Biochemia stresu oksydacyjnego. Wykład 2 Powstawanie reaktywnych form tlenu w komórkach

Transkrypt

1 Biochemia stresu oksydacyjnego Wykład 2 Powstawanie reaktywnych form tlenu w komórkach

2 - Enzymy generujące H 2 O 2 : np. * oksydaza aldehydowa * oksydaza D-aminokwasowa * okydaza -hydroksykwasowa * oksydaza ksantynowa * oksydaza acetylokoenzymu A * oksydaza glutarylokoenzymu A * oksydaza galaktozowa * oksydaza glikolanowa Źródła ROS w komórce. - Enzymy generujące O 2 np. * oksydaza ksantynowa * oksydaza aldehydowa * oksydaza diaminowa * reduktaza cytochromu P450 * reduktaza glutationowa * oksydaza galaktozowa * mieloperoksydaza * oksydoreduktaza NADPH * hydroperoksydaza prostaglandynowa * tyrozynaza * syntaza tlenku azotu * reduktaza cytochromu b5 * lipooksygenaza * dioksygenaza tryptofanowa

3 Źródła ROS w komórce - Cykle redoks i utleniania ksenobiotyków - Utlenianie białek oddechowych (hemoglobiny, mioglobiny) - Samoutlenianie związków niskocząsteczkowych (np. związków tiolowych) - Łańcuch oddechowy w mitochondriach

4 Mitochondrium -Zewnętrzna błona mitochondrialna: * stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~1:1 * duża zawartość poryn - Cząsteczki o masie do ~6 kda mogą swobodnie dyfundować do przestrzeni międzybłonowej. Większe muszą mieć sekwencję sygnałową na N-końcu, pozwalającą na wiązanie do translokaz. -Przestrzeń międzykomórkowa: * stężenie małych cząsteczek podobne jak w cytozolu * skład białek jest odmienny niż w cytozolu -Wewnętrzna błona mitochondrialna: * stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~3:1 * duża zawartość kardiolipiny (zmniejszenie przepuszczalności błony) * brak poryn * transport wszystkich substancji wymaga transporterów * obecność białek odpowiedzialnych za fosforylację oksydacyjną, syntezę i hydrolizę ATP, transport białek regulatorowych. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

5 Mitochondrium Reakcje w matriks mitochondrialnej - Pirogronian produkowany podczas glikolizy jest transportowany do matriks, dekarboksylowany oksydacyjnie i przyłączany do Co-A (powstaje CO 2, acetylo-coa i NADH). - Grupa acetylowa przyłączana jest do szczawiooctanu (C4), tworząc cytrynian (C6). Izomer cytrynianu jest następnie dekarbokylowany oksydacyjnie do -ketoglutaranu (C5) i bursztynianu (C4), z którego regenerowany jest szczawiooctan. Przy tym 3 jony wodorowe (6 e - ) są przenoszone na NAD +, a para atomów wodoru (2 e - ) na FAD. 6C -Elektrony z NADH mogą być transportowane z cytoplazmy przez czółenko jabłczanowoasparaginowe lub czółenko glicerolo-3-fosforanowe GDP+Pi GTP - W cyklu Krebsa powstają 2 cząsteczki CO 2, czemu towarzyszy produkcja 3 cząsteczek NADH i 1 cząsteczki FADH 2. Powstaje też 1 wysokoenergetyczne wiązanie fosforanowe, a 9 kolejnych ATP może powstawać podczas utleniania NADH i FADH 2 za pośrednictwem łańcucha oddechowego. L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

6 Łańcuch oddechowy - Przyjmuje elektrony z NADH, i przenosi je przez liczne kofaktory do pierwszego ruchliwego nośnika elektronów, utlenionego koenzymu Q. Uzyskana w ten sposób energia jest wykorzystywana do przeniesienia czterech protonów z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej. - Koenzym Q otrzymuje elektrony także z kompleksu II (dehydrogenazy bursztynianowej) oraz dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerolu. - Zredukowany koenzym Q przekazuje elektrony na kompleks III, skąd trafiają na cytochrom c, ulokowany w przestrzeni międzybłonowej. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana jest do przeniesienia czterech protonów do przestrzeni międzybłonowej. - Z cytochromu c elektrony przenoszone są na kompleks IV (oksydazy cytochromu c), gdzie cząsteczkowy tlen redukowany jest do wody. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana jest do przeniesienia dwóch elektronów do przestrzeni międzybłonowej.

