Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia nowotworów mechanizmy i zastosowania

Transkrypt

1 Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia nowotworów mechanizmy i zastosowania STRESZCZENIE Nowotwory są diagnozowane u ponad kilku milionów ludzi rocznie. Ze względu m.in. na słabą antygenowość jak i lekooporność większości nowotworów, PDT może stać się efektywną alternatywną, bądź uzupełniającą do chirurgii, metodą leczenia. PDT wymaga trzech elementów: fotouczulacza, źródła światła oraz tlenu. PDT jest z sukcesem stosowana w wielu klinikach na świecie, również w Polsce. Terapia ta jest wykorzystywana w leczeniu schorzeń onkologicznych (m.in. nowotwory głowy, szyi, płuc, przełyku, trzustki, pęcherza moczowego, narządu rodnego), jak i nieonkologicznych (liszaj twardzinowy, gronkowiec złocisty, brodawczakowatość). WPROWADZENIE METODA FOTODYNAMICZNA Pomimo ogromnego postępu w medycynie, wciąż wiele osób na świecie umiera z powodu zbyt późnej diagnozy lub braku skutecznych metod leczenia nowotworów (m.in. oporność wielolekowa komórek nowotworowych w chemioterapii stanowi poważny problem kliniczny). Metoda fotodynamiczna jest nową obiecującą techniką diagnozowania (PDD Photodynamic Diagnosis) i leczenia (PDT Photodynamic Therapy) nowotworów, która została zaakceptowana i jest obecnie stosowana w wielu klinikach [1]. Metoda ta cieszy się dużym uznaniem, ponieważ pozwala przede wszystkim na selektywne niszczenie tkanki nowotworowej bez zbędnych uszkodzeń tkanek zdrowych. Cechuje się znacznie mniejszymi efektami ubocznymi w porównaniu do standardowych terapii (chirurgia, radio- i chemioterapia) [2,3]. Poza zastosowaniami onkologicznymi PDD i PDT znalazły także zastosowanie w leczeniu wielu schorzeń nieonkologicznych [4]. Terapia fotodynamiczna (PDT) wymaga trzech składników [5]: fotouczulacza, który uczula tkankę nowotworową na działanie światła; źródła światła, zdolnego do wzbudzenia skumulowanego w tkance nowotworowej fotouczulacza źródło światła wzbudzającego musi być dobrane do stosowanego fotouczulacza (pasmo emisji źródła światła musi się pokrywać z pasmem absorpcji fotouczulacza jest to warunek zainicjowania reakcji fotochemicznej); tlenu rozpuszczonego w tkance. MECHANIZMY DZIAŁANIA Znane są dwa główne mechanizmy reakcji fotodynamicznej, które są ściśle uzależnione od stężenia tlenu w środowisku reakcji [5-7]. W przypadku obu typów mechanizmów początkowe reakcje przebiegają podobnie (Ryc. 1). W wyniku absorpcji fotonu (fotouczulacz naświetlany światłem o długości fali pokrywającej się z jego maksimum absorpcji) fotouczulacz przechodzi z singletowego, podstawowego stanu energetycznego ( 1 P 0 ) do wzbudzonego stanu singletowego ( 1 P * ). Część energii zostaje wypromieniowana w postaci kwantu fluorescencji (składowa diagnostyczna PDD), a część energii na skutek przejścia międzysystemowego (ISC) przeprowadza fotouczulacz do wzbudzonego stanu trypletowego ( 3 P * ) (składowa terapeutyczna PDT). Rycina 1. Reakcje zachodzące w mechanizmie typu I oraz II [5]. Agata Nowak-Stępniowska * Paulina Pergoł Alfreda Padzik-Graczyk Pracownia Biochemii, Instytut Optoelektroniki, Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa Pracownia Biochemii, Instytut Optoelektroniki, Wojskowa Akademia Techniczna, ul. Kaliskiego 2, Warszawa; tel.: (22) , agata_nowak_stepniowska@interia.pl Artykuł otrzymano 22 lipca 2012 r. Artykuł zaakceptowano 11 października 2012 r. Słowa kluczowe: metoda fotodynamiczna, fotouczulacze, reaktywne formy tlenu, nowotwory Wykaz skrótów: 5-ALA (ang. 5-aminolaevulinic acid) kwas 5-aminolewulinowy; CIN (ang. cervical intraepithelial neoplasia) wewnątrznabłonkowa neoplazja szyjki macicy; EPR (ang. enhanced vascular permeability and retention) wzmożona przepuszczalność naczyniowa oraz zatrzymywanie cząsteczek w tkance nowotworowej; MLA (ang. methyl ester of 5-ALA) ester metylowy kwasu 5-aminolewulinowego; PACT (ang. photodynamic antimicrobial chemotherapy) fotodynamiczna antybakteryjna chemioterapia; PDD (ang. photodynamic diagnosis) diagnostyka fotodynamiczna; PDT (ang. photodynamic therapy) terapia fotodynamiczna; ROS (ang. reactive oxygen specious) reaktywne formy tlenu; RRP (ang. recurrent respiratory papillomatosis) nawracająca brodawczakowatość układu oddechowego Postępy Biochemii 59 (1)

2 Rycina 2. Reakcje kolejnych redukcji anionorodnika ponadtlenkowego (w oparciu o [9], zmodyfikowano). W mechanizmie typu I (niskie stężenie tlenu w środowisku reakcji) zachodzą dalej następujące przemiany (Ryc. 1). Między wzbudzonym stanem trypletowym fotouczulacza ( 3 P * ) a substratem (RH) czyli tkanką nowotworową dochodzi do przeniesienia atomu wodoru lub elektronu, co prowadzi do wytworzenia rodników (R i PH ) i anionorodników (P - i RH - ) fotouczulacza i substratu, które reagują z tlenem będącym w podstawowym stanie trypletowym ( 3 Σ g3 O 2 ), prowadząc do wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), które niszczą tkankę nowotworową w procesie utleniania [5,6]. Powstanie anionorodnika ponadtlenkowego (O 2 - ) generuje w środowisku fizjologicznym kolejne ROS (Ryc. 2) [8]. W mechanizmie typu II (wysokie stężenie tlenu w środowisku reakcji), zachodzą dalej następujące przemiany (Ryc. 1). W wyniku przejścia fotouczulacza do wzbudzonego stanu trypletowego ( 3 P * ), dochodzi do przekazania energii między fotouczulaczem we wzbudzonym stanie trypletowym ( 3 P * ) a cząsteczką tlenu ( 3 Σ g3 O 2 ), znajdującego się w podstawowym stanie trypletowym (przekazanie energii między cząsteczkami jest dozwolone, ponieważ oba indywidua występują w tym samym stanie spinowym). W ten sposób generowany zostaje tlen w stanie wzbudzonym, tzw. tlen singletowy ( 1 g1 O 2* ) o silnych właściwościach utleniających. Stan singletowy charakteryzuje się tym, że wszystkie elektrony w atomie są sparowane (spiny antyrównoległe). Natomiast w stanie trypletowym mogą występować atomy oraz cząsteczki, które posiadają dwa niesparowane elektrony (spiny równoległe). Większość związków organicznych występuje w podstawowym stanie singletowym. Tlen charakteryzuje się trypletowym stanem podstawowym, a wzbudzonym singletowym. W związku z tym tlen posiadając dwa niesparowane elektrony może reagować tylko z cząsteczką mającą również dwa niesparowane elektrony. Reaktywność tlenu jest ograniczona, ponieważ znaczna część cząsteczek ma sparowane elektrony. Dlatego też tlen w stanie trypletowym, ze względu na trudność ze znalezieniem odpowiednich reagentów do reakcji dwuelektronowej, reaguje zazwyczaj ze związkami jednoelektronowo tj. poprzez przyjęcie od nich jednego elektronu i generując wolne rodniki. Istnieją dwie formy tlenu singletowego: delta ( 1 g1 O 2* ) i sigma ( 1 Σ g1 O 2* ) (Ryc. 3) [8,9]. W reakcji fotodynamicznej główną rolę odgrywa jedynie niższy wzbudzony stan singletowy delta ( 1 g ), ponieważ jest to stan metastabilny charakteryzujący się stosunkowo długim okresem półtrwania [5]. Mechanizm typu II jest dominujący ze względu na tlenowy charakter organizmu ludzkiego. Spadek stężenia tlenu w czasie, w tkance poddanej fotodynamicznej terapii, jest proporcjonalny do stężenia fotouczulacza i dawki energii [7]. W miarę wyczerpywania się tlenu zaczyna przeważać mechanizm typu pierwszego. Wolne rodniki są w przeważającej większości czynnikami silnie utleniającymi, ale ze względu na krótkie okresy półtrwania niszczą struktury komórkowe w najbliższym sąsiedztwie ich powstawania. Natomiast tlen singletowy charakteryzuje się dostatecznie długim okresem półtrwania w środowisku wodnym, aby utlenić także struktury komórkowe poza obrębem jego powstania [5]. Reaktywne formy tlenu generowane w wyniku reakcji fotodynamicznej to czynniki o dużym potencjale destrukcyjnym. Czynniki te w pierwszej kolejności niszczą błony komórek oraz organelli subkomórkowych w szczególności błony plazmatyczne i mitochondrialne. Jednakże wszystkie składniki subkomórkowe ulegają uszkodzeniu w zależności od lokalizacji fotouczulaczy w komórce [5,8,9]. FOTOUCZULACZE Fotouczulacze stosowane w diagnostyce i terapii metodą fotodynamiczną muszą spełniać wiele warunków takich jak [5]: powinny być związkami chemicznie czystymi, o znanym i trwałym składzie; powinny wykazywać minimalną toksyczność w ciemności i być toksyczne tylko w obecności światła; powinny selektywnie zatrzymywać się w tkance nowotworowej przez co najmniej kilkadziesiąt godzin; nie powinny dawać efektów fototoksycznych w zdrowych tkankach; Rycina 3. Formy tlenu singletowego w roztworach wodnych (w oparciu o [9], zmodyfikowano). 54

3 powinny charakteryzować się wysoką reaktywnością fotochemiczną, zdolnością do efektywnej produkcji tlenu singletowego i innych reaktywnych form tlenu oraz długim czasem życia stanu trypletowego, co jest podstawą wysokiej cytotoksyczności dla komórek nowotworowych; powinny powodować jak najmniejsze skutki uboczne; pasma absorpcji fotouczulaczy nie powinny pokrywać się z pasmami absorpcji barwników wewnątrz organizmu (endogennych). W rzeczywistości do tej pory nie znaleziono fotouczulacza, który spełniałby wszystkie te wymogi. Najbardziej rozpowszechnioną grupą fotouczulaczy są pochodne porfirynowe jak protoporfiryna IX [10]. W latach 70. hematoporfiryna (Hp) oraz mieszaniny pochodnych hematoporfiryny (HpD) były najczęściej stosowanymi fotouczulaczami określanymi jako pierwsza generacja fotouczulaczy. Pionierskie wysiłki Doughertiego i innych z Centrum Onkologii Roswell Park dały początek rozwojowi PDD i PDT. Dougherty, Kessel i współpracownicy z sukcesem wyizolowali dimery i oligomery do n = 8 z HpD tworząc Photofrin II. Jego działanie okazało się dwukrotnie skuteczniejsze w stosunku do stosowanych przez Lipsona pochodnych hematoporfiryny (HpD). Dzięki temu terapia fotodynamiczna zaczęła być stosowana w klinikach, a fotouczulacze dostępne komercyjnie [5,6]. W latach 80. powstała druga generacja fotouczulaczy pochodzących z różnych rodzin chemicznych jak: TPPS n sulfonowana tetrafenyloporfiryna [11], ftalocyjaniny cynkowe i glinowe [12], m-thpc meso-tetra(hydroksyfenylo) chloryny [13], chloryna e6 [14], m-thpp meso-tetra(3- -hydroksyfenylo) porfiryna [15], merocyjanina 540 [16], hyperycyna [17] czy pochodne błękitu metylenowego [18]. Ogromne zainteresowanie wzbudziło także zastosowanie kwasu 5-aminolewulinowego (ALA) (Malik i Lugaci, rok 1987), który jest prekursorem endogennej protoporfiryny IX ligandu hemu (Ryc. 4a,b) [5]. Liczne badania pokazują, że najlepsze właściwości wykazują fotouczulacze amfifilowe. Posiadają one w swej strukturze domeny lipofilowe i zwykłe łańcuchy boczne wykazujące właściwości hydrofilowe. Związki amfifilowe dobrze kumulują się w komórkach nowotworowych, gdyż są podwójnie umocowane; częścią cząsteczki w strukturach lipidowych, a podstawnikami bocznymi w wodnej części komórki [5]. W Pracowni Biochemii i Spektroskopii Instytutu Optoelektroniki Wojskowej Akademii Technicznej w Warszawie opracowano technologię otrzymywania i oczyszczania nowej klasy fotosensybilizatorów amfifilowych, będących diaminokwasowymi pochodnymi protoporfiryny PP(dA- A) 2 Arg 2 (Ryc. 4c) [19]. Opis otrzymywania PP(dAA) 2 podano w patentach [20,21]. Związki te wykazują właściwości lipofilowe i tylko w niewielkim stopniu rozpuszczają się w wodzie. W celu uzyskania związków rozpuszczalnych w wodzie dwie grupy karboksylowe w resztach kwasu propionowego pierścienia porfirynowego, wysolono argininą uzyskując połączenia jonowe, co opisują patenty [22,23]. W ten sposób otrzymuje się związki PP(dAA) 2 Arg 2 dobrze rozpuszczalne w wodzie, ale jednocześnie dobrze dyfundujące przez błony biologiczne. Założono, że przyłączenie aminokwasowych podstawników do pierścienia porfirynowego zwiększy efektywność oddziaływania z receptorami błonowymi komórek nowotworowych, co powinno się przyczynić do ułatwienia transportu tych związków do wnętrza komórek i skuteczniej zwalczać komórki nowotworowe [5,24,25]. Kilka innych fotouczulaczy jest obecnie używanych eksperymentalnie w różnych fazach badań przedklinicznych i klinicznych. Rycina 4. Struktury związków: a 5-ALA, b protoporfiryny IX, c PP(dAA) 2 Arg 2. Postępy Biochemii 59 (1)

4 SUBKOMÓRKOWA LOKALIZACJA FOTOUCZULACZY Oddziaływanie fotouczulacza z komórkami w obrębie tkanki docelowej lub nowotworowej znacząco wpływa na wynik PDT. Kluczowym parametrem tych oddziaływań jest subkomórkowa lokalizacja fotouczulaczy, ponieważ fotouczulacze mogą lokować się w obrębie wielu różnych organelli komórkowych takich jak: mitochondria, lizosomy, siateczka śródplazmatyczna, aparat Golgiego i błony komórkowe. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja w komórkach zależy m.in. od struktury fotouczulacza. Fotouczulacze, które są hydrofobowe mają dwu lub mniejszy ładunek ujemny (tj.-2,-1,0 itd) mogą dyfundować przez błonę komórkową i potem przemieścić się do błony organelli wewnątrzkomórkowych. Te fotouczulacze także mają zdolność największej absorpcji w komórkach in vitro, a zwłaszcza gdy są obecne w stosunkowo niskim stężeniu w obrębie komórkowego medium. Fotouczulacze, które są mniej hydrofobowe mają większy niż dwa ładunek ujemny (tj.-2,-3,-4 itd) są zbyt polarne, aby dyfundować przez błonę i są w związku z tym pochłaniane w mechanizmie endocytozy. Absorpcja fotouczulacza przez komórki nowotworowe jest kluczowa dla efektywnego PDT, ponieważ ROS mają krótki okres półtrwania i działają blisko miejsca ich powstania. Poznanie lokalizacji fotouczulacza jest ważne by wybrać najbardziej efektywny fotouczulacz dla każdego zastosowania [26]. FARMAKOKINETYKA I BIODYSTRYBUCJA FOTOUCZULACZY Podany dożylnie fotouczulacz może przyłączyć się do różnych białek surowicy, co wpływa na jego farmakokinetykę i biodystrybucję w obrębie ciała ludzkiego. Farmakokinetyka fotouczulaczy zależy od miejsca jego kumulacji oraz od tego jak mocno wiąże się w obrębie specyficznego obszaru docelowego (np. komórek nowotworowych). Takie właściwości farmakokinetyczne fotouczulacza mogą bezpośrednio wpływać na parametry luminescencji i determinować stopień niszczenia komórek nowotworowych. Kontakt fotouczulaczy, związanych z białkami surowicy, z powierzchnią komórek śródbłonka umożliwia związanie z przydanką naczyń (zewnętrznej błony ściany naczyń). Od tego etapu, fotouczulacz może albo wiązać się z zewnątrzkomórkową macierzą albo lokować w obrębie komórek nowotworowych. W końcowym etapie, fotouczulacz jest usuwany z obszaru docelowego przez naczynia limfatyczne lub krwionośne i wydalany przez wątrobę lub nerki. Końcowy efekt PDT w stosunku do komórek nowotworowych zależy od tego, w którym stadium wchłaniania fotouczulacz zostanie wzbudzany przez światło o odpowiedniej długości fali [26]. BIOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ORGANIZMU NA TERAPIĘ FOTODYNMICZNĄ (PDT) Efekt fotodynamiczny przez szereg lat był uważany jako efekt działający lokalnie, czyli tylko w tej tkance, w której został wywołany [5]. Obecnie wiadomo, iż reakcja PDT prowadzi do ogólnoustrojowej antynowotworowej reakcji immunologicznej [27,28]. W przypadku nowotworów indukowanych przez wirusy, układ odpornościowy może rozpoznawać taki antygen wirusowy i go unieszkodliwić. Identyfikacja antygenów związanych z nowotworami jest niezwykle trudna w przypadku nowotworów nie wywołanych wirusami. Większość nowotworów posiada mechanizmy, które utrudniają ich eliminację z organizmu. Należą do nich m.in.: słaba antygenowość, częste reakcje krzyżowe z antygenami własnymi, immunosupresja, zmienność antygenowa. Komórki nowotworowe charakteryzują się zdolnością rekrutowania pewnych komórek ze szpiku i krwioobiegu. Są to m.in. makrofagi, granulocyty, komórki tuczne i fibroblasty. Niektóre z rekrutowanych komórek, głównie makrofagi i fibroblasty, pod wpływem komórek nowotworowych podlegają przeprogramowaniu fenotypowemu. W ten sposób powstają charakterystyczne dla nowotworów makrofagi TAM (ang. Tumor Associated Macrophages) i fibroblasty CAF (ang. Carcinoma Associated Fibroblast). Te zmienione komórki wraz z pozostałymi zrekrutowanymi przez nowotwór komórkami łącznie z macierzą pozakomórkową tworzą tzw. mikrośrodowisko nowotworowe. To środowisko i komórki nowotworowe są odpowiedzialne za angiogenezę i immunosupresję [29,30]. PDT powoduje lub wzmaga odpowiedź antynowotworową, niszczy strukturę nowotworu i tym samym umożliwia bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy komórkami układu immunologicznego a nowotworowymi, prowadząc do ogólnoustrojowej antynowotworowej odpowiedzi immunologicznej. PDT prowadzi do śmierci komórek nowotworowych na drodze bezpośredniej i pośredniej. Śmierć na drodze bezpośredniej obserwuje się w wyniku naświetlania, gdy energia jest przekazywana z fotouczulacza w stanie wzbudzonym do tlenu cząsteczkowego tworząc tlen singletowy (typ II). Te wysoce reaktywne cząsteczki powodują bezpośrednie fotouszkodzenie białek, tłuszczów i innych cząsteczek w miejscu kumulacji fotouczulacza, prowadząc bezpośrednio do śmierci komórek nowotworowych w mechanizmie nekrozy i/lub apoptozy. Należy wspomnieć, że mechanizm śmierci zależy od wielu czynników. Najważniejsza jest wewnątrzkomórkowa lokalizacja fotouczulacza, ponieważ uszkodzenie mitochondriów generalnie prowadzi do apoptozy, podczas gdy uszkodzenie np. błon plazmatycznych może opóźnić lub zatrzymać apoptozę i indukować nekrozę [31]. Z kolei dawka energii wpływa na generację nekrozy albo apoptozy. Wysoka dawka energii dezaktywuje enzymy (kaspaza 3), które są niezbędne do wywołania apoptozy i prowadzi zazwyczaj do nekrozy [27,28]. Obserwuje się różnice w ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej, ponieważ nekroza w większym stopniu niż apoptoza prowadzi do stanu zapalnego, co stanowi pierwszy krok indukcji specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Fototoksyczne zmiany w śródbłonku naczyń tkanki nowotworowej wywołane przez PDT prowadzą do trwałego niedotlenienia komórek nowotworowych. Efekt naczynio- 56

5 wy wywołany PDT prowadzi do zwiększonej przepuszczalności naczyń, okluzji naczyń, a w rezultacie niedokrwiennej śmierci pozostałych komórek nowotworowych (ścieżka pośrednia). Bezpośredni efekt PDT na komórki odpornościowe może być szkodliwy. Limfocyty kumulują fotouczulacz i też mogą zostać zniszczone przy naświetlaniu, prowadząc do lokalnej supresji układu immunologicznego [27,28]. Komórki układu immunologicznego są znajdowane w podstawie tkanki nowotworowej, oddzielone od komórek nowotworowych przez zewnątrzkomórkową macierz. PDT niszcząc strukturę tkanki nowotworowej umożliwia bezpośrednie oddziaływanie między komórkami układu immunologicznego a nowotworowymi. Po początkowym uszkodzeniu komórek nowotworowych i komórek układu odpornościowego silna reakcja zapalna zachodzi lokalnie, która aktywuje i przyciąga nieuszkodzone leukocyty z innych miejsc. Fotouszkodzenie błon prowadzi do aktywacji fosfolipaz błonowych powodując masowe uwalnianie produktów hydrolizy lipidów i metabolitów kwasu arachidonowego [30,32]. Oba te czynniki są mediatorami zapalenia. Co więcej zmiany w ścianach naczyń krwionośnych przyciągają neutrofile i płytki krwi [33-36]. Te komórki uwalniają więcej mediatorów zapalnych, które mają właściwości chemotaktyczne zdolne do masowej rekrutacji komórek układu odpornościowego i przemieszczania ich do miejsca uszkodzenia. PDT jest związana z ekspresją genów i produkcją białka wielu cytokin: IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a, G-CSF [37,38]. Te cytokiny są ważnymi białkami regulującymi proces zapalny. Uwalnianie tych czynników chemotaktycznych z tkanki nowotworowej powoduje przyciąganie i kumulację nielimfoidalnych komórek charakterystycznych dla procesu zapalnego. Kilka minut po zakończeniu reakcji PDT duża liczba neutrofilów przemieszcza się do tego obszaru [27,28]. Inwazja neutrofilów poprzedza rekrutację komórek tucznych, limfocytów T, monocytów i makrofagów [27,28]. Fagocyty usuwają martwe komórki [27,28]. W celu zwalczenia i długoterminowej kontroli nowotworu jest ważna ścieżka pośrednia jak i bezpośrednia. Ze względu na wpływ terapii fotodynamicznej na układ immunologiczny podejmuje się próby modulacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej z wykorzystaniem PDT i elementów układu odpornościowego. Poniżej opisano jedną z metod. Modulacja przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej z udziałem komórek dendrytycznych i PDT Odpowiedź immunologiczna jest aktywowana m.in. przez sygnały niebezpieczeństwa (zagrożenia), rozpoznawane przez komórki, które stanowią odporność wrodzoną. Z tych komórek, komórki dendrytyczne (profesjonalne komórki prezentujące antygen limfocytom T) są głównym łącznikiem między wrodzoną a nabytą odpowiedzią immunologiczną [39]. Jednym z najważniejszych czynników komórkowych indukowanych w wyniku PDT (który jest uwalniany z nekrotycznych komórek nowotworowych) jest zewnątrzkomórkowe HSP70 należące do rodziny białek szoku cieplnego HSPs [40]. Ekspresję genów, które kodują HSPs indukuje wiele szkodliwych czynników zarówno egzo- jak i endogennych, na jakie narażona jest komórka (m.in. wolne rodniki, różne typy promieniowania). W warunkach prawidłowych, zawartość HSP70 jest niska, wzrasta dopiero w warunkach stresu. Rola m.in. HSP70 w procesie nowotworzenia związana jest przede wszystkim z ich antyapoptotycznymi właściwościami, gdyż główną funkcją HSPs jest ochrona przed czynnikami stresu. Co więcej HSP70 i inne (HSP90 i GRP96) zidentyfikowano w przestrzeni pozakomórkowej. Okazuje się, że zewnątrzkomórkowo umiejscowione białka biorą udział w odpowiedzi immunologicznej jak również wpływają na reakcję zapalną, czego wynikiem jest synteza cytokin zapalnych [41,42]. Komórki dendrytyczne posiadają specyficzne receptory dla HSPs. Indukcja HSPs w wyniku PDT może stanowić sygnał zagrożenia stymulujący różnicowanie komórek dendrytycznych i indukcję syntezy cytokin, włączając IL-15 i IL-12, a przez to wzmagać prezentację antygenu limfocytom T CD8 + ). Dlatego prowadząc hodowlę komórek dendrytycznych w obecności lizatu komórek nowotworowych uszkodzonych PDT można wzmóc przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną [40]. RODZAJE ŚMIERCI KOMÓRKOWEJ Uszkodzenia komórkowe mogą prowadzić do: nekrozy (stanowi szybką i nagłą śmierć komórek, która obejmuje całe grupy komórek powodując ostry stan zapalny na skutek utraty integralności błony komórkowej i wycieku zawartości komórki. Nagłe uwolnienie dużej objętości masy białkowej może spowodować nieodwracalne zatkanie kanalików nerkowych i poważne komplikacje zdrowotne) [5,43-46]. apoptozy (programowana śmierć trwa znacznie dłużej niż nekroza. Ponieważ nie następuje utrata integralności błony nie dochodzi do ostrego zapalenia w obrębie leczonej tkanki. Dodatkowo, badania in vitro pokazują obecność oddziaływań między komórką uszkodzoną a nieuszkodzoną w wyniku PDT. Reakcja ta ma charakter kaskadowy. Uszkodzona komórka indukuje apoptozę w komórce nieuszkodzonej co jest zjawiskiem korzystnym zwłaszcza w przypadku guzów o dużej masie, kiedy to światło nie może tak głęboko dotrzeć) [5,31,43-52]. autofagii (trwają badania nad znaczeniem tego mechanizmu w procesie PDT) [53]. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedź komórkowa na uszkodzenie zależy od kilku czynników sklasyfikowanych jako zewnętrzne (stężenie fotouczulacza, dawka energii) i wewnętrzne (metabolizm komórkowy, faza cyklu komórkowego) mających wpływ na wrażliwość komórek na PDT. Lokalizacja subkomórkowa fotouczulacza wpływa na to czy zajdzie apoptoza i w jakim stopniu zajdzie indukcja apoptozy w wyniku PDT [31]. PDT może bowiem prowadzić do apoptozy lub nekrozy albo do kombinacji tych dwóch mechanizmów [43-46]. Z tych względów, w metodzie PDT, dąży się do generowania śmierci ze znaczną przewagą apoptozy w stosunku do nekrozy. Postępy Biochemii 59 (1)

6 Obecnie trwają prace nad optymalizacją warunków reakcji fotodynamicznej leczenia różnego typu nowotworów jak i chorób nienowotworowych. Poniżej zestawiono obszary medycyny, gdzie z powodzeniem stosuje się metodę PDT w leczeniu różnych schorzeń. ZASTOSOWANIA PDD I PDT ZASTOSOWANIA PDT W LECZENIU NOWOTWORÓW Przełyk Choroby przełyku można z powodzeniem diagnozować i leczyć metodą PDT. W UK PDT zaakceptowano do leczenia chorób przełyku [54,55]. Płuca PDT jest metodą stosowaną w leczeniu nowotworów płuc. PDT z użyciem lasera Nd:YAG w przypadkach paliatywnych przedłuża czas życia do nawrotu choroby. W jednym z badań leczono 144 pacjentów w zaawansowanym stadium nowotworu. U wszystkich pacjentów występowało 50% zwężenie światła oskrzeli, powodujące duszności. Wszyscy pacjenci odpowiedzieli na leczenie PDT. Po 8 tygodniach średnica światła oskrzeli wzrosła do 58% u wszystkich pacjentów, zmniejszając duszności. Średnie przeżycie wyniosło 5 miesięcy. Wśród pacjentów z wczesnym stadium leczono 16 osób. PDT indukowało kompletną odpowiedź już po 1 zabiegu. U osób z nawrotami choroby dalsze zabiegi PDT również dały kompletną odpowiedź. Średnia życia wyniosła 69 miesięcy [54,55]. Trzustka Opisywane są próby kliniczne z wykorzystaniem fotouczulaczy: sulfonowanej ftalocyjaniny glinu (AlsPc), kwasu 5-ALA i mthpc. W badaniach na ludziach (mthpc (0,15 mg/kg i dawka energii z zakresu J) z 16 pacjentów 7 przeżyło więcej niż rok (średnia życia 9,5 miesiąca) [54,55]. Głowa i szyja PDT w leczeniu nowotworów głowy i szyi jest atrakcyjną propozycją. mthpc stosuje się w Europie do leczenia nowotworów głowy i szyi. U pacjentów z wczesnym rakiem płasko-komórkowym 85% zostało wyleczonych (97 z 114 pacjentów). W przypadku stadium zaawansowanego nowotworu w badaniu z 45 osób 12 nie zareagowało na leczenie (średnia życia 2 miesiące). U reszty średnia życia wyniosła 16 miesięcy [54,55]. Mózg W przypadku glejaka wielopostaciowego stosuje się zabieg chirurgiczny przy wsparciu obrazowania z użyciem 5-ALA i PDT z wykorzystaniem Photofrinu. W jednym z badań klinicznych na 27 pacjentów (kontrola 14, a 13 leczonych) przeżycie wyniosło 52,8 tygodni w stosunku do 24,6 tygodni u nie leczonych osób [54,55]. Terapia fotodynamiczna jako nieinwazyjna metoda znalazła olbrzymie zastosowanie w dermatologii w leczeniu zmian przednowotworowych, nowotworowych jak i nienowotworowych. W przypadku zmian nowotworowych w dermatologii [56] stosuje się dwa główne proleki, 5-ALA i jego ester Rycina 5. Porównanie budowy bakterii gram ujemnych i dodatnich (w oparciu o [57], zmodyfikowano). metylowy (MLA). Główne wskazania dermatologiczne do miejscowego stosowania PDT to powierzchniowe niemelanomowe nowotwory skóry i dysplazje (nieprawidłowa budowa tkanki lub narządu powstająca w okresie rozwojowym). Silnie pigmentowane raki jak melanoma nie odpowiadają dobrze po leczeniu PDT, ponieważ melanina absorbuje promieniowanie czerwone. Poniżej opisano wyniki przykładowych chorób leczonych PDT. AK popromienne rogowacenie uzyskuje się odpowiedź na poziomie 70-90% (twarzowa i skórna postać dają lepsze rezultaty, a obwodowa słabiej odpowiada na leczenie 44-73% i rośnie wznowa do 19% po 3 latach). PDT i krioterapia dają podobne rezultaty, ale ze względów kosmetycznych pacjenci wybierają PDT. BCC rak podstawno komórkowy uzyskano 87% skuteczność w przypadku powierzchniowego i 53% dla postaci guzowatej ze wznową 18% po 45 miesiącach. BD choroba Bowen a miejscowe PDT jest tu szeroko stosowane. Skuteczność wynosi 86-93% z 18% wznów w okresie 3-5 lat. Miejscowe PDT może być potencjalnie używane w leczeniu pacjentów po przeszczepie organów, w których znacząco wzrosło ryzyko rozwoju dysplastycznych zmian skórnych i raków niemelanomowych skóry. INNE ZASTOSOWANIA PDT Rozwój bakterii lekoopornych na standardowe leczenie wzmogło poszukiwania niestandardowych metod leczenia. PDT ma szanse być metodą stosowaną do miejscowych infekcji. PDT może zmniejszyć potrzebę używania antybiotyków. Stąd wprowadzono pojęcie PACT fotodynamiczna antybakteryjna chemioterapia [57]. Tlen singletowy jako czynnik antybakteryjny ma krótki okres półtrwania i ograniczony dystans dyfuzją (100 nm). 58

7 Tabela 1. Badania przeżywalności gronkowca złocistego pod wpływem PDT w różnych warunkach. Testy in vitro (na podstawie [57], zmodyfikowano). Szczep gronkowca lub fenotyp S. aureus Cowan I EMRSA-16 S. aureus NCTC 6571, MRSA (dwa szczepy: EMRSA-15 i EMRSA-16) EMRS-12 MRSA W przypadku bakterii, efekt letalny związany z PDT zachodzi na poziomie kwasów nukleinowych [58] lub błony komórkowej [59] lub na obu poziomach jednocześnie [60]. Bakterie gram ujemne mają dwie błony: cytoplazmatyczną i zewnętrzną (Ryc. 5). Obecność lipopolisacharydów w zewnętrznej błonie bakterii gram ujemnych wiąże się z silnym ujemnym ładunkiem, który czyni błonę nieprzepuszczalną dla neutralnych i anionowych związków. Badania ostatniej dekady pokazały, że anionowe fotouczulacze mogłyby być efektywne w połączeniu z czynnikami zwiększającymi przepuszczalność zewnętrznej błony bakterii gram ujemnych m.in. polimiksyną i EDTA [61]. Pokazano, że przyłączenie fotouczulaczy jak ftalocyjaniny, porfiryny i chloryny do kationowych polipeptydów daje efektywną inaktywację bakterii gram + i (Tab. 1)[62]. Metoda fotodynamiczna znalazła także zastosowanie w leczeniu brodawczakowatości spowodowanej przez ludzki wirus brodawczaka HPV. Nawracająca brodawczakowatość układu oddechowego (RRP, ang. Recurrent Respiratory Papillomatosis), wywołana przez HPV typu 6 i 11 jest najczęstszym łagodnym nowotworem krtani u dzieci. Konwencjonalne metody nie zapobiegają przed wielokrotnymi nawrotami choroby. W jednym z badań klinicznych zastosowano miejscowo PDT z wykorzystaniem eteru dihematoporfiryny (4,25 mg/kg, 50J) na 48 pacjentach. Zaobserwowano wyraźną poprawę. Obiecujące wyniki uzyskali także inni badacze (statystycznie 50% poprawy). HPV wywołuje także brodawczaki układu rozrodczego. U kobiet HPV infekuje szyjkę macicy (typ 16 lub 17) i może prowadzić do rozwoju wewnątrznabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CIN, ang. Cervical Intraepithelial Neoplasia), a nawet raka szyjki macicy. W badaniach klinicznych PDT z użyciem eteru/estru polihematoporfiryny (2 mg/kg, laser YAG-OPO) uzyskano wysoką skuteczność w leczeniu CIN, ale też raka szyjki macicy. Miejscowo stosuje się PDT z wykorzystaniem 5-ALA lub MLA w leczeniu kłykciny sromu, prącia i pochwy (20% 5-ALA, 100 J/cm 2, skuteczność 95% po 1 zabiegu, 100% po 2 zabiegach, % wznów 6,3) [63-65]. Na koniec przedstawiono zastosowania PDT w leczeniu schorzeń skórnych różnego pochodzenia (Tab. 2). NANOTECHNOLOGIA W PDT Stężenie fotouczulacza Bchlide-IgG (10 µm) SnCe6-IgG (4,25 µg/ml) Dimetylowy błękit metylenowy (0,5-2,0 µm) Sulfonowana ftalocyjanina glinu (6,0 mg/l) 5-ALA (0,38 mm) W terapii fotodynamicznej jednym z problemów ograniczających zastosowanie wielu fotouczulaczy jest trudność z przygotowaniem formuły farmaceutycznej, która umożliwi ich pozajelitowe podanie. Całkowita dawka energii [J/cm 2 ] Problemy fotouczulaczy I-szej generacji to: są mieszaninami kilku częściowo niezidentyfikowanych porfiryn, słaba selektywność, niski współczynnik ekstynkcji (wymagają podania sporej ilości by uzyskać satysfakcjonujący efekt); słaba penetracja tkanek (maximum absorpcji przy stosunkowo krótkich długościach fal, 630 nm) oraz wysoka kumulacja w skórze (6-8 tygodni wrażliwości na światło po PDT). Problemy Photofrinu II dały rozwój fotouczulaczom II-ej generacji, które są czyste, dobrze scharakteryzowane, silnie generują tlen singletowy, mają silne pasma absorpcji w zakresie nm i głęboko penetrują tkanki. Wadą jest ich hydrofobowość. Słaba rozpuszczalność w wodzie, hydrofobowych fotouczulaczy ogranicza ich dożylne podanie [68,69]. Z tych powodów powstały różne strategie rozwoju systemów dostarczania leków. Należą do nich m.in. osadzanie fotouczulacza na nośniku koloidalnym jak: liposomy, cząsteczki polimerowe czy olejowe układy zdyspergowane; pułapkowanie fotouczulacza w lipofilowym rdzeniu lipoproteiny niskiej gęstości LDL oraz koniugaty fotouczulacz- -przeciwciało monoklonalne (mab), fotouczulacz-nanocząsteczka-mab [68-73]. Pasywne systemy dostarczania fotouczulaczy Pasywne systemy docelowe wykorzystują naturalne ścieżki dystrybucji: dyfuzję pasywną, fagocytozę. Zaliczamy do nich: liposomy, olejowe układy zdyspergowane, biodegradowalne cząsteczki polimerowe i hydrofilowe polimery. Badania pokazują, że selektywna kumulacja tych nośników następuje na skutek wzmożonej przepuszczalności naczyniowej oraz zatrzymywania różnych cząsteczek w tkance nowotworowej (EPR, ang. Enhanced Vascular Permeability and Retention) [74,75]. Nieszczelna sieć naczyń krwionośnych tkanki nowotworowej prowadzi do wytworzenia nieprawidłowej bariery śródbłonkowej; słaby drenaż limfatyczny natomiast upośledza układ limfatyczny lub prowadzi do niedrożności limfatycznej i wzrostu przepuszczalności naczyń. Te mechanizmy dają sposobność nośnikom aby osiągnąć cel przez dyfuzję prostą. Wzrost przepuszczalności naczyń włosowatych wielu nowotworów następuje wskutek zaburzenia śródbłonkowej integralności komórki prowadząc do aktywacji czynników wydzielniczych lub prozapalnych. Te zjawiska mogą wzmóc zewnątrznaczyniowy transport makrocząsteczek. Pasywne gromadzenie się makrocząsteczek długo krążących w tkance nowotworowej na skutek EPR zwiększa stężenie fotouczulacza w tkance nowotworowej [68-70]. Postępy Biochemii 59 (1) Efekt >99.9% 70-99,9% w zależności od fazy wzrostu 100% śmiertelność 100% śmiertelność 100% śmiertelność

8 Tabela 2. PDT w leczeniu nienowotworowych chorób skóry [66]. Brodawka wirusowa Trądzik młodzieńczy (pospolity) Łuszczyca Ropne zapalenie gruczołów potowych Liszaj twardzinowy Twardzina skóry Choroba Darier a Choroba Hailey-Hailey Nadmierne owłosienie Znamię łojowe Prąciowy liszaj płaski Sarkoidoza Międzypalcowe grzybice Łysienie plackowate Nienowotworowe choroby skórne odpowiadające na leczenie 5-ALA-PDT Grudkowa zmiana skórna wywołana wirusem HPV. Trwają badania nad PDT z użyciem 20% kremu 5-ALA i różnych źródeł światła: lampy, LED, lasery, by osiągnąć najefektywniejsze leczenie przy min. skutkach ubocznych [67]. Nie opracowano optymalnych parametrów PDT. Testuje się różne źródła światła i moce dla PDT z użyciem 5-ALA. Prowadzono badania pilotażowe z użyciem różnych stężeń 5-ALA (0, 2, 10 lub 20 %) i dawek energii z zakresu 1-30 J/cm 2. Polepszenie było widoczne u niektórych pacjentów już po 1 zabiegu, ale efektywne leczenie obserwowano po kilkukrotnych zabiegach. Metoda wymaga dalszych badań. Choroba wywołana przez gronkowca wywołująca w gruczołach potowych i otaczającej tkance łącznej stan zapalny. W leczeniu tej choroby metoda PDT wymaga dalszych badań nad potwierdzeniem skuteczności. Przewlekła choroba zewnętrznych narządów płciowych. Następuje pogrubienie skóry z wytworzeniem białawych grudek czemu towarzyszy ból i swędzenie. Uzyskano objawowe polepszenie po PDT z użyciem 20% kremu 5-ALA i dawki energii 80 J/cm 2. Po 6-8 tyg. u 10 z 12 kobiet nastąpiła redukcja objawów. Efekt utrzymywał się 3-9 miesięcy. Przewlekła choroba autoimmunologiczna, charakteryzująca się stwardnieniem skóry i tkanek na skutek nadmiernego gromadzenia się kolagenu. Stosowano PDT z użyciem 3% 5-ALA i dawki energii 10 J/cm 2. Zabiegi przeprowadzano raz lub dwa razy na tydzień, przez 3-6 miesięcy w zależności od odpowiedzi klinicznej. Choroba cofnęła się. Metoda wymaga dalszych badań aby potwierdzić jej skuteczność w badanych warunkach. Genetycznie uwarunkowana choroba skóry wywołana zaburzeniem procesu rogowacenia w obrębie mieszków włosowych i poza nimi. Zmiany dotyczą skóry, błon śluzowych oraz paznokci. PDT z użyciem 20% 5-ALA i dawki energii 150 J/cm 2 może być wspomagającą terapią, ale nie może zastąpić standardowego leczenia retinoidami. Rzadka choroba pęcherzowa o dziedziczeniu autosomalnym, dominującym. Leczono z powodzeniem 2 pacjentów z wykorzystaniem 20% kremu 5-ALA i naświetlano dawką energii 120 J/cm 2. Leczenie powtórzono po 2 miesiącach. Biopsje wykazały prawidłowy naskórek. Nastąpiły remisje po 19 i 25 tygodniach. Mechanizm jest niejasny. Prowadzono badania z użyciem 20% 5-ALA, dawek energii 100 i 200 J/cm 2 z wykorzystaniem lasera argonowego. 3 miesiące po PDT 100 J/cm 2 90% włosów odrosło w stosunku do 50% w obszarach naświetlonych 200 J/cm 2. Wysokie dawki mogą zapewnić całkowitą utratę owłosienia. Biopsja przed i po leczeniu wskazuje na selektywne niszczenie naskórka i mieszków włosowych oszczędzając skórę właściwą. Występuje w postaci pojedynczego guza o zrazikowej lub brodawkowatej powierzchni i żółtym zabarwieniu. Lokalizuje się zazwyczaj na owłosionej skórze głowy bądź twarzy. 20% 5-ALA i dawka energii 50 J/cm 2 zapewniają efektywne leczenie. Towarzyszy często chorobom autoimmunologicznym. Jest to przewlekła choroba skóry i błon śluzowych atakująca często skórę genitaliów. Leczenie z użyciem 20% 5-ALA i dawką energii 50 J/cm 2 dało wyraźne polepszenie po 4 tyg. Po 6 miesiącach nie nastąpił nawrót choroby. Metoda może być z powodzeniem stosowana w leczeniu prąciowego liszaja płaskiego. Choroba związana z układem odpornościowym. Charakteryzuje ją powstawanie ziarniniaków, czyli małych grudek zapalnych nie ulegających martwicy. Guzowata sarkoidoza skórna jest podatna na leczenie PDT z wykorzystaniem 5-ALA (żel 3% 5-ALA i dawka energii 20 J/ cm 2 ). Po 3 miesięcznym leczeniu zmiany ustąpiły. Leczenie bez procesu zapalnego. Nienowotworowe choroby skórne oporne na działanie 5-ALA-PDT Badania nie wykazały skuteczności stosowania PDT z wykorzystaniem 5-ALA. Badacze sądzą, że pewne dotknięte chorobą obszary skóry mogą nie być osiągalne w leczeniu z powodu skomplikowanego kształtu przestrzeni między palcowej wyjaśniają słabe rezultaty lecznicze. Choroba skórna o nieustalonej do tej pory etiopatogenezie (prawdopodobnie o podłożu genetycznym). Charakteryzuje się występowaniem przejściowych bądź trwałych ognisk wyłysienia (brak ognisk zapalnych). Obserwuje się brak efektów leczniczych po PDT z użyciem 5-ALA. Badacze podają, że być może serie 20 zabiegów leczniczych mogłyby dać zauważalną odpowiedź na terapię. Liposomy to lipidowe pęcherzyki złożone z jednej lub więcej koncentrycznie ułożonych biwarstw fosfolipidowych. Ich główne składniki to fosfolipidy i cholesterol, które są obecne w organizmie w dużych ilościach, dlatego powinny być biokompatybilne. Prowadzone są badania eksperymentalne oraz kliniczne z udziałem nośników liposomowych jako efektywnych systemów dostarczania fotouczulacza w PDT. Liposomalny BPD-MA zaaprobowano do leczenia w Szwajcarii i USA [68-70]. Olejowe układy zdyspergowane to m.in. CRM Cremophor-EL niejonowy polioksyetylowany olej rycynowy stosowany jako czynnik emulsyfikujący. Badania pokazują preferencyjne pochłanianie fotouczulacza zdyspergowanego w CRM przez tkankę nowotworową. W badaniu PDT z wykorzystaniem fotouczulacza hematoporfiryny oraz CRM nastąpiła regresja przeszczepionego nowotworu pęcherza moczowego u szczura przy znacząco niższym stężeniu fotouczulacza w porównaniu z Hp-PDT. Z kolei CRM okazał się skuteczniejszy niż liposom DPPC (dipalmitylofosfatydylocholina) przy zastosowaniu fotuczulacza SnET 2 w leczeniu tego samego typu nowotworu [69]. 60

9 Biodegradowalne nanocząsteczki (m.in. PLA poli(d,l- -kwas mlekowy) są alternatywą dla liposomów dzięki szerokiej różnorodności materiałów i procesu wytwarzania. Dla PDT doświadczenia prowadzono m.in. z hematoporfiryną, ftalocyjaniną i m-thpc osadzonych na biodegradowalnych nanocząsteczkach [68]. Obiecujące wyniki uzyskano w stosunku do nowotworu EMT-6 z użyciem fotouczulacza ZnPcF 16 z PLA i emulsji CRM. Uzyskano 100% skuteczność z PLA w porównaniu do 60% z CRM [69]. Terapeutyczne zastosowania pozajelitowo podanych nośników koloidalnych są ograniczone z powodu ich szybkiej eliminacji z krążenia. Pochłanianie nośników przez jednojądrowe fagocyty jest promowane przez opsonizację. Aby przedłużyć ich cyrkulację w krwioobiegu dodatkowo modyfikuje się ich powierzchnię (zmiana ładunku, hydrofobowości, stabilizacja steryczna) [69]. Aktywne systemy dostarczania fotouczulaczy Selektywne dostarczanie fotouczulacza do tkanki nowotworowej jest możliwe dzięki ukierunkowaniu fotouczulacza poprzez tworzenie koniugatów z udziałem cząstek nakierowanych na receptor docelowy (fotouczulacz-mab lub fotouczulacz-nanocząsteczka-mab) [68-70]. Do głównych zalet tej strategii należą: wysokie powinowactwo wiążącej cząstki do receptora lub antygenu docelowej powierzchni komórki; bezpośrednia lub bardziej specyficzna lokalizacja dzięki czemu można zwiększyć wydajność i selektywność PDT stosując niższe stężenia fotouczulacza. Niezbędnym wymogiem tej strategii jest nietoksyczność, nieimmunogenność i biodegradowalność koniugatów; stabilność koniugatów w krwioobiegu i zdolność do pokonania barier fizjologicznych i osiągnięcia miejsca docelowego przed internalizacją. W tych celach wykorzystuje się m.in. lipoproteiny i przeciwciała monoklonalne. W klasie lipoprotein, lipoproteiny niskiej gęstości LDL odgrywają ważną rolę w transporcie i uwalnianiu cząsteczki fotouczulacza do komórek nowotworowych. Synteza receptorów LDL na powierzchni komórki jest regulowana przez jej zapotrzebowanie na cholesterol. Wiadomo, że szybko proliferujące komórki mają wysokie zapotrzebowanie na cholesterol do syntezy błon komórkowych. Badania pokazują, że fotouczulacz złączony niekowalencyjnie z LDL przed podaniem prowadzi do wzrostu wydajności PDT w porównaniu z podaniem samego fotouczulacza [69,70,73]. Inna strategia zakłada koniugację fotouczulacza z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko specyficznym antygenom komórek nowotworowych. Istnieją bowiem różnice między komórkami zdrowymi i nowotworowymi, m.in. wyższa synteza specyficznych antygentów i onkobiałek przez komórki nowotworowe [74,76,77]. We wstępnych badaniach Hp-PDT z przeciwciałami skierowanymi przeciw antygenom mięśniako-mięsaka M1 uzyskano 95% skuteczność (równoważne stężenie samego Hp lub mab stosowano jako kontrole). Pomimo zachęcających rezultatów in vitro wiele problemów trzeba jeszcze pokonać przed próbami klinicznymi. Wydajność in vivo koniugatów fotouczulacz-mab lub fotouczulacz-nanocząsteczka-mab zależy bowiem od wielu czynników, które mogą wpływać na dostępność do tkanki nowotworowej. Zmiany w profilu antygenowym komórek nowotworowych prowadzą do utraty specyficzności receptorów. Sugeruje się podawanie mieszanin przeciwciał skierowanych przeciwko różnym antygenom, aby osiągnąć maksymalną skuteczność. Do niedawna większość przeciwciał używanych w badaniach klinicznych stanowiły przeciwciała mysie, mogące powodować reakcje antyidiotypowe reakcje. Obecnie dostępne są już mniej immunogenne przeciwciała chimeryczne, humanizowane i ludzkie [69-72]. Wzrost efektu PDT i zmniejszenie stężenia fotouczulacza można osiągnąć używając specyficznych cząsteczek wyszukujących komórki nowotworowe jak czynnik wzrostu EGF, specyficzne białka (transferyna) [78] czy hormony (insulina) jako alternatywę dla mab [69,71,72]. Nowe rozwiązania pozwalające na większą selektywność, większą kumulację fotouczulacza, a przez to mniejsze dawki leku dają obiecujące rezultaty. Przed naukowcami jeszcze wiele lat badań nad optymalizacją leczenia nowotworów z wykorzystaniem nanotechnologii i ich bezpieczeństwem, ale dotychczasowe wyniki dają duże nadzieje. PDT W POLSCE W Polsce prowadzone są badania diagnostyczne oraz terapeutyczne z zakresu: dermatologii, gastroenterologii, laryngologii, pulmonologii, ginekologii i ortopedii z użyciem 5-ALA i Photofrinu. Do głównych klinik zajmujących się PDT w Polsce należą: Centrum Laserowej Diagnostyki i Terapii Fotodynamicznej w Bytomiu i Klinika Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi oraz Katedra Ginekologii i Położnictwa Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, Klinika Ginekologii Onkologicznej B Centrum Onkologii w Warszawie oraz Klinika Chorób Przyzębia Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku [5,79,80]. PODSUMOWANIE Opracowywanie nowoczesnych i skutecznych metod diagnozowania oraz terapii nowotworów jest wciąż ważnym elementem medycyny. Metoda fotodynamiczna może stać się istotnym narzędziem współczesnej onkologii miedzy innymi ze względu na częstą immunosupresję standardowych metod, jak naświetlanie czy chemioterapia. PDT natomiast w leczeniu miejscowych infekcji bakteryjnych pozwala w zasadniczy sposób zredukować czas leczenia, efekty uboczne obserwowane po podaniu antybiotyków i w wielu przypadkach obniżyć koszty terapii. Zastosowanie natomiast nanotechnologii w PDT daje bardzo obiecujące wyniki pozwalające na znaczące podwyższenie efektywności PDT przy obniżeniu skutków ubocznych terapii. PIŚMIENNICTWO 1. Schuitmaker JJ, Baas P, van Leengoed HLLM, van der Meulen FW, Star WM, van Zandwijk N (1996) Photodynamic therapy: a promising new modality for the treatment of cancer. J Photochem Photobiol B 34: Sibata CH, Colussi VC, Oleinick NL, Kinsells TJ (2001) Photodynamic therapy in oncology. Expert Opin Pharmacother 2: Postępy Biochemii 59 (1)

10 3. Agostinis P, Berg K, Cengel KA, Foster TH, Girotti AW, Gollnick SO, Hahn SM, Hamblin MR, Juziene A, Kessel D, Korbelik M, Moan J, Mroz P, Nowis D, Piette J, Wilson B, Golab J (2011) Photodynamic Therapy of Cancer: an update. Cancer J Clin 61: Szeimies RM, Landthaler M, Karrer S (2002) Non-oncologic indications for ALA-PDT. J Dermatolog Treat 13(Suppl1): Graczyk A (1999) Photodynamic diagnosis and treatment of cancer, Bellona, Warszawa, ch.1-2, pp (in Polish) 6. Juzeniene A, Moan J (2007) The history of PDT in Norway Part one: identification of basic mechanisms of general PDT. Photodiagn Photodyn Ther 4: Castano AP, Demidova TN, Hamblin MR (2005) Mechanisms in photodynamic therapy: part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagn Photodyn Ther 2: Bartosz G (2006) Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. PWN, Warszawa 9. Halliwell B, Gutteridge JM (1984) Free radicals, lipid peroxidation, and cell damage. Lancet 2: Sternberg ED, Dolphin D (1998) Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy. Tetrahedron 54: Evensen JF, Moan J, Winkelman JW (1987) Toxic and phototoxic effects of tetraphenylpophinesulphonate and haematoporphyrin derivative in vitro. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 51: Berg K, Bommer JC, Moan J (1989) Evaluation of sulfonated aluminum phthalocyanines for use in photochemotherapy. A study on the relative efficiences of photoinactivation. Photochem Photobiol 49: Ma L, Moan J, Berg K (1994) Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroksyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int J Cancer 57: Cunderlikova B, Gangeskar L, Moan J (1999) Acid-base properties of chlorin e6: relation to cellular uptake. J Photochem Photobiol B 53: Friberg EG, Cunderlikova B, Pettersen EO, Moan J (2003) PH effects on the cellular uptake of four photosensitizing drugs evaluated for use in photodynamic therapy of cancer. Cancer Lett 195: Cunderlikova B, Sikurova L, Moan J (2003) PH, serum proteins and ionic strength influence the uptake of merocyanine 540 by WiDr cells and its interaction with membrane structures. Bioelectrochemistry 59: Uzdensky AB, Bragin DE, Kolosov MS, Kubin A, Loew HG, Moan J (2003) Photodynamic effect of hypericin and a water-soluble derivative on isolated crayfish neuron and surrounding glial cells. J Photochem Photobiol B 72: Peng Q, Brown SB, Moan J (1993) Biodistribution of a methylene blue derivative in tumor and normal tissue of rats. J Photochem Photobiol B 20: Ye S, Czuba M, Romiszewska A, Karolczak J, Graczyk A (2003) Investigation of photo-physical properties of selected diaminoacid photoporphyrin derivatives PP(AA)Arg 2. I determination of quantum yield of fluorescence. Optica Applicata 2-3(XXXIII0): Padzik-Graczyk A, Konarski J, Sobczyńska J (1994) Sposób otrzymywania hemin. Patent PL B1/ Konarski J (1990) Sposób otrzymywania nowych pochodnych di(l-etylo)deuteroporfiryny. Patent PL / Padzik-Graczyk A, Konarski J (1994) Sposób otrzymywania soli kompleksowych hematoporfiryny i jej pochodnych. Patent PL B1/ Graczyk A, Konarski J (1995,1997) Complex salts of hematoporphyrin and its derivatives, their synthesis and therapeutic agents. Patents US 5, 45, 599A/95, EPO A2/ Misiewicz-Krzemińska I, Skupińska K, Graczyk A, Kasprzycka-Guttman T (2009) Influence of protoporphyrin IX amino acid substituents on affinity to human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. Biotech Histochem 84: Nowak-Stępniowska A, Wiktorska K, Małecki M, Romiszewska A, Padzik-Graczyk A (2011) Cytotoxicity of PP(Arg) 2 and PP(Ala) 2 (Arg) 2 - mediated photodynamic therapy and early stage of apoptosis induction in prostate cancer in vitro. Acta Biochim Pol 4: Robertson CA, Hawkins D, Abrahamse H (2009) Photodynamic therapy (PDT): A short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT. J Photochem Photobiol B 96: van Duijnhoven FH, Aalbers RIJM, Rovers JP, Terpstra OT, Kuppen P (2003) The immunological consequences of photodynamic treatment of cancer, a literature review. Immunobiol 207: Nowis D, Stokłosa T, Legat M, Issat T, Jakóbisiak M, Gołąb J (2005) The influence of photodynamic therapy on the immune response. Photodiagn Photodyn Ther 2: Szala S (2009) Angiogeneza i immunosupresja: jin i jang progresji nowotworów. Postepy Hig Med Dosw 63: Jakóbisiak M, Gołąb J (2007) Immunologia. PWN, Warszawa, pp. 31. Oleinick NL, Morris R, Belichenko I (2002) The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why how. Photochem Photobiol Sci 1: Almeida RD, Manadas BJ, Carvalho AP, Duarte CB (2004) Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy. Biochim Biophys Acta 1704: Cecic I, Korbelik M (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett 183: Cecic I, Parkins S, Korbelik M (2001) Induction of systemic neutrphill response in mice by photodynamic therapy of solis tumors. Photochem Photobiol 74: Cecic I, Korbelik M (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett 183: Cecic I, Stott B, Korbelik M (2006) Acute phase response-associated systemic neutrophil mobilization in mice bearing tumors treated by photodynamic therapy. International Immunopharmacol 6: Gollnick SO, Evans SS, Baumann H, Owczarczak P, Maier P, Vaughan L, Wang WC, Unger E, Henderson BW (2003) Role of cytokines in photodynamic therapy-induced local and systemic inflammation. Br J Cancer 88: de Vree WJA, Essers MC, Koster JF, Sluiter W (1997) Role of interleukin 1 and granulocyte colony-stimulating factor in photofrin-based photodynamic therapy of rat rhabdomyosarcoma tumors. Cancer Res 57: Kopeć-Szlęzak J (2008) Biologia komórek dendrytycznych. Onkol Pol 11: Jung NC, Kim HJ, Kang MS, Lee JH, Song JH, Seo HG (2012) Photodynamic therapy-mediated DC immunotherapy is highly effective for the inhibition of established solid tumors. Cancer Lett 324: Laskowska E (2007) Małe białka szoku termicznego rola w apoptozie, kancerogenezie i chorobach związanych z agregacją białek. Postepy Biochem 1: Kazimierczuk A, Kiliańska ZM (2009) Plejotropowa aktywność białek szoku cieplnego. Postepy Hig Med Dosw 63: Kessel D (2006) Death pathways associated with photodynamic therapy. Med Laser Appl 21: Plaetzer K, Kiesslich T, Verwanger T, Krammer B (2003) The modes of cell death induced by PDT: an overview. Med Laser Appl 18: Buytaert E, Dewaele M, Agostinis P (2007) Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy. Biochim Biophys Acta 1776: Kłyszejko-Stefanowicz L (2002) Cytobiochemia. Biochemia niektórych struktur komórkowych. Wydawnictwo naukowe PWN 47. Grądzka I (2006) Mechanizmy i regulacja programowanej śmierci komórek. Postepy Biochem 2: Wojtczak L, Zabłocki K (2008) Mitochondria w życiu, chorobie i śmierci komórki. Postepy Biochem 2: Kmita H, Stobienia O (2006) Kanał VDAC jako regulator funkcji mitochondriów. Postepy Biochem 2: