Methods of Condensed Matter Physics in Molecular and Cellular Biology. Jan Antosiewicz. Lecture 9. December 3, 2014

Transkrypt

1 Methods of Condensed Matter Physics in Molecular and Cellular Biology Jan Antosiewicz Lecture 9 December 3, 2014 Molecular Biology of the Cell, 15: , 2004

2 A microscope (from the Greek: μικρός, mikrós, "small" and σκοπεῖν, skopeîn, "to look" or "see") is an instrument to see objects too small for the naked eye. The science of investigating small objects using such an instrument is called microscopy. Microscopic means invisible to the eye unless aided by a microscope. Image illustrating the principle of various microscopes. SPM=scanning probe microscopy; AFM=atomic force microscopy; STM=scanning tunneling microscope, SNOM=scanning near-field optical microscopy.

3 Fluorescence and Raman Microscopy i.e. chemically selective imaging through combination of optical spectroscopy and microscopy Both, fluorescence and Raman microscopes are basically optical microscopes with additional equipment. A fluorescence microscope is an optical microscope that uses fluorescence and phosphorescence to study properties of substances. A Raman microscope is a laser-based optical microscope modified to be used to perform Raman spectroscopy. wikipedia

4 Basic optical transmission microscope elements(1990s, Nikon) Ocular lens (eyepiece) (1) Objective turret or Revolver or Revolving nose piece (to hold multiple objective lenses) (2) Objective (3) Focus wheel to move the stage (4 coarse adjustment, 5 fine adjustment) Frame (6) Light source, a light or a mirror (7) Diaphragm and condenser lens (8) Stage (to hold the sample) (9) There are three preconditions which have to be fulfilled in order to obtain accurate images of small objects using a microscope: 1. Magnification 2. Resolution 3. Contrast

5

6 Image formation: In the optical microscope, when light from an illumination source passes through the condenser and then through the specimen, some of the light passes both around and through the specimen undisturbed in its path. This light is called direct, undeviated, or nondiffracted light, and represents the background light. Some of the light interacting with the specimen is deviated or diffracted. Diffracted light is rendered onehalf wavelength or 180 degrees out of phase with the direct light that has passed through without encountering obstacles. The one-half wavelength out of phase, caused by the specimen itself, enables this light to cause destructive interference with the direct light when both arrive at the intermediate image plane located at the fixed diaphragm of the eyepiece. The eye lens of the eyepiece further magnifies this image, which finally is projected onto the retina, the film plane of a camera, or the surface of a light-sensitive digital image sensor. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

7 What has happened is that the direct or undeviated light is projected by the objective and spread evenly across the entire image plane at the diaphragm of the eyepiece. The light diffracted by the specimen interferes at the objective rear focal plane and is brought into focus at various localized places on the same image plane, where the diffracted light causes destructive interference and reduces intensity, resulting in the generation of a pattern containing a wide spectrum of grayscale values ranging from very dark to very bright. These patterns of light and dark are what we recognize as an image of the specimen. Because our eyes are sensitive to variations in brightness, the image becomes a more or less faithful reconstitution of the original specimen. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

8 Microscope specimens can be considered as complex line or pattern gratings with details and openings spanning a large range of sizes. This concept of image formation was largely developed by Ernst Abbe. According to Abbe, the details of a specimen will be resolved if the objective captures 2 orders of light, such as the 0th order of the light and at least the 1st order of diffraction. The greater the number of diffracted orders that gain admittance to the objective, the more accurately the image will represent the original object. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

9 condenser: (kondensor) is one of the main components of the optical system of many transmitted light compound microscopes. A condenser is a lens that serves to concentrate light from the illumination source that is in turn focused through the object and magnified by the objective lens. It is a basic component of almost all compound light microscopes manufactured since the 19th Century. An equivalent condenser, which focuses an electron beam, is a basic component of both transmission and scanning electron microscopes.