7 Łańcuch oddechowy - Przepływ elektronów z NADH lub FADH 2 do O 2 poprzez łańcuch oddechowy powoduje wypompowywanie protonów z macierzy. Wytworzona siła protonomotoryczna obejmuje dwie składowe: gradient ph (gradient protonowy) i transbłonowy potencjał elektryczny. - W łańcuchu oddechowym powstaje anionorodnik ponadtlenkowy w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu. Generowany jest w kompleksie I i III. L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

8 Łańcuch oddechowy Łańcuch oddechowy z zaznaczonymi wartościami standardowego potencjału redukcyjnego. - standardowy potencjał redukcyjny O 2 /O 2 ' - wynosi V, więc przeniesienie elektronu może być mediowane przez wiele związków). Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

9 Związki ułatwiające identyfikację miejsc tworzenia reaktywnych form tlenu Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

10 Produkcja O 2 ' - w kompleksie I łańcucha oddechowego Kompleks I (oksydoreduktaza NADH:ubichinon) - Jest transbłonowym kompleksem enzymatycznym, który: * utlenia NADH, przekazując elektrony na ubichinon * jest połączony z pompą protonową, a jego aktywność przyczynia się do powstania gradientu protonów * stanowi jedno z dwóch głównych miejsc pobierania równoważników redukcyjnych (drugie miejsce to kompleks II) * jest głównym źródłem ROS w komórce w warunkach fizjologicznych Flawina Centra Fe-S semichinon/ rodnik semichinonowy Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

11 Koenzym Q (ubichinon) - Ubichinon jest kluczowym transporterem elektronów w łańcuchu oddechowym i ważnym antyoksydantem - Niedobór lub dysfunkcja ubichinonu prowadzi do różnorodnych efektów klinicznych: * encefalomiopatii * niemowlęcej choroby wieloukładowej * ataksji móżdżkowej * izolowanej miopatii mitochondrialnej * zespół nerczycowy Quinzee & Hirano. Dev Disabil Res Rev 2010.

12 Dehydrogenaza bursztynianowa - Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH) jest zarówno częścią łańcucha oddechowego jak i cyklu Krebsa, w którym utlenia bursztynian do fumaranu - SDH zbudowana jest z czterech jednostek, wszystkie kodowane są przez geny jądrowe - Jest jedynym kompleksem łańcucha oddechowego, który nie pompuje protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną - Zaburzenia funkcji SDH są bardzo rzadkie (2-4% zaburzeń łańcucha oddechowego) i prowadzą do: * zespołu Leigha (choroba neurodegeneracyjna rozwijająca się u niemowląt) * rodzinnej paragangliomy (przyzwojaka, nowotworu układu współczulnego lub przywspółczulnego) Rutter et al. Mitochondrion 2010.

13 Odwrotny transport elektronów Odwrotny transport elektronów - Kiedy mitochondria utleniają pirogronian, elektrony są przekazywane z NADH do chinonu (Q) poprzez FMN i centra Fe-S. Powstający QH' jest redukowany do chinolu (QH 2 ). - Kiedy mitochondria utleniają jedynie bursztynian (przy braku innych substratów) elektron przenoszony jest wbrew potencjałowi redoks ze zredukowanego chinonu (chinol, QH 2 ) na NAD +, zamiast w stronę O 2. NAD utlenianie pirogronianu O 2 utlenianie samego bursztynianu Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

14 Produkcja O 2 ' - w kompleksie III łańcucha oddechowego Kompleks III (oksydoreduktaza koenzym Q:cytochrom c) - Budowa kompleksu III: * zewnętrzne miejsce chinonowe (Q o ) * wewnętrzne miejsce chinonowe (Q i ) * cytochrom b566 (cyt b566) * cytochrom b562 (cyt 562) * białko Rieske (z kompleksami Fe-S) * cytochrom c1 * cytochrom c -Działanie kompleksu III: * Ubichinon jest redukowany do QH 2 po stronie wewnętrznej (Q i ) i migruje do strony zewnętrznej (Q o ) uwalniając 2H + i przenosząc 1 e - na cyt c1 za pośrednictwem białka Rieske. Powstaje przy tym QH' i Q. * Drugi e - redukuje cytochrom b, dzięki czemu elektrony są przenoszone na wewnętrzną stronę błony, gdzie redukują chinon do QH 2. * cyt c i cyt c1 przyjmują tylko pojedynczy e-, dlatego pełna redukcja Q wymaga utlenienia dwóch cząsteczek QH 2 w dwóch kolejnych cyklach. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

