Diagnostyka neurofibromatozy typu I,

Transkrypt

1 Diagnostyka neurofibromatozy typu I, czyli jak to się robi w XXI wieku dr n. biol. Robert Szymańczak Laboratorium NZOZ GENOMED GENOMED S.A.

2 Neurofibromatoza typu I (choroba von Recklinghausena) częstość występowania 1 na 3500 autosomalnie dominujący tok dziedziczenia olbrzymia zmienność objawów klinicznych u niespokrewnionych pacjentów u pacjentów należących do tej samej rodziny u jednego pacjenta w zależności od okresu życia mutacje w genie NF1 kodującym białko neurofibrominę 1 penetracja mutacji sięgająca 100% 50% przypadków wynik mutacji de novo

3 Neurofibromina I Białko cytoplazmatyczne, którego wysoki poziom ekspresji obserwuje się zwłaszcza w neuronach, komórkach Schwanna, oligodendrocytach i leukocytach Białko to, dzięki wielodomenowej cząsteczce, jest zdolne do regulacji kilku procesów wewnątrzkomórkowych, m.in.: aktywuje GTP-azę ras, kontrolując w ten sposób proliferację komórek i pełniąc funkcję supresora nowotworowego prawdopodobnie bierze udział w regulacji aktywności cyklazy adenylowej i wewnątrzkomórkowego procesu syntezy cyklicznego AMP (camp) bierze udział w transporcie fosfolipidów, zdolność do wiązania podjednostek beta/gamma białka G Białko kodowane przez gen NF1 (17q11.2)

4 Gen NF1 WIEEELKI problem Nazwa genu: Nazwa białka: GJB2 koneksyna 26 NF1 neurofibromina I (isoforma I) Model struktury białka: Długość genu (nt): Ilość egzonów : Dł. sekwencji mrna (nt): Ilość kodonów: Liczba pseudogenów: (1 kodujący) brak

5 Analiza mutacji w genie NF1 dlaczego to musi być takie trudne?! Rozmiar genu i liczba egzonów Konieczność analizy całego regionu kodującego genu NF1 brak mutacji specyficznych brak miejsc o podwyższonej częstości występowania mutacji tzw. hot spots Obecność pseudogenów (potencjalne źródło wyników fałszywie pozytywnych) Gen NF1 posiada jeden z najwyższych współczynników występowania mutacji spontanicznych w genomie człowieka Struktura genu NF1 (Vandenbroucke, 2004)

6 Sierp, kosa i żniwiarka diagnostyki molekularnej neurofibromatozy typu I - wybrane metody wykorzystywane na przestrzeni minionych lat

7 Przychodzi Pacjent i co dalej? 1. Porada genetyczna i skierowanie na badania molekularne

8 Przychodzi Pacjent i co dalej? 2. Pobranie materiału biologicznego do badań

9 Przychodzi Pacjent i co dalej? 3. Izolacja materiału genetycznego do celów diagnostycznych

10 Przychodzi Pacjent i co dalej? 4. Badanie przesiewowe analiza sekwencji genu NF1 w kierunku obecności patogennych mutacji z zastosowaniem sekwencjonowania nowej generacji (NGS) Wynik analizy NGS (MiSeq, Illumina)

11 Przychodzi Pacjent i co dalej? 5. Potwierdzenie obecności zidentyfikowanej w badaniu przesiewowym patogennej mutacji poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera (metoda referencyjna) dela/- Fluorogram, sekwencja analizowana od końca 3

12 A co się zyskuje?

13 A co się zyskuje? Mutacje korelowane Mutacje genie NF1 85% znanych mutacji z neurofibromatozą typu I 85% znanych mutacji oraz mutacje dotychczas niezidentyfikowane

14 Laboratorium W ciągu 10 miesięcy od wprowadzenia diagnostyki neurofibromatozy typu I z wykorzystaniem sekwencjonowania nowej generacji (NGS) wykonano analizę i wydano wynik dla 39 pacjentów.

15 Bibliografia 1. Cnossen, M. H. Neurofibromatosis Type I: a clinical and molecular genetic study. Erasmus University, Costa, S., R. Tojal, A. Valverde. Neurofibromatosis - Diagnostic Assessment. W Neurodegeneration, zredagowane przez L. M. Martins. InTech, Ferner, R. E., S. M. Huson, N. Thomas, C. Moss, H. Willshaw, D. G. Evans, M. Upadhyaya, et al. Guidelines for the Diagnosis and Management of Individuals with Neurofibromatosis 1. Journal of Medical Genetics 44, nr 2 (2007): Hardy, C. A. The Protein Truncation Test. W PCR Mutation Detection Protocols, zredagowane przez B. D. M. Theophilus i R. Rapley, Methods in Molecular Biology 187. Humana Press, Huson, S. M. Recent developments in the diagnosis and management of neurofibromatosis. Archives of Disease in Childhood 64, nr 5 (1989): Jett, K., J. M. Friedman. Clinical and Genetic Aspects of Neurofibromatosis 1. Genetics in Medicine: Official Journal of the American College of Medical Genetics 12, nr 1 (2010): Lee, M.-J., D. A. Stephenson. Recent Developments in Neurofibromatosis Type 1. Current Opinion in Neurology 20, nr 2 (kwiecień 2007): Pasmant, E., A. de Saint-Trivier, I. Laurendeau, A. Dieux-Coeslier, B. Parfait, M. Vidaud, D. Vidaud, I. Bièche. Characterization of a 7.6-Mb Germline Deletion Encompassing the NF1 Locus and About a Hundred Genes in an NF1 Contiguous Gene Syndrome Patient. European Journal of Human Genetics: EJHG 16, nr 12 (2008): Rood-Breithaupt, J. Neurofibromatosis 1: Diagnosis Using RFLP Markers and Mutation Screening Via Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis. Drexel University, Upadhyaya, M., P. Thompson, S. Han, i D. N. Cooper. Neurofibromatosis Type 1. W Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, zredagowane przez R. Elles i R. Mountford, Methods in Molecular Medicine TM 92. Humana Press, Vandenbroucke, I., T. Callens, A. De Paepe, i L. Messiaen. Complex Splicing Pattern Generates Great Diversity in Human NF1 Transcripts. BMC Genomics 3, nr 1 (2002): 13.