10 numerical aperture (apertura numeryczna): N.A., a dimensionless number that characterizes the range of angles over which the system can accept or emit light. The numerical aperture of a microscope objective is the measure of its ability to gather light and to resolve fine specimen detail while working at a fixed object (or specimen) distance. The numerical aperture with respect to a point P depends on the half-angle θ of the maximum cone of light that can enter or exit the lens. N.A.=n sin θ

11 Numerical Aperture and Resolution: Image-forming light waves pass through the specimen and enter the objective in an inverted cone as illustrated in Figure 1(a). If small objects (such as a typical stained specimen mounted on a microscope slide) are viewed through the microscope, the light incident on these minute objects is diffracted so that it deviates from the original direction (Figure 1(a)). The smaller the object, the more pronounced the diffraction of incident light rays will be. Higher values of numerical aperture permit increasingly oblique rays to enter the objective front lens, which produces a more highly resolved image and allows smaller structures to be visualized with higher clarity. Illustrated in Figure 1(a) is a simple microscope system consisting of an objective and specimen being illuminated by a collimated light beam, which would be the case if no condenser was used. Light diffracted by the specimen is presented as an inverted cone of half-angle (α), which represents the limits of light that can enter the objective. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

12 In order to increase the effective aperture and resolving power of the microscope, a condenser (Figure 1(b)) is added to generate a ray cone on the illumination side of the specimen. This enables the objective to gather light rays that are the result of larger diffraction angles, increasing the resolution of the microscope system. The sum of the aperture angles of the objective and the condenser is referred to as the working aperture. If the condenser aperture angle matches the objective, maximum resolution is obtained. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

13 One way of increasing the optical resolving power of the microscope is to use immersion liquids between the front lens of the objective and the cover slip. Most objectives in the magnification range between 60x and 100x (and higher) are designed for use with immersion oil. Good results have been obtained with oil that has a refractive index of n = 1.51, which has been precisely matched to the refractive index of glass. All reflections on the path from the object to the objective are eliminated in this way. If this trick were not used, reflection would always cause a loss of light in the cover slip or on the front lens in the case of large angles (Figure 2). campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

14 Resolving power of optical microscope The theory given by Abbe for non-selfluminous objects states that one obtains an exact image of the object only if all orders of the diffraction patterns caused by the object are present at the back focal plane* of the objective which is materially impossible. In order to see any detail, at least one diffraction order besides the zeros must be accepted by the objective. From this remark one one deduces the formula for the resolving power. The minimum resolvable spacing dmin is given by: d min = 1 d min P ' H βλ N.A. λ being the wavelength of the light used, N.A. = n sinθ the numerical aperture of the objective, n the refractive index of the medium between the object and the lens of the objective, and 2θ the angle under which the object sees the front lens of the objective. The factor β, which lies bewteen 1 and 0.5, is determined by the N.A. of the illuminating system and the degree of coherence of the light used objective diaphgram P dmin K. J. Van Kamp, Am. J. Phys. 37: *Focal plane = A plane perpendicular to the axis of an optical system and passing through the focal point of the system.

15 The Airy Disk and Microscope Resolution: the objective and tube lens do not image a point in the object (for example, a minute hole in a metal foil) as a bright disk with sharply defined edges, but as a slightly blurred spot surrounded by diffraction rings, called Airy disks (see Figure 3(a)). Three-dimensional representations of the diffraction pattern near the intermediate image plane are known as the pointspread function (Figure 3(b)). An Airy disk is the region enclosed by the first minimum of the airy pattern and contains approximately 84 percent of the luminous energy, as depicted in Figure 3(c). The point-spread function is a three-dimensional representation of the Airy disk. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

16 The Airy Disk and Microscope Resolution: when the distance between the Airy disks is increasingly reduced, a limit point is reached when the principal maximum of the second Airy disk coincides with the first minimum of the first Airy disk. The superimposed profiles display two brightness maxima that are separated by a valley. The intensity in the valley is reduced by approximately 20 percent compared with the two maxima. This is just sufficient for the human eye to see two separate points, a limit that is referred to as the Rayleigh criterion. The distance where this limit is reached is known as the effective resolution of the microscope and is denoted as d 0. d 0= 1.22 λ N.A.obj + N.A.con Where λ is the imaging wavelength of light, NACon is the condenser numerical aperture, and NAObj equals the objective numerical aperture. The factor 1.22 has been taken from the calculation for the case illustrated in Figure 4 for the close approach of two Airy disks where the intensity profiles have been superimposed. campus.magnet.fsu.edu/articles/basics