15 Produkcja O 2 ' - w kompleksie III łańcucha oddechowego - Inhibitory kompleksu III: * Myxothiazol: blokuje miejsce Q o uniemożliwiając przeniesienie elektronu z QH 2 do centrów Fe-S i cytochromu b. * Stigmatellin: blokuje przeniesienie pierwszego elektronu na centrum Fe-S. * Antimycin A: wiąże się do miejsca Q i i blokuje przeniesienie drugiego elektronu do miejsca Q i. Dzięki temu hamuje powstawanie QH 2 i nasila tworzenie O 2 ' -. - Wydaje się, że O 2 '- tworzony na kompleksie III jest uwalniany do przestrzeni międzybłonowej (czyli jest dysmutowany głównie przez CuZnSOD). To wciąż jednak nie jest jasne. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

16 Uwalnianie cytochromu c - Cyt-c jest zakotwiczony w wewnętrznej błonie mitochondrialnej za pośrednictwem kardiolipiny. -W obecności ROS kompleks cyt-c/kardiolipina działa jak peroksydaza kardiolipiny, tworząc wodoronadtlenki kardiolipiny, o zmniejszonym powinowactwie do cyt-c. Uwalnianie cyt-c jest jednym ważnych etapów wczesnej apoptozy. - Uwalnianie cyt-c jest procesem dwuetapowym: * utrata kontaktu z wewnętrzną błoną mitochondrialną (hamowane przez NO) * uwalnianie do cytozolu przez uszkodzoną zewnętrzną błonę mitochondrialną (nasilane przez Bid, Bax, lub Bak dezintegrujące błonę).

17 Łańcuch oddechowy

18 Detekcja reaktywnych form tlenu Widmo EPR uzyskane z mitoplastów po zastosowaniu DMPO (pułapki spinowej) - wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego DMPO Wykorzystanie fluorescencji DCF (dichlorofluoresceiny) do wykrywania H 2 O 2 w mikronaczyniach siatkówki DMPO + antymycyna A DMPO + + antymycyna A + SOD Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009; Ishizaki et al. J Physiol 2009

19 Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego - Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H 2 O 2 w mitochondriach izolowanych z kardiomiocytów świnki morskiej. Aktywność łańcucha oddechowego stymulowana bursztynianem. - Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H 2 O 2 w komórkach hodowanych in vitro. kontrola stymulacja - CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone): czynnik rozprzęgający - rotenon: inhibitor kompleksu I - AA (antymycyna A): inhibitor kompleksu III - bursztynian: substrat oddechowy - pirogronian: substrat oddechowy Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

20 Rozwój blaszki miażdżycowej Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

21 Rozwój blaszki miażdżycowej LDL Readily Enter the Artery Wall Where They May be Modified LDL Vessel Lumen Oxidation of Lipids and ApoB Aggregation LDL Endothelium Hydrolysis of Phosphatidylcholine to Lysophosphatidylcholine Other Chemical Modifications Modified LDL Modified LDL are Proinflammatory Intima Ross R. N Engl J Med 1999

22 Rozwój blaszki miażdżycowej Monocyte Vessel Lumen LDL MCP-1 LDL Endothelium Modified LDL Intima Ross R. N Engl J Med 1999

23 Rozwój blaszki miażdżycowej Monocyte Vessel Lumen LDL MCP-1 LDL Modified LDL Endothelium Intima Macrophage Modified LDL Promote Differentiation of Monocytes into Macrophages Ross R. N Engl J Med 1999

24 Rozwój blaszki miażdżycowej Adhesion Molecules Monocyte Vessel Lumen LDL MCP-1 LDL Endothelium Modified LDL Taken up by Macrophage Foam Cell Macrophage Intima Ross R. N Engl J Med 1999

25 Rozwój blaszki miażdżycowej Adhesion Molecules Monocyte Vessel Lumen LDL MCP-1 LDL Endothelium Cytokines Modified LDL Macrophage Intima Ross R. N Engl J Med 1999

26 Ischemia i reperfuzja - ultrastruktura mitochondriów Ischemia-reperfuzja w mięśniu przywodzącym łydki królika kontrola - zdrowy mięsień rozjaśnienie macierzy, utrata granul puchnięcie mitochondriów, fragmentacja grzebieni Korn et al. J Thor Cardiovasc Sur 2002

27 Wpływ hipoksji na produkcję ROS w izolowanym sercu - Produkcja ROS zwiększa się w niedotlenieniu. * komórki w zasadzie nigdy nie są anoksyjne - tlen jest zawsze dostępny * mitochondria oddychają normalnie w bardzo niskim po 2. Gdy po 2 spadnie poniżej wartości progowej, oddychanie zaczyna się obniżać, a produkcja ROS spada. - MnTbap: SOD mimetic - CG: katalaza + glutation - MCG: MnTbap + CG - L-NAME: inhibitor NOS Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

28 Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego - Pomiar produkcji O 2 ' - za pomocą DHE (dihydroethidium), przekształcanej do 2-OH- E+ (2-hydroksyethidium) w izolowanym sercu świnki morskiej. - Pomiar produkcji ONOO - za pomocą dityr (dityrosine), przekształcanej z tyrozyny w izolowanym sercu świnki morskiej. BDM (butanedione monoxime): inhibitor skurczów kardiomiocytów MnTBAP: mimetyk SOD L-NAME (N-nitro-L-arginine methyl ester): inhibitor NOS manadione: inhibitor transportu elektronów Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

29 Regulacja produkcji O 2 ' - w mitochondriach - Cykliczne lub ciągłe chłodzenie izolowanego narządu (tu: serce świnki morskiej) prowadzi do wzrostu poziomu ROS. Jest to spowodowane: * zwiększoną produkcją ROS * zmniejszoną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych, przede wszystkim MnSOD. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

30 Ischemia i reperfuzja - Uszkodzenie tkanek po ischemii i reperfuzji jest powodowane przez wzrost produkcji ROS (szczególnie istotne przy transplantacji narządów): * Podawanie zmiataczy O 2 ' - i H 2 O 2 (ale nie jedynie O 2 ' - ) zmniejsza uszkodzenia * Nadekspresja enzymów antyoksydacyjnych (CuZnSOD, MnSOD, HO-1) zmniejsza uszkodzenia * Po reperfuzji dochodzi do zwiększonej produkcji O 2 ' - i ONOO -. kontrola - Większość ROS w ischemii i reperfuzji jest produkowana w łańcuchu oddechowym, zwłaszcza przez kompleks III. - Bardzo istotna jest rola oksydoreduktazy ksantynowej. -Schłodzenie narządu przed przeszczepem nasila produkcję ROS. nabłonek jelitowy I/R

31 Białka rozsprzęgające (UCP) -Białko UCP (UCP1) zostało po raz pierwszy opisane w brunatnych adipocytach, odpowiedzialnych za termogenezę bezdrżeniową. - UCP pozwala na powrót elektronów do matriks mitochondrialnej bez produkcji ATP (może więc zachodzić przy niedoborze ADP, zmniejszając ryzyko nadmiernej akumulacji H + w przestrzeni międzybłonowej). Towarzyszy temu produkcja ciepła. - UCP2 odgrywa rolę w regulacji wydzielania insuliny. - UCP3 ulega ekspresji głównie w mięśniach i ma działanie antyoksydacyjne. - UCP4 i UCP5 produkowane są głównie w układzie nerwowym i mają działanie antyoksydacyjne. G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008

32 UCP w łańcuchu oddechowym Wolkow & Isner. Aging Res Rev

33 Mechanizmy termogenezy Termogeneza zwiększa się w odpowiedzi na stymulację adrenergiczną, prowadzącą do wzrostu camp i aktywację PKA. Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.

34 Termogeneza bezdrżeniowa - Termogeneza bezdrżeniowa: * produkcja ciepła w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT) * głównie u zwierząt hibernujących i u noworodków (wyjątek: świniowate) * u szczurów: 3 g BAT zużywa 2 x więcej tlenu niż podstawowy metabolizm (BMR) reszty ciała (czyli g) * u ludzi jest ok. 50 g BAT, które mogą zużywać ok. 20% tlenu niż BMR Buffy et al. Br J Canc 2011.

35 BAT -BAT u gryzoni: * odpowiada za termogenezę bezdrżeniową * zwiększa wydatki energetyczne * zmniejsza otyłość * zmniejsza tworzenie białych adipocytów -BAT u ludzi: * jest obecny przez całe życie, ale w niewielkich ilościach (wykrywalny w PET/CT), głównie między łopatkami (u noworodków) lub nad obojczykami (u dorosłych Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.

36 Białka rozprzęgające (UCP) - Homologi UCP u roślin odgrywają rolę w dojrzewaniu owoców i w termogenezie roślin Philodendron selloum Chan et al. Diabetes 2004.

37 UCP-1 -Kluczowym białkiem w termogenezie bezdrżeniowej jest UCP-1. Funkcja innych białek UCP jest mniej istotna. - Transport protonów przez UCP-1 zależy od pary histydyn, których nie ma w innych UCP. - Jest eksprymowany w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT) - Ekspresja UCP-1 jest indukowana przez kwasy tłuszczowej (prawdopodobnie poprzez aktywację czynnika PPAR ) Buffy et al. Br J Canc 2011.

38 UCP-2 Chan et al. Diabetes 2004.

39 UCP-2 - Jest eksprymowane w różnych tkankach, w tym w komórkach -trzustki - Ekspresja UCP-2 koreluje odwrotnie z poziomem ATP, głównego regulatora produkcji insuliny w komórkach. - Ekspresja UCP-2 jest indukowana przez kwasy tłuszczowe (poprzez PPAR), co może chronić komórki przed lipotoksycznością. - Ekspresja UCP-2 jest indukowana przez ROS (np. w makrofagach). Chan et al. Diabetes 2004.

40 Funkcje UCP2 Zdrowe komórki Buffy et al. Br J Canc 2011.

41 Funkcje UCP2 Komórki dysplastyczne i nowotworowe Buffy et al. Br J Canc 2011.

42 Produkcja insuliny w komórkach Fajans SS. Nat Med. 2004

43 UCP w łańcuchu oddechowym - Niedobór UCP może zwiększać produkcję ATP w mitochondriach. - W komórkach trzustki: * pobieranie glukozy przyczynia się do wzrostu aktywności łańcucha oddechowego i zwiększenia produkcji ATP z ADP. To stymuluje fuzję pęcherzyków zawierających insulinę i prowadzi do wydzielania insuliny. * Wysoki stosunek ATP/ADP aktywuje UCP2, co zmniejsza gradient protonów i obniża produkcję ATP, obniżając tym samym wydzielanie insuliny. - Czynnikiem aktywującym UCP2 jest prawdopodobnie anionorodnik ponadtlenkowy.

44 Stres oksydacyjny w cukrzycy - Zmiany w metaboliźmie komórek prowadzą do zmian w wydzielaniu insuliny: * Wzrost poziomu glukozy zwiększa poziom metabolizmu komórek i podnosi poziom komórkowego ATP. * To prowadzi do zamknięcia kanałów K ATP, depolaryzacji błony, aktywacji zależnych od potencjału kanałów Ca 2+, napływu Ca 2+ do cytoplazmy. * Wzrost poziomu Ca 2+ jest bezpośrednim sygnałem uwalniania insuliny. Freeman & COX: Hum Mol Genet 2006.

45 Regulacja produkcji insuliny przez ROS Newsholme et al. J Physiol 2007

46 UCP3 - Ulega ekspresji głównie w mięśniach szkieletowych -UCP-3 może nasilać utlenianie kwasów tłuszczowych. * współdziała tioesterazą mitochondrialną (MTE), nasilając transport kwasów tłuszczowych (produkowanych przez MTE) z macierzy mitochondrialnej, dzięki czemu uwalnia CoA. * uwolnienie CoA pozwala na utrzymanie wysokiego tempa utleniania kwasów tłuszczowych Argyropoulos & Harper. J Appl Physiol 2002.

47 Białka rozprzęgające (UCP) - Homologi UCP znane są również u Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans - Ewolucyjnie najstarszą formą UCP jest prawdopodobnie UCP-4 (u ssaków obecny w mózgu) -Funkcje białek UCP: * regulacja termogenezy (UCP-1) * regulacja metabolizmu kwasów tłuszczowych (UCP-2 i UCP-3) * zmniejszenie produkcji ROS (UCP-1, UCP-2, UCP-3, UCP-4, UCP-5) * zahamowanie wydzielania insuliny (UCP-2) * regulacja apoptozy (UCP-4) - Myszy UCP KO mają normalny fenotyp, ale: * UCP-1 KO wrażliwe na zimno, podatne na tycie * UCP-2 KO zwiększona produkcja ROS * UCP-3 KO zwiększona produkcja ROS, zmniejszone utlenianie kwasów tłuszczowych Chan et al. Diabetes 2004.

48 Dziękuję Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej