Barwniki biarsenowe do specyficznej i wielofunkcyjnej modyfikacji białek

Transkrypt

1 Barwniki biarsenowe do specyficznej i wielofunkcyjnej modyfikacji białek Artur Krężel Pracownia Chemii Biologicznej, Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Wrocławski, Wrocław Pracownia Chemii Biologicznej, Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Joliot-Curie 14a, Wrocław; tel.: (71) , krezel@biotech.uni.wroc.pl Artykuł otrzymano 27 września 2013 r. Artykuł zaakceptowano 15 października 2013 r. Słowa kluczowe: fluorescencja, barwniki biarsenowe, motyw czterocysteinowy, modyfikacja fluorescencyjna, białka fluorescencyjne, sonda fluorescencyjna Wykaz skrótów: AsCy3 barwnik biarsenowy Cy3; BAL (ang. British anti-lewisite) 2,3-dimerkaptopropanol; CALI/FALI inaktywacja świetlna chromoforu/fluoroforu; CrAsH biarsenowa karboksyfluoresceina, CFP cyjanowe białko fluorescencyjne; CRABP I komórkowe białko wiążące kwas retinowy I; Cy3/Cy5 barwniki cyjaninowe; EDT 1,2-dimerkaptoetan; FITC izotiocyjanian fluoresceiny; FRET (ang. Förster resonance energy transfer) rezonansowy transfer energii Förstera; GFP białko zielonej fluorescencji, GPCR receptor sprzężony z białkiem G; HALO bakteryjna dehalogenaza haloalkilowa; NHS N-hydroksysukcynimid; Ni 2+ -NTA system oczyszczania białek; sflash biarsenowa sulfofluoresceina; SNAP zmodyfikowany wariant ludzkiej alkilotransferazy O 6 -alkiloguaninowej; SplAsH spirolaktam biarsenowej fluoresceiny; TC motyw/sekwencja/metka czterocysteinowa; TRITC izotiocyjanian tetrametylorodaminy; YFP białko żółtej fluorescencji Podziękowania: Autor dziękuje Narodowemu Centrum Nauki (grant 2011/01/B/ST5/00830) oraz Fundacji na rzecz Nauki Polskiej (subsydium Focus F1/2010, FG1/2010) za finansowe wsparcie badań oraz zakup aparatury badawczej wykorzystanej w realizacji projektów, których rezultaty zawarte są w tym artykule. STRESZCZENIE Modyfikacje chemiczne białek stanowią podstawę badania ich funkcji, właściwości oraz lokalizacji w komórkach i organizmach. Do najważniejszych z nich należy modyfikacja fluorescencyjna, która wykorzystywana jest powszechnie w biochemii, biologii molekularnej oraz diagnostyce medycznej. We fluorescencyjnym wybarwianiu białek bardzo ważne jest precyzyjne umiejscowienie fluoroforu w sekwencji czy na powierzchni makromolekuły, tak by nie zakłócał on aktywności białka oraz by produkt koniugacji mógł być wykorzystany do charakterystyki znakowanego białka. Barwniki biarsenowe, powszechnie używane we fluorescencyjnej modyfikacji białek, stanowią obecnie ważne narzędzie nie tylko w wybarwianiu białek na poziomie komórek, lecz również, ze względu na swoje właściwości, stanowią podstawę do tworzenia narzędzi wykorzystywanych w badaniach fałdowania, degradacji, zmian aktywności, kontrolowanej inaktywacji tlenem singletowym, oligomeryzacji czy oczyszczaniu białek. Celem artykułu jest zapoznanie czytelników z metodą biarsenową oraz podstawowymi wymaganiami, jakie muszą spełniać białka, aby metoda ta stosowana była prawidłowo. Artykuł przedstawia najciekawsze zastosowania popularnych barwników biarsenowych, jak również ich chemicznych pochodnych, zarówno w badaniach komórkowych jak i w diagnostyce i analityce biochemicznej. WPROWADZENIE Barwniki fluorescencyjne znajdują zastosowanie w biochemii, biologii molekularnej, diagnostyce biochemicznej oraz medycznej. Ich niezwykła popularność wynika z ich unikalności jak i dużej rozdzielczości technik fluorescencyjnych. Wysoka czułość fluorescencji dodatkowo obniża konieczność stosowania wysokich stężeń, co ogranicza ingerencję w badany układ, jak również zmniejsza koszty badań. Rozszerzenie palety barw klasycznie stosowanych fluoroforów pozwala na ich stosowanie w znacznie szerszym zakresie spektralnym obejmującym UV-Vis-IR [1]. Modyfikacje chemiczne białek, w szczególności fluorescencyjne, cieszą się od lat niezwykłą popularnością wśród badaczy ze względu na możliwość modulowania ich właściwości. Wzbogacenie prostych barwników fluorescencyjnych o ugrupowania chemiczne, reaktywne względem niektórych grup funkcyjnych, pozwala na ich łatwe i szybkie wykorzystanie w barwieniu białek. Klasycznymi przykładami są fluorofory z ugrupowaniem izotiocyjanianowym reagującym głównie z grupami aminowymi białek takie, jak FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) i TRITC (izotiocyjanian tetrametylorodaminy). Podobną, lecz bardziej selektywną reaktywność względem grup aminowych białek posiadają sukcynimidy poszczególnych fluoroforów, jak np. NHS-fluoresceina czy NHS-tetrametylorodamina. Połączenie platform barwników z ugrupowaniem jodoacetamidowym czy maleimidowym, pozwala na selektywne i szybkie modyfikacje ugrupowania tiolowego zredukowanych reszt cysteinowych [2]. Fluorescencyjna modyfikacja wyżej wymienionymi reaktywnymi barwnikami, choć bardzo popularna, posiada jednak poważne ograniczenie związane z brakiem możliwości kontrolowania modyfikacji poszczególnych grup w białku. Obecność większej liczby reszt lizynowych czy cysteinowych uniemożliwia specyficzne wprowadzenie barwnika w pożądaną pozycję białka. Należy tu jednak pamiętać, że białka rzadko posiadają wiele wyeksponowanych reszt cysteinowych i wykorzystując ich modyfikację chemiczną można często uzyskać zamierzony cel. Problemy związane ze specyficznością (względem danego miejsca białka) fluorescencyjnej modyfikacji białek stały się przyczynkiem do badań nad technikami pozwalającymi selektywnie wyznakować białko w komórce, z zastosowaniem odpowiednio zaprojektowanych barwników. Ponadto, w klasycznych badaniach in vitro możliwość wprowadzenia fluoroforu poprzez reakcję z konkretnymi resztami aminokwasowymi lub sekwencjami białka ma ogromne znaczenie dla kontroli jego aktywności, zwijania, konformacji itp. Precyzyjne wprowadzenie barwnika pozwala także na wykorzystanie zmodyfikowanych białek 102

2 w monitorowaniu oddziaływań z innymi molekułami przy zastosowaniu takich technik jak anizotropia fluorescencji czy FRET [3]. METODY SPECYFICZNEGO ZNAKOWANIA BIAŁEK Techniki selektywnego umieszczania fluoroforów w białkach rozwijają się wieloma ścieżkami. Dostępna jest ogromna paleta białek fluorescencyjnych, które można dołączyć do obu końców znakowanego białka [4]. Zastosowanie białek fluorescencyjnych pozwala na konstrukcję fluorescencyjnie zmodyfikowanego białka fuzyjnego, które produkowane jest samoistnie w komórkach, po wcześniejszym wprowadzeniu odpowiednio przygotowanego DNA, jak to ma miejsce np. w przypadku zielonego białka fluorescencyjnego GFP [5,6]. Inne strategie wykorzystują specyficzne oddziaływanie białka lub jego fragmentu z niskocząsteczkowymi ligandami posiadającymi właściwości fluorescencyjne [7]. Wprowadzenie takich związków do białka fuzyjnego, pozwala na precyzyjne ulokowanie fluorescencyjnego liganda po stronie białka reporterowego. Jednym z najczęściej stosowanych białek reporterowych jest alkilotransferaza O 6 -alkiloguaninowa przekształcająca pochodne O 6 -benzyloguaniny do kowalencyjnych koniugatów. Ligandy będące fluorescencyjnymi pochodnymi nazywane są ligandami SNAP. Innym, analogicznym przykładem białka reporterowego jest dehalogenaza haloalkilowa, wiążąca kowalencyjnie pochodne chloroalkilowe. Fluorescencyjnie zmodyfikowane pochodne chloroalkilowe noszą nazwę ligandów HALO. W każdym z wyżej wymienionych przykładów selektywne umiejscowienie fluoroforu wymaga dodania do sekwencji interesującego nas białka dużego białka reporterowego, które w licznych przypadkach jest większe od obiektu badań [8]. I tak monomeryczne białka fluorescencyjne posiadają masę cząsteczkową wynoszącą około 27 kda, masa białek SNAP i HALO to odpowiednio 21 i 33 kda. Użycie tak dużych makrocząsteczek fluorescencyjnych w wielu wypadkach ogranicza badania komórkowe lub zmienia natywne cechy badanych białek. Ponadto umiejscowienie barwnika fluorescencyjnego tylko w dwóch pozycjach (N- i C-terminalnych) ogranicza możliwość zastosowania wspomnianych powyżej białek fuzyjnych w wielu badaniach wykorzystujących techniki fluorescencyjne [8,9]. W 1998 roku grupa Rogera Tsiena opublikowała nową technikę regioselektywnego wybarwiania białek z zastosowaniem niskocząsteczkowych barwników biarsenowych, które selektywnie rozpoznają motywy czterocysteinowe (TC) w białkach [10]. Zarówno masa cząsteczkowa barwnika (najprostsze to Da) jak i sam motyw TC (~1kDa) nie powodują znaczącego zwiększenia masy cząsteczkowej znakowanego białka [9]. Rycina 1 przedstawia strukturę dwóch najwcześniej opracowanych barwników biarsnowych, zbudowanych na fluorescencyjnych platformach fluoresceiny i rezorufiny (FlAsH-EDT 2, ReAsH-EDT 2 ). W barwnikach tych dwa atomy arsenu wprowadzone są w pozycjach 4 i 5, co powoduje ich prostopadłe ułożenie względem cząsteczki fluoroforu jak motywu TC. Związki arsenoorganiczne wykazują wysokie powinowactwo do atomów siarki i to ta cecha jest kluczem do sukcesu tej techniki. Oba atomy arsenu zablokowane są w swojej wyjściowej formie przez niskocząsteczkowy 1,2-dimerkaptoetan (EDT), który Rycina 1. Przykłady struktur i fluorescencyjna modyfikacja białek z udziałem najpopularniejszych barwników biarsenowych, FlAsH-EDT 2 oraz ReAsH-EDT 2. TC oznacza motyw czterocysteinowy w białku. ogranicza ich niepożądane reakcje. Atomy arsenu znajdujące się w odległości ok. 4,8 Å od siebie wiążą się bardzo mocno z motywem CCXXCC, w którym cztery atomy siarki pochodzące z reszt cysteinowych wyeksponowane są tak, by selektywnie wiązać się z dwoma atomami arsenu, jak to przedstawiono na rycinie 1. Należy tu wspomnieć, że powinowactwo motywu TC do związków biarsenowych (K d ~ M) jest kilka rzędów wyższe niż do EDT [11]. Z tego właśnie powodu zablokowane cząsteczkami dimerkaptoetanu atomy arsenu bardzo łatwo i szybko wymieniają się na motyw TC. Szybkość reakcji w oczywisty sposób zależy od stężeń reagentów, ale zwykle produkt reakcji w mikrolub submikromolowym stężeniu, powstaje w przedziale od kilku do kilkudziesięciu minut [12]. Szybkość powstawania kompleksu odróżnia metodę Tsiena od metod opisywanych powyżej, w których fluorescencja pojawia się po znacznie dłuższym czasie [1,10-12]. Niezwykłą cechą barwników biarsenowych, rozróżniającą je od innych ligandów jest to, że w postaci niezwiązanej z motywem TC, czyli zablokowanych cząsteczkami EDT, nie wykazują właściwości fluorescencyjnych. Przywracane są one gwałtownie po związaniu się z motywem TC [9]. Zjawisko to tłumaczy się tym, że pochłonięta przez barwnik energia wytracana jest na rotację EDT wokół atomów arsenu, co w przypadku kompleksu z motywem TC jest niemożliwe. Blokada steryczna i brak możliwości rotacji powodują, że energia wydzielana jest w postaci promieniowania. Niezwykle istotną cechą tej metody jest odwracalność wiązania z motywem TC. Produkt rozdysocjowuje pod wpływem wyższego, zazwyczaj milimolowego stężenia EDT. Cecha ta jest wykorzystywana głównie w określaniu powinowactwa do białka z motywem TC oraz w aplikacjach biotechnologicznych [9]. W przypadku metody biarsenowej należy pamiętać, że choć jest ona stosunkowo prosta w zastosowaniu, to jednak klasyczne białko fuzyjne z GFP bądź z jego odmianami może być obrazowane bez żadnych dodatkowych reakcji, co jest niewątpliwie zaletą białek fluorescencyjnych [1,5,6]. Postępy Biochemii 60 (1)

3 PROJEKTOWANIE BARWNIKÓW BIARSENOWYCH Barwniki biarsenowe syntezowane są dwuetapowo. W pierwszym etapie syntezy do wyjściowego fluoroforu podstawiane są atomy rtęci w pozycjach 4 i 5, które w kolejnym etapie wymieniane są na arsen w reakcji transmetalacji, a następnie blokowane EDT. Alternatywnie do EDT jako blokadę stosuje się BAL (2,3-dimerkaptopropanol). Pierwsza generacja barwników biarsenowych ograniczała się głównie do FlAsH-EDT 2 i ReAsH-EDT 2. W wyniku dalszych prac powstawały kolejne związki biarsenowe budowane na różnych platformach fluorescencyjnych różniących się właściwościami fizykochemicznymi, w tym barwą emitowanego promieniowania. Rycina 2a prezentuje kilka przykładów barwników biarsenowych zbudowanych na różnych platformach fluorescencyjnych. Tabela 1 przedstawia wartości długości fal wzbudzenia i emisji po związaniu do odpowiednich motywów TC, wydajności kwantowe oraz molowe współczynniki absorpcji barwników. Obecnie znane są barwniki biarsenowe, które emitują po związaniu się do metki powinowactwa promieniowanie elektromagnetyczne od 430 nm (niebieskie) do ponad 600 nm (czerwone) [9]. Na szczególną uwagę zasługuje tu biarsenowy barwnik oparty na platformie Cy3 (AsCy3-EDT 2 ), w którym dwa atomy arsenu są oddalone od siebie znacznie bardziej niż w przypadku FlAsH-EDT 2 [13]. Odległość ta wynosi 14,5 Å i uniemożliwia wydajne wiązanie się do motywu CCXXCC. Aby wiązanie było możliwe, opracowano inną specyficzną metkę rozpoznającą ten barwnik (szczegóły poniżej). Warto wspomnieć, że możliwość uzyskania różnych barw białek z zastosowaniem tej techniki pozwala na konstruowanie par FRET zarówno pomiędzy innymi fluoroforami, na przykład białkami fluorescencyjnymi [14], jak również pomiędzy różniącymi się od siebie barwnikami biarsenowymi [15]. Platformy fluorescencyjne ze względu na swoją budowę, mogą być różnorodnie modyfikowane chemicznie. Jednoczesne umiejscowienie ugrupowania biarsenowego i dodatkowych grup funkcyjnych, takich jak np. grupa aminowa czy karboksylowa (CrAsH-EDT 2 ) pozwala na różnorodne wykorzystanie tej klasy związków [9]. Rycina 2b przedstawia kilka przykładów związków biarsenowych, posiadających element selektywnie wiążący jony Ca 2+, które modulują emisję fluoroforu biarsenowego w kompleksie (CaGF) [16,17], biotynę (biotin-flash) czy fotoczuły linker (TRAP) [18]. Ten ostatni związek znalazł zastosowanie w fotoaktywowanym wiązaniu poprzecznym białek partnerskich. W metodzie tej jedno z białek zawiera motyw TC, do którego wiąże się selektywnie związek biarsenowy, którego aktywacja promieniowaniem UV prowadzi do kowalencyjnego związania się z drugim białkiem partnerskim [18]. Połączenie barwnika biarsenowego z cząsteczką biotyny pozwala na selektywną heterodimeryzację białek posiadających metkę TC oraz przykładowo streptawidynę, selektywnie wiążącą biotynę [19]. Prosta aktywacja grupy aminowej lub karboksylowej barwnika biarsenowego i związanie go do podłoża stałego, takiego jak żywica czy dwutlenek krzemu, pozwala na wykorzystanie tej klasy związków w selektywnym oczyszczaniu białek na tymże podłożu. Oczyszczanie białek jest tu możliwe dzięki odwracalności wiązania TC- -związek biarsenowy w obecności nadmiaru EDT lub BAL [11]. Modyfikacja grupy karboksylowej barwnika FlAsH- -EDT 2 pozwala na utworzenie spirolaktamu (Ryc. 2b). Taka modyfikacja prowadzi do wygaszenia fluorescencji nawet po związaniu spirolaktamu do motywu TC. Pozwala ona natomiast na wykorzystanie platformy fluoresceinowej jako wysięgnika w łączeniu się z innymi fluoroforami [20] lub w wydajniejszym oczyszczaniu białek [21]. Powiązanie ze sobą dwóch barwników FlAsH-EDT 2, poprzez krótki PEG pozwala na dimeryzację białek, choć metoda ta jest ograniczona tylko do białek oddziałujących ze sobą i zawierających motyw TC [22]. Przyłączenie do platformy Cy3-EDT 2 innego barwnika fluorescencyjnego (np. Cy5) pozwala na uzyskanie wysokorozdzielczej sondy do badań mikroskopowych, w której wykorzystuje się wewnątrzcząsteczkowy FRET [23]. Przy projektowaniu barwników biarsenowych należy wspomnieć, że obecnie na rynku dostępne są jedynie dwa Tabela 1. Właściwości spektralne barwników biarsenowych w kompleksach z różnymi sekwencjami TC [9]. λ wz, λ em i Φ oznaczają odpowiednio długość fali wzbudzenia, długość fali maksymalnej emisji oraz wydajność kwantową kompleksu. Nazwa barwnika Platforma chemiczna Sekwencja TC FlAsH-EDT2 ReAsH-EDT2 fluoresceina rezorufina WEAAAREACCRECCARA WDCCPGCCK FLNCCPGCCMEP WEAAAREACCRECCARA FLNCCPGCCMEP YLNCCPGCCMEP WLNCCPGCCMEP HLNCCPGCCMEP FLNCCPGCCKTF λ wz / λ em (nm) 508/ / / / / / / /608 ε max (M -1 cm -1 ) Wydajność kwantowa Φ 0,49 0,71 CHoXAsH-EDT2 2,7-dichloro-3,6-dihydroksyksanton WEAAAREACCRECCARA 380/430 0,35 CrAsH-EDT2 5(6)-karboksyfluoresceina AREACCPGCCK 495/534 F2FlAsH-EDT2 2,7 -difluorofluoresceina FLNCCPGCCMEP 500/522 F4FlAsH-EDT2 3,4,5,6-tetrafluorofluoresceina FLNCCPGCCMEP 528/544 Cl2FlAsH-EDT2 2,7 -dichlorofluoresceina FLNCCPGCCMEP 520/539 AsCy3-EDT2 Cy3 CCKAEAACC 560/ ,28 BArNile-EDT2 9-amino-5-benzofenoksazon AEAAAREACCRECCARA 520/604 0,48 0,094 0,034 0,2 0,

