POLITECHNIKA POZNAŃSKA WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ. Z a k ł a d C h e m i i O r g a n i c z n e j. Mgr inż. Magdalena Szubert ROZPRAWA DOKTORSKA

Transkrypt

1 POLITECHNIKA POZNAŃSKA WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ INSTYTUT TECHNOLOGII I INŻYNIERII CHEMICZNEJ Z a k ł a d C h e m i i O r g a n i c z n e j Mgr inż. Magdalena Szubert ROZPRAWA DOKTORSKA Modyfikacja warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych oraz ocena właściwości otrzymanych modyfikatów Promotor: Prof. dr hab. inż. Adam Voelkel Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego i przedłożona Radzie Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej w celu uzyskania stopnia doktora Poznań 2014

2 Składam serdeczne podziękowania Promotorowi pracy Panu Prof. dr hab. inż. Adamowi Voelkelowi za wsparcie, przekazaną wiedzę, wszystkie cenne uwagi oraz za wyjątkowo życzliwą atmosferę sprzyjającą realizacji pracy naukowej. Dziękuję również Pani dr inż. Katarzynie Adamskiej za wszelką pomoc, możliwość współpracy, zaangażowanie w tematykę oraz niezwykłą cierpliwość okazaną w trakcie moich studiów doktoranckich. Osobne podziękowania składam Mamie oraz Mężowi za to, że zawsze mogę na nich liczyć, za ich postawę, która sprawiła że wszystkie zaistniałe problemy były dla mnie mniej odczuwalne, za bezcenne wsparcie, otuchę, motywację i wszystko co każdego dnia dla mnie robią. Magdalena Szubert

3 Badania realizowane podczas pracy doktorskiej zostały częściowo wykonane w ramach projektów badawczych finansowanych przez Narodowe Centrum Nauki o numerach N N oraz 2012/05/N/ST8/03745 To nie jest koniec, to nawet nie jest początek końca, to dopiero koniec początku Winston Churchil

4 Spis treści Spis treści Wykaz akronimów i symboli stosowanych w pracy:... 7 WPROWADZENIE... 8 CZĘŚĆ TEORETYCZNA Biomateriały (wiadomości ogólne) Biomateriały ceramiczne Rys historyczny Charakterystyka biomateriałów ceramicznych Hydroksyapatyt (HA) β-fosforan trójwapniowy (β-tcp) Połączenie bioceramiki z tkanką kostną Właściwości biomateriałów ceramicznych Warstwa wierzchnia Modyfikacje warstwy wierzchniej biomateriałów Modyfikacja warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych Modyfikatory Techniki charakterystyki materiałów Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) Spektroskopia tłumionego całkowitego odbicia wewnętrznego, ATR Spektroskopia Ramana Dyfraktometria rentgenowska, XRD Spektroskopia fotoelektronów w zakresie promieniowania X, XPS Potencjał dzeta Inne techniki charakterystyki warstwy wierzchniej Odwrócona chromatografia gazowa, IGC Odwrócona chromatografia cieczowa, ILC Kąt zwilżania Skaningowa mikroskopia elektronowa, SEM Możliwości zastosowań otrzymanych modyfikatów Materiały dentystyczne

5 Spis treści 8.2. Nośniki leków CEL PRACY CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Wykaz odczynników stosowanych w pracy Procedura Stosowane metody badań oraz aparatura badawcza Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) Spektroskopia tłumionego całkowitego odbicia wewnętrznego, ATR Spektroskopia Ramana Spektroskopia fotoelektronów w zakresie promieniowania X, XPS Osteoindukcyjność i bioaktywność SEM/EDS Pomiar ph Degradowalność Masa względna i sorpcja wody Potencjał dzeta Uwalnianie leku WYNIKI I DYSKUSJA Ocena procesu modyfikacji Hydroksyapatyt oraz jego modyfikaty Hydroksyapatyt niemodyfikowany HA+HMDI+PEG HA+HMDI+pHEMA HA+HMDI+PAA HA+LLA HA+HMDI+LLA HA+PLLA HA+HMDI+MMA HA+PHB β-fosforan trójwapniowy oraz jego modyfikaty β-fosforan trójwapniowy niemodyfikowany β-tcp+hmdi+peg β-tcp+hmdi+phema β-tcp+phb β-tcp+hmdi+mma

6 Spis treści β-tcp+lla β-tcp+ ε-cl β-tcp+pcl Wydajność przeprowadzonych procesów modyfikacji Stopień pokrycia powierzchni (ρ) Ocena właściwości otrzymanych modyfikatów Osteoindukcyjność oraz bioaktywność Stabilność chemiczna (ph oraz potencjał dzeta) Degradacja Sorpcja wody Uwalnianie leku Synteza HA oraz β-tcp Modyfikowany materiał dwufazowy PODSUMOWANIE LITERATURA STRESZCZENIE ABSTRACT DOROBEK NAUKOWY

7 Wykaz akronimów i skrótów Wykaz akronimów i symboli stosowanych w pracy: β -TCP - β-fosforan trójwapniowy ε-cl - kaprolakton ATR - spektroskopia tłumionego całkowitego odbicia wewnętrznego CTAB- bromek heksadecylotrimetyloamonowy DBTDL - dibutylodilaurynian cyny DMF dimetyloformamid EDS spektroskopia z dyspersją energii FTIR spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera HMDI heksametylodiizocyjanian HA hydroksyapatyt HCl - kwas solny IGC odwrócona chromatografia gazowa ILC odwrócona chromatografia cieczowa MMA - metakrylan metylu NMR spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego PEG - glikol poli(oksyetylenowy) phema poli(metakrylan hydroksyetylu) PHB - poli(3-hydroksymaślan) PCL - poli(ε-kaprolakton) PLA polilaktyd SBF płyn symulujący płyn ustrojowy SEM skaningowa mikroskopia elektronowa THF - tetrahydrofuran Tris trihydroksyaminometan XPS spektroskopia fotoelektronów XRD dyfraktometria rentgenowska 7

8 Wprowadzenie WPROWADZENIE Problematyka dotycząca biomateriałów, modyfikacji ich powierzchni, oznaczania ich właściwości fizykochemicznych oraz biologicznych jest złożona, gdyż dotyczy ona wielu dziedzin nauki. Zagadnienia, z którymi należy się zmierzyć dotyczą problemów interdyscyplinarnych, z zakresu technologii chemicznej, inżynierii materiałowej, biotechnologii oraz medycyny. Dlatego zaprojektowanie oraz komercjalizacja uzyskanych wyników pozwalająca na wprowadzenie nowych materiałów do praktyki klinicznej są realne tylko przy ścisłej współpracy specjalistów z wyżej wymienionych dyscyplin naukowych. Propozycją ze strony technologii chemicznej a właściwie chemii organicznej jest manipulacja właściwości biomateriałów poprzez modyfikację ich warstwy wierzchniej. Szczególną uwagę zwrócono na materiały ceramiczne bazujące na hydroksyapatycie oraz β-fosforanie trójwapniowym. Materiały te znajdują zastosowanie głównie w chirurgii stomatologicznej oraz kostnej do rekonstrukcji ubytków kostnych. Obserwowany proces starzenia się społeczeństwa powoduje zwiększenie popytu na materiały implantacyjne wykorzystywane w leczeniu złamań układu kostnoszkieletowego, protez stosowanych jako uzupełnienia po leczeniu nowotworów złośliwych, a także implantów stomatologicznych. Pomimo znacznego zapotrzebowania, wciąż brakuje na rynku biomateriału spełniającego wszystkie wymagania nowoczesnej medycyny, stąd potrzebne są badania o założeniach podjętych podczas realizowanej pracy doktorskiej. Zakres pracy doktorskiej stanowi bezpośredni łącznik pomiędzy nauką doświadczalną, prowadzoną w laboratorium, a przedsiębiorstwami produkcyjnymi, ponieważ uzyskane wyniki powinny znaleźć realizację w masowej produkcji wyrobów medycznych. W trakcie lektury dostępnej literatury narastało przekonanie, że obiecującymi materiałami będę modyfikaty, w których składnik organiczny będzie związany z podłożem wiązaniem kowalencyjnym. Zastosowanie modyfikowanych materiałów o unikatowych właściwościach pozwoli na szybszy powrót do zdrowia, zmniejszenie powikłań okołooperacyjnych, poprawę gojenia rany i ograniczenie konieczności powtórnej ingerencji chirurgicznej, co wpłynie na zmniejszenie bólu pacjentów. Również względy ekonomiczne odgrywają tu znaczną rolę, gdyż koszty zabiegów oraz operacji chirurgicznych mających na celu wszczepienie różnego rodzaju 8

9 Wprowadzenie implantów lub biomateriałów wahają się od kilku do kilkudziesięciu tysięcy złotych. Podobnie wysokie bywają koszty związane z długotrwałą rehabilitacją i absencją pacjenta w pracy zawodowej. Pomimo tego, że podjęta w niniejszej pracy tematyka biomateriałów jest obszarem zainteresowań wielu ośrodków badawczych na całym świecie ciągle wymaga wprowadzania nowych rozwiązań. Wiele z zaproponowanych w pracy związków nie było dotychczas stosowanych jako modyfikatory warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych. Ponadto opracowano nowatorskie metody syntezy oraz modyfikacji biomateriałów ceramicznych. W wielu opublikowanych pracach naukowych dotyczących tematyki modyfikacji biomateriałów zagadnienie przebiegów reakcji oraz mechanizmów zachodzących pomiędzy ich warstwą wierzchnią oraz cząsteczkami modyfikatora jest pomijane. Ponadto, wielu autorów uważa za trwałą modyfikację powierzchni fizyczne zmieszanie HA lub β-tcp z innymi materiałami. Wiadomo jednak, że w takim wypadku nie zachodzi reakcja chemiczna a jedynie tworzą się materiały kompozytowe, które znacznie różnią się właściwościami od charakteryzowanych w niniejszej pracy modyfikatów. 9

10 Część teoretyczna Rozdział 1 CZĘŚĆ TEORETYCZNA 1. Biomateriały (wiadomości ogólne) Po raz pierwszy pojęcie biomateriał zostało zdefiniowane podczas Konferencji Biomateriałów Biomaterials Consensus Conference at the National Institute of Health w 1982 r. Zgodnie z ustaleniami od tego czasu przyjmuje się następującą definicję: biomateriał jest to każda substancja (inna niż lek) albo kombinacja substancji syntetycznych lub naturalnych, która może być użyta w dowolnym czasie, a której zadaniem jest uzupełnianie lub zastąpienie tkanek narządu lub jego części w celu spełnienia ich funkcji [1 3]. Cechą wspólną wszystkich biomateriałów jest fizjologiczna akceptacja przez żywy organizm, która warunkuje ich zastosowanie w medycynie. Wynika ona z podobieństwa zarówno pod względem chemicznym, biologicznym jak i mechanicznym poszczególnych biomateriałów do tkanek których funkcje mają zastąpić lub wspomóc [3]. Bardzo ważnymi właściwościami charakteryzującymi biomateriały są brak toksyczności i immunogenności, czyli ich obojętność chemiczna oraz farmakologiczna aby nie wywoływały reakcji alergicznych, kancerogennych ani cytotoksycznych [1]. W zależności od przeznaczenia materiału mogą one również wykazywać takie właściwości jak bioaktywność, degradowalność, biostabilność, osteoindukcyjność oraz osteokondukcyjność, o których mowa będzie w dalszej części pracy. Omawiając zagadnienia związane z biomateriałami należy także wspomnieć o urządzeniach medycznych składających się z jednego lub więcej biomateriałów, czyli o implantach. Implanty mogą być umieszczone całkowicie lub częściowo pod powierzchnią nabłonka oraz mogą pozostać przez dłuższy czas w organizmie [4]. Ze względu na różnorodność biomateriałów pod względem charakteru chemicznego oraz struktury, klasyfikację materiałów wszczepowych możemy dokonać stosując różne kryteria. Dla ułatwienia zostały one przedstawione w tabelach

