Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w szpiczaku plazmocytowym na podstawie analizy kariotypowej i c-ig-fish w plazmocytach

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str JOLANTA RYGIER, BEATA GRYGALEWICZ, PAULINA KRAWCZYK, ANNA PASTWIŃSKA, RENATA WORONIECKA, BARBARA PIEŃKOWSKA-GRELA Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w szpiczaku plazmocytowym na podstawie analizy kariotypowej i c-ig-fish w plazmocytach Cytogenetics aberrations in plasma cell myeloma on the basis of karyotyping and c-ig-fish analysis of plasma cells Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii - Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Warszawa Kierownik: dr hab. n. med. Barbara Pieńkowska-Grela STRESZCZENIE Szpiczak plazmocytowy (PCM) to złośliwy nowotwór wywodzący się z komórek plazmatycznych, charakteryzujący się duŝą heterogennością. Wśród czynników prognostycznych istotną rolę odgrywają aberracje cytogenetyczne. Celem pracy było określenie zmian cytogenetycznych w badaniu kariotypu i badaniu FISH, przeprowadzonym w populacji plazmocytów szpiku 36 pacjentów. Zmiany kariotypowe stwierdzono u 11% badanych pacjentów, zaś zmiany ujawnione techniką c-ig-fish u 75% badanych. Spośród typowych dla szpiczaka aberracji najczęściej (31%) stwierdzano masywną utratę 13q. W jednym przypadku zmianie tej towarzyszyła źle rokująca fuzja FGFR3/IGH. W badanej grupie nie odnotowano obecności fuzji IGH/MAF, CCND1/IGH i delecji TP53. Wykryto natomiast rzadkie aberracje w obrębie badanych genów: przy u typowych fuzji wykazano obecność zmiany liczby kopii genów CCND1, CBFB, MAF i IGH. Dzięki zastosowaniu poszerzonego zestawu sond DNA moŝliwa była takŝe pośrednia ocena ploidii. Metoda c-ig-fish na znakowanych plazmocytach umoŝliwiła wyodrębnienie pacjentów ze złymi rokowniczo zmianami, a takŝe aberracjami nietypowymi, których wartość predykcyjna pozostaje w trakcie ustalania. SŁOWA KLUCZOWE: Szpiczak plazmocytowy Cytogenetyka FISH Ploidia. SUMMARY Plasma cell myeloma (PCM) is a malignant tumor derived from plasma cells. PCM represents a very heterogeneous entity. Cytogenetic analysis is one of the most important prognostic factors. Aim of this study was to determine the cytogenetic changes by means of classical karyotype analysis and c-ig-fish. The investigated group consist of 36 patients. Karyotypic changes were detected in 11% of patients, while changes revealed by c-ig-fish method were present in 75% of patients. Among typical cytogenetic changes the most frequent was massive deletion of 13q detected in 31% of cases. In one patient deletion of 13q was accompanied by poor risk factor FGFR3/IGH gene fusion. In the examined group there was no fusion of IGH/MAF, CCND1/IGH or TP53 deletion. However rare gene aberrations were detected. There were copy number changes of CCND1, CBFB, MAF and IGH genes in the absence of typical gene fusion. Additionally deletions of CBFB or/and MAF were revealed. FISH analysis with broad probe spectrum made possible indirect ploidy evaluation. The c-ig-fish method on labeled plasma cells facilitate separation of patients with poor risk factors and indicate patients with atypical aberrations which prognostic value still need to be established. KEY WORDS: Plasmocytic myeloma Cytogenetics FISH Ploidy WSTĘP Szpiczak plazmocytowy (plasma cell myeloma PCM, multiple myeloma MM) jest chorobą rozrostową układu limfoproliferacyjnego, diagnozowaną w 10 15% zachorowań na rozrostowe choroby układu krwiotwórczego. Jest drugim pod względem częstości występowania nowotworem hematologicznym. Mediana w momencie rozpoznania wynosi 70 lat, przy czym rzadko odnotowuje się zachorowania poniŝej 30 roku Ŝycia. Częściej chorują męŝczyźni niŝ kobiety [1].

2 640 J. RYGIER i wsp. Szpiczak plazmocytowy naleŝy do grupy gammapatii monoklonalnych. Ich istotą jest niekontrolowany rozrost klonu limfocytów B zróŝnicowanych do komórki plazmatycznej. Patologiczne plazmocyty gromadzą się w szpiku kostnym, co prowadzi do wyparcia prawidłowych linii hematopoetycznych, niedokrwistości, a niekiedy zmniejszenia liczby krwinek białych i płytek krwi. Konsekwencją wzrostu stęŝenia produkowanych przez plazmocyty cytokin jest stymulacja osteoklastów, zmiany osteolityczne, patologiczne złamania, niewydolność nerek. Mimo znacznego postępu w terapii i zastosowaniu autologicznego przeszczepu szpiczak plazmocytowy pozostaje ciągle chorobą nieuleczalną. Średnia przeŝycia wynosi od 3 do 5 lat, a tylko 5 10% pacjentów przeŝywa około 10 lat [2]. Zgodnie z obowiązującymi wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia jednym z istotniejszych czynników rokowniczych, obok stęŝenia β 2 -mikroglobuliny i albuminy we krwi, są zmiany genetyczne i cytogenetyczne, będące po części podstawą wyboru terapii u chorych na szpiczaka plazmocytowego [3, 4, 5]. Zmiany cytogenetyczne, uchwytne w klasycznej analizie kariotypu, są w szpiczakach widoczne jedynie w ok. 1/3 przypadków. Zastosowanie technik opartych o fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) ujawnia obecność aberracji omosomowych u ponad 90% pacjentów [6]. Metoda pozwalająca na ocenę aberracji w komórkach plazmatycznych szpiku (c-ig-fish) rekomendowana jest przez Międzynarodową Grupę Szpiczakową, a w szczególności zalecana w przypadkach niewykazujących obecności metafaz [7, 8]. Najczęściej występujące zmiany omosomowe o znaczeniu rokowniczym zestawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Najczęstsze aberracje omosomowe występujące w szpiczaku plazmocytowym, na podstawie przeglądu literatury Table 1. The most frequent omosome aberrations in plasma cell myeloma according to literature Zmiana cytogenetyczna delecje 13q 13% [10] 36% [6] Częstość występowania aberracji zaleŝnie od metody wykrywania KARIOTYPY FISH 40-50% [2] 52% [6] aberracje omosomu 1 20% [2] 40% [6] 50% [2] 55% [6] aberracje omosomu 11 10% [10] 15-20% [10] aberracje omosomu 14 15% [2] 31% [6] 55-70% [2] 50% [6] anomalie 6q 3-4% [2] 5% [2] anomalie 8p 10% [11] anomalie 3q 16% [11] t(11;14) - IGH/CCND1 19% [6] 5% [10] 37% [6] t(4;14) - IGH/FGFR3 11% [6] 21% [6] t(14;16) - IGH/MAF 0% [6] 11% [6] rearanŝacje MYC 4-5% [9] 15% [9] delecja TP53 (17p13) <5% [2] 0% [6] 10% [2] 20% [6] hipodiploidia 9 14% [2] 11%[10] 30-35% [2] hiperdiploidia 30% [2] 20% [10] 60% [2] Komórki plazmatyczne mają słabą zdolność proliferacji, a ich odsetek w szpiku dostarczanym do badania jest niewielki. Z tego względu większość ocenianych cytogenetycznie przypadków wykazuje kariotypy prawidłowe, a aberracje ujawniają się głównie w zaawansowanych stadiach (u 30 50% pacjentów). Zmienione kariotypy są zwykle złoŝone, z licznymi odstępstwami od obrazu prawidłowego.

3 Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w PCM 641 Dostrzegalne zmiany dotyczą najczęściej ploidii, dzieląc szpiczaki na dwie grupy: hiperdiploidalne (H) i nie-hiperdiploidalne (NH). Hiperdiploidia związana jest najczęściej z trisomią omosomów: 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 i 21 [2, 12, 13]. Powielenie liczby kopii omosomów związane jest zwykle z lepszym rokowaniem. Szczególnie pacjenci z trisomią 5, 9 lub/i 17 lepiej reagują na leczenie i mają dłuŝszy całkowity czas przeŝycia niŝ pacjenci z kariotypem nie-hiperdiploidalnym [2, 9, 12, 13]. Hipodiploidia związana jest przewaŝnie z całkowitą lub częściową monosomią omosomów 6, 13, 16 i 22 oraz wysoką częstotliwością translokacji z zaangaŝowaniem genu IGH. Utraty omosomów wykrywane są w kariotypach 9 14% przypadków, natomiast metoda FISH pozwala na detekcję tego typu zmian u 30 35% pacjentów. Pacjenci tacy gorzej odpowiadają na leczenie, wykazując krótszy czas remisji i całkowity okres przeŝycia [2]. Do grupy tej zalicza się takŝe pacjentów z hipotetraploidią, powstałą w wyniku powielenia hipodiploidalnej liczby omosomów. Wśród pacjentów chorych na szpiczaka plazmocytowego, obok zaangaŝowania genu IGH w translokacje z róŝnymi partnerami, najczęstsze aberracje dotyczą omosomu 13. W grupie chorych z nieprawidłowym kariotypem monosomie 13 notowane są częściej niŝ delecje [2]. Masywne delecje widoczne są w obrazie kariotypowym. Utraty submikroskopowych fragmentów omosomu 13, dotyczą głównie obszarów 13q14 i 13q34. [10, 14, 15]. Monosomia 13 i masywne utraty 13q wykrywane klasyczną metodą prąŝkową mają silniejsze znaczenie prognostyczne niŝ submikroskopowe utraty omosomu 13 wykryte metodą FISH. Ostatnie raporty wskazują, Ŝe anomalie omosomu 13 nie są tak istotne rokowniczo jak delecja genu TP53 (17p13) czy obecność translokacji angaŝujących gen IGH (14q32), które są silnie związane z kariotypem nie-hiperdiploidalnym i często współwystępują z delecją 13 [16, 17]. Delecja TP53 posiada niezaleŝną wartość prognostyczną. Wykrywana jest u ok. 10% chorych na szpiczaka, związana jest z progresją choroby i opornością na chemioterapię [2]. Translokacje angaŝujące geny immunoglobulin najczęściej dotyczą genu łańcucha cięŝkiego (IGH) i są wykrywane w 50-70% nowotworów komórek plazmatycznych. Partnerami translokacji jest zwykle jeden z pięciu onkogenów: CCND1 (11q13), C-MAF (16q23), FGFR3 (4p16) lub rzadziej CCND3 (6p21) bądź MAFB (20q11). Translokacje: t(4;14)(p16;q32) i t(14;16)(q32;q23) są aberracjami swoistymi dla szpiczaka, niespotykanymi w innych nowotworach. Obydwie te zmiany są czynnikami złego rokowania. Translokacja t(4;14)(p16;q32) prowadząca do fuzji FGFR3/IGH, ujawnia się zwykle w przypadku kariotypów nie-hiperdiploidalnych, powiązanych z aberracjami omosomu 13 [9, 12]. Translokacja t(14;16)(q32;q23) z fuzją genów IGH/MAF, dotyczy 2-10% pacjentów MM [18]. Ze względu na telomerowe lokalizacje zaangaŝowanych genów zmiany są niewidoczne w badaniu kariotypowym. Najczęściej wykrywaną aberracją genu IGH jest translokacja t(11;14)(q13;q32), aktywująca gen CCND1, znana jako zmiana charakterystyczna dla chłoniaka z komórek płaszcza [9, 12]. Aberracja ta jest widoczna w obrazie kariotypowym, jednak w przypadku nowotworów z komórek plazmatycznych częściej wykrywana jest techniką FISH (u 15 20% pacjentów ze szpiczakiem i w 50% przypadków amyloidozy łancuchów lekkich) [9, 12]. W szpiczaku zmiana ta jest łączona z dobrą odpowiedzią na leczenie. Wśród innych zmian o potencjalnym znaczeniu rokowniczym stosunkowo często widoczne są aberracje omosomu 1. Amplifikacje 1q21 korelują z krótszym przeŝyciem, nie tylko u pacjentów z MM, ale takŝe w innych nowotworach hematologicznych i prawdopodobnie w guzach litych [19, 20, 21]. Podobnie negatywne znaczenie kliniczne moŝe wykazywać, słabo jeszcze poznane, zjawisko delecji genu CBFB (16q22), który zaangaŝowany jest w hematopoezę i osteogenezę [22]. Utraty 8p notowane niekiedy w szpiczaku plazmocytowym powstają najczęściej w wyniku translokacji niezrównowaŝonych [11]. Pomimo ciągłego poszerzenia wiedzy o roli określonych aberracji cytogenetycznych na przebieg szpiczaka plazmocytowego, jednoznaczna indywidualizacja leczenia pacjentów w codziennej praktyce klinicznej jest nadal kwestią przyszłości. Wynika to między innymi z niejednakowego działania leków

4 642 J. RYGIER i wsp. u chorych z dotychczas określonych grup ryzyka [23]. Sytuacja ta wskazuje na konieczność dalszych badań w celu określenia innych, poza juŝ poznanymi, cech genetycznego zróŝnicowania szpiczaka. Celem podjętej pracy było określenie częstości występowania typowych zmian cytogenetycznych w badanej grupie szpiczaków, rozszerzone o próby określenia typu ploidii w badaniu c-ig-fish oraz statusu wybranych genów. MATERIAŁ I METODY Materiałem badań był szpik pobrany w czasie biopsji diagnostycznych od 36 pacjentów w wieku od 41 do 82 lat (mediana 67 lat) z rozpoznaniem szpiczaka plazmocytowego. Uzyskane komórki poddano krótkotrwałej hodowli in vitro w medium Eagle a z dodatkiem 30% surowicy bydlęcej, L-glutaminy i antybiotyków, bez stymulacji lub z dodatkiem mitogenu (Phorbol-12-myristate-13-acetate, TPA). Zawiesina komórek była utrwalona bezpośrednio oraz po 24 i 72 godzinach hodowli w warunkach 5% CO 2, 37ºC wg standardowej procedury. Preparaty cytogenetyczne zawierające metafazy barwiono róŝnicowo metodą prąŝków G dla oceny kariotypu (wg Wang, Fedorff 1972). Równolegle zastosowano technikę cytogenetyki molekularnej c-ig-fish, polegającą na znakowaniu komórek plazmatycznych, wcześniej opłaszczonych przeciwciałami łańcuchów lekkich immunoglobulin: Anty Human Lambda i Kappa (Vector), sondami hybrydyzującymi do badanych regionów. [20, 24]. W celu określenia zmian w tak wyodrębnionych plazmocytach uŝyto zestawu specyficznych sond DNA (LSI i CEP VYSIS, Abbott Moleculars). Zastosowano sondy jednokolorowe wykrywające delecje 13q14 i 13q34, delecję genu TP53, sondy fuzyjne (Dual Color, Dual Fusion), w celu określenia fuzji genów: CCND1/IGH, FGFR3/IGH i IGH/MAF sondy rozdzielcze (Dual Color, Break Apart),wykrywające rearanŝacje w obrębie genu CCND1, CBFB i IGH, sondy hybrydyzujące do centromerów (CEP) omosomów: 3, 8, 9, 11, 15 i 16 oraz sondy subtelomerowe, znakujące obszary 3qter i 8pter. Przyjęta granica błędu dla sond centromerowych, fuzyjnych i rozdzielczych wynosiła 10%, zaś dla pozostałych sond punktowych 20%. WYNIKI Przebadano cytogenetycznie grupę 36 chorych na szpiczaka plazmocytowego, z czego ocenę kariotypu szpiku przeprowadzono u 19 pacjentów, a ocenę metodą FISH u 31 pacjentów. Badanie kariotypowe Wyniki analizy kariotypowej szpiku 19 pacjentów, u których uzyskano metafazy o jakości pozwalającej na analizę przedstawiono w Tabeli 2. U pozostałych pacjentów badanie kariotypu nie powiodło się. Zaburzenia kariotypu komórek szpiku wykazano w 2 z 19 przypadków, w których uzyskano metafazy (11% badanej grupy). W obu przypadkach wykazano kariotypy kompleksowe, z aberracjami dotyczącymi liczby i struktury omosomów. W kariotypie pacjenta nr 1136 odnotowano obecność dwóch klonów komórek ze zmianami, obok występujących w przewadze metafaz prawidłowych. W klonie o kariotypie hipodiploidalnym stwierdzono liczne aberracje w tym: powielenie długiego ramienia omosomu 1 w postaci izoomosomu i(1)(q10), dodatkowy materiał nieznanego pochodzenia na długim ramieniu omosomu 3, ubytek jednej kopii omosomu 6 oraz utratę fragmentu długiego ramienia pozostałej kopii omosom 6 z punktem pęknięcia q23. Drugi, tetraploidalny klon komórek, wykazywał powielenie powyŝszych zmian, czemu towarzyszyły dodatkowe utraty: del(10)(q11) oraz ubytki kopii omosomów 4, 5, 6 i 13.

5 Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w PCM 643 Tabela 2. Wyniki analizy kariotypu u 19 chorych na szpiczaka plazmocytowego. Table 2. Results of karyotype analysis of 19 plasma cell myeloma patients. Lp. Nr Wiek Płeć Kariotyp Ploidia Kariotyp nie-hiperdiploidalny M 41~42,XY,i(1)(q10),add(3)(q2?7),-6[1],del(6)(q23)[1], inc[cp7]/71~96,xxy,i(1)(q10)x2~3,+del(1)(q11), add(3)(q2?7)x2~3,-4,-5,-6,-13,inc[cp3]/46,xy[15] M 41~44,X,-Y[15], add(1)(p13 or p22)[15],del(14)(q?24)[5], add(16)(p1?12)[14],-17, [4],add(17)(p?1)[4],-19 [5], -20[15],-20[15],-22[6], +mar1[14],+mar2[14],+mar[8] [cp15]/86~88,idemx2[cp2]/46,xy[3] M 46,XY[20] M 46,XY[10] M 46,XY[20] K 46,XX[22] K 46,XX[20] M 46,XY[21] M 46,XY[21] K 46,XX[18] K 46,XX[20] K 46,XX[20] M 46,XX[20] K 46,XX[20] M 46,XY[17] M 46,XY[20] M 46,XY[20] M 46,XY[21] M 46,XY[8] Hipodiploidia/ hipotetraploidia Diploidia W drugim hipodiploidalnym przypadku (nr 1174) zmiany strukturalne dotyczyły obecności dodatkowego materiału nieznanego pochodzenia na omosomach 1, 16 i 17 oraz utraty fragmentu omosomu 14 oraz prawidłowych kopii omosomów 19, 20 i 22. W pozostałych 17 przypadkach (89%) nie wykazano zmian uchwytnych w obrazie prąŝkowym. Badanie FISH Badanie FISH przeprowadzono na wyznakownych plazmocytach szpiku 36 pacjentów z rozpoznanym szpiczakiem plazmocytowym. Typowych dla szpiczaka aberracji poszukiwano u 31 pacjentów (Tabela 3). U 19 pacjentów przeprowadzono analizę obecności fuzji IGH/MAF, FGFR3/IGH i CCND1/IGH i delecji obszarów TP53 i 13q34. U kolejnych 12 pacjentów oceniano wyłącznie obecność delecji TP53 i 13q34. Charakterystyczną dla szpiczaka fuzję FGFR3/IGH stwierdzono w jednym z 19 (5%) badanych przypadków (nr 2543). Aberracja ta ujawniła się w 62% wyznakowanych plazmocytów. Zmianie tej towarzyszyła delecja 13q34 występująca w tym samym odsetku komórek. Równoczesne zwielokrotnienie liczby kopii obydwu znakowanych genów FGFR3, i IGH bez obecności fuzji wykazano w czterech przypadkach: nr 1174, 918, 2490 i 2554 (od 31% do 96% plazmocytów). W badanej grupie nie stwierdzono obecności przypadków z fuzją IGH/MAF. Stwierdzono natomiast w pojedynczych przypadkach zmiany liczby kopii genu MAF. Równoczesne zwielokrotnienie liczby kopii obu badanych genów (MAF i IGH) bez obecności fuzji wykazano w 4 przypadkach (nr 1174, 918, 2490 i 2554). Utratę jednej kopii MAF wykazano w dwóch przypadkach (nr 1229 i 2555) w odpowiednio, 56% i 53% plazmocytów. Powielenie liczby kopii MAF ujawniło się w jednym przypadku (nr 2569, w 70% komórek).

6 644 J. RYGIER i wsp. Lp. Numer pacjenta Tabela 3. Analiza c-ig-fish w grupie 31 pacjentów ze szpiczakiem plazmocytowym. Table 3. Results of C-Ig-FISH analysis of 31 plasma cell myeloma patients. Płeć/ Wiek Fuzja FGFR3/IGH Fuzja IGH/MAF Fuzja CCND1/IGH M 62% FUZJA 50%*(IGH) 60%*(IGH,CCND1) M/56 31%*(IGH,FGFR3) 38%*(IGH,MAF) 27%*(IGH,CCND1) M/51 86%*(IGH,FGFR3) K/77 64%*(IGH,FGFR3) K/72 96%*(IGH,FGFR3) K/57 23%#(IGH) M/75 46%*(IGH) K/70 34% #(IGH) 88%*(IGH,MAF) 66%*(IGH,MAF) 97%*(IGH,MAF) 38%*(IGH) 29%#(IGH) K/65 56% #(MAF) M/70 53%#(MAF) M/60 70%*(MAF) 84%* (IGH,CCND1) 64%*(IGH,CCND1) 92%*(IGH,CCND1) 29%#(IGH) 45%*(IGH) 27% #(IGH) M/82 nb nb 21%*(CCND1) RearanŜacja rearanŝ. CCND1 nb Delecja TP53 62% 18%* (4syg.) nb 73%* (3syg.) rearanŝ. CCND1 rearanŝ. CCND1 Delecja 13q14/13q34 18%* (4syg.) 61%* (3syg.) 61%* 60%* (4syg.) 87%* 86%* nb 68% rearanŝ. CCND1; rearanŝ. IGH nb 20% nb 24% nb 79% nb 80% nb 15% * (3syg.) M/70 rearanŝ. 52%*(CCND1) CCND M/75 rearanŝ. 46% 58%*(CCND1) CCND M/58 rearanŝ. 50%*(CCND1) CCND M/67 rearanŝ. 22% 28%*(CCND1) CCND K/75 nb nb nb nb 84% M/75 nb nb nb nb 58% M/74 nb nb nb nb 58% M/64 nb nb M/69 nb nb nb nb K/59 nb nb nb M/41 nb nb nb M/45 nb nb nb nb K/46 nb nb nb nb K/60 nb nb nb nb M/63 nb nb nb nb K/42 nb nb nb nb M/ M/ M/56 Pogrubienie obecność badanej cechy * dodatkowe kopie sygnału (genu) # utrata sygnału (genu) nb nie badano

7 Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w PCM 645 W Ŝadnym z przypadków nie stwierdzono fuzji CCND1/IGH. Równoczesne powielenie liczby kopii genów CCND1 i IGH stwierdzono w 5 badaniach nr 2543, 1174, 918, 2490 i Ponadto w 5 dalszych przypadkach ujawniło się selektywne powielenie liczby kopii sygnałów CCND1 (nr 1136, 1098, 2761, 2481, 2541) w 21% do 76% plazmocytów [Rycina 1]. Dalsza analiza z uŝyciem sondy rozdzielczej wykazała, Ŝe powielenie to dotyczyło kompletnej kopii genu CCND1, bez jego rearanŝacji. Zmiany liczby kopii sygnałów IGH były dwojakiego rodzaju. Ze znaną fuzją (IGH/FGFR3) związane było wystąpienie 3 sygnałów tego genu w przypadku nr W 7 dalszych przypadkach zmiany liczby sygnałów IGH wystąpiły bez obecności badanych fuzji (FGFR3, MAF, CCND1). W 4 opisanych powyŝej (nr 1174, 918, 2490 i 2554) wystąpiło równoczesne powielenie sygnału genu CCND1 lub/i MAF. W jednym przypadku nr 2699 wykazano selektywne powielenie IGH do trzech sygnałów w kaŝdym wariancie badania (średnio w 43% plazmocytów). Badanie z uŝyciem sondy rozdzielczej wykazało, Ŝe nastąpiła tu rearanŝacja jednej z kopii genu, co wskazuje na obecność fuzji IGH z innym, nieznanym genem partnerskim. W dwóch kolejnych przypadkach nr 2489 i 2542 w kaŝdym z trzech wariantów badania wykazano utratę jednej kopii genu IGH w ok. 30% badanej populacji plazmocytów. Sondę znakującą gen TP53 zastosowano w 31 przypadkach. W Ŝadnym nie stwierdzono delecji badanego genu. Zwielokrotnienie liczby kopii genu TP53 obserwowano w 4 przypadkach, gdzie odnotowano powielenie wszystkich badanych obszarów do 3~4 kopii (nr 1174, 918, 2490, 2554). Masywną utratę materiału omosomu 13 stwierdzono w 11 przypadkach (36%), w których stwierdzono ubytki obu znakowanych regionów q14 i q34. U 4 z tych pacjentów obserwowane ubytki regionu 13q nie znalazły odzwierciedlenia w ocenianym uprzednio obrazie prąŝkowym (przypadki nr 1159, 1229, 1248, 2761). Ryc. 1. Wyznakowany plazmocyt z powieleniem CCND1 - sonda IGH/CCND1. IGH (sygnał zielony), CCND1 (sygnał czerwony) Fig. 1. Labeled plasma cell with CCND1 duplication IGH/CCND1 probe. IGH (green signal), CCND1 (red signal) W tabeli 4 zestawiono analizę 13 przypadków szpiczaka, która obejmowała detekcję liczby kopii obszarów znajdujących się na omosomach 3, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16 i 17. Określono liczbę kopii

8 646 J. RYGIER i wsp. genów FGFR3, CCND1, IGH, MAF,CBFB, TP53 oraz regionów 3qter i 8pter w odniesieniu do liczby odpowiednich centromerów. Na podstawie analizy liczby sygnałów wszystkich badanych regionów oceniono ploidię komórek tych 13 nowotworów w których analiza kariotypu nie powiodła się lub nie wykazała obecności komórek nieprawidłowych. Tabela 4. Zestawienie wyników c-ig-fish dla oceny ploidii. Table 4. List of c-ig-fish results for ploidy estimation. CEP 3 qter FGFR3 4 CEP 8 qter CEP Liczba kopii badanych regionów omosomów 9 CEP 11 CCND1 13 q34 14 IGH 15 CEP CEP 16 CBFB MAF TP53 17 Typ ploidii * T * T * 1# H * H # H # ?H ** * 2 3** NH * NH # NH # NH NH NH NH * rearanŝacji ** rearanŝacja # delecja lub monosomia T tetraploidia H hiperdiploidia NH nie-hiperdiploidia W dwóch przypadkach (nr 2554, 2490) wykazano równoczesne zwielokrotnienie (od 4 do 5) liczby kopii omosomu 3 (centromer 3 i qter), omosomu 8 (centromer i pter) oraz centromerów omosomu 9 i 15. Równocześnie stwierdzono powielenie liczby kopii sygnałów IGH (4 6 kopii), FGFR3 (3 6 kopii) oraz 4 kopie omosomu 11 (4 kopie kompletnego genu CCND1 i centromeru 11), a takŝe powielenie obszarów 13q i 17q (po 4 kopie). Obraz taki wskazuje na okołotetraploidalny (T) skład obu przypadków, przy czym obniŝenie liczby kopii genów MAF, CBFB i centromeru 16 do, odpowiednio, trzech i dwóch kopii, wskazują na relatywne (w stosunku do 4n) utraty kopii omosomu 16. W kolejnych 2 nowotworach (2761 i 2481) wykazano zwielokrotnienie liczby kopii omosomów 9 i 11 oraz (w przypadku 2761) omosomu 15, co sugeruje skład hiperdiploidalny z typowym powieleniem omosomów nieparzystych. Ponadto w przypadku 2761 obecne są dodatkowe zaburzenia omosomów 3 i 8. Obecność aberracji strukturalnej omosomu 3 wskazuje nietypowy wzór znakowania, z przewagą sygnałów 3q (2 sygnały centromeru i 3 sygnały 3qter). Utrata jednego sygnału tel 8p wobec dwóch kopii CEP 8, wskazuje na zaburzenia strukturalne omosomu 8.

9 Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w PCM 647 W przypadku nr 2569 zaobserwowano trzy kopie tel 3q i CEP3 (trisomia 3) oraz powielenie liczby kopii omosomu 16 (po 4 kopie CBFB, MAF i centromeru). Równocześnie ujawniono wybiórczą delecję obszaru telomerowego omosomu 8p i ubytek sygnału pochodzącego z omosomu 13 (q34), przy zachowaniu dwóch kopii IGH, FGFR3, TP53 oraz genu CCND1 i centromeru 11. Obraz taki sugeruje hiperdiploidię z obecnością masywnej delecji 13q lub monosomii 13. W przypadku nr 2555 zachowane zostały po dwie kopie większości badanych obszarów, jedynie ujawnione 3 kopie centromeru 9 i 15 wskazują na trisomie tych omosomów. W przypadku tym stwierdzono ponadto delecję 13q34 oraz monosomię 16 (równoczesne ubytki CBFB, MAF i centromeru 16). Obraz taki moŝe wskazywać na hipodiploidię z obecnością masywnej delecji 13q/monosomii 13 i utratę jednej kopii omosomu 16. Ostateczne określenie typu ploidii jest w tym przypadku wątpliwe (?H). W przypadku nr 2543 odnotowano po 3 kopie sygnałów IGH, FGFR3 z równoczesną ich kolokalizacją, co było związane z fuzją tych genów. W tym przypadku odnotowano ponadto 3 kopie niezrearanŝowanego genu CCND1 (powielenie) z równoczesnymi 2 sygnałami pochodzącymi z centromeru 11. Zachowanie dwóch kopii pozostałych badanych regionów wskazuje na hiperdiploidii. W kolejnym przypadku nr 2541 jedynym odstępstwem od obrazu prawidłowego były 3 kopie niezrearanŝowanego genu CCND1 z równoczesnymi 2 sygnałami pochodzącymi z centromeru 11. Zachowanie dwóch kopii pozostałych badanych regionów wskazuje na nie-hiperdiploidalny skład omosomów. W trzech kolejnych przypadkach (nr 2561, 2535 i 2496) stwierdzono po dwa sygnały ze wszystkich badanych obszarów, co wskazując na cech hiperdiploidii. DYSKUSJA Obserwacje zmian cytogenetycznych w szpiczaku plazmocytowym w kontekście przebiegu klinicznego choroby pozwoliło na określenie waŝnych czynników rokowniczych umoŝliwiających klasyfikację pacjentów do odpowiednich grup ryzyka [8, 25, 23]. Wiadomo, Ŝe zmiany uchwytne w klasycznej analizie kariotypu są wykrywane jedynie w ok. 1/3 przypadków, natomiast zastosowanie techniki FISH ujawnia obecność aberracji omosomowych u 80 90% pacjentów [2, 6]. Dlatego teŝ badanie c-ig-fish przeprowadzane, w miarę moŝliwości, równolegle z badaniem kariotypowym, jest w dalszym ciągu uŝyteczną metodą nie tylko diagnostyczną, ale teŝ słuŝącą poszukiwaniu dalszych cech genetycznego zróŝnicowania w szpiczaku. W badanej przez nas grupie pacjentów metafazy uzyskano w 79% analizowanych przypadków. Wśród nich uchwytne zmiany kariotypu udało się wykryć jedynie u 11% pacjentów. Znamiennie, były to przypadki z hipodiploidią i hipotetraploidią, a więc naleŝące do grupy przypadków z kariotypami kompleksowymi. Komórki nowotworowych plazmocytów charakteryzuje niestabilność genetyczna, której efektem są liczne aberracje kariotypowe. Przyjmuje się powszechnie, Ŝe pacjenci z licznymi zmianami kariotypowymi wykazują gorsze rokowanie. W pozostałych 98% przypadkach analizowanej kariotypowo grupy nie stwierdzono odchyleń od obrazu prawidłowego, co moŝe wynikać zarówno z u zmian uchwytnych mikroskopowo, jak i u aktywności mitotycznej komórek plazmatycznych w badanej populacji. Trudności te są udziałem większości laboratoriów i wynik nasz nie odbiega od prezentowanych w piśmiennictwie [ 2, 6, 7]. W badaniu FISH odsetek przypadków ze zmianami w naszej grupie pacjentów (75%) sytuuje się nieco poniŝej wartości prezentowanych w innych publikowanych badaniach (80 90%) [15, 24, 7]. Takie niedoszacowanie wynikać moŝe z u moŝliwości wykonania kompletu oznaczeń w niektórych analizowanych przypadkach, ze względu na dostatecznej ilości materiału do przeprowadzenia pełnej analizy. Zastosowanie techniki c-ig-fish i rozszerzenie panelu sond w duŝym stopniu podnosi jakość wykonywanych przez nas oznaczeń w stosunku do wyników uzyskiwanych w badaniu pełnej populacji szpiku (dane niepublikowane). Z grupy 17 szpiczaków, które w analizie prąŝkowej nie wyka-

10 648 J. RYGIER i wsp. zały obecności zmian kariotypowych, 14 poddano analizie c-ig-fish. W 4 przypadkach wykryto nieujawnioną wcześniej delecję fragmentu omosomu 13, obejmującą regiony 13q14 i 13q34. Brak tej masywnej zmiany w obrazie kariotypów wskazuje, Ŝe uzyskano podziały pochodzące z komórek prawidłowych. Dodatkowo w dwóch takich przypadkach analiza FISH wykazała zmiany dotyczące genów MAF, IGH lub CCND1. Delecja długiego ramienia omosomu 13, dawniej uznawana za czynnik niekorzystnego rokowania w szpiczaku plazmocytowym jest w części przypadków zmianą obejmującą niewielki obszar 13q14 bez utraty telomerowego obszaru 13q34 [26, 27, 28]. Aktualne badania wskazują na krótszy okres wolny od progresji i krótsze całkowite przeŝycie u pacjentów z aberracjami 13q, głównie masywnymi utratami, podczas gdy niewidoczne w kariotypie, małe delecje omosomu 13 wykrywalne jedynie metodą FISH, związane są z rokowaniem pośrednim [25]. Obecność zmian towarzyszących del(13q), szczególnie równoczesna obecność t(4;16) istotnie pogarszają efekty leczenia [11, 23, 25]. Analiza FISH w badanej przez nas grupie wykazała równoczesne utraty 13q14 i 13q34 w 36% analizowanych przypadków, co wskazuje na masywną delecję lub monosomię omosomu 13. Porównanie z wynikiem badania kariotypowego wykazało, Ŝe analiza FISH pozwoliła na detekcję masywnych delecji 13q w przypadkach, gdzie zmiany te nie ujawniły się w badaniu klasyczną metodą prąŝkową. Przyczyną takiego obrazu był najprawdopodobniej podziału plazmocytów w hodowli in vitro. W dwóch z nich badanie FISH wykazało dalsze aberracje, w tym liczby omosomów 3 i 8. RozbieŜność ta potwierdza, Ŝe w znacznej części kariotypowanych przypadków szpiczaka analizowane są komórki nie będące plazmocytami. Badania nasze potwierdzają, Ŝe analiza kariotypu w kierunku czynników rokowniczych w szpiczaku obarczona jest duŝym błędem wyników fałszywie negatywnych, równieŝ w obszarze aberracji teoretycznie uchwytnych w badaniu prąŝkowym. Zmianą submikroskopową, nieuchwytną w badaniu kariotypu jest delecja genu TP53 [8, 24, 25]. Delecja tego genu, zlokalizowanego na krótkim ramieniu omosomu 17 (17p13), posiada niezaleŝną wartość prognostyczną: związana jest z progresją choroby w zaawansowanym stadium i rozwijającą się opornością na chemioterapię [25]. W badanej przez nas grupie pacjentów w badaniu FISH nie wykryto przypadków z delecją TP53. Delecji TP53 nie wykazano równieŝ w dwóch badanych przypadkach okołotetraploidalnych. W badanej przez nas grupie nowotworów tylko w jednym przypadku stwierdzono obecność typowej, charakterystycznej dla szpiczaka fuzji. U jednego pacjenta wykazano jednoczesną obecność dwóch zmian rokowniczych: źle rokującą fuzję FGFR3/IGH i del(13)(q14q34). W Ŝadnym z badanych przypadków nie stwierdzono obecności źle rokującej fuzji IGH/MAF oraz dobrze rokującej fuzji CCND1/IGH. Wykazaliśmy jednak obecność nietypowej aberracji angaŝującej gen CCND1. W czterech przypadkach szpiczaka (21%), doszło do powielenia liczby kopii kompletnego genu CCND1, nie związane z jego wariantową translokacją ani z powieleniem liczby kopii całego omosomu 11. Wariantowe translokacje CCND1 są, przez analogie do IGH/CCND1, oceniane jako czynnik lepszego rokowania [WHO 2008], jednak wartość predykcyjna powielenia tego genu nie jest ostatecznie określona. Nieliczne prace w tym zakresie wskazują istotnie gorszą prognozę w przypadkach z powieleniem obszaru 11q [11], aczkolwiek inni autorzy uznają, Ŝe trisomia 11/powielenie niezrearanŝowanego genu CCND1 nie wpływa negatywnie na przebieg choroby [29]. Innymi rzadkimi aberracjami wykrytymi metodą FISH w badanej przez nas grupie szpiczaków były utraty fragmentu krótkiego ramienia omosomu 8 (w 15% ocenianych w tym zakresie szpiczaków), utraty omosomu 16 lub wybiórczo genu CBFB (w 30% przypadków). Sądzi się, Ŝe utraty krótkiego ramienia omosomu 8, wykrywane w 10 20% przypadków szpiczaków, są zwykle związane z niezrównowaŝonymi translokacjami, z udziałem całych ramion omosomów (whole-arm translocation) [11]. Między innymi, utrata 8p moŝe być związana z translokacją i równoczesnym zaburzeniem omosomu 1q [30]. Ocena innych powtarzalnych aberracji wymaga dalszych badań. Obserwowane przez nas w 15% grupy badanej metodą FISH utraty jednej kopii genu IGH są opisywane rzadko. Delecję jednej kopii

11 Poszukiwanie aberracji cytogenetycznych w PCM 649 IGH opisywano jako współwystępującą z del(13) [31]. Inna grupa badaczy upatruje w utracie kopii IGH wskaźnika wysokiej kompleksowości zmian w grupie szpiczaków z t(11;14) [32]. W badaniu c-ig-fish na podstawie analizy liczby sygnałów centromerów omosomów 3, 8, 9, 11, 13, 15, 16, regionów 3qter, 8pter, 13q14 i 13q34 oraz obszarów genów FGFR3, CCND1, IGH, CBFB, MAF i TP53 w obecnej pracy podjęto próbę określenia ploidii komórek nowotworu w 13 szpiczakach, w których analiza kariotypu nie powiodła się lub nie wykazała obecności komórek nieprawidłowych. W wyniku analizy przyporządkowano badane przypadki do zróŝnicowanych typów ploidii. Stwierdzono: dwa przypadki nowotworów okołotetraploidalnych, trzy przypadki hiperdiploidalne, jeden przypadek dostarczył powaŝniejszych trudności interpretacyjnych, poniewaŝ zawierał zarówno trisomie jak i monosomie, 7 przypadków określono jako nie-hiperdiploidalne, z liczbą omosomów w komórce w zakresie diploidii. W rutynowej analizie FISH w kierunku wykrycia cech niekorzystnego rokowania naleŝy odnosić uzyskane wyniki do ploidii badanej populacji plazmocytów. W analizie przypadków okołotetraploidalnych naleŝy zwracać uwagę na fakt, Ŝe obecność dwóch kopii regionu jest relatywnie zbyt niska i wskazuje poliploidyzację komórek z wyjściową delecją TP53, stanowiąc czynnik niekorzystnego rokowania. Zalecenie oceny ploidii dla prawidłowej interpretacji liczby kopii poszczególnych obszarów genomu w badaniu FISH jest podejmowane w literaturze przedmiotu [31]. Na podstawie uzyskanych wyników moŝna stwierdzić, Ŝe równoległe zastosowanie rozszerzonego panelu sond umoŝliwia nie tylko ocenę typowych fuzji, ale takŝe pozwala na określenie typu ploidii, co ma niepodwaŝalne znaczenie w przypadku oceny obecności istotnych rokowniczo delecji. PIŚMIENNICTWO 1. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL i wsp.who Classification of Tumours of Heamatopoietic and Lymphoid Tissues. IARC, Lyon Terpos E, Eleutherakis-Papaiakovou V, Dimopoulos MA. Clinical implications of omosomal abnormalities in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma 2006; 47(5): Greipp PR, San Miguel J, Durie BG i wsp. International staging system for multiple myeloma. J Clin Oncol. 2005; 23: Dmoszyńska A. Szpiczak mnogi nowe cele leczenia. Onkol Prak Klin. 2008; 5: Avet-Loiseau H, Li JY, Facon T i wsp. High incidence of translocations t(11;14)(q13;q32) and t(4;14)(p16;q32) in patients with plasma cell malignancies. Cancer Res. 1998; 58: Won Kyung Kwon, Jin Young Lee, Yeung Chul Mun i wsp. Clinical utility of FISH analysis in addition to G-banded karyotype in hematologic malignancies and proposal of a practical approach. Korean J Hematol. 