4 Rycina 2. Struktury barwników oraz prekursorów biarsenowych: a) barwniki biarsenowe o szerokiej palecie barw (Tab. 1); b) związki o podwójnej funkcji oparte o CrAsH- -EDT 2 ; c) spirolaktam SplAsH-dansyl; d) podwójny barwnik FlAsH-EDT 2 połączony hydrofilowym linkerem. klasyczne barwniki biarsenowe, czerwony ReAH-EDT 2 i zielony FlAsH-EDT 2. Stanowią one część zestawu do barwienia, w którego skład wchodzą również wektory kodujące metki TC. Cena takich zestawów jest dość wygórowana, co skłania wielu użytkowników do samodzielnej syntezy. Poza wyżej wspomnianymi barwnikami biarsenowymi są obecnie niedostępne inne prekursory czy gotowe produkty biarsenowe. MOTYWY SELEKTYWNIE WIĄŻĄCE BARWNIKI BIARSENOWE Metoda regioselektywnej modyfikacji białek z użyciem związków biarsenowych wymaga przygotowania białka tak, aby posiadało dogodne miejsce wiążące barwnik. Wart podkreślenia jest fakt, że obecność zredukowanych reszt cysteinowych czy nawet sekwencji -CC- w białkach jest niewystarczająca by barwnik przyłączył się trwale. Jedynie motyw zawierający cztery reszty cysteinowe w odpowiedniej odległości od siebie pozwala na wydajną kowalencyjną modyfikację. Reszty cysteinowe muszą być wyeksponowane na powierzchni białka w parach tak, by mogły wysycić sferę koordynacji obu atomów arsenu w stechiometrii dwie reszty na jeden atom arsenu. Chronologicznie ujmując pierwszym motywem czterocysteinowym (TC) użytym w opisywanej metodzie był modelowy, helikalny motyw -EAAAREACCRECCRA- bazujący na znanym wcześniej motywie (EAAAR) n tworzącym trwałe helisy [10]. Substytucja reszt Ala na Cys nie zaburza tworzenia helisy, a odległości pomiędzy resztami wiążącymi dwa atomy arsenu wpasowują się w odległość pomiędzy skrętami α-helisy (Ryc. 3a). Warto podkreślić, że w sekwencjach białek motyw CCXXCC jest wielką rzadkością, więc nie ma tu obawy o tło związane z wybarwianiem innych białek niż te, które posiadają właściwy motyw TC. Ograniczenie metody jedynie do motywu helikalnego powodowało wiele problemów, takich jak słabe barwienie w różnych liniach komórkowych lub wysokie tło fluorescencji. Kolejna próba optymalizacji motywu TC polegała na zastąpieniu helikalnego motywu krótkim peptydem -CCPGCC-, co spowodowało wyraźne zwiększenie powinowactwa pomiędzy związkami biarsenowymi a tymże motywem. Przełożyło się to także na wzrost kontrastu wybarwianych komórek. Za zwiększenie powinowactwa odpowiada tu głównie reszta proliny i glicyny (-PG-) występująca powszechnie w pętlach i zwrotach białkowych. Na podstawie pomiarów kinetycznych, stała K d oddziaływania -CCPGCC- z platformą biarsenową (bez blokad EDT) została określona na 4 pm [11]. Kolejny krok w optymalizacji motywu TC polegał, nie tyle na zwiększeniu już wysokiego powinowactwa, ale co ważne dla badań komórkowych, na zwiększeniu wydajności kwantowej kompleksu oraz odporności na EDT, który Postępy Biochemii 60 (1)

5 standardowo dodawany jest po etapie barwienia do medium komórkowego w celu zmniejszenia niespecyficznego wybarwienia. Na podstawie sortowania komórek zawierających motyw TC otoczony przez różne reszty aminokwasowe wykazano, że spośród linowych sekwencji z barwnikami biarsenowymi najwydajniej wiąże się 12-aminokwasowy motyw FLNCCPGCCMEP [24]. Obecnie jest to najpowszechniej wykorzystywana sekwencja do umieszczania motywu TC w terminalnych regionach białka. Warto wspomnieć, że oprócz krótkich motywów w barwieniu białek wykorzystywano również układy tandemowe, gdzie za pierwszym motywem TC ustawiano kolejne. Poprawia to co prawda kontrast, ze względu na większą ilość wiążących się barwników biarsenowych na jedną cząsteczkę białka, powoduje jednak inne komplikacje związane z obecnością dużej ilości reszt Cys w białku [25]. Zamiana łącznika -PG- pomiędzy parami reszt cysteinowych, prowadzi do nieco odmiennej specyfiki w oddziaływaniu platform FlAsH i ReAsH z motywem TC, co wykorzystane jest w równoległym barwieniu dwóch odmiennych białek [26, 27]. WPROWADZANIE MOTYWU TC DO BIAŁEK Jak opisano wyżej, sukces w wybarwianiu białek z użyciem barwników biarsenowych związany jest głównie z optymalnym dla tej modyfikacji motywem TC. W wielu przypadkach zwiększenie masy białka lub wydłużenie sekwencji poprzez dodanie liniowej sekwencji TC nie jest pożądane. Niezwykłą zaletą opisywanej metody jest możliwość umieszczenia optymalnego motywu TC na powierzchni białek wkomponowując się w poszczególne elementy struktury drugorzędowej. W poprzednim rozdziale wskazano na możliwość umieszczania motywu TC w strukturze helikalnej białek. Wprowadzenie motywu TC w strukturę kartki-β wymaga znajomości struktury przestrzennej białka (Ryc. 3b). Jednak nawet w takim wypadku, wydajna modyfikacja białka z użyciem barwników biarsenowych wymaga wielu mutacji tak, by uzyskać optymalne miejsce wiązania się atomów arsenu [28,29]. Najczęściej wybieranym motywem strukturalnym białek do wprowadzania czterech reszt cysteinowych jest pętla lub β-zakręt, który strukturalnie odpowiada zoptymalizowanej sekwencji CCPGCC (Ryc. 3c) [30]. Co ważne, istnieje możliwość użycia tego motywu również przy w pełni nieznanej strukturze trójwymiarowej białka, co rozszerza możliwość aplikacji całej metody [31,32]. Kolejnym sposobem lokowania