M. tuberculosis complex Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli

23 National Institute for Materials Science. "A rapid, paper-based diagnostic test for tuberculosis." ScienceDaily. ScienceDaily, 3 October 2013

24 Spoligotypowanie = metoda przesiewowa SZCZEPY RÓŻNE SZCZEPY IDENTYCZNE Zastosowanie metody bardziej różnicującej Szczepy różne Szczepy różne Szczepy takie same

25 Wzór molekularny Beiging leczenie gruźlicy mniej skuteczne wobec szczepów genotypu Beinging nie związane z lekooporności. J Infect Dis. (2010) 201 (4): W Europie >80% MDR Konferencja TB PAN-NET Mediolan czerwiec 2014

26 Dlaczego świat boi się prątków Beijing? Szybko nabywają oporności na leki Większa patogenność Łatwo transmitowane Oporne na działanie mechanizmów obronnych człowieka Namnażają się w makrofagach i monocytach Nieprzewidywalna odpowiedź na leczenie

27 Płeć Wiek Analiza 106 szczepów Beijing wyizolowanych od chorych w Polsce w latach Obcokrajowcy (%) Liczba szczepów Polacy (%) Ogółem (%) 42 (40) 64 (60) 106 (100) Mężczyźni 31 (29) 55 (53) 86 (82) Kobiety 11 (10) 9 (8) 20 (18) Dorośli 38 (36) 62 (58) 100 (94) Dzieci (0-14) (troje 0-3 lat) 4 (4) 2 (2) 6 (6) Szczepy lekowrażliwe 11(10) 11(10) 22 (20) Szczepy lekooporne 30 (28) 54 (52) 84 (80) Liczba szczepów MDR 18 (17) 53 (50) 71 (67) Wśród MDR pre-xdr XDR 4 (4) 2 (2) 14 (13) 6 (6) 18 (20) 8 (8)

28 W Polsce w populacji chorych na gruźlicę typu Beijing dominuje postać oporna na leki p/prątkowe (80%) MDR-TB 42% Pre-XDR-TB - 20% XDR-TB 8% Wszystkie szczepy lekooporne izolowane od chorych na gruźlicę w Polsce należy weryfikować metodami genotypowania w celu określenia ich przynależności do rodziny molekularnej Beijing.

29 Hist - Pat Ziarniniaki nie są strukturą swoistą dla gruźlicy i mogą występować w innych chorobach jak: mykobakterioza sarkoidoza, chłoniaki bruceloza choroba kociego pazura grzybice ziarniniakowatości Wegenera odczyny na ciało obce Znalezienie ziarniniaków nawet z martwicą nie upoważnia do his-pat rozpoznania tbc

30 Diagnostyka TB Materiały płucne Materiały pozapłucne Plwocina Wydzielina oskrzelowa Popłuczyny oskrzelowe BAL Popłuczyny żołądkowe Płyn mózgowo-rdzeniowy Płyn z opłucnej Płyn z otrzewnej Płyn z osierdzia Węzły chłonne Tkanki Biopsje Mocz Hodowla Badania genetyczne Materiały histopatologiczne

31 76 materiałów utrwalonych w parafinie badanych metodą genetyczną 51,3% (39) mat. (+) bad. gen. 48,7% (37) mat. (-) bad. Gen.

32 Wyniki badań 37 mat. hist.-pat. z barwieniem Z-N 37 mat. 23 mat. Z-N (-) 14 mat. Z-N (+) 5 (22%) mat. 18 (78%) mat. 10 (72%) mat. 4 (28%) mat.t Bad. gen.(+) Bad.gen. (-) bad.gen. (+) bad.gen. (-)

33 Testy IGRA (Interferon-Gamma Release Assay) T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Abingdon, Wielka Brytania) Quanti FERON-TB GOLD (Cellestis, Carnegie, Australia)

34 Zasada działania testów IGRA ocena produkcji interferonu γ wydzielanego przez limfocyty T krwi obwodowej po stymulacji swoistymi antygenami ESAT-6 (early secretory antigen target 6) i CFP 10 (culture filtrate protein 10) kodowanymi w regionie RD1 (Region of Difference 1) genomu M.tuberculosis brak go w genomie prątków BCG i w większości prątków środowiskowych z wyjątkiem: M. kansasii, M. szulgai, M. marinum

35 Możliwość zastosowania testu IGRA T-SPOT.TB do identyfikacji aktywnej postaci gruźlicy z materiałów klinicznych: BALf do diagnostyki gruźlicy płuc płyn z opłucnej postaci pozapłucnej

36 T-SPOT.TB w diagnostyce gruźlicy płuc i postaci pozapłucnej W literaturze ukazały się publikacje dotyczące wykorzystania testu IGRA z płynów do diagnostyki gruźlicy Jafari C. i wsp. (BALf)/ 3 rozmazy plwociny negatywne Losi M. i wsp. (pł.z opłucnej)/czułość 95% i swoistość 76% Trajman i wsp. czułość 89% i swoistość 97%

37 Test IGRA T-SPOT.TB 71 chorych w IGiChP w latach chorych z krwi obwodowej wykrycie LTBI BALf (55), płynów z opłucnej (16) aktywnej gruźlicy Ilość limfocytów T wydzielających interferon gamma w płynie opłucnowym i BALf oznaczano metodą ELISpot (T-SPOT.TB). Równolegle mat. poddano rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej Podstawę rozpoznania TB stanowiły wynik hodowli płynu z opłucnej lub BALf.

38 LTBI 71 (71 krwi, 55 BALf i 16 płynów z opłucnej) Aktywna TB 10 + T-SPOT.TB z krwi 10 + T-SPOT.TB z płynów ustrojowych 1 + T-SPOT.TB z pł. z opłucnej 9 + T-SPOT.TB z BALf 1 potwierdzony mikrobiologicznie wyhodowano szczep M. tbc 4 potwierdzone mikrobiologicznie wyhodowano szczep M. tbc

39 Spoligotypowanie = metoda przesiewowa SZCZEPY RÓŻNE SZCZEPY IDENTYCZNE Zastosowanie metody bardziej różnicującej Szczepy różne Szczepy różne Szczepy takie same

40 Kontaminacja bronchoskopu Obraz kliniczny PACJENTKA 1 PACJENTKA 2 Zmiany wskazujące na proces gruźliczy Brak zmian Data bronchoskopii AFB Sonda genetyczna + + Hodowla + + Lekooporność INH R SM R INH R SM R Analiza molekularna wykazała identyczne wzory molekularne szczepów od obu pacjentek

41 Zakażenia krzyżowe w laboratorium Nr próbki/ pacjenta Wyniki genotypowania szczepów Spoligotyping MIRU-VNTR A B C D 3774 T4_CEU T4_CEU * H * H H T T B T T T

42 Częstość występowania kontaminacji krzyżowych w Laboratorium Prątka w latach czerwiec 2014 Liczba materiałów klinicznych od chorych z podejrzeniem gruźlicy Liczba wyhodowanych szczepów / liczba chorych z potwierdzeniem TB 598 szczepów / 408 chorych Liczba przypadków podejrzanych o zakażenie krzyżowe / liczba szczepów 12 przypadków / 26 szczepów Liczba przypadków potwierdzonych / liczba szczepów fałszywych 4 przypadki potwierdzonej kontaminacji / 5 szczepów 0.8%

43 4 przypadki potwierdzonej kontaminacji krzyżowej Przypadek Nr badania Data posiewu AFB Obfitość/czas wzrostu na pożywce stałej Czas wzrostu na pożywce płynnej Wzór DNA szczepu Wynik analizy A B /15 dni NW Źródło kontaminacji plwocina Materiał - +/13dni NW p.oskrzelowe skontaminowany /18dni +/7dni Źródło kontaminacji plwocina Materiał Plwocina - +/79dni NW skontaminowany 7511 p.oskrzelowe - +/18dni +/12dni Źródło kontaminacji C p.oskrzelowe - +/46dni +/19dni Materiał skontaminowany 562B Plwocina +++ +/18 dni +18dni Źródło kontaminacji D 571 p.oskrzelowe Brak wzrostu +/19dni p.oskrzelowe - Brak wzrostu +/26dni Materiał skontaminowany Materiał skontaminowany

44 Podsumowanie Znalezienie czynnika sprawczego gruźlicy i procesem trudnym i wymaga ścisłej współpracy mikrobiologów z klinicystami Wiarygodność mikrobiologicznej diagnostyki gruźlicy wymaga zastosowania najnowszych metod diagnostycznych i powinna być wykonywana w laboratoriach prątka o najwyższym poziomie referencyjności czas wykonania badania!!!!!!

45 Podsumowanie W ostatniej dekadzie metody szybkiej diagnostyki TB w tym testy oporności umożliwiły wczesne wykrycie chorego z TB i identyfikację lekoopornej gruźlicy Problemem pozostaje czułość wykrywania gruźlicy u dzieci, zakażonych HIV i postaci pozapłucnych

46