2010; 45(3): Christensen JH, Abildgaard N, Plesner T i wsp. Interphase fluorescence in situ hybridization in multiple myeloma and monoclonal gammapathy of undetermined significance without and with positive plasma cell identification: analysis of 192 cases from the Region of Southern Denmark. Cancer Genet Cytogenet. 2007; 174: Ross FM, Avet-Loiseau H, Drach J i wsp. European myeloma group recommendations for FISH in myeloma. Haematologica. 2007; 92(suppl. 2): PO Fonseca R, Barlogie B, Bataille R i wsp. Genetics and Cytogenetics of Multiple Myeloma: A Workshop Report. Cancer Res. 2004; 64: Shaugnessy J, Jacobson J, Sawyer J i wsp. Continuous absence of metaphase-defined cytogenetic abnormalities, especially of omosome 13 and hipodiploidy, ensures long-term survival in multiple myeloma treated with total therapy: interpretation in the context of global gene expression. Blood. 2003; 101: Guetierrez NC,Garcia JL, Hernandez JM I wsp. Prognostic and biologic significance of omosomal imbalances assessed by comparative genomic hybridization in multiple myeloma. Blood. 2004; 104(9): Fonseca R, Bergsagel PL, Drach J i wsp. International Myeloma Working Group molecular classification of multiple myeloma: spotlight review. Leukemia. 2009; Wuilleme S, Robillard N, Lode L i wsp. Deletion 13q14 and secondary IgH translocations were egally distributed between plidy groups. Leukemia: 2005; 19: Put N, Lemmens H, Wlodarska I i wsp. Interphase Fluorescence In Situ Hybridization on Selected Plasma Cells is Superior in the Detection of Cytogenetic Aberrations in Plasma Cell Dyscrasia. Genes Chromosomes Cancer. 2010; 49: Fassas AB, Spencer T, Sawyer J i wsp. Both hipodiploidy and deletion of omosome 13 independently confer poor prognosis in multiple myeloma. Br J Haemat. 2002; 118:

12 650 J. RYGIER i wsp. 16. Bergsagel PL, Kuehl M. Molecular Pathogenesis and Consequent Classification of Multiple Myeloma. J Clin Oncol. 2005; 23: Stewart AK, Bergsagel PL, Greipp PR i wsp. A practical guide to defining high- risk myeloma for clinical trials, patient counseling and choice of therapy. Leukemia. 2007; 21: Fonseca R, Debes-Marun CS, Picken EB i wsp. The recurent IgH translocations are highly associated with nonhiperdiploid variant multiple myeloma. Blood.2003; 102: Hanamura I, Stewart JP, Huang Y i wsp. Frequent gain of omosome band 1q21 in plasma-cell dyscrasias detected by fluorescence in situ hybridization: incidence increases from MGUS to relapsed myeloma and is related to prognosis and disease progression following tandem stem-cell transplantation. Blood. 2006; 108: Sawyer JR, Tricot G, Mattox S i wsp. Jumping translocations of omosome 1q in multiple myeloma: evidence for a mechanism involving decondensation of pericentromeric heteroomatin. Blood. 1998; 91: Sawyer JR, Tricot G, Lukacs JL i wsp. Genomic instability in multiple myeloma: evidence for jumping segmental duplications of omosome arm 1q. Genes Chromosomes Cancer. 2005; 42: Kundu M, Chen A, Anderson S i wsp. Role of Cbfb in hematopoiesis and perturbations resulting from expression of the leukemogenetic fusion gene Cbfb/MYH11. Blood. 2002; 100(7): Fonseca R, Bergsagel PL. Diagnosis and genetic classification of multiple myeloma w Rajkumar SV, Kyle RA. Treatment of multiple myeloma and related disorders. Wyd. Cambridge University Press Fiserova A, Hajek R, Holubova V i wsp. Detection of abnormalities in multiple myeloma using immunomagnetically selected plasma cells. Neoplasma. 2002; 49: Kumar SK, Mikhael JR, Buadi FK i wsp. Management of newly diagnosed symptomatic multiple myeloma: updated Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy (msmart) consensus guidelines. Mayo Clin Proc. 2009; 84: Seong C, Delasalle K, Hayes K i wsp. Prognostic value of cytogenetics in multiple myeloma. Br J Haemat. 1998; 101: Facon T, Avet-Loiseau H, Guillerm G i wsp. Chromosome 13 abnormalities identified by FISH analysis and serum beta- 2-microglobulin produce a powerful myeloma staging systems for patients receiving high-dose therapy. Blood. 2001; 95: Zojer N, Kögsberg R, Ackermann J i wsp. Deletion of 13q14 remains an independent adverse prognostic variable in multiple myeloma despite its frequent detection by interphase fluorescesnce in situ hybridization. Blood. 2000; (6) Gugliemelli T, Gugliano E, Cappia S i wsp. Frequency and distribution of trisomy 11 in multiple myeloma patients: relation with overexpression of CCND1 and t(11;14). Cancer Genet Cytogenet. 2007; 173(1): Brigaudeau C. 1q rearrangements in multiple myeloma. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 1998; 2(3): Koren-Michowitz M, Hardan I, Berghoff J. i wsp.chromosome 13q deletion and IgH abnormalities may be both masked by near-tetraploidy in high proportion of multiple myeloma patients: a combined morphology and I-FISH analysis. Cancer Lett. 2007; 255(2): Trakhtenbrot L, Hardan I, Koren-Michowitz M i wsp. Correlation between losses of IGH or its segments and deletions of 13q14 in t(11;14)(q13;q32) multiple myeloma. Genes Chromosomes Cancer. 2010; 49: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Jolanta Rygier Samodzielna Pracownia Cytogenetyki Centrum Onkologii- Instytut Warszawa ul. Roentgena 5 jrygier@gmail.com