motywu TC jest splot dwóch struktur drugorzędowych posiadających po dwie reszty cysteinowe w każdym z motywów. Warunkiem utworzenia dogodnego motywu TC jest odpowiednia odległość pomiędzy atomami siarki tak, by utworzyły charakterystyczny równoległobok wymagany przy wiązaniu się barwników biarsenowych (Ryc. 3d). Przy konstrukcji takiego motywu mogą zostać wykorzystane zarówno α-helisy jak i kartki-β [33,34]. Warto podkreślić, że omówiona powyżej architektura białkowa posiada spory potencjał aplikacyjny w badaniach oddziaływań, oligomeryzacji, aktywności białek, zmian konformacji, rozpoznawania struktur itd. [9]. WIZUALIZACJA BIAŁEK W KOMÓRKACH Spośród wszystkich zastosowań, barwniki biarsenowe wykorzystywane są najczęściej do wizualizacji białek z motywem TC w żywych komórkach. Dzięki swojemu małemu rozmiarowi są częstokroć jedynym sposobem by precyzyjnie określić lokalizację oraz komórkowe losy białek [35]. Mimo, że sekwencje CCXXCC są niezwykle rzadko spotykane w białkach różnych organizmów, to jednak największym problemem opisywanej techniki jest wysokie tło podczas barwienia związkami biarsenowymi, spowodowane niespecyficznym wiązaniem się do reszt cysteinowych innych białek. Najbardziej narażone na niespecyficzne barwienie związkami biarsenowymi są białka posiadające wyeksponowane dwie reszty cysteinowe obok siebie (-CC-) w sekwencji aminokwasowej [36]. Niedawno opublikowany protokół wskazuje na to, że niewystarczające płukanie komórek z EDT lub BAL po ich barwieniu powoduje wysokie tło i spadek kontrastu. Sugerowane stężenie EDT do płukania komórek, obniżające tło spowodowane niespecyficznym barwieniem, wynosi 250 µm, natomiast w przypadku BAL jest to 100 µm [37]. Alternatywnie można użyć niższe stężenie EDT i wydłużyć czas inkubacji [10]. Rycina 4 przedstawia barwienie komórek HEK293T po ich wcześniejszej transfekcji wektorem kodującym histon H2B z C-terminalną metką TC z zastosowaniem FlAsH-EDT 2 jako barwnika. W tym wypadku do barwienia komórek użyto standardowo 500 nm stężenie FlAsH-EDT 2 wraz z 12,5 µm EDT przez jedną godzinę. Barwniki biarsenowe nie mogą być dodawane bezpośrednio do medium zawierającego serum ze względu na spore powinowactwo do BSA [37]. Gdy modyfikacji fluorescencyjnej mają ulec zewnątrzkomórkowe białka błonowe, wówczas do barwienia sugeruje się zastosować nieprze- Rycina 3. Motywy czterocysteinowe (TC) wprowadzane w drugorzędowe struktury białek: a) α-helisa; b) β-kartka; c) β-zakręt; d) motyw strukturalny utworzony z dwóch α-helis. Kolor szary oznacza atom siarki reszt cysteinowych niezbędnych dla wiązania barwników biarsenowych. Pomarańczowa linia prezentuje charakterystyczny równoległobok optymalny dla modyfikacji biarsenowej. Rycina 4. Komórki HEK293T transformowane wektorem kodującym histon H2B ze zlokalizowaną na końcu karboksylowym metką TC wybarwiane 500 nm FlAsH-EDT 2 ; a) zdjęcie komórek w świetle widzialnym; b) komórki inkubowane z barwnikiem po odpłukaniu 250 μm EDT widziane pod mikroskopem fluorescencyjnym; c) nałożenie zdjęć a i b ukazujące fluorescencję białka w jądrze komórkowym

6 puszczalne przez błony barwniki biarsenowe takie jak CrAsH-EDT 2 (biarsenowa karboksyfluoresceina) czy sflash-edt 2 (biarsenowa sulfofluoresceina) [11,38]. Należy wspomnieć, że metoda barwienia żywych komórek z udziałem barwników biarsenowych nie ogranicza się jedynie do komórek adherentnych i ssaczych [9]. Z powodzeniem stosuje się tą technikę w barwieniu komórek roślinnych [39], Dictyostelium [40], drożdży [41], bakterii [42] oraz wirusów [43]. BARWNIKI BIARSENOWE W BADANIACH STRUKTURALNYCH BIAŁEK Barwniki biarsenowe znalazły zastosowanie w wielu badaniach związanych z denaturacją czy agregacją białek. W pierwszej publikacji na ten temat FlAsH-EDT 2 został użyty jako znacznik stanu sfałdowania białka CRABP I w komórkach bakteryjnych [31]. Eksperyment przeprowadzony z użyciem komórek bakteryjnych, pokazał zasadnicze różnice pomiędzy denaturacją białek w komórkach i w typowych warunkach in vitro. W innych badaniach nad CRABP I barwnik posłużył do wskazania, że sekwencja poly(q) powoduje strukturalne zmiany i agregację białka. Barwnik FlAsH-EDT 2 został użyty również do monitorowania komórkowej lokalizacji agregatów α-synukleiny. Jednoczesne zastosowanie barwnika zielonego i czerwonego pozwoliło na obserwację FRET towarzyszącego procesowi agregacji [44]. W związku z tym, że fluorescencja barwników biarsenowych jest zależna od strukturalnego ułożenia motywu TC, a także od otoczenia w środowisku dokowania, związki te są powszechnie wykorzystywane do badania zmian konformacyjnych w białkach. W analizie konformacyjnej najczęściej wykorzystywany jest ReAsH-EDT 2 ponieważ jest on bardziej wrażliwy na zmianę otoczenia środowiska. Związek ten był wielokrotnie stosowany w badaniach zmian konformacyjnych kalmoduliny zachodzących pod wpływem wiązania lub dysocjacji jonów Ca 2+ [29]. FlAsH-EDT 2 został natomiast zastosowany do pomiarów anizotropii pojedynczej cząsteczki kalmoduliny w nanosekundowej skali [45]. W innych badaniach związki biarsenowe wykorzystano do pomiaru oddziaływania dwóch białek posiadających połówkowy motyw TC. Ich oddziaływanie odtwarza kompletny motyw TC, do którego wiąże się barwnik biarsenowy emitując charakterystyczne promieniowanie [33]. Natomiast badania nad powstawaniem oligomeru białka p53 wykazały, że barwniki biarsenowe są znacznie czulsze niż stosowana dotąd reszta tryptofanowa [46]. Większość zastosowań barwników biarsenowych opiera się na wykorzystaniu precyzyjnego dokowania barwnika w białku i wykorzystaniu jego fluorescencji do pomiarów Rycina 5. Rodzaje kontroli aktywności białek przez barwniki biarsenowe: a) mechanizm CALI/FALI dezaktywacja białka poprzez uszkodzenia tlenem singletowym generowanym przez silne naświetlanie barwnika; b) alosteryczne hamowanie aktywności przez wiązanie barwnika; c) alosteryczna aktywacja barwnikiem. Zielony owal ilustruje barwnik FlAsH. Postępy Biochemii 60 (1)

7 FRET. I tak, np. FRET pomiędzy FlAsH a fluorescencyjnie zmodyfikowanym ATP i ADP został wykorzystany do badań strukturalnych oraz dynamiki 50 kda domeny miozyny V [47]. Częściej jednak związki biarsenowe są wykorzystywane jako donory lub akceptory w parach FRET z białkami fluorescencyjnymi. Takie podejście ma liczne zalety w porównaniu do pary FRET dwóch białek fluorescencyjnych przede wszystkim FRET pojawia się dopiero po dodaniu barwnika biarsenowego oraz zmniejsza znacząco rozmiar fluoroforu. Dość mocno eksplorowanym tematem są tu badania nad zmianami konformacyjnymi receptorów białek G (GPCR) [14]. W badaniach konformacyjnych najczęściej wykorzystywaną parą jest FlAsH-CFP (z cyjanowym białkiem fluorescencyjnym) [48] choć używana jest również para FlAsH-YFP (z żółtym białkiem fluorescencyjnym) [49]. KONTROLA AKTYWNOŚCI BIAŁEK Z UŻYCIEM BARWNIKÓW BIARSENOWYCH Mimo, że związki biarsenowe zostały stworzone z myślą o alternatywnym barwieniu białek w komórkach to jednak możliwości ich wykorzystania są znacznie szersze. Jednym z ciekawych zastosowań opisywanych barwników jest kontrola aktywności białek, która może być przeprowadzona na trzy sposoby (Ryc. 5). Pierwszy z nich opiera się na mechanizmie CALI/FALI (inaktywacja świetlna chromoforu/ fluoroforu). Mechanizm działania CALI/FALI nie jest w pełni poznany, ale prawdopodobnie fluorofor (w tym wypadku barwnik biarsenowy) wystawiony na działanie silnego promieniowania elektromagnetycznego, generuje tlen singletowy znacznie wydajniej niż białka fluorescencyjne. Precyzyjne ulokowanie fluoroforu w miejscu aktywnym białka lub w miejscu strategicznym dla jego aktywności, poprzez umieszczenie tam motywu TC, powoduje największe uszkodzenie w najbliższej okolicy barwnika (Ryc. 5a). Użycie FlAsH-EDT 2 do inaktywacji synaptotagaminy I u Drosophila spowodowało spadek aktywności białka o 66% w zaledwie 10 sekund. Co istotne, uszkodzeniu uległo tylko to białko, na którym znajdował się barwnik FlAsH [50]. W innym przypadku ReAsH-EDT 2 użyty został do barwienia koneksyny 43 w szczelinach komórkowych i spowodował jej dezaktywacje w 95% po 25 sekundach [51]. Warta podkreślenia jest informacja, że przy typowej wizualizacji białek z udziałem barwników biarsenowych, nie stosuje się tak intensywnego promieniowania jak w CALI/FALI. Nie ma więc powodów do obaw związanych z uszkodzeniem białek wyznakowanych barwnikami biarsenowymi. Kolejny sposób regulacji aktywności białek przez barwniki biarsenowe, polega na zmianach alosterycznych białka pod wpływem wiązania się barwnika. Warto zaznaczyć, że w tym wypadku aktywność białka, np. enzymu może być hamowana (Ryc. 5b) lub pobudzona (Ryc. 5c) po przyłączeniu się fluoroforu. Umiejscowienie motywu TC w pętli białkowej lub w innych drugorzędowych elementach strukturalnych poprzez zamianę niekonserwowanych aminokwasów na resztę Cys nie powoduje zazwyczaj drastycznych zmian w aktywności białek. Szczegółowo przebadanym obiektem jest tu fosfataza tyrozynowa, w przypadku której wprowadzenie barwnika w najbardziej optymalną pozycję zakończyło się zmniejszeniem aktywności enzymu aż 12 razy [52]. ZASTOSOWANIE BARWNIKÓW BIARSENOWYCH W ANALITYCE BIOCHEMICZNEJ Wiązanie się barwników biarsenowych do motywów TC, jak omówiono wyżej, jest bardzo wydajne, a oddziaływanie na tyle silne, że wyznakowane białka można swobodnie rozdzielać z użyciem szeregu metod chromatograficznych i elektroforetycznych. Popularnym przykładem jest tu możliwość rozdziału zmodyfikowanych białek z użyciem SDS- -PAGE, co nie prowadzi do uszkodzenia barwnika mimo denaturacji białka. Poziom detekcji szacuje się pomiędzy 1 a 5 ng [53]. Czułość detekcji jest jeszcze większa, gdy stosuje się elektroforezę kapilarną z detekcją fluorescencji (10-20 mola kompleksu FlAsH) [54]. Mocne i jednocześnie odwracalne wiązanie się barwników biarsenowych do motywu TC znalazło swoje zastosowanie w chromatografii powinowactwa używanej przy oczyszczaniu białek. Dane literaturowe prezentują dwa sposoby immobilizacji barwnika na złożu agarozowym z immobilizowanym NHS (N-hydroksysukcynimid) z użyciem CrAsH-EDT 2 [11] lub spirolaktamu FlAsH-EDT 2 [21]. Elucja białek z metką TC ze złoża następuje przy zastosowaniu milimolowych stężeń EDT, a oczyszczone białka wykazują 90% czystości, a więc więcej niż przy użyciu systemu Ni 2+ -NTA. Więcej informacji na temat wykorzystania barwników biarsenowych znajduje się w naszym ostatnim artykule przeglądowym poświęconym rozwojowi metod badawczych opartych o tę klasę związków [9]. PODSUMOWANIE Chemiczna oraz specyficzna względem motywów białek modyfikacja jest obecnie szeroko rozwijanym kierunkiem, zarówno w kontekście izolowanych obiektów, jak i w badaniach komórkowych. Możliwość zastosowania szerokiej palety barw związków, które uzyskują swoją fluorescencję dopiero po związaniu się do białka docelowego wzbogaca skalę zastosowań. Mała masa cząstkowa barwników oraz niewielka długość metki TC stawiają opisywaną metodę wyżej niż znakowanie białek z użyciem białek fluorescencyjnych lub białek reporterowych selektywnie modyfikowanych przez fluorogeniczne ligandy. Precyzja lokowania barwnika na powierzchni drugorzędowych struktur białek pozwala na badanie ich zmian konformacyjnych, agregacji, fałdowania czy oddziaływania z innymi molekułami z wykorzystaniem szeregu nowoczesnych technik fluorescencyjnych. Odwracalność wiązania barwnik biarsenowy - motyw TC czyni tę metodę bardziej uniwersalną, co odzwierciedla się w badaniach nad regulacją aktywności białek. Podkreślenia wymaga również fakt, że wciąż tworzone są nowe narzędzia oparte na biarsenowej modyfikacji białek wykorzystywane w biologii molekularnej czy analityce biochemicznej. PIŚMIENNICTWO 1. Tsien R (2007) Roger Tsien: bringing color to cell biology. A passion for chemistry, color, and conversations with cells is what drives Roger Tsien. Interview by Ruth Williams. J Cell Biol 179: Terai T, Nagano T (2013) Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch 465: Grecco HE, Verveer PJ (2011) FRET in cell biology: still shining in the age of super-resolution? Chemphyschem 12:

8 4. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2: Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY (2006) The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science 312: Wydro M, Lehmann P (2004) Białko zielonej fluorescencji (GFP) - struktura, własności i zastosowanie w biologii molekularnej roślin. Postepy Biochem 50: Crivat G, Taraska JW (2012) Imaging proteins inside cells with fluorescent tags. Trends Biotechnol 30: Hinner MJ, Johnsson K (2010) How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr Opin Biotechnol 21: Pomorski A, Krężel A (2011) Exploration of biarsenical chemistrychallenges in protein research. Chembiochem 12: Griffin BA, Adams SR, Tsien RY (1998) Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science 281: Adams SR, Campbell RE, Gross LA, Martin BR, Walkup GK, Yao Y, Llopis J, Tsien RY (2002) New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc 124: Pomorski A, Otlewski J, Krężel A (2010) The High Zn(II) Affinity of the Tetracysteine Tag Affects Its Fluorescent Labeling with Biarsenicals. Chembiochem 11: Cao H, Xiong Y, Wang T, Chen B, Squier TC, Mayer MU (2007) A red cy3-based biarsenical fluorescent probe targeted to a complementary binding peptide. J Am Chem Soc 129: Hoffmann C, Gaietta G, Bunemann M, Adams SR, Oberdorff-Maass S, Behr B, Vilardaga JP, Tsien RY, Ellisman MH, Lohse, MJ (2005) A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nat Methods 2: Spagnuolo CC, Vermeij RJ, Jares-Erijman EA (2006) Improved photostable FRET-competent biarsenical-tetracysteine probes based on fluorinated fluoresceins. J Am Chem Soc 128: Tour O, Adams SR, Kerr RA, Meijer RM, Sejnowski TJ, Tsien RW, Tsien RY (2007) Calcium Green FlAsH as a genetically targeted smallmolecule calcium indicator. Nat Chem Biol 3: Pomorski P (2012) Zobaczyć sygnał - metody obrazowania zmian stężenia jonów wapnia w komórce. Postepy Biochem 58: Yan P, Wang T, Newton GJ, Knyushko TV, Xiong Y, Bigelow DJ, Squier TC, Mayer MU (2009) A targeted releasable affinity probe (TRAP) for in vivo photocrosslinking. Chembiochem 10: Taguchi Y, Shi ZD, Ruddy B, Dorward DW, Greene L, Baron GS (2009) Specific biarsenical labeling of cell surface proteins allows fluorescentand biotin-tagging of amyloid precursor protein and prion proteins. Mol Biol Cell 20: Bhunia AK, Miller SC (2007) Labeling tetracysteine-tagged proteins with a SplAsH of color: a modular approach to bis-arsenical fluorophores. Chembiochem 8: Ying LQ, Branchaud BP (2011) Purification of tetracysteine-tagged proteins by affinity chromatography using a non-fluorescent, photochemically stable bisarsenical affinity ligand. Bioconjug Chem 22: Stafforst T (2012) A FlAsH reporter for protein-dimerization triggers. Chembiochem 13: Fu N, Xiong Y, Squier TC (2012) Synthesis of a targeted biarsenical Cy3-Cy5 affinity probe for super-resolution fluorescence imaging. J Am Chem Soc 134: Martin BR, Giepmans BN, Adams SR, Tsien RY (2005) Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nat Biotechnol 23: Van Engelenburg SB, Nahreini T, Palmer AE (2010) FACS-based selection of tandem tetracysteine peptides with improved ReAsH brightness in live cells. Chembiochem 11: Robia SL, Flohr NC, Thomas DD (2005) Phospholamban pentamer quaternary conformation determined by in-gel fluorescence anisotropy. Biochemistry 44: Zurn A, Klenk C, Zabel U, Reiner S, Lohse MJ, Hoffmann C (2010) Sitespecific, orthogonal labeling of proteins in intact cells with two small biarsenical fluorophores. Bioconjug Chem 21: Krishnan B, Gierasch LM (2008) Cross-strand split tetra-cys motifs as structure sensors in a beta-sheet protein. Chem Biol 15: Goodman JL, Fried DB, Schepartz A (2009) Bipartite tetracysteine display requires site flexibility for ReAsH coordination. Chembiochem 10: Madani F, Lind J, Damberg P, Adams SR, Tsien RY, Graslund AO (2009) Hairpin structure of a biarsenical-tetracysteine motif determined by NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 131: Ignatova Z, Gierasch LM (2004) Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc Natl Acad Sci USA 101: Chen VL, Bishop AC (2010) Chemical rescue of protein tyrosine phosphatase activity. Chem Commun (Camb) 46: Luedtke NW, Dexter RJ, Fried DB, Schepartz A (2007) Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlAsH and ReAsH. Nat Chem Biol 3: Dexter RJ, Schepartz A (2010) Direct visualization of protein association in living cells with complex-edited electron microscopy. Angew Chem Int Ed Engl 49: Zhang XW, Yan XJ, Zhou ZR, Yang FF, Wu ZY, Sun HB, Liang WX, Song AX, Lallemand-Breitenbach V, Jeanne M, Zhang QY, Yang HY, Huang QH, Zhou GB, Tong JH, Zhang Y, Wu JH, Hu HY, de The H, Chen SJ, Chen Z (2010) Arsenic trioxide controls the fate of the PML- RARalpha oncoprotein by directly binding PML. Science 328: Bohme I, Morl K, Bamming D, Meyer C, Beck-Sickinger AG (2007) Tracking of human Y receptors in living cells-a fluorescence approach. Peptides 28: Hoffmann C, Gaietta G, Zurn A, Adams SR, Terrillon S, Ellisman MH, Tsien RY, Lohse MJ (2010) Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat Protoc 5: Cao H, Chen B, Squier TC, Mayer MU (2006) CrAsH: a biarsenical multi-use affinity probe with low non-specific fluorescence. Chem Commun (Camb) Estevez JM, Somerville C (2006) FlAsH-based live-cell fluorescent imaging of synthetic peptides expressed in Arabidopsis and tobacco. Biotechniques 41: , Hwang RD, Chen CC, Knecht DA (2009) ReAsH: another viable option for in vivo protein labelling in Dictyostelium. J Microsc 234: Andresen M, Schmitz-Salue R, Jakobs S (2004) Short tetracysteine tags to beta-tubulin demonstrate the significance of small labels for live cell imaging. Mol Biol Cell 15: Romantsov T, Stalker L, Culham DE, Wood JM (2008) Cardiolipin controls the osmotic stress response and the subcellular location of transporter ProP in Escherichia coli. J Biol Chem 283: Pereira CF, Ellenberg PC, Jones KL, Fernandez TL, Smyth RP, Hawkes DJ, Hijnen M, Vivet-Boudou V, Marquet R, Johnson I, Mak J (2011) Labeling of multiple HIV-1 proteins with the biarsenical-tetracysteine system. PLoS One 6: e Roberti MJ, Bertoncini CW, Klement R, Jares-Erijman EA, Jovin TM (2007) Fluorescence imaging of amyloid formation in living cells by a functional, tetracysteine-tagged alpha-synuclein. Nat Methods 4: Li J, Bigelow DJ, Squier TC (2004) Conformational changes within the cytosolic portion of phospholamban upon release of Ca-ATPase inhibition. Biochemistry 43: Webber TM, Allen AC, Ma WK, Molloy RG, Kettelkamp CN, Dow CA, Gage MJ (2009) Conformational detection of p53 s oligomeric state by FlAsH Fluorescence. Biochem Biophys Res Commun 384: Sun M, Oakes JL, Ananthanarayanan SK, Hawley KH, Tsien RY, Adams SR, Yengo CM (2006) Dynamics of the upper 50-kDa domain of myosin V examined with fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem 281: Zurn A, Zabel U, Vilardaga JP, Schindelin H, Lohse MJ, Hoffmann C (2009) Fluorescence resonance energy transfer analysis of alpha 2a- Postępy Biochemii 60 (1)

9 adrenergic receptor activation reveals distinct agonist-specific conformational changes. Mol Pharmacol 75: Ziegler N, Batz J, Zabel U, Lohse MJ, Hoffmann C (2011) FRET-based sensors for the human M1-, M3-, and M5-acetylcholine receptors. Bioorg Med Chem 19: Marek KW, Davis GW (2002) Transgenically encoded protein photoinactivation (FlAsH-FALI): acute inactivation of synaptotagmin I. Neuron 36: Tour O, Meijer RM, Zacharias DA, Adams SR, Tsien RY (2003) Genetically targeted chromophore-assisted light inactivation. Nat Biotechnol 21: Zhang XY, Bishop AC (2007) Site-specific incorporation of allostericinhibition sites in a protein tyrosine phosphatase. J Am Chem Soc 129: Yang H, He J, Hu F, Zheng C, Yu Z (2010) Detection of Escherichia coli enoyl-acp reductase using biarsenical-tetracysteine motif. Bioconjug Chem 21: Kottegoda S, Aoto PC, Sims CE, Allbritton NL (2008) Biarsenical-tetracysteine motif as a fluorescent tag for detection in capillary electrophoresis. Anal Chem 80: Biarsenical probes for specific and multifunctional modification of proteins Artur Krężel Laboratory of Chemical Biology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 14a Joliot-Curie St., Wroclaw, Poland krezel@biotech.uni.wroc.pl Key words: fluorescence, biarsenical probe, tetracysteine tag, fluorescent modification, fluorescent protein, fluorescent probe ABSTRACT Chemical modifications of proteins are crucial for studying their functions, biophysical properties and cellular localization. The most important is the protein fluorescent modification utilized in biochemistry, molecular biology and medicinal diagnostics. Precision of fluorophore attachment in certain part of the protein or amino acid sequence is very important for the labeling and subsequent characterization or protein applications. One of the most important type of probes used for fluorescent protein labeling are biarsenical probes. They are not only to localize proteins in cell but based on their chemical properties they are widely applied for studying protein folding, degradation, control of the activity, protein inactivation with singlet oxygen, oligomerization and protein purification. Here, author presents principles of protein labeling with biarsenical probes with special attention to factors affecting proper protein modification. Review includes the most interesting applications of biarsenical probes in molecular biology, molecular diagnostics and analytical biochemistry