17 długość tubusa = l Zasada działania mikroskopu świetlnego: 1) przedmiot OA jest umieszczony w niewielkiej odległości za ogniskiem obiektywu (a f1); 2) obiektyw daje obraz O1A1, powiększony, odwrócony i rzeczywisty (b l); 3) obraz O1A1 jest przedmiotem dla okularu, znajduje się między ogniskiem a okularem (a' f2); 4) obraz O2A2 jaki daje okular jest pozorny, prosty, powiększony, znajduje się w odległości dobrego widzenia od okularu d, (b' d); 5) powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia obiektywu i powiększenia okularu;

18 Magnification of the objective: O1 A 1 b l W 1= = OA a f1 Magnification of the eyepiece: O2 A 2 b ' d W 2= = O 1 A 1 a' f 2 Microscope magnification: l d W =W 1 W 2= f 1 f 2

19 Contrast in Optical Microscopy: When imaging specimens in the optical microscope, differences in intensity and/or color create image contrast, which allows individual features and details of the specimen to become visible. Contrast is defined as the difference in light intensity between the image and the adjacent background relative to the overall background intensity. Three photomicrographs of the same viewfield containing transparent, colorless human cheek cells imaged with an optical microscope under differing contrast modes: brightfield, phase contrast, and Hoffman modulation contrast. It is quite apparent that the three images appear different, and because of these variations, a microscopist might arrive at a different conclusion from each viewfield. Microscopic view of a histologic specimen of human lung tissue stained with hematoxylin and eosin (tissue stained with haematoxylin and eosin shows cytoplasm stained pink-orange and nuclei stained darkly, either blue or purple).

20 Aberacja geometryczna i chromatyczna: Wszystkie soczewki charakteryzuje zniekształcanie otrzymywanych z ich pomocą obrazów optycznych przejawiające się brakiem ostrości, zmianą kształtu (aberracja geometryczna) czy pojawieniem się zabarwień (aberracja chromatyczna). Sposób usunięcia aberacji chromatycznej odkrył w 1733 roku angielski matematyk i prawnik, Chester Hall ( ), który przewidział, że używając soczewki skupiającej ze szkła kronowego w połączeniu z soczewką rozpraszającą ze szkła flintowego (istotny jest różny współczynnik załamania obu rodzajów szkła) można usunąć rozszczepienie kolorów bez utraty powiększenia soczewki skupiającej. Do historii jako wynalazca soczewki achromatycznej przeszedł jednak nie on lecz John Dollond ( ), angielski optyk i przemysłowiec, który w 1758 roku opatentował sposób wytwarzania soczewki Hall'a. Rozwiązywanie problemu aberracji sferycznej zapoczątkował w 1830 roku Joseph Jackson Lister, angielski optyk amator, ustawiając kilka soczewek w precyzyjnie dobranych odstępach.

21 Far field and near field optical microscopies FFOM is a microscopy in which the distance between the light source and the specimen is typically much greater than the wavelength of the incident light this is a conventional optical microscopy. Near-field scanning optical microscopy (NSOM/SNOM) is a microscopy technique for nanostructure investigation that breaks the far field resolution limit by exploiting the properties of evanescent waves. This is done by placing the detector very close (distance much smaller than wavelength λ) to the specimen surface. This allows for the surface inspection with high spatial, spectral and temporal resolving power. With this technique, the resolution of the image is limited by the size of the detector aperture and not by the wavelength of the illuminating light. In particular, lateral resolution of 20 nm and vertical resolution of 2 5 nm have been demonstrated. An evanescent wave is a near-field standing wave with an intensity that exhibits exponential decay with distance from the boundary at which the wave was formed. Dr. Hans U. Danzebrink

22 Distance dependence of near-field optical resolution: series of scanning transmission images recorded at 20 nm high gold/palladium test structures on a silicon wafer. The scan height is subsequently reduced from approx. 300 nm (left image) to approx. 10 nm (right image), thus reaching a lateral resolution of about 80 nm. Please note that a wavelength of 1064 nm is used here; therefore these 80 nm correspond to a lateral resolution of l/13, i. e. about one order of magnitude better than in conventional optical microscopy. Dr. Hans U. Danzebrink

23 Fluorescence microscope Mikroskop fluorescencyjny to tradycyjny mikroskop świetlny, wzbogacony o kilka właściwości: 1) używa znacznie większej intensywności promieniowania do oświetlenia próbki, wzbudzając w próbce fluorescencję, o długości fali większej niż światło wzbudzające (przesunięcie Stokesa poprzedni wykład); 2) daje powiększony obraz próbki, ale obraz jest tworzony przez promieniowanie fluorescencji próbki, a nie przez promieniowanie użyte do jej oświetlenia; 3) obiektyw, w większości mikroskopów fluorescencyjnych, pełni dwie role: ogniskuje wiązkę oświetlającą na próbce i zbiera emitowaną fluorescencję; 4) używa luster dichroicznych do oddzielenia światła wzbudzającego i emitowanego;

24 Podstawową funkcją mikroskopu fluorescencyjnego jest wzbudzenie molekuł znajdujących się w badanym preparacie, za pomocą promieniowania o określonej długości fali, a następnie oddzielenie znacznie słabszej emitowanej fluorescencji od światła wzbudzającego. W dobrze skonfigurowanym mikroskopie tylko światło fluorescencji próbki dociera do detektora, a w konsekwencji fluorescencja określająca strukturę badanych molekuł dobrze kontrastuje z bardzo ciemnym, lub wręcz czarnym, tłem. Niedostateczna ciemność tła i znacznie wyższa intensywność wiązki wzbudzającej niż wyświecanej to najpoważniejsze ograniczenia przy detekcji sygnałów w tej technice.

25 Mikroskop fluorescencyjny może mieć konstrukcję epifluorescence microscope lub transmission fluorescence microscope, ponadto może być mikroskopem prostym lub odwróconym (o odwróconej drodze optycznej, obiektyw znajduje się pod preparatem). Mikroskop pokazany na rysunku może być używany zarówno w modzie epi fluorescencji jak i transmisyjnym, i jest mikroskopem prostym. Edukacyjna strona firmy NIKON:

26 W modzie epi iluminacji oświetlenie i detekcja zachodzą po tej samej stronie próbki. W modzie trans iluminacji oświetlenie i detekcja zachodzą po przeciwnych stronach.

27 Zwierciadła dichroiczne (filtry dichroiczne) to precyzyjne elementy optyczne służące do selektywnego odbijania (przepuszczania) światła w danym zakresie widma, a przepuszczania (odbijania) w każdym innym zakresie. Z fizycznego punktu widzenia, oba elementy działają na tej samej podstawie.

28 Profile transmisji kombinacji filtrów Nikon B 2E używanych w mikroskopach fluorescencyjnych tej firmy: Widmo filtra wzbudzenia (linia czerwona) przepuszcza 75% między 450 a 490 nm, z centralną długością fali 470 nm. Dichroiczne zwierciadło (linia żółta) odbija promieniowanie z zakresu wzbudzającego, a przepuszcza dłuższe i krótsze fale z dobrą wydajnością (0% transmisji odpowiada 100% odbicia). Filtr emisyjny (linia biała) przepuszcza promieniowanie w zakresie światła zielonego ( nm). Edukacyjna strona firmy NIKON:

29 Konfokalny mikroskop fluorescencyjny W konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym cała próbka jest oświetlona przez wiązkę wzbudzającą i obrazowana jest w całości. W mikroskopie konfokalnym światło wzbudzające jest ogniskowane w jednym punkcie próbki, w danej chwili uzyskuje się obraz tylko z tego punktu, a obraz całego preparatu usyskuje się skanując go punkt po punkcie (optyczne przekroje). Aby wyeliminować fluorescencję dochodzącą do okularu spoza obszaru ogniska, która działa jak czynnik zaburzający obserwowany obraz, mikro skopia konfokalna wykorzystuje przesłony z małymi otworami (pinhole), umieszczone przed okularem, które pozwalają na elimi nację promieniowania wyemitowanego poza ogniskiem. Pinhole za źródłem światła wzbudzającego czyni je źródłem punktowym. Nazwa konfokalny pochodzi od tego, że położenie pinhole jest sprzężone (conjugate) z położeniem ogniska (to the focal point), zatem jest to confocal pinhole. Edukacyjna strona firmy NIKON:

30 In confocal microscopy it is necessary to map a sample to obtain the full set of data. The mapping can be arranged in two ways - by scanning the light beam along the sample with a system of oscillating mirrors or by moving the sample itself using an XY or X-Y-Z scanning stages. When a 3D structure of a bulk sample should be revealed one can engage in a tedious task of taking multiple X-Y optical cross-sections along the Z-axis (Figure a). The resulting information is transferred into software to reconstruct the detailed 3D image. The technique is the backbone of confocal microscopy and is extremely useful for analysis of polymers, nano-materials, integrated circuits, pharmaceutical samples and biological objects. In principle it is possible to reconstruct a 3D surface of a sample from the X-Y-Z scan. Though, if one is interested in obtaining only a surface profile it can be done much faster using an auto-focusing technique. While scanning the sample surface the focal point microscope objective is moving up and down to focus exactly at the sample surface (Figure b). Source: Princeton Instruments brochure

31 Porównanie jakości obrazów preparatu z nabłonka skrzydła motyla barwionego fluorescencyjnym barwnikiem o nazwie jodek propidyny (propidium iodide), uzyskiwanych w mikroskopie fluorescencyjnym konwencjonalnym i konfokalnym. Widoczne jest znaczące poprawienie rozdzielczości wynikające z eliminacji promieniowania fluorescencji pochodzącej spoza obszaru ogniska obiektywu. Edukacyjna strona firmy NIKON:

32 Dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna (zwana też nieliniową mikroskopią fluorescencyjną) Możliwość wielofotonowego wzbudzania molekuł została przewidziana w 1930 roku przez Marię Göppert Mayer w jej pracy doktorskiej, a zaobserwowane ono zostało 30 lat później, krótko po wynalezieniu lasera. Zajście tego procesu wymaga gęstości fotonów strumienia fotonów rzędu MW/cm2 w impulsie piko bądź femtosekundowego lasera. Jest tak dlatego, że wirtualna absorbcja fotonu nierezonansowego ma czas życia rzędu sek i w tym czasie musi zostać zaabsorbowany drugi foton, pozwalający na osiągnięcie elektronowego stanu wzbudzonego. Impulsy lasera są wysyłane z częstością Mhz. Edukacyjna strona firmy NIKON:

33 Mikroskopia fluorescencyjna z dwufotonowym wzbudzeniem jest alternatywą dla jednofotonowej mikroskopii konfokalnej, która stwarza możliwości trójwymiarowego obrazowania badanych preparatów. Zaletą dwufotonowego wzbudzenia jest to, że obszar wzbudzenia jest mniejszy niż przy wzbudzeniu jednofotonowym, bo tylko w ognisku lasera gęstość fotonów jest wystarczająco duża i nie wymaga ona pinhole. Ponadto użyte fotony mogą głębiej wnikać do próbki, tak więc badane preparaty mogą być grubsze, a fotouszkodzenie fluoroforów w próbce jest znacznie mniej prawdopodobne niż przy wzbudzeniu jednofotonowym. Edukacyjna strona firmy NIKON:

34 Światło wzbudzające jest ogniskowane na preparacie (a) i wzbudzona fluorescencja osiąga pinhole (b) to jest pożądany sygnał. Część fluorescencji wzbudzonej w ognisku rozprasza się w próbce i nie osiąga pinhole osłabia to rejestrowany sygnał. Część światła wzbudzają cego jest absorbowana (d) lub rozpraszana (e) przed osią gnięciem ogniska. Część pochodzącej od tych promieni fluorescencji może trafić do pinhole i zostanie zarejestro wana jako niechciany sygnał tła (szum) redukujący kontrast obrazu. Edukacyjna strona firmy NIKON: Wzbudzający foton też może być rozproszony (g) przez osiagnięciem ogniska, jak w m. konfokalnym, ale praw dopodobieństwo jednoczesnego rozproszenia dwóch fotonów w tym samym punkcie w preparacie i wzbudze nie fluorescencja wynosi zero. Większa część światła osiąga ognisko bo mniejsze jest prawdopodobieństwo absorbcji poza nim i mniejsze jest rozpraszanie światła o dłuższej fali (h oraz i), a ponadto nawet jak fluorescencja wywołana w preparacie zostanie rozproszona w próbce, to ma większą szansę dodarcia do detektora (j, k), bo nie ma pinhole. To skutkuje lepszym kontrastem obrazu.

35 Porównanie jakości obrazów otrzymywanych w mikroskopie konfokalnym i mikroskopie ze wzbudzeniem dwufotonowych, na przykładzie preparatu ze splotu naczyniówki rekina (jedna z błon wchodzących w w skład ściany gałki ocznej). Obrazy te zostały zarejestrowane z płaszczyzny znajdującej się 80µm poniżej powierzchni preparatu, która jest maksymalną głębokością pozwalającą na zadawalający kontrast w mikroskopie konfokalnym. Widać jednak, że obraz uzyskany w mikroskopie dwufotonowym jest znacznie bardziej kontrastowy. Edukacyjna strona firmy NIKON:

36 Epifluorescencyjny obraz trzech molekularnych komponentów w dzielącej się nowotworowej komórce człowieka. DNA jest przedstawione kolorem niebieskim, białko o nazwie INCENP jest przedstawione kolorem zielonym, mikrotubule są przedstawione kolorem czerwonym. Każdy fluorofor jest obrazowany oddzielnie przy użyciu odpowiedniej kombinacji filtrów wzbudzającego i emisyjnego za pomocą kamery CCD. Na czwartym rysunku obrazy te są na siebie nałożone. F Lamiot;

37 Single YFP molecule super-resolution microscopy using Spectral Precision Distance Microscopy (SPDMphymod). Typical measured distance is 15 nm with standard deviation 5 nm. Yellow Fluorescent Protein (YFP) is a genetic mutant of green fluorescent protein, derived from Aequorea victoria. Its excitation peak is 514 nm and its emission peak is 527 nm. Like green fluorescent protein (GFP), it is a useful tool in cell and molecular biology, usually explored using fluorescence microscopy. Andy Nestlt;

38 Mikroskopia ramanowska Mikroskop Ramana to standardowy mikroskop świetlny plus wzbudzający laser, spektrometr (lub monochromator), czuły detektor CCD (chargecoupled device) lub fotopowielacz. Istnieje kilka odmian mikroskopii Ramana, większość uwagi poświęcimy tu przed-stawieniu mikroskopii opartej na koherentnym anty-stokesowskim rozpraszaniu Ramana (coherent anti-stokes Raman scattering, CARS). Początki tej mikroskopii to rok 1982, ale dopiero w 1999 roku grupa X. Sunney Xie z Wydziału Chemii Uniwersytetu Harwarda zademonstrowała trójwymiarowe obrazy żywych komórek (A. Zumbusch, G. R. Holtom, X. S. Xie, Phys. Rev. Lett., tom 82, str , 1999). Pierwsze obrazy żywych komórek uzyskane metodami mikroskopii CARS: a) sześć żywych, niebarwionych bakterii rodzaju Shewanella putrefaciens w D2O, pobudzające promieniowanie 855 i 1134 nm, rejestrowano przesunięcie Ramana 2878 cm 1 od drgań wiązań C H; b) trzy żywe niebarwione komórki HeLa, wzbudzanie 853 i 1135 nm, rejestrowano przesunięcie Ramana 2913 cm 1 od drgań wiązań C H;

39 Zasada działania zwykłego mikroskopu Ramana Zaletą mikroskopii Ramana jest możliwość identyfikacji chemicznej obserwowanej molekuły bez konieczności jej znakowania, zmieniając długość fali wzbudzającej można selektywnie otrzymywać sygnały od coraz to innych składników molekularnych, w zasadzie próbki nie wymagają specjalnego przygotowania i nie ulegają zniszczeniu w trakcie badań, intensywność pasm ramanowskich jest proporcjonalna do stężenia i w końcu sygnały od wszechobecnej (zazwyczaj) wody są małe i łatwe do usunięcia przy opracowywaniu danych.

40 The collection of spectra taken from multiple spots on the same sample is called a Data Cube because for a simple 2D X Y scan the data is represented by a 3D array (cube) where X and Y dimensions hold spatial coordinates and the Z dimension stores the spectral information. A 3D spectral scan is represented by a 4D Data Cube which includes three spatial dimensions plus one spectral dimension. The additional spectral dimension in Data Cubes provides a powerful tool for differentiation of internal sample structure. Human mind is unable to comprehend dense 3D and 4D arrays of data. Therefore, the reconstructing software handling the Data Cubes should have a potent data mining functionality. The useful information from the multi dimensional data structures is extracted by slicing them along any of spatial or spectral coordinates. Source: Princeton Instruments brochure

41 A typical Raman spectrum of a biological cell. The Raman spectrum is highly dependent on the chemical structure, but almost unaffected by the local environment, of the molecule. Therefore, it is not only specific, but also quantitative. Source of the Figure: Thomas, George J. Jr. "Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28:1 27 (1999). Unfortunately standard Raman microscopy requires high excitation intensities what makes it not useful for studying biomolecules in vivo and in vitro.

42 CARS Microscopy Coherent anti-stokes Raman scattering (CARS) is a nonlinear four-wave mixing process that is used to enhance the weak (spontaneous) Raman signal. In the CARS process, the molecule is initially in the ground state (the lowest energy state). The pump beam excites the molecule to a virtual state. A virtual state is not an eigenstate of the molecule and it can not be occupied but it does allow for transitions between otherwise uncoupled real states. If a Stokes beam is simultaneously present along with the pump, the virtual state can be used as an instantaneous gateway to address a vibrational eigenstate of the molecule. The joint action of the pump and the Stokes has effectively established a coupling between the ground state and the vibrationally excited state of the molecule. The molecule is now in two states at the same time: it resides in a coherent superposition of states. This coherence between the states can be probed by the probe beam, which promotes the system to a virtual state. Again, the molecule cannot stay in the virtual state and will fall back instantaneously to the ground state under the emission of a photon at the anti-stokes frequency (source of this description: wikipedia). Commonly, experiments are performed in a frequency-degenerate manner with the pump and the probe field being obtained from the same laser, and having the same frequency. Most often a configuration with two laser beams are used, where one beam serves as both pump and probe beam and the second beam is then the Stokes beam. To be able to select the vibration for investigation requires at least one of the laserbeams to be wavelength tuneable, in many cases obtained using a pump-laser/opo (optical parametric 0scillator) combination, as shown in the right-side. The laserbeams are aligned into the microscope to assure that the laserpulses hit the target sample in the same spot simultaneously; the latter is usually assured by the introduction of an adjustable delay line.

43 Zasada działania mikroskopu Ramana opartego na CARS: zwierciadło półprzezroczyste dzieli promień lasera na dwie części, z jednej w krysztale fotonicznym jest generowany zsynchronizowany, przesunięty ku czerwieni, impuls S, przechodzi przez filtr środkowo przepustowy i rekombinuje z drugą częścią, P, na zwierciadle dichroicznym, która przeszła przez system opóźniający. Przed rekombinacją oba impulsy ulegają wzmocnieniu (układy chirp ). Zrekombinowane impulsy są kierowane do mikroskopu. (Istnieją realizacje CARS M, gdzie S i P są kierowane na preparat z przeciwnych stron).

44 Sygnały mikroskopii CARS przy anty stokesowskiej częstości 2105 cm 1 pochodzące od deuterowanych lipidów, obrazujące wielkie jednowarstwowe pęcherzyki (giant uni lamellar vesicle, GUV) w badanym preparacie sygnał powstaje tam gdzie są obecne grupy CD2 lipidów. W deuterowanych lipidach, w mikroskopii CARS obserwuje się sygnały od drgań C D silniejsze niż sygnały od drgań C H w niedeuterowanych związkach. Wykorzystując impulsy spolaryzowanego promieniowania pobudzającego zauważono też silne wzmocnienie sygnałów, gdy kierunek wiązań C D odpowiadał kierunkowi polaryzacji światła. Intensywność sygnału odpowiada szybkości zliczania fotonów (counting speed, khz, kcps).

45 Porównanie obrazów tkanek nicienia C. Elegans z mikroskopii fluorescencyjnej i CARS Caenorhabditis elegans to niepasożytniczy nicień żyjący w glebach klimatu umiarkowanego.

46 Porównanie obrazowania kropli lipidowych, w nicieniu C. elegans, metodami mikroskopii CARS (A) i dwu fotonowej mikroskopii fluorescencyjnej (B) po barwieniu czerwienią Nilu. Nicień był utrzymywany przez 3 tygodnie w stanie letargu. W lewym górnym rogu widoczne jest przewężenie odpowiadające gardłu nicienia. Mikroskopia CARS pokazuje pełny obraz rozkładu kropli lipidowych, także te podskórne. Mikroskopia fluorescencyjna (ex nm) pokazuje jedynie krople lipidowe w jelicie. A więc krople podskórne nie mogą być wizualizowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. T. Hellerer, C. Axäng, C. Brackmann, P. Hillertz, M. Pilon, and A. Enejder, Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, PNAS (37) ;

47 Czerwień Nilu