11 Część teoretyczna Rozdział 1 Tabela 1Podział biomateriałów ze względu na pochodzenie (opracowanie własne na podstawie piśmiennictwa [1,3]) Rodzaj Pochodzenie Zalety Wady materiałów materiałów autogenne (autologiczne) tkanki własne brak bariery immunologicznej podwójna ingerencja chirurgiczna powodujący dobre wgajanie osłabienie kości w operowanym miejscu właściwości osteogenne, przedłużony czas zabiegu indukcyjne i kondukcyjne dolegliwości pooperacyjne izogenne (syngenne) bliźniak jednojajowy lub brak reakcji odrzucenia bardzo ograniczona dostępność materiału bliski krewny przeszczepu spowodowany podobieństwem genetycznym dawcy i biorcy brak doniesień literaturowych na temat tego typu przeszczepów allogenne (homologenne) ksennogenne (heterogenne) alloplastyczne (syntetyczne) osobnik tego samego gatunku (nie spokrewniony) materiał pozyskiwany z banku tkanek eliminacja przeprowadzenia podwójnego zabiegu chirurgicznego zwierzęce struktura zbliżona do kości ludzkiej zdolności osteokondukcyjne możliwość pozyskania dużej ilości materiału syntetyczne brak możliwości przeniesienia chorób zakaźnych oraz wirusowych możliwość uzyskania dowolnej ilości materiałów różnorodność materiałów zwiększająca obszary ich zastosowań możliwość wystąpienia konfliktu immunologicznego powodującego obumarcie wszczepu możliwość wystąpienia konfliktu immunologicznego powodującego obumarcie wszczepu trudność uzyskania materiałów o właściwościach (m.in. mechanicznych lub biologicznych) zbliżonych do materiałów naturalnych W tabeli 2 zaprezentowano rodzaje biomateriałów wraz z ich najważniejszymi zastosowaniami w medycynie. Każda grupa materiałów ze względu na swoje odmienne od pozostałych właściwości może spełniać inne funkcje w organizmie. Warto więc 11

12 Część teoretyczna Rozdział 1 podkreślić już na samym początku pracy, że nie istnieje i nie może istnieć jeden idealny biomateriał spełniający wszystkie wymagania stawiane materiałom implantacyjnym. Dlatego przydatność każdego materiału powinna być rozpatrywana indywidualnie pod kątem jego przyszłych zastosowań. Biorąc pod uwagę wady oraz zalety wszystkich grup biomateriałów (tab. 2) ciekawym rozwiązaniem wydaje się połączenie różnych rodzajów materiałów w taki sposób aby wykorzystać jak najwięcej zalet oraz wyeliminować wady stosowanych materiałów. Dlatego właśnie coraz większą uwagę poświęca się materiałom kompozytowym oraz modyfikacji powierzchni pozostałych materiałów. Obecnie materiałami najszerzej stosowanymi w medycynie są polimery (46%), następnie metale i ich stopy (37%), materiały kompozytowe (12%), ceramiczne (4%) a grupą o najmniejszym zastosowaniu są materiały węglowe (1%) [8]. Użyteczność polimerów wynika z ich różnorodnych właściwości fizycznych, chemicznych a także materiałowych. Występują one w postaci ciał stałych, cieczy, filmów, tkanin oraz żeli. Polimery naturalne to materiały wytworzone w organizmach żywych jako składniki strukturalne tkanek. Zalicza się do nich takie białka jak: kolagen, fibrynogen i jedwab oraz następujące wielocukry: celulozę i chitynę. Syntetyczne polimery stosowane w medycynie należą do dwóch grup. Są to polimery niedegradowalne lub polimery biodegradowalne i bioresorbowalne [5]. Wśród pierwszej grupy największe zastosowanie znalazły: silikony, poli(tetrafluoro etylen) (PTFE), poliuretany (PU), polietylen (PE), polipropylen (PP), poli(tereftalan etylenu) (PET), poli(metakrylan metylu) (PMMA) oraz poliamidy (PA). Natomiast do polimerów biodegradowalnych i bioresorbowalnych w organizmie zalicza się przede wszystkim: poli(kwasy glikolowe) (PGA), poli(kwasy mlekowe) (PLA), poli(laktydo-co-glikolidy) (PLGA) [3,5]. 12

13 Tabela 2 Podział biomateriałów ze względu na rodzaj. Opracowanie własne na podstawie literatury [4-7] Rodzaj biomateriałów metaliczne polimerowe Podział Zalety Wady Ważniejsze zastosowania stale austenityczne stopy na osnowie kobaltu wysoka wytrzymałość mechaniczna tytan i jego stopy odporność na zużycie cierne stopy z pamięcią jednorodność kształtu akceptowalne koszty wytwarzania naturalne łatwość produkcji (biopolimery) możliwość sterowania właściwościami podobieństwo syntetyczne parametrów fizycznych do parametrów tkanek odporność korozyjna możliwość ponownego przetwarzania podatność na korozję ryzyko wystąpienia odczynów alergicznych możliwość utworzenia zakrzepów brak pełnej akceptowalności przez ludzki organizm nieodpowiednie właściwości mechaniczne (moduł sztywności) trudność sterylizacji toksyczność produktów degradacji (polimery niedegradowalne) brak odporności na działania temperatury endoprotezy stawowe płytki i wkręty stosowane do zespoleń odłamów kostnych stenty elektrody w rozruszniku serca panewki endoprotez stawów nici chirurgiczne protezy więzadeł zastawki serca elementy konstrukcyjne sztucznego serca wypełnienia ubytków kostnych wypełniania podskórne przy redukcji zmarszczek implanty stosowane w chirurgii plastycznej kleje chirurgiczne nośniki leków cewniki 13

14 ceramiczne kompozytowe resorbowalne w organizmie z kontrolowaną reaktywnością w organizmie obojętne odporność korozyjna wytrzymałość na ściskanie odporność na ścieranie wysoka inertność w środowisku tkankowym twardość biotolerancja dyspersyjne możliwość sterowania parametrami wzmacniane cząstkami wzmacniane włóknami decydującymi o właściwościach materiałów szeroki zakres zastosowań kruchość, podatność na pękania niska wytrzymałość na zginanie brak odkształcalności nieodporność na obciążenia dynamiczne ograniczenia w doborze biozgodnych włókien dodatek do cementów dentystycznych pokrycia implanów uzupełnienie ubytków kostnych nośniki leków w inżynierii tkankowej do sterowanej regeneracji tkanek w chirurgii kostnej do spełnienia funkcji biomechanicznych węglowe warstwy węglowe inertność w środowisku tkankowym włókna węglowe kompozyty węgielwęgiel zdolność do sorpcji oraz desorpcji przy określonym ph szeroki zakres możliwości modyfikacji powierzchni kruchość nieodporność na ścieranie ryzyko wystąpienia reakcji zapalnych nośniki leków element kompozytów leczenie ubytków tkanki chrzęstnej, miękkiej i kostnej oraz narządów 14

15 Część teoretyczna Rozdział 1 Zastosowanie metali jako materiałów o przeznaczeniu medycznym wynika z ich wysokiego przewodnictwa elektrycznego oraz cieplnego. Dzięki wolnym (niesparowanym) elektronom obecnych w cząsteczkach metali mogą one przekazywać ładunek elektryczny i energię cieplną [7]. Niestety, implantowanie materiałów metalicznych stwarza problemy praktyczne, gdyż stosowanie medycznych metod diagnostycznych takich jak rezonans magnetyczny oraz tomografia komputerowa jest w ich przypadku bardzo ograniczone [8]. Najstarszą grupą materiałów metalicznych jest stal austenityczna, której głównym przedstawicielem jest stal chromowo-niklowomolibdenowa (CrNiMo). Wytwarza się ją w postaci taśm, blach, prętów. Na uwagę zasługują również stopy na osnowie kobaltu, które cechuje wyższa od stali austenitycznej biotolerancja w środowisku płynów ustrojowych oraz, co bardzo ważne wyższa odporność na korozję wżerową i szczelinową. Do tego typu materiałów zalicza się: odlewniczy CoCrMo oraz kute na gorąco CoNiWMo, CoCrWNi i CoNiCrMoWFe [4,6,7]. Powszechnie stosowanymi materiałami implantacyjnymi są tytan oraz stopy tytanu (przede wszystkim Ti6Al4V oraz Ti6Al7Nb). Przewagą tych materiałów nad stalami jest ich mniejszy ciężar właściwy i dlatego właśnie materiały tytanowe są stosowane na endoprotezy stawowe. Ostatnią, bardzo interesującą grupą biomateriałów metalicznych są stopy z pamięcią kształtu. Efekt pamięci objawia się tym, że odkształcony plastycznie w niższej temperaturze stop odzyskuje swój początkowy stan w temperaturze wyższej, co jest związane z odwrotną przemianą martenzytyczną tych materiałów. Do stopów z pamięcią kształtu należy Nitinol czyli stop TiNi. Kompozyty składają się z co najmniej dwóch materiałów, z których każdy charakteryzuje się odmiennymi właściwościami, natomiast właściwości kompozytu muszą różnić się od właściwości faz składowych i są uzależnione od udziałów objętościowych tych faz [4,8]. Kompozyty węglowe o właściwościach zbliżonych do właściwości tkanek miękkich i kostnych znalazły szerokie zastosowanie w medycynie i dlatego właśnie w wielu opracowaniach dotyczących biomateriałów materiały kompozytowe opisywane są razem z materiałami węglowymi. Ze względu na to, że materiały ceramiczne są tematem niniejszej pracy zostaną one omówione bardziej szczegółowo w osobnym rozdziale. 15

16 Część teoretyczna Rozdział 2 Ostatnią grupą biomateriałów wszczepowych o najmniejszym zastosowaniu w medycynie są materiały węglowe. Należą do nich warstwy węglowe które dzielą się na warstwy diamentowe oraz warstwy diamentowopodobne. Do grupy materiałów węglowych zalicza się również otrzymywane z celulozy czy poli(akrylonitrylu) włókna węglowe oraz kompozyty węgiel-węgiel, w których zarówno osnowę jak i wzmocnienie stanowią materiały węglowe [3]. 2. Biomateriały ceramiczne 2.1. Rys historyczny Pierwszymi materiałami ceramicznym użytymi do regeneracji kości były fosforan sodu oraz siarczan(vi) wapnia (XIX wiek), jednakże próby te nie przyniosły oczekiwanych rezultatów. Lepsze efekty otrzymano stosując kolejny materiał jakim był porowaty tlenek glinu nasycony żywicą epoksydową (do 1971 r.). Pomyślność badań nad tlenkiem glinu doprowadziła do rozpoczęcia w 1972 r. produkcji endoprotez wykonanych z tego materiału. Po serii badań klinicznych stwierdzono, że tlenek glinu cechuje obojętność w środowisku tkankowym. Od 1976 r. podejmowano próby wprowadzenia endoprotezy biodrowej oraz całkowitej endoprotezy stawu biodrowego z elementami bioceramicznymi. Od 1972 r. prowadzono badania nad szklistymi materiałami ceramicznymi. Wytworzono nowy biomateriał w postaci szkła zawierający tlenek fosforu (V). Pomimo tego, iż odtąd rozwój dziedziny bioceramiki następuje bardzo dynamicznie, do dziś wiele problemów nie zostało do końca rozwiązanych i do dnia dzisiejszego prowadzone są intensywne badania nad udoskonaleniem biomateriałów ceramicznych [4,6,7] Charakterystyka biomateriałów ceramicznych W zależności od przeznaczenia materiału, w literaturze wyróżnia się trzy rodzaje ceramiki biomedycznej: resorbowalną w organizmie - ceramika hydroksyapatytowa 16

17 Część teoretyczna Rozdział 2 Materiały zawierają pierwiastki i związki, które biorą udział w metabolizmie i wnikają do tkanek. W wyniku resorpcji, której ulegają, służą jako rusztowanie lub wypełnienie rekonstruujących się tkanek [4]. Grupa biomateriałów ceramicznych resorbowalnych w organizmie jest przedmiotem badań wielu naukowców. W grupie tych materiałów znajdują się ortofosforany wapnia. Szczególne znaczenie w implantologii posiada hydroksyapatyt oraz β-fosforan trójwapniowy, które zostały opisane poniżej. Cechują się one najwyższą wśród wszystkich biomateriałów biotolerancją oraz zdolnością do ścisłego łączenia się z kością. W syntetycznych tworzywach hydroksyapatytowych szybkość resorpcji jest uwarunkowana zawartością fazy krystalicznej w ten sposób, że im mniej tej fazy tym szybciej następuje proces resorpcji. Istotny wpływ ma także stosunek molowy Ca/P, ponieważ wraz z jego wzrostem rozpuszczalność oraz resorpcja maleje [7]. z kontrolowaną reaktywnością powierzchniową bioszkła Materiały te, tak jak poprzednia grupa, tworzą bardzo silne wiązania z tkanką. Ich skład chemiczny i fazowy dobrany jest w taki sposób, aby powierzchnia implantu reagując ze środowiskiem tkankowym oraz z płynami ustrojowymi wytworzyła określone reakcje prowadzące do powstania połączeń substancji organicznych z nieorganicznymi. Do przedstawicieli tej grupy materiałów należą bioszkła oraz materiały bioszklanoceramiczne. Skład chemiczny najczęściej stosowanej grupy bioszkieł oparty jest na układzie potrójnym Na2O-SiO2-CaO. Czynnikiem limitującym zastosowanie tej grupy związków jest obecność trudno resorbowalnej w organizmie krzemionki, której zachowanie się w warunkach in vivo nie jest w pełni poznane. Dlatego właśnie obecnie trwają badania nad zastosowaniem bioszkieł, których skład chemiczny oparty jest na układzie potrójnym CaO-P2O5-Na2O. Stosuje się także różnego rodzaju dodatki, np.: Al2O3, P2O5, CaF2, MgO modyfikujące skład bioszkieł. Dodatki te są stosowane w celu polepszenia właściwości materiałów: obecność Al2O3 wpływa na powstawanie warstwy krzemionkowej i apatytowej natomiast wprowadzenie P2O5 i F powoduje zwiększenie rozpuszczalności i reaktywności. Dużą zaletą sterowania składem chemicznym bioszkieł jest modelowanie ich właściwości fizycznych, chemicznych a także bioaktywnych [9]. obojętną ceramika korundowa (Al2O3), cyrkonowa (ZrO2) 17

18 Część teoretyczna Rozdział 2 Materiały obojętne (inertne) to materiały, które w kontakcie ze środowiskiem biologicznym nie ulegają zmianom, nie działają toksycznie na organizm, nie uwalniają do otaczającej tkanki żadnych jonów. Natomiast reakcja organizmu żywego na obecność materiałów inertnych przejawia się wytworzeniem cienkiej, włóknistej tkanki otaczającej wszczep. Ze względu na to, że materiały ceramiczne obojętne nie łączą się chemicznie z tkanką włóknistą, ich umiejscowienie polega na perforacji w implancie w który wrasta tkanka. Najszersze zastosowanie w medycynie, ze względu na właściwości biologiczne (wysoką biotolerancję) oraz mechaniczne (wysoka wytrzymałość na ściskanie, zginanie i ścieranie) znalazł tlenek glinu (biokorund). Stosuje się go w stomatologii (chirurgii szczękowej) oraz ortopedii (pokrycia główek endoprotez metalicznych) [7,9] Hydroksyapatyt (HA) Tkanka kostna składa się z części organicznej (30% masy kostnej) oraz z części mineralnej (70% masy kostnej). Część organiczną stanowią komórki kostne oraz głównie kolagen, natomiast 95% części mineralnej wypełniona jest kryształami HA. Polipeptydowy łańcuch kolagenu złożony z 1000 aminokwasów w tkance kostnej występuje w postaci krystalicznej. Kryształy HA są w kolagenie odpowiednio ukierunkowane, długie osie kryształów zorientowane są równolegle do osi fibryli tworzących osnowę. Duża liczba jonów zaadsorbowana na powierzchni hydroksyapatytów aktywnie uczestniczy w wymianie ładunku z jonami z otaczającego środowiska [4,10]. Hydroksyapatyt (HA) jako główny mineralny składnik kości magazynuje większość zawartego w organizmie wapnia (99%) oraz fosforu (85%). Jego kryształy stanowią aż 77% masy organicznego podścieliska, z którego zbudowane są kości. HA jest również głównym mineralnym składnikiem zębiny [11]. W postaci czystej, bez domieszek, w stanie surowym oraz po wypaleniu HA jest barwy białej. Wykazuje właściwości sorpcyjne wobec śliny, lipidów, kwasów tłuszczowych [5]. Jest nierozpuszczalny w zasadach, słabo rozpuszczalny w wodzie, ale rozpuszcza się w kwasach. Gęstość rentgenograficzna HA wynosi 3,156 g/cm 3. 18

19 Część teoretyczna Rozdział 2 Rysunek 1Wzór półstrukturalny HA o wzorze sumarycznym Ca 10(PO 4) 6(OH) 2 Chemicznie HA jest to sześcioortofosforan (V) dwuwodorotlenek dziesięciowapnia o wzorze ogólnym Ca10(PO4)6(OH)2 (rys. 1) i stosunku molowym Ca/P wynoszącym 1,667. Skład HA w przeliczeniu na tlenki przedstawia się następująco [6,11]: CaO 55,8% P2O5 42,4% H2O 1,8% Wyróżnia się trzy różne rodzaje HA [4,6,11]: mineralogiczny apatyty występujące w przyrodzie nieożywionej, w skałach magmowych, niektórych wapiennych skałach metamorficznych oraz fosforanowych skałach osadowych. Apatyty są ważnym surowcem przy produkcji nawozów sztucznych, dla przemysłu metalurgicznego, szklarskiego oraz ceramicznego. Pochodzące z języka greckiego słowo apatyt oznacza oszustwo i po raz pierwszy zostało użyte w 1790 r. dla nowo odkrytej grupy minerałów, które stwarzały wiele trudności ówczesnym badaczom. biologiczny występuje w przyrodzie ożywionej jako podstawowy składnik kości i zębów a także wchodzi w skład tkanek patologicznie zwapnionych takich jak kamienie nerkowe i moczowe, kamień nazębny oraz zwapnione tkanki miękkie, syntetyczny ma obecnie największe znaczenie dla medycyny. Metody jego syntezy zostaną opisane w dalszej części rozdziału. Z zależności od otrzymanego stosunku molowego Ca/P rozróżnia się: 19

20 Część teoretyczna Rozdział 2 HA stechiometryczny związek o składzie chemicznym odpowiadającym idealnie stechiometrii związku Ca10(PO4)6(OH)2 HA niestechiometryczny związek, którego analiza chemiczna wykazuje inny skład niż HA stechiometryczny. Związek taki może zawierać wodę sieciową, jony 2- HPO 4, Ca 2+ i/lub 2OH - zastąpione przez O 2-. Ponieważ w praktyce laboratoryjnej otrzymanie stechiometrycznego HA jest bardzo trudne, odmiany niestechiometrycznego HA zostały usystematyzowane w literaturze, i tak wyróżniamy: HA z niedomiarem wapnia apatytowy fosforan wapnia o stosunku molowym Ca/P zawartym w zakresie 1,5-1,66, a nawet poniżej tej wartości HA z nadmiarem wapnia - zasadowe ortofosforany wapnia o stosunku molowym Ca/P powyżej 1,667 HA węglanowy apatyt zawierający w swoim składzie jony Mogą one być podstawione w miejsce grup OH - 2- CO 3. (apatyt węglanowy typu A) lub częściowo zastępować jony 3- PO 4 układach biologicznych typ B apatytu węglanowego). Syntetyczny HA można otrzymać stosując następujące metody [4,6]: (występujący w mokre reakcje zachodzące w wodnych roztworach lub zawiesinach. Oparte na zobojętnianiu kwasów i zasad (np. Ca(OH)2 z H3PO4) lub soli wapniowych typu CaCl2 i Ca(NO3)2 z fosforanami Na2HPO4 oraz (NH)4HPO4. W metodzie tej należy w szczególny sposób kontrować wzajemny stosunek ilościowy reagentów, ich czystość, szybkość dozowania roztworów, warunki mieszania, ph, czas i temperaturę wytrącania, gdyż mają one wpływ na skład oraz kształt i rozmiar cząstek otrzymanego proszku, hydrotermalne należące do metod mokrych, przebiegające w specjalnych autoklawach w temperaturach o C i ciśnieniu pary wodnej 0,2-8,5 MPa z zastosowaniem monetytu (CaHPO4) oraz brusztytu (CaHPO4 2H2O) jako surowców wyjściowych, suche reakcje zachodzące w stanie stałym, w temperaturze powyżej 1000 o C, pomiędzy CaHPO4 2H2O lub Ca2P2O7 i CaCO3, 20

21 Część teoretyczna Rozdział 2 topnikowe wykorzystujące reakcje pomiędzy sproszkowanymi substratami zawierającymi wapno i fosfor oraz topnikami B2O3, CaF2 i CaCl2, zol-żel zastępująca wysokotemperaturowe reakcje syntezy reakcjami niskotemperaturowymi zachodzącymi w roztworach alkoholowych lub wodnych. Proces ten przebiega dwuetapowo, najpierw poprzez hydrolizę (alkoholanów lub soli), a następnie kondensację otrzymanych produktów hydrolizy, inne, m.in. elektrokrystalizacja i liofilizacja β-fosforan trójwapniowy (β-tcp) Fosforan trójwapniowy (TCP) występuje w dwóch odmianach polimorficznych, wysokotemperaturowej α, oraz niskotemperaturowej β (trwałej do temperatury 1125 o C). Wzór półstruktularny został zaprezentowany na rysunku 2: Rysunek 2 Wzór półstrukturalny TCP o wzorze sumarycznym Ca 3(PO4) 2 β-fosforan trójwapniowy (β-tcp) jest drugim, po hydroksyapatycie fosforanem wapnia pod względem znaczenia dla medycyny. Podstawową różnicą pomiędzy tymi dwoma materiałami jest to że, w przeciwieństwie do uwodnionego HA, TCP nie zawiera w swoim składzie wody. Odpowiednikiem mineralogicznym syntetycznego β-tcp jest whitlockit, dlatego o ceramice β-tcp mówi się whitlockitowa. β-tcp jest białym proszkiem o gęstości rentgenograficznej równej 3,07 g/cm 3. W porównaniu do HA wykazuje większą rozpuszczalność (12,3 razy w mediach kwaśnych oraz 22,3 razy w zasadowych). 21

22 Część teoretyczna Rozdział 2 Chemicznie β-tcp jest dwu(ortofosforanem(v)) trójwapniowym o wzorze ogólnym Ca3(PO4)2 i stosunku molowym Ca/P wynoszącym 1,5. Skład β-tcp w przeliczeniu na tlenki przedstawia się następująco [6,11]: CaO 54,3%, P2O5 45,7%. Metody otrzymywania ceramiki whitlockitowej są analogiczne do metod wytwarzania HA. Zastosowanie ceramiki opartej o fosforany wapnia w medycynie [6,11]: w formie proszku: głównie w stomatologii: do leczenia nadwrażliwości zębiny przy odsłoniętych szyjkach zębowych, do leczenia biologicznego miazgi zęba, w leczeniu ubytków szkliwa, jako uszczelniacz kanałowy, w leczeniu starć patologicznych zębiny, jako dodatek do cementów dentystycznych, do leczenia sperforowanych kanałów korzeniowych, do wytwarzania pomocniczych preparatów czyszczących zęby, do wytwarzania pokryć na implantach dentystycznych, np.: pokrycia sztucznych korzeni zębowych w części, która przylega do kości; oraz w ortopedii: jako pokrycia implantów ortopedycznych, np.: nanoszone plazmowo warstwy HA na trzpienie endoprotez stawu biodrowego; w formie granul: do uzupełnienia ubytków kostnych po zabiegach hemisekcji, radektomii, amputacji korzenia zęba lub po operacji cyst korzeniowych, w leczeniu głębokich kieszonek kostnych, w chirurgii szczękowo-twarzowej i ortopedii do wypełnień ubytków kostnych po usuniętych torbielach i guzach lub powstałych w wyniku urazów; 22

23 Część teoretyczna Rozdział 2 w formie kształtek porowatych: jako nośnik leków, jako podłoże do hodowli komórek, jako wypełnienie zębodołów powstałych w wyniku ekstrakcji zęba, do wypełnienia ubytków kostnych; w formie kształtek gęstych: jako implanty ucha środkowego (otolaryngologia), jako implanty kostne dna oczodołu, podłoża do hodowli tkanek (inżynieria tkankowa) Połączenie bioceramiki z tkanką kostną Reakcje na granicy biomateriał-tkanka można ogólnie sklasyfikować [4 6]: obumarcie tkanki w przypadku toksycznego materiału, utworzenie wokół implantu otoczki z tkanki włóknistej o różnej grubości, w przypadku materiału inertnego (nietoksycznego i nieaktywnego biologicznie), utworzenie wiązania pomiędzy biomateriałem a tkanką żywą, jeśli materiał jest nietoksyczny i bioaktywny, zastąpienie materiału przez otaczającą go tkankę, w przypadku materiału nietoksycznego oraz resorbowalnego. Fizykochemiczne wiązanie biomateriału ceramicznego z kością prawdopodobnie ma związek z takimi procesami jak rozpuszczanie, wytrącanie oraz wymiana jonowa. W momencie zaimplantowania wszczepu, w wyniku działalności komórkowej oraz utworzonych enzymów, dochodzi do zmiany odczynu i tworzenia się środowiska kwaśnego. Wywołuje to częściowe rozpuszczenie biomateriału oraz migrację jonów Ca 2+, 2- HPO4 i 3- PO 4, co powoduje wzrost stężenia tych jonów wokół implantu i wytrącenie się w tym miejscu kryształów apatytowych. Następnie, z otaczających płynów ustrojowych wbudowywane są do sieci krystalicznej jony Mg 2+, 2- CO3 oraz inne. Aktywność komórkowa zostaje pobudzona dzięki wymianie jonowej oraz dyfuzji. Dochodzi do proliferacji oraz różnicowania się komórek, wzrasta też ich przyczepność do nowopowstałej warstwy apatytowej. Kryształy apatytu łączą się z kolagenową 23

24 Część teoretyczna Rozdział 3 osnową organiczną po czym zostają do niej wcielone. Podejrzewa się, że wiązanie warstwy apatytowej z kością jest trwałe i ma charakter jonowy [6]. Wrastanie tkanki kostnej jest uprzywilejowane w przypadku bioceramiki porowatej w stosunku do gęstej ceramiki. Ponadto, żywotność wrośniętej tkanki zależy od jej unaczynienia i ukrwienia w miejscu implantacji, a ponieważ kość jest tkanką silnie unaczynioną i dynamiczną po połączeniu z materiałem bioceramicznym rzadko dochodzi do obumarcia tkanki [4]. W porównaniu do HA, β-tcp ze względu na wyższą rozpuszczalność, charakteryzuje się również większą resorbowalnością w organizmie żywym. Resorpcja β-tcp następuje przez makrofagi i komórki olbrzymie, natomiast tworzenie się nowej tkanki kostnej na powierzchni β-tcp odbywa się na drodze hydrolizy lub poprzez rozpuszczenie i ponowne wytrącenie obecnych w roztworze jonów wapniowych i fosforanowych [6]. 3. Właściwości biomateriałów ceramicznych Do pełnej charakterystyki biomateriałów, w szczególności grupy materiałów ceramicznych niezbędne jest zapoznanie się z pojęciami związanymi z oddziaływaniem materiałów z organizmem, opisującymi ich właściwości, do których należą: biozgodność to zdolność materiału do wywołania określonej (akceptowalnej) odpowiedzi ze strony organizmu. Materiał zgodny biologicznie jest również biokompatybilny czyli inaczej charakteryzuje się biotolerancją. Oznacza to, że nie wywołuje on żadnych niepożądanych reakcji prowadzących do pojawienia się w organizmie stanu zapalnego, tzn. jest obojętny immunologicznie [2 4,6,12,13], osteointegracja, czyli bezpośrednie strukturalne i funkcjonalne połączenie żywej tkanki kostnej z powierzchnią implantu. W wyniku osteointegracji następuje stabilizacja kliniczna wszczepionego materiału [6,11]. Odpowiednia osteointegracja zależy od wielu czynników. W pierwszym etapie, po wszczepieniu materiału jest to przede wszystkim gęstość kości w miejscu implantacji (lepsza stabilizacja w przypadku gości gęstej), wymiarów oraz kształtu wszczepu (wzrost średnicy oraz długości wszczepu wpływa na powiększenie powierzchni kontaktu kość-wszczep a co z tym związane korzystnie wpływa na stabilizację). Dowiedziono również, że struktura powierzchni znacząco wpływa na osteointegrację. W przypadku materiałów o większej chropowatości zakotwiczenie implantu w tkance jest 24

25 Część teoretyczna Rozdział 3 ułatwione poprzez miejsca mikrozaczepów znajdujących się na takiej powierzchni. Ponadto siły oddziałujące poprzez wszczepiony implant na kość są łatwiej przenoszone (co powoduje korzystniejszy ich rozkład) przez wszczep o powierzchni chropowatej w porównaniu z powierzchnią gładką, bioaktywność to zdolność biomateriału do reakcji z tkanką żywą. Powierzchnia materiału bioaktywnego przylega bezpośrednio do tkanek, bez tworzenia warstwy pośredniej [6]. Pojęcie bioaktywności jest związane z osteoindukcją, ponieważ materiały bioaktywne powinny być jednocześnie osteoindukcyjne, osteoindukcyjność to tworzenie na powierzchni implantu aktywnej biologicznie warstwy apatytu, zbliżonej do apatytu biologicznego [14]. Bardziej szczegółowo, osteoindukcja polega na pobudzaniu niezróżnicowanych komórek pierwotnych do różnicowania się w kierunku osteoblastów [15]. Osteoindukcja jest drugim, po osteokondukcji, a zarazem ostatnim etapem procesu regeneracji kości, osteokondukcyjność polega na utworzeniu mechanicznego rusztowania dla nowo tworzącej się kości [15] w związku z czym wspomaga proces odnowy tkanki kostnej, resorbowalność jest to zdolność biomateriału do rozpadu poprzez działalność komórkową, czego konsekwencją jest całkowity lub częściowy zanik. Produkty powstające w wyniku resorpcji materiału zostają wyeliminowane z organizmu drogą naturalnych przemian biochemicznych, degradowalność to zdolność materiału do przemiany w mniej złożone produkty pośrednie w wyniku np. hydrolizy lub pod wpływem działania systemu biologicznego. Materiał powinien degradować w taki sposób aby produkty degradacji mogły być usunięte samoczynnie przez organizm. 4. Warstwa wierzchnia Ponieważ warstwa wierzchnia wykazuje odmienne cechy fizyczne i chemiczne niż materiał podstawowy (rdzeń) naukowcy zajmujący się badaniami materiałowymi, w szczególności z dziedziny inżynierii powierzchni posługują się następującą definicją warstwy wierzchniej: 25

26 Część teoretyczna Rozdział 4 Warstwa wierzchnia zewnętrzna warstwa materiału ograniczona rzeczywistą powierzchnią przedmiotu, obejmująca tą powierzchnię oraz część materiału w głąb od powierzchni rzeczywistej, która wykazuje zmienione cechy fizyczne i niekiedy chemiczne w stosunku do cech materiału rdzenia [16]. Rysunek 3 Zobrazowanie położenia warstwy wierzchniej wraz z rozkładem jej cech Różnice właściwości warstwy wierzchniej oraz rdzenia materiału (rys. 3) wynikają głównie z ich odmiennego stanu energetycznego. Atomy, cząsteczki i jony warstwy wierzchniej (z kilku pierwszych warstw atomowych) są rozmieszczone inaczej niż wewnątrz materiału. Atomy warstwy wierzchniej ciała stałego posiadają wyższą energię potencjalną i podczas kontaktu z inną fazą (gazem lub cieczą) dążą do jej obniżenia. Atomy warstwy wierzchniej są jednocześnie przyciągane przez atomy sieci wewnętrznej oraz oddziałują z atomami fazy będącej w kontakcie z powierzchnią. Grubość warstwy wierzchniej należy rozpatrywać indywidualnie dla każdego materiału, ale ogólnie można przyjąć, że sięga ona w głąb do 100 warstw atomowych [8]. 26

27 Część teoretyczna Rozdział 5 5. Modyfikacje warstwy wierzchniej biomateriałów Warstwa wierzchnia materiału oraz jej modyfikacja jest bardzo ważna, gdyż styka się ona bezpośrednio z ośrodkiem zewnętrznym przez co jest narażona na działanie zewnętrznych obciążeń oraz odpowiada za reakcje z otaczającym środowiskiem [17]. Biorąc pod uwagę to, że biomateriały funkcjonują w środowisku biologicznym, czyli wodnym preferowana jest obecność w ich warstwie wierzchniej odpowiednich cząstek lub ugrupowań o właściwościach hydrofilowych (np. COOH lub OH) [8]. W zależności od rodzaju materiału oraz jego struktury w warstwie wierzchniej występują różne siły oddziaływań. Do najsilniejszych oddziaływań należą oddziaływania jonowe o sile wiązania od 10 do 20 kj/mol oraz oddziaływania wodorowe (siła wiązania w zakresie 3-7 kj/mol). Kolejnym, lecz dużo słabszym (energia wiązania tylko 1-2 kj/mol) rodzajem oddziaływań warstwy wierzchniej biomateriałów są wiązania van der Waalsa. Występują one w każdym materiale i mogą się utworzyć pomiędzy wszystkimi rodzajami atomów. Oddziaływania van der Waalsa odpowiadają również za przyciąganie się cząsteczek hydrofobowych [8,18]. Ze względu na zróżnicowanie budowy powierzchni materiałów implantacyjnych wynikające z mnogości stosowanych biomateriałów istnieje bardzo wiele sposobów modyfikacji ich powierzchni. Ogólny podział metod modyfikacji powierzchni biomateriałów przedstawiono na rysunku 4. 27

28 Część teoretyczna Rozdział 5 Rysunek 4 Metody modyfikacji powierzchni biomateriałów. Opracowanie własne na podstawie literatury [5] Modyfikacja powierzchni biomateriałów metodami biologicznymi polega na unieruchamianiu biocząsteczek, czyli cząsteczek aktywnych biologicznie. Należą do nich m.in.: białka (przeciwciała, antygeny, enzymy); cukry (oligosacharydy, wielocukry oraz cukry proste); tłuszcze (kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, glikolipidy) oraz kwasy nukleinowe. Modyfikacja metodą unieruchamiania biocząsteczek na powierzchni stosowana jest w celu poprawy biozgodności biomateriałów, przyspiesza również proliferację oraz adhezję komórek. Wyróżnia się trzy sposoby modyfikacji metodami biologicznymi: dwie polegają na procesach fizycznych takich jak adsorpcja oraz uwięzienie (ang. entrapment), natomiast trzecia opiera się połączeniu biocząsteczek za pomocą wiązań chemicznych (głównie kowalencyjnych). Za fizysorpcję odpowiadają siły van der Waalsa, elektrostatyczne, powinowactwa elektronowego oraz dyspersyjne Londona. Wszystkie z nich należą do słabych oddziaływań międzycząsteczkowych, dlatego właśnie metoda adsorpcji fizycznej stosowana jest w przypadkach gdy preferowany jest krótkotrwały efekt przyłączenia. Natomiast po połączeniu 28

29 Część teoretyczna Rozdział 5 biocząsteczek z powierzchnią biomateriału za pomocą wiązań kowalencyjnych otrzymuje się trwałe wiązania chemiczne. Metodą tą często modyfikuje się powierzchnie polimerów, gdyż wiele z nich posiada w swojej strukturze grupy funkcyjne umożliwiające utworzenie wiązania. W przypadku polimerów inertnych (polietylen, polipropylen, politetrafluoroetylen, polifluorek winylidenu, nieposiadających w swojej strukturze takich grup (-COOH, NH2, -OH, -SH) należy przed procesem modyfikacji poddać je funkcjonalizacji powierzchni. W tym celu stosowane są następujące procesy: fotoszczepienie, kopolimeryzacja, nanoszenie warstwy ozonu [8,19]. Możliwości modyfikacji powierzchni biomateriałów metodami chemicznymi oraz fizykochemicznymi jest bardzo wiele, i nie sposób byłoby opisać je wszystkie. Zostaną więc przedstawione jedynie wybrane sposoby, reprezentujące poszczególne rodzaje metod modyfikacji. Chemiczne metody modyfikacji warstwy wierzchniej opierają się głównie na takich oddziaływaniach pomiędzy atomami lub cząsteczkami zewnętrznej warstwy z modyfikatorem w wyniku których zachodzą reakcje chemiczne. Reakcje te można podzielić na dwie grupy: specyficzne oraz niespecyficzne. Te pierwsze polegają na wymianie tylko określonych grup funkcyjnych na inne, np. karbonylowych na karboksylowe. Reakcje niespecyficzne dotyczą jednoczesnych zmian w kilku ugrupowaniach chemicznych zewnętrznej warstwy materiału. Przykładem takich reakcji może być silanizacja lub utlenianie powierzchni metalu mieszaniną podtlenków. Kolejnymi metodami chemicznej modyfikacji powierzchni biomateriałów są fotoszczepienie oraz szczepienie radiacyjne. Wyróżnia się trzy sposoby modyfikacji tego typu: szczepienie z użyciem jonizacyjnego źródła promieniowania (najczęściej typu gamma), szczepienie promieniami UV (fotoszczepienie) oraz szczepienie z użyciem wysokoenergetycznej wiązki elektronowej. Wszystkie trzy rodzaje szczepienia opierają się na podobnym mechanizmie działania: pod wpływem promieniowania wiązania chemiczne warstwy wierzchniej zostają zniszczone i tworzą się wolne rodniki oraz inne aktywne miejsca zdolne do przyłączenia monomerów. Metody szczepienia są głównie stosowane do modyfikacji hydrofobowych polimerów za pomocą zwilżalnych hydrożeli. Do jednych z najbardziej efektywnych oraz, co z tym związane, najczęściej stosowanych chemicznych metod modyfikacji powierzchni biomateriałów zalicza się osadzanie 29

30 Część teoretyczna Rozdział 5 plazmowe. Plazma do modyfikacji powierzchni może być stosowana w procesach trawienia, ablacji lub do osadzania, np. cienkich filmów w celu pokrycia powierzchni. Metoda osadzania plazmowego posiada szereg zalet. Przede wszystkim istnieje możliwość przeprowadzenia procesu w temperaturze oraz przy ciśnieniu otoczenia co znacznie ułatwia stosowanie tej metody. Poza tym uzyskane warstwy są cienkie i jednolicie pokrywają całą powierzchnię oraz wykazują dużą adhezję do podłoża. Ponadto, osadzanie plazmowe z użyciem polimeru można stosować na niemal każdego rodzaju powierzchni ciała stałego (metali, ceramiki). Wadami tej metody są bardzo wysoka cena sprzętu, niemożność uzyskania porowatych powierzchni oraz reakcje uboczne zachodzące podczas procesu. Pokrycie powierzchni cienką, jednolitą warstwą uzyskać można również stosując metodę osadzania Langmuira-Blodgett. W metodzie tej jako modyfikatory stosuje się środki powierzchniowo czynne. Ich charakterystyczna budowa (polarna głowa oraz niepolarny ogon ) powoduje równomierne rozmieszczenie na powierzchni wody. Modyfikowany materiał zanurza się w roztworze wodnym zawierającym surfaktant. Metodą tą możliwe jest tworzenie wielowarstwowej powłoki. Utworzoną warstwę utrwala się przez sieciowanie lub polimeryzację cząsteczek. Ze względu na analogiczną zasadę osadzania warstw do poprzedniej, metodą często z nią mylona jest metoda samoorganizujących się monowarstw. Za pomocą tej metody pokrywane są powierzchnie: różnych metali (złota, srebra, miedzi) ditiolami oraz alkanotiolami; platyny aminami oraz alkoholami; srebra i tlenków glinu kwasami karboksylowymi oraz krzemionki, szkła i glinu n-alkilosilanami. Warstwa modyfikatora jest silnie związana z powierzchnią modyfikowanego materiału, ponieważ zachodzi między nimi proces adsorpcji chemicznej, a jednocześnie na łańcuchy alkilowe działają siły van der Waalsa. Zmodyfikowana warstwa powinna w sposób jednorodny całkowicie pokrywać powierzchnię biomateriału. Pożądane jest również aby była jak najcieńsza, aby nie dochodziło do rozwarstwień w trakcie użycia materiału. Uważa się, że idealna grubość zmodyfikowanej warstwy wierzchniej powinna wynosić od 3 do 10 Å. W praktyce jednak wykazano, że przy jednolitym pokryciu całej powierzchni biomateriału bardzo trudne jest uzyskanie tak cienkiej warstwy. Grubość otrzymywanej warstwy jest różna 30

31 Część teoretyczna Rozdział 5 w zależności od zastosowanej metody modyfikacji oraz od materiału i jego późniejszego przeznaczenia. Metodami fizykochemicznymi otrzymywane są warstwy o grubości minimalnej Å, a metodami biologicznymi od 10 do 30 Å [19] Modyfikacja warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych Metodą modyfikacji biomateriałów ceramicznych stosowaną w niniejszej pracy doktorskiej jest modyfikacja chemiczna. Jak wskazano w poprzednim rozdziale modyfikacja ta polega na takim połączeniu modyfikowanej warstwy wierzchniej danego biomateriału i cząsteczek modyfikatora aby utworzyły się pomiędzy nimi wiązania chemiczne. Najczęściej są to wiązania kowalencyjne. Ze względu na trwałość wiązania kowalencyjnego utworzonego pomiędzy warstwą wierzchnią biomateriałów a modyfikatorem nie dochodzi do rozwarstwianiu się materiału Modyfikatory Niemożliwe jest wymienienie wszystkich modyfikatorów stosowanych w bardzo licznych metodach modyfikacji powierzchni biomateriałów. W związku z tym w poniższym rozdziale zostaną opisane tylko modyfikatory powierzchni stosowane w niniejszej pracy doktorskiej. Modyfikatory te są polimerami lub monomerami przed polimeryzacją. Polimery te należą głównie do grupy materiałów resorbowalnych i degradowalnych. Polimery resorbowalne charakteryzują się tym, że podczas implantacji w organizmie ich właściwości m.in. masa cząsteczkowa oraz wytrzymałość ulegają zmianom (są niestabilne). Przyczyną takiego zachowania jest zdolność polimerów resorbowalnych do degradacji w środowisku tkankowym. Produkty degradacji takich polimerów są nieszkodliwe dla organizmu ponieważ są to produkty przemiany materii lub komponenty tkanek. Głównym mechanizmem resorpcji polimerów jest prosta hydroliza chemiczna. W przypadku niektórych polimerów (PLA, PCL) proces resorpcji przebiega w dwóch etapach. Najpierw łańcuch polimeru zostaje podzielony na mniejsze fragmenty. Przyczyną tego procesu jest woda docierająca do implantu, działa ona selektywnie na miejsca o strukturze amorficznej. W drugim etapie pozostałe fragmenty polimeru są atakowane przez enzymy. Proces degradacji polimerów resorbowalnych zależy od szeregu czynników, a mianowicie: ciężaru cząsteczkowego, temperatury zeszklenia, krystaliczności, regularności struktury łańcucha oraz miejsca implantacji polimeru. Funkcją polimerów resorbowanych jest zapewnienie stabilizacji uszkodzonej 31

32 Część teoretyczna Rozdział 5 tkanki kostnej umożliwiającej jej zrost. Czas degradacji powinien pokrywać się z czasem potrzebnym do utworzenia nowej tkanki w miejscu implantacji. Gdy warunek ten zostanie spełniony nie zachodzi wówczas konieczność wykonania powtórnego zabiegu chirurgicznego (usunięcia implantu) co jest dużą zaletą tych polimerów. Polimery resorbowalne są często stosowane także jako nośniki leków, np.: różnych antybiotyków lub środków przeciwbólowych. Dostarczenie danego leku bezpośrednio w implantowane miejsce znacznie zwiększa komfort pacjentów oraz ogranicza powikłania [9]. W pracy stosowano następujące polimery: Glikol poli(oksyetylenowy) lub politlenek etylenu, PEG ze względu na swoje wyjątkowe właściwości (m.in. bardzo wysoką zwilżalność) umożliwiające kontrolę nad adsorpcją białek oraz komórek jest od wielu lat obiektem zainteresowań wielu naukowców [20 23]. W literaturze można znaleźć wiele zastosowań tego polimeru jako modyfikatora powierzchni biomateriałów, m.in. przez sieciowanie [24,25] unieruchomienie na powierzchni [26] oraz różnego rodzaju pokrycia [27]. PEG należy do grupy polimerów charakteryzujących się efektem pęcznienia w środowisku wodnym. Jako materiał stosowany w medycynie jest również nietoksyczny oraz biokompatybilny [21]. Do wyjątkowych cech PEG należą również jego nie immunogenność oraz nie antygenowość [28]. Ogólny wzór PEG zaprezentowano na rysunku 5, przy czym masa cząsteczkowa może wynosić od 200 do nawet kilku tysięcy (n w przedziale od 4 do ponad 200). Rysunek 5 Wzór półstrukturalny glikolu poli(oksyetylenowego) 32

33 Część teoretyczna Rozdział 5 Stan skupienia PEG jest zależny od masy cząsteczkowej polimeru,. Poniżej 1000 Da PEG jest lepką, bezbarwną cieczą, powyżej tej masy białym, woskowatym ciałem stałym. Największe znaczenie w zastosowaniach biomedycznych ma PEG o masie cząsteczkowej od kilkuset do Da. Końcowe grupy hydroksylowe OH w cząsteczce PEG umożliwiają utworzenia wiązania kowalencyjnego z cząsteczkami powierzchni innych materiałów. Takie przyłączenie cząsteczek PEG do powierzchni ma wiele zalet i liczne zastosowania. Fakt, że wielkość cząsteczek do których zostaje przyłączony PEG wzrasta, spowalnia proces filtracji w kłębuszkach nerkowych, co jest wykorzystywane np.: w projektowaniu leków [29,30]. Kolejnym przykładem jest wpływ PEG na właściwości elektryczne modyfikowanych materiałów. Po pokryciu powierzchni lepką, hydrofilową oraz obojętną elektrycznie warstwą jej ładunek ulega zmianie. Właściwość tą wykorzystuje się w elektroforezie kapilarnej w trakcie kontroli przepływu elektroosmotycznego [28]. Polikwas mlekowy, Polilaktyd, PLA- należy do grupy poli(α-hydroksy estrów), występuje w postaci dwóch optycznych izomerów: (ataktycznego) poli-d-laktydu PDLA, (izotaktycznego) poli-l-laktydu PLLA oraz mieszanki obu form, czyli poli-dllaktydu PDLLA. Formy PLLA oraz PDLA wyróżniają się krystalicznością, natomiast PDLLA jest polimerem o strukturze amorficznej. Stopień krystaliczności zależy od masy cząsteczkowej oraz warunków syntezy polimeru. W przyrodzie występują tylko enancjomery L [31]. Proces otrzymywania PLA składa się z dwóch etapów, najpierw należy kwas mlekowy przetworzyć w postać dimeru, a następnie poprzez reakcję otwarcia pierścienia zachodzi proces polimeryzacji. Na rysunku 6 przedstawiono wzór PLA. 33

34 Część teoretyczna Rozdział 5 Rysunek 6 Wzór półstrukturalny polilaktydu PLA jest polimerem degradowalnym oraz resorbowalnym w środowisku tkankowym. Jego dużą zaletą jest fakt, iż produkty tej degradacji są naturalnymi metabolitami. Degradacja na drodze hydrolizy odbywa się poprzez pęknięcie łańcucha w miejscu wiązania estrowego czego efektem jest wydzielenie się kwasu mlekowego, który następnie wydalany jest z organizmu w postaci dwutlenku węgla oraz wody [9,13]. Ze względu na swoją biokompatybilność oraz wysoką wytrzymałość mechaniczną (m.in. wysoka wartość modułu Younga) istnieje wiele zastosowań PLA w medycynie jako: elementy do łączenia kości i tkanek [19]; modyfikator warstwy wierzchniej materiałów bioceramicznych [32 34]; składnik kompozytów [35 37]; nośnik leków [38]. Z PLLA wykonuje się również resorbowalne nici chirurgiczne oraz protezy naczyń krwionośnych [39]. PLA jest bardziej hydrofobowy niż PEG [19], co wiąże się z wydłużonym czasem jego całkowitej resorpcji, który wynosi od 2 do nawet 6 lat [40]. Poli(ε-kaprolakton), PCL - jest półkrystalicznym polimerem z grupy poliestrów alifatycznych [41]. Reakcja otrzymywania polega na polimeryzacji ε-kaprolaktonu z otwarciem pierścienia. PCL jest biokompatybilny, nietoksyczny, hydrofobowy, ulega degradacji hydrolitycznej lecz w dość długim czasie (od 2 do 3 lat) [9,31,42,43]. Jego wzór półstrukturalny przedstawiono na poniższym rysunku (rys. 7). 34

35 Część teoretyczna Rozdział 5 Rysunek 7 Wzór półstrukturalny poli(ε-kaprolaktonu) W medycynie stosowany jest jako nośnik leków [43,44], składnik kompozytów [44,45], modyfikator powierzchni biomateriałów ceramicznych [46 48]. Poli(metakrylan 2-hydroksyetylu), phema - jest jednym w ważniejszych materiałów z grupy hydrożeli polimerowych, charakteryzujących się zdolnością do zatrzymywania w swojej strukturze dużych ilości wody. Dzięki tej właściwości od wielu lat z phema wytwarzane są miękkie soczewki kontaktowe [49,50]. Jako hydrożel wykazuje minimalną tendencję do adsorpcji białek oraz właściwości fizyczne zbliżone do żywych tkanek miękkich (plastyczność, miękkość, zawartość wody) [51]. PHEMA jest także polimerem biokompatybilnym oraz nietoksycznym, pomimo tego że jego monomery, czyli HEMA mają właściwości toksyczne [50]. Wzór polimeru pokazano na rysunku 8. Rysunek 8 Wzór półstrukturalny poli( metakrylanu 2-hydroksyetylu) 35

36 Część teoretyczna Rozdział 5 PHEMA jest składnikiem preparatu kościozastępczego, stosowanego w stomatologii, wyróżniającym się powierzchnią o ujemnym potencjałem elektrycznym (-10 mv). Sprzyja to tworzeniu się osteoblastów oraz odpychaniu patogennych organizmów [1]. Poli(3-hydroksymaślan), PHB - należy do grupy alifatycznych poliestrów, jest biokompatybilny oraz biodegradowalny [52]. PHB otrzymuje się na drodze chemicznej syntezy lub w procesie fermentacji bakterii m.in. Bacillus megaterium lub Ralstonia eutropha H16. Podczas degradacji hydrolitycznej (rozpad wiązań estrowych) wydziela się kwas hydroksymasłowy, który jest składnikiem krwi (w stężeniu 0,3-1,5 mm) [12]. PHB jest polimerem biokompatybilnym, nietoksycznym, półkrystalicznym, taktycznym. W medycynie stosowany jest w charakterze nośnika leków [53] oraz materiału do budowy rusztowań w inżynierii tkankowej [54,55]. Wzór PHB został przedstawiony na poniższym rysunku. Rysunek 9 Wzór półstrukturalny poli(3-hydroksymaślanu) 6. Techniki charakterystyki materiałów Bardzo ważnym etapem procesu modyfikacji jest charakterystyka otrzymanych materiałów. W tym celu zastosowano szereg metod opisanych poniżej Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) Podczerwień (ang. infrared, IR) to obszar widma elektromagnetycznego znajdujący się pomiędzy światłem widzialnym a falami mikrofalowymi. Promieniowanie IR dzieli się na trzy zakresy: bliska, przedział liczby falowej od do 4000 cm -1, podstawowa, przedział liczby falowej od 4000 do 400 cm -1, 36

37 Część teoretyczna Rozdział 6 daleka, przedział liczby falowej od 400 do 20 cm -1, przy czym do określenia struktury związków organicznych największe zastosowanie ma środkowy zakres, czyli podczerwień podstawowa. Spektroskopia w podczerwieni jest metodą wykorzystującą absorpcję promieniowania podczerwonego przez oscylujące cząsteczki. Oscylacje atomów cząsteczki zależą od: rodzaju drgających atomów, sił wzajemnych oddziaływań pomiędzy atomami oraz od sposobu ułożenia atomów w cząsteczce. Wyróżnia się następujące rodzaje drgań: rozciągające lub walencyjne mogą być symetryczne lub asymetryczne, związane są z rytmicznym ruchem atomów wzdłuż osi wiązania, powodującym rozciąganie a następne skracanie długości wiązań chemicznych, deformacyjne o charakterze zginającym (w których zmianie ulega kąt pomiędzy wiązaniami atomów), wahadłowym lub skręcającym (gdy drgające atomy poruszają się poza płaszczyznę), szkieletowe, czyli drgania całego pierścienia. Zasada działania spektrometru podczerwieni z transformacją Fouriera (ang. Fourier Transform Infrared, FTIR) jest następująca: wiązka promieniowania podczerwonego ze źródła promieniowania (najczęściej żarzące się ciało stałe) pada na rozdzielacz i ulega podziałowi na dwie wiązki. Następnie każda z tych wiązek pada na inne zwierciadło, ruchome lub stałe, a po odbiciu od niego interferują i ponownie tworzą jedną wiązkę, która jest rejestrowana przez detektor. Zwierciadło ruchome zmienia swoje położenie za pomocą tłoka oraz napędu, które sprawiają że droga przemierzana przez drugą część wiązki ma zmienną długość. Rejestracja sygnału odbywa się przy ciągłej zmianie pozycji zwierciadła. Powstały interferogram przedstawia wartość sygnału detektora w funkcji dróg optycznych. Za pomocą transformacji Fouriera sygnał ten jest zamieniany na zależność intensywności promieniowania przechodzącego w funkcji długości fali lub liczby falowej padającej wiązki (czyli widmo w podczerwieni). Liczba falowa (ν) jest proporcjonalna do energii drgań i w następujący sposób zależy od długości fali (λ): 10 ν = λ 4 [cm -1 Intensywność pasm natomiast określana jest zazwyczaj za pomocą transmitancji, która jest stosunkiem natężenia promieniowania przepuszczonego przez próbkę do natężenia wiązki na nią padającej [3,56 58]. ] (1) 37

38 Część teoretyczna Rozdział Spektroskopia tłumionego całkowitego odbicia wewnętrznego, ATR Metoda tłumionego całkowitego odbicia wewnętrznego (ang. Attenuated Total Reflection, ATR) należy do refleksyjnych metod spektroskopowych, gdyż widmo otrzymuje się poprzez pomiar promieniowania odbitego od próbki. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu specjalnej przystawki do spektrometru. Układ optyczny takiej przystawki zbudowany jest m.in. z przezroczystego dla podczerwieni ośrodka (np.: diamentu, selenku cynku lub germanu) o dużym współczynniku załamania światła. Badana próbka umieszczana jest na zewnętrznej powierzchni tego ośrodka, natomiast wiązka światła pada na jego wewnętrzną stronę gdzie dochodzi do jej odbicia. Następnie, po przebyciu pewnej drogi przez próbkę, wiązka światła powraca do ośrodka przezroczystego, a po wydostaniu się z niego mierzona jest intensywność, która jest przedstawiona w formie widma [3]. Metoda ATR jest szczególnie przydatna i stosowana w badaniu struktury warstw wierzchnich, głębokość analizowanej warstwy wierzchniej wynosi od 1 do 5 µm Spektroskopia Ramana Ze względu na to, iż spektroskopia Ramana oraz spektroskopia w podczerwieni należą do technik badania widm oscylacyjnych materiałów, są metodami wzajemnie komplementarnymi [3]. Podstawową różnicę stanowi to, że w przeciwieństwie do IR, (która wykorzystuje absorpcję promieniowania) spektroskopia Ramana bazuje na zjawisku rozpraszania światła, które wpisuje się w zakres spektroskopii emisyjnej. W spektroskopii Ramana wiązką wzbudzającą jest wiązka promieniowania laserowego, a sygnał pochodzi od wiązki rozproszonej, której parametrami mierzalnymi są długość, intensywność oraz polaryzacja. Dzięki efektowi Ramana (zmiana polaryzowalności, czyli zdolności przemieszczania się elektronów względem jąder w polu elektrycznym) w widmie światła rozproszonego pojawiają się linie, które nie występują w świetle padającym. Rozróżnia się trzy rodzaje pasm obserwowanych w widmie Ramanowskim: pasma Rayleigha są to pasma o dużym natężeniu oraz długości fali równej fali wzbudzającej; pasma stokesowskie o niższych częstotliwościach i większych długościach fali; 38

39 Część teoretyczna Rozdział 6 pasma antystokesowskie o wyższych częstotliwościach oraz niższych długościach fali. Pasmo antystokesowskie pojawia się w widmie Ramana po przeciwnej stronie co pasmo stokesowskie w stosunku do pasma Rayleigha. Pasmo to ma zwykle niższą intensywność niż pasma stokesowskie [10]. W praktyce najczęściej rejestruje się widma z pasmami stokesowskimi. Widmo Ramana jest zależnością natężenia promieniowania od częstotliwości tego promieniowania reprezentowanej przez przesunięcie ramanowskie (określane przez różnice odwrotności długości fali padającej oraz rozproszonej, wyrażane w cm -1 ]. Widmo Ramana to widmo oscylacyjno-rotacyjne niosące informacje m.in. o strukturze badanej substancji i jej składzie chemicznym Dyfraktometria rentgenowska, XRD Promieniowanie rentgenowskie w widmie fal elektromagnetycznych zajmuje miejsce pomiędzy promieniowaniem UV oraz gamma. W dyfraktometrach promieniowanie X wytwarzane jest za pomocą lampy rentgenowskiej. Technika XRD (ang. X-ray diffraction) dostarcza informacji o strukturze krystalicznej oraz składzie fazowym analizowanych materiałów. Materiały ceramiczne mają strukturę polikrystaliczną, składającą się z wielu ułożonych przypadkowo krystalitów. Metoda badań materiałów proszkowych polega na tym, że gdy wiązka promieniowania monochromatycznego pada na nieruchomą próbkę, ulega dyfrakcji na losowo zorientowanych osiach krystalicznych. Podczas badania rejestruje się położenia kątowe oraz natężenia odbić dyfrakcyjnych od różnych grup płaszczyzn sieciowych. Obraz dyfrakcyjny w postaci koncentrycznych kręgów powstaje wskutek nałożenia odbić interferencyjnych dla wszystkich możliwych orientacji kryształu. Aby efekt ten wystąpił muszą być spełnione warunki równania Braggów: λ n=2d sinθ (2) w którym d oznacza odległość pomiędzy płaszczyznami atomowymi, θ to kąt dyfrakcji (równy kątowi padania), λ to długość fali promieniowania rentgenowskiego a n jest liczbą naturalną. 39

40 Część teoretyczna Rozdział 6 Podstawowym wnioskiem wynikającym z powyższego równania jest warunek na długość fali promieniowania rentgenowskiego które musi być co najmniej równa parametrom sieci kryształu: λ 2d max (3) ponieważ dmax oznacza największą odległość między płaszczyznami sieciowymi danego kryształu Spektroskopia fotoelektronów w zakresie promieniowania X, XPS W technice spektroskopii fotoelektronów w zakresie promieniowania X (ang. X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS) tak jak w poprzedniej technice (XRD) do wzbudzenia próbki również niezbędne jest promieniowanie rentgenowskie czyli promieniowanie X. Metoda XPS polega na wybiciu fotoelektronów z orbitali rdzenia poprzez naświetlanie miękkim promieniowaniem X, a następnie analizie tych elektronów. Grubość badanej warstwy wynosi od 1 do 8 nm. Za pomocą tej metody możliwa jest detekcja wszystkich pierwiastków, z wyjątkiem helu i wodoru, oraz ich analiza zarówno jakościowa jak i ilościowa. Przebieg pomiaru można w skrócie opisać następująco: na badaną próbkę kierowane jest promieniowanie X o określonej energii hν lampy. Energia ta wybija fotoelektrony z próbki poprzez wzbudzenie jej atomów. Wybite w ten sposób fotoelektrony po przejściu przez szczelinę wyjściową oraz system soczewek trafiają do analizatora energii, który przepuszcza tylko elektrony o ustalonej wcześniej energii kinetycznej (Ekin). Następnie elektrony docierają do powielacza elektronowego a powstały impuls prądowy jest rejestrowany i poddawany komputerowej obróbce matematycznej. Znając energię kinetyczną wybijanych elektronów, korzystając z poniższego wzoru można obliczyć energię wiązania elektronów w atomach próbki (Eb): E h E (4) b kin We wzorze tym ф oznacz pracę wyjścia spektrometru. Powstałe w ten sposób widmo jest zależnością ogólnej liczby zliczeń na sekundę od energii wiązania wyrażanej w elektronowoltach ev. Położenie pasm fotoelektronów wskazuje na energię wiązania elektronów w próbce. Charakterystyczne pasma otrzymuje się tylko dla elektronów które przeszły przez analizator, natomiast pozostałe stanowią tło [59,60]. Położenie pasm XPS związane jest ze strukturą próbki, zależy od następujących czynników: 40

41 Część teoretyczna Rozdział 6 przesunięcia chemicznego, sprzężenia spinowo-orbitalnego, rozszczepienia multipletowego oraz od efektów wtórnych tj. wstrząśnięcia (sake-up) i wytrząśnięcia (sake-off) Potencjał dzeta Gdy naładowana cząstka umieszczona jest w cieczy to oddziaływania pomiędzy powierzchnią tej cząstki oraz otaczającą ją cieczą można opisać w następujący sposób: warstwa cieczy dzieli się na dwie części, wewnętrzną, której jony (o przeciwnym ładunku do ładunku cząstki) ściśle przylegają do powierzchni cząstki oraz zewnętrzną, o jonach słabiej związanych z powierzchnią cząstki. Jeżeli weźmiemy pod uwagę obie części jednocześnie to otrzymamy definicję podwójnej warstwy elektrycznej, występującej wokół każdej cząstki (rys. 10). Rysunek 10 Zobrazowanie podwójnej warstwy oraz potencjału dzeta występujących wokół cząstki umieszczonej w cieczy. Opracowanie własne na podstawie literatury [61] W obrębie warstwy zewnętrznej (tzw. warstwa dyfuzyjna) istnieje pewna granica (płaszczyzna poślizgu) wewnątrz której jony poruszają się wraz z cząstką, natomiast jony znajdujące się poza tą granicą nie mają takich właściwości. Potencjał dzeta jest to 41

42 Część teoretyczna Rozdział 6 potencjał płaszczyzny poślizgu, zmienia się on wraz z odległością cieczy od powierzchni cząstki. Na podstawie wielkości potencjału dzeta można ocenić zdolność dyspersyjną układu koloidalnego (typu emulsja lub ciało stałe-ciecz). Gdy wartość bezwzględna potencjału dzeta przekracza 30 mv układ uważany jest za stabilny. Krzywa potencjału dzeta przedstawiana jest w funkcji ph. Strategicznym punktem na krzywej jest tzw. punkt izoelektryczny, czyli punkt w którym ph przyjmuje wartość 0 i układ jest najmniej stabilny. Jak zostało wspomniane wcześniej, potencjał dzeta związany jest z ruchem naładowanej cząstki pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego względem cieczy ośrodka, w którym cząstka ta jest zdyspergowana, czyli ze zjawiskiem elektrokinetycznym zwanym elektroforezą. Elektroforetyczne wyznaczanie potencjału dzeta jest najczęściej stosowane dla roztworów wodnych przy umiarkowanych stężeniach elektrolitu [62]. Potencjał dzeta ζ obliczany jest na podstawie ruchliwości µe (wyliczonej z prędkość cząstki oraz natężenia pola elektrycznego), oraz lepkości η i stałej dielektrycznej (ε) korzysta się z równania [63,64]: 4 e (5) Zjawisko podwójnej warstwy elektrycznej oraz związanego z nią potencjału dzeta ma również swoje zastosowanie w dziedzinie biomateriałów oraz medycynie. Elektryczna warstwa podwójna tworzy się przy granicy ujemnie naładowanych ścianek kości oraz zjonizowanej cieczy wypełniającej kanały mokrej kości. Dodatnie jony cieczy są przyciągane a następnie trwale wiązane na powierzchni kanału, tworząc w ten sposób płaszczyznę poślizgu [4]. 7. Inne techniki charakterystyki warstwy wierzchniej Badanie warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych technikami odwróconej chromatografii gazowej oraz cieczowej należą do nowatorskich metod. Wprowadzenie ich na szerszą skalę do laboratoriów jest na etapie badań i zdaje się być jedynie kwestią czasu. Stosuje się ją głównie w celu zbadania oddziaływań różnych związków organicznych ze znajdującym się wewnątrz kolumny ciałem stałym (biomateriałem). Techniki te również od kilku lat są przedmiotem zainteresowań Zespołu Profesora 42

43 Część teoretyczna Rozdział 7 Adama Voelkela, prace realizowane w Zakładzie Chemii Organicznej Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej dotyczą: oceny zdolności adsorpcyjnych w układzie biomateriał/białko przy zastosowaniu odpowiednich modeli adsorpcji z wykorzystaniem techniki odwróconej chromatografii cieczowej; oceny adhezji zębów do wypełnień dentystycznych zawierających w swoim składzie biomateriały ceramiczne z wykorzystaniem metody odwróconej chromatografii gazowej; oceny właściwości fizykochemicznych materiałów na bazie fosforanów wapnia służących do kontrolowanego oraz przedłużonego uwalniana substancji aktywnej (leku) metodą odwróconej chromatografii gazowej Odwrócona chromatografia gazowa, IGC Za pomocą odwróconej chromatografii gazowej (ang. Inverse Gas Chromatography IGC), wyznacza się parametry warstwy wierzchniej ciał stałych, również biomateriałów. Odwrócona chromatografia gazowa jest poszerzeniem tradycyjnej chromatografii gazowej. W metodzie tej badany materiał umieszcza się w kolumnie chromatograficznej w postaci, np.: rozdrobnionego ciała stałego lub cienkiej warstwy naniesionej na odpowiedni nośnik. Badana substancja umieszczona w kolumnie jako faza stacjonarna oddziałuje ze związkami testowymi, płynącymi przez kolumnę wraz z gazem inertnym. Oddziaływania międzycząsteczkowe fazy stacjonarnej i lotnych związków testowych powodują zmianę parametrów retencji, które są wykorzystywane do oznaczania m. in. właściwości powierzchniowych badanej substancji. Idealnie dobrane związki testowe oddziałują z fazą stacjonarną w taki sposób, że odzwierciedlają jej właściwości: kwasowość lub zasadowość centrów aktywnych, polarność i in. Badania metodą IGC można przeprowadzać w nieskończonym lub w skończonym rozcieńczeniu związku testowego. W pierwszym przypadku do kolumny wstrzykuje się pary związków testowych, które oddziałują z miejscami aktywnymi badanego materiału. Uzyskane parametry retencji mogą być wykorzystane w celu wyznaczenia m.in. wartości parametrów rozpuszczalności, składowej dyspersyjnej i specyficznej swobodnej energii powierzchniowej. Przeprowadzenie badań w skończonym rozcieńczeniu umożliwia 43

44 Część teoretyczna Rozdział 7 wyznaczenie np. izoterm adsorpcji, opisujących właściwości powierzchniowe badanego materiału [65 68]. Właściwości warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych (tj. HA oraz β-tcp) a zwłaszcza ich energii powierzchniowej oraz właściwości kwasowo-zasadowych są szczególnie istotne w przypadku oceny ich cech adhezyjnych. Wielkości te są przydatne w ocenie efektów modyfikowania warstwy wierzchniej biomateriałów. Zakłada się, że im warstwa wierzchnia wykazuje wyższą wartość energii tym jest ona bardziej reaktywna, co wpływa np.: na jej aktywność katalityczną, siłę oddziaływania pomiędzy cząsteczkami innego materiału a także może wpływać na zachowanie się układów biologicznych. Wyznaczono wartości parametrów określających stan warstwy wierzchniej badanych biomateriałów, a zwłaszcza jej zdolności do oddziaływań dyspersyjnych i kwasowo-zasadowych, w tym składową dyspersyjną swobodnej energii powierzchniowej oraz parametry KA i KD, charakteryzujące zdolność powierzchni do oddziaływań specyficznych [68,69]. Wyznaczone parametry powierzchniowe umożliwiają oszacowanie wpływu modyfikacji na właściwości warstwy wierzchniej badanych materiałów Odwrócona chromatografia cieczowa, ILC Metoda odwróconej chromatografii cieczowej (ang. Inverse Liquid Chromatography) stosowana jest to określenia aktywności powierzchni lub oceny zdolności adhezyjnych warstwy wierzchniej wybranego materiału. W metodzie tej badane są oddziaływania pomiędzy dobranymi związkami testowymi a umieszczoną w kolumnie fazą stacjonarną (biomateriałem). Parametry retencji dla związków testowych, uzyskane w wyniku ich oddziaływania z fazą stacjonarną, przy zastosowaniu odpowiednich zależności mogą posłużyć do określania charakterystyki powierzchni badanej fazy stacjonarnej (biomateriału). Jednym z modeli może być LSER (ang. Linear Solvation Energy Relationship). Szeroko stosowanym matematycznym przedstawieniem tego modelu jest zależność Abrahama, łącząca parametry retencyjne (np. współczynnik podziału) substancji rozpuszczonych (związków testowych) z wielkościami fizykochemicznymi fazy stacjonarnej (badanego materiału). Pomimo tego, iż podstawowa różnica pomiędzy dwiema metodami odwróconej chromatografii - IGC i ILC polega na użyciu cieczy lub gazu jako fazy ruchomej, dostarczającej związek testowy do powierzchni fazy stacjonarnej, mechanizmy 44

45 Część teoretyczna Rozdział 7 procesów chromatograficznych już znacznie różnią się od siebie. Badanie zachowań substancji rozpuszczonej w układzie ILC jest bardziej skomplikowane niż w układzie IGC. Wszystkie pomiary ILC są wynikiem oddziaływań między substancją rozpuszczoną oraz fazą ruchomą z wypełnieniem kolumny chromatograficznej. W odwróconej chromatografii gazowej tego problemu nie ma, ponieważ faza mobilna, czyli gaz obojętny taki jak: hel, przepływając przez złoże kolumny jest nieaktywna i substancja rozpuszczona może być poddana procesowi adsorpcji w sposób bezpośredni. Wada ta jednocześnie nie ogranicza zastosowania ILC, gdyż metoda ta ma również wiele zalet przeważających nad IGC. Przede wszystkim w układzie ILC istnieje możliwość badania dużych cząsteczek substancji rozpuszczonej, czyli także roztworów polimerowych, które nie mogą być badane przy IGC. Dodatkową zaletą ILC jest badanie bezpośrednich oddziaływań ciało stałe-ciecz w układach rzeczywistych, np.: w warunkach jakie występują w układach biologicznych, czyli w neutralnym ph, temperaturze ciała ludzkiego, stężeniu oraz składzie przepływającej cieczy zbliżonej do płynu ustrojowego oraz przy odpowiednim ciśnieniu [70] Kąt zwilżania Pomiar kąta zwilżania pozwala w prosty oraz szybki sposób określić czy powierzchnia badanego materiału ma charakter hydrofobowy czy hydrofilowy. Kąt zwilżania jest to kąt zawarty pomiędzy powierzchnią ciała stałego (które pozostaje w kontakcie z cieczą) a styczną do kropli cieczą poprowadzoną z punktu zetknięcia fazy stałej, ciekłej oraz gazowej. Zwilżanie (rozpływanie kropli na powierzchni ciała stałego) zachodzi wówczas, jeśli cząsteczki cieczy są silnie przyciągane przez cząsteczki ciała stałego (kąt zwilżania przyjmuje wartość powyżej 90 o ). W przypadku, gdy cząsteczki cieczy przyciągają się nawzajem silniej niż są przyciągane przez cząsteczki ciała stałego, zwilżanie nie zachodzi, a na powierzchni ciała stałego powstaje kropla cieczy (kąt zwilżania wynosi poniżej 90 o ). Równowagę sił powierzchniowych na granicy faz ciało stałe/ciecz określa równanie Young a [60]: γsg = γsc + γcg cosθ [N/m] (8) które pozwala na wyznaczenie kąta zwilżania: 45

46 Część teoretyczna Rozdział 7 cos sg cg sc (9) w którym: sg napięcie powierzchniowe między fazą stałą i fazą gazową [N/m], sc napięcie powierzchniowe między fazą stałą i fazą ciekłą [N/m], cg napięcie powierzchniowe między fazą ciekłą i gazową [N/m] Skaningowa mikroskopia elektronowa, SEM Za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (ang. scanning electron microscope, SEM) możliwa jest obserwacja topografii powierzchni badanej próbki w skali od nano do mikrometrycznej. Jest to metoda bardzo czuła, spośród metod mikroskopowych wyróżnia się bardzo dużą głębią ostrości, nawet 300 razy większą w porównaniu do mikroskopu optycznego. Zasada działa skaningowego mikroskopu elektronowego opiera się na oddziaływaniach elektronów z materią. Pierwotna wiązka elektronów padająca na daną powierzchnię powoduje emisję a następne odbicie elektronów. Skutkuje to generowaniem różnych sygnałów wtórnych: elektronów wtórnych, elektronów wstecznie rozproszonych, elektronów Augera lub promieniowania rentgenowskiego. Sygnały te rejestrowane są za pomocą detektorów, a następnie po wzmocnieniu przesyłane do monitora na którym powstaje obraz próbki będący odzwierciedleniem topografii powierzchni [3,10,71]. Zastosowanie różnych przystawek analitycznych w mikroskopie SEM umożliwia identyfikację ilościową badanej próbki poprzez detekcję pojedynczych pierwiastków. Najczęściej stosowaną metodą takiej analizy jest spektroskopia z dyspersją energii (ang. energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS). Polega ona na analizie promieniowania rentgenowskiego wzbudzonego poprzez skanowanie powierzchni wiązką elektronów. Za pomocą metody EDS identyfikuje się większość pierwiastków chemicznych (muszą mieć liczbę atomową powyżej 5). 46

47 Część teoretyczna Rozdział 8 8. Możliwości zastosowań otrzymanych modyfikatów 8.1. Materiały dentystyczne Ponieważ mineralna faza zębów składa się z HA, naturalne jest że materiał ten jest stosowany również jako składnik kompozytowych wypełnień dentystycznych [72]. Istnieją również inne, estetyczne oraz ekonomiczne zalety stosowania HA jako materiału dentystycznego, ponieważ HA powoduje zwiększenie połysku oraz zapewnia wysoką wydajność wypełnień kompozytowych [72,73]. HA jest także znacznie tańszym materiałem niż większość stosowanych składników wypełnień, zwłaszcza polimerowych [74]. Kolejnym interesującym aspektem takich materiałów jest fakt, iż HA jako materiał bioaktywny, (a nie tylko biokompatybilny) posiada zdolność uwalniania jonów wapnia oraz fosforu, które są odpowiedzialne za remineralizację szkliwa oraz odnowę mineralnej fazy zębów [75] Nośniki leków Ze względu na bardzo dobrą biozgodność, wysoką bioaktywność oraz właściwości osteoindukcyjne i osteokondukcyjne fosforany wapnia znajdują, poza standardowymi zastosowaniami jako materiały wszczepowe w niewielkich ubytkach kostnych coraz więcej nowych aplikacji, umożliwiających ich pełne wykorzystanie. Ostatnio prowadzone są intensywne prace dotyczące nośników leków na bazie ceramiki hydroksyapatytowej [76 78]. Rozwiązanie takie ma na celu stworzenie implantów wielofunkcyjnych pełniących jednocześnie rolę substytutu ubytku kostnego stanowiącego rusztowanie dla nowotworzącej się kości oraz dostarczenie w miejsce ubytku aktywnej substancji leczniczej. Istnieje możliwości zaprojektowania takiego systemu, w którym substancja lecznicza jest uwalniania z ceramicznego nośnika w sposób kontrolowany, tzn. w odpowiedniej dawce i przy określonej szybkości. Sterowanie procesem uwalniania aktywnej substancji leczniczej z materiałów hydroksyapatytowych odbywa się poprzez: stosowanie materiałów o różnej porowatości - im mniejsza porowatość tym szybkość uwalniania substancji aktywnej jest mniejsza, impregnacja polimerami hydrofobowymi, powodującymi zmniejszenie szybkości uwalniania leku, 47

48 Część teoretyczna Rozdział 8 stosowanie modyfikowanych materiałów ceramicznych. W zależności od zastosowanego modyfikatora kształt krzywych uwalniania substancji aktywnej ulega zmianie. Ze względu na słabe ukrwienie tkanki kostnej w wielu chorobach takich jak rak kości, osteoporoza, zapalenie szpiku kostnego lub w stanach zapalnych kości konwencjonalne (doustne lub dożylne) podanie leków nie gwarantuje osiągnięcia odpowiedniego stężenia terapeutycznego. Przewlekłe przyjmowanie wielu leków, zwłaszcza antybiotyków i leków przeciwnowotworowych a nawet przeciwbólowych może skutkować nieodwracalnymi zmianami w organizmie, osłabiając układ immunologiczny oraz uszkadzając organy wewnętrzne, przede wszystkim wątrobę. Dlatego właśnie rozwój dziedziny inżynierii biomedycznej w kierunku badań nad implantami wielofunkcyjnymi wydaje się być niezbędny, gdyż często decyduje o skuteczności leczenia tkanki kostnej [79]. 48

49 Cel pracy CEL PRACY Celem pracy było otrzymanie nowej grupy biomateriałów ceramicznych poprzez modyfikację warstwy wierzchniej hydroksyapatytu oraz β-fosforanu trójwapniowego a następnie ocena właściwości otrzymanych modyfikatów. Modyfikacje przeprowadzane były w celu poprawy właściwości biologicznych, fizykochemicznych oraz mechanicznych biomateriałów ceramicznych. Badania wykonane w ramach pracy dotyczyły poszukiwań odpowiednich modyfikatorów, sposobów przeprowadzania procesu syntezy i modyfikacji oraz technik umożliwiających ocenę otrzymanych rezultatów. 49

50 Część doświadczalna Rozdział 9 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 9. Wykaz odczynników stosowanych w pracy Podczas modyfikacji oraz syntezy biomateriałów ceramicznych stosowano następujące odczynniki chemiczne: amoniak, POCH S.A., r-r 25%, CZDA, nr kat azotan wapnia, czterowodny, Sigma-Aldrich, czystość 99%, nt kat. C1396 bromek heksadecylotrimetyloamionowy, POCH S.A., czystość 99%, nr kat. ACRS22716 bromek potasu, Merck, chlorek magnezu, sześciowodny, Chempur Polska, czystość 99,9% chlorek potasu, Chempur Polska, czystość 99,5% chlorek sodu, Chempur Polska, czystość 99,9% chlorek wapnia, Chempur Polska, czystość 99,9% chloroform, Sigma-Aldrich, odwodniony, czystość 99%, dibutylodilaurynian cyny, Sigma-Aldrich, czystość 95%, nr kat dimetyloformamid, odwodniony, POCH S.A., czystość 99,8%, nr kat diwodorofosforan potasu, Chempur, czystość>99% eter dietylowy, POCH S.A etylowy alkohol bezwodny, POCH S.A., 99,8%, CZDA, nr kat β-fosforan trójwapniowy, Sigma-Aldrich, czystość 95% (95% β-tcp; <2% HA; <1% α-tcp; <2% inne fazy fosforanów wapnia takie jak Ca2P2O7), nr kat glikol poli(oksyetylenowy), Sigma-Aldrich, P3515, Mn heksametylodiizocyjanian, Sigma-Aldrich, czystość 98%(GC), nr kat hydroksyapatyt, Sigma-Aldrich, czystość 90% (zanieczyszczenia 5% H2O), nr kat ε-kaprolakton, POCH, czystość 99%, ACRS kwas solny, Chempur, cz.d.a. stężenie 35-38% metakrylan metylu, POCH, czystość 99%, ACRS poli(3-hydroksymaślan), Sigma-Aldrich, Mw= , nr kat poli(ε-kaprolakton), Sigma-aldrich, nr kat poli-(l)-laktyd, Sigma-Aldrich, Mw= , nr kat

51 Część doświadczalna Rozdział 9 poli(metakrylan 2-hydroksyetylu), Sigma-Aldrich, Mw=20 000, nr kat tetrahydrofuran, POCH S.A. odwodniony, czystość 99,9%, nr kat toluen, odwodniony, POCH S.A. odwodniony, czystość 99,8%, nr kat trihydroksyaminometan, POCH S.A., czystość 99,9%, nr kat siarczan (VI) sodu, POCH S.A., czystość, 99,9%, nr kat wodorofosforan diamonu, Sigma-Aldrich, czystość 98%, wodorofosforan potasu, trójwodny, Sigma-Aldrich, czystość 99,9%, nr kat wodorofosforan sodu, Sigma-Aldrich, czystość>99,0%, nr kat. S7907 wodorotlenek sodu, Chempur, czystość>99,8% wodorowęglan sodu, Chempur, czystość 99,9% 51

52 Część doświadczalna Rozdział Procedura Rysunek 11 Ogólny schemat przeprowadzania procesu modyfikacji warstwy wierzchniej HA oraz β-tcp z zastosowaniem czynnika sprzęgającego W ramach niniejszej pracy doktorskiej wykonano szereg modyfikacji warstwy wierzchniej HA oraz β-tcp za pomocą kilku polimerów oraz monomerów. Ogólny schemat tej procedury przedstawiono na rysunku 11. Analizując otrzymane wyniki wyselekcjonowano grupę modyfikatorów najskuteczniej pokrywającą warstwę wierzchnią HA oraz β-tcp i dla tej grupy przeprowadzono dalszą ocenę ich właściwości. Zestawienie wszystkich modyfikacji zostało przedstawione w tabeli 3. 52

53 MODYFIKATOR CZYNNIK SPRZĘGAJĄCY HMDI KATALIZATOR DBTDL SYMBOL STOSOWANY W PRACY ROZPUSZCZALNIK T [ o C] t [h] Część doświadczalna Rozdział 10 Tabela 3 Zestawienie wszystkich modyfikacji warstwy wierzchniej HA oraz β-tcp wykonane w ramach pracy doktorskiej HYDROKSYAPATYT (HA) PEG HA+HMDI+PEG DMF phema HA+HMDI+pHEMA DMF PAA HA+HMDI+PAA Etanol LLA HA+LLA THF+ Toluen LLA HA+HMDI+LLA THF+ Toluen PLLA HA+PLLA Toluen MMA HA+HMDI+MMA DMF ε-cl HA+CL Toluen PHB HA+PHB Etanol

54 Część doświadczalna Rozdział 10 β-fosforan TRÓJWAPNIOWY (β-tcp) PEG TCP+HMDI+PEG DMF phema TCP+HMDI+pHEMA DMF PHB TCP+PHB Etanol MMA TCP+HMDI+MMA DMF LLA TCP+LLA Toluen ε-cl TCP+CL Toluen PCL TCP+PCL Toluen Przebieg procesów modyfikacji Modyfikacje warstwy wierzchniej HA oraz β-tcp wykonano na kilka sposobów. Wszystkie reakcje można podzielić na dwa rodzaje: z zastosowaniem czynnika sprzęgającego pełniącego funkcję łącznika pomiędzy biomateriałem a modyfikatorem oraz bez takiego łącznika. Poniżej opisano poszczególne procedury. Proces modyfikacji z użyciem czynnika sprzęgającego składa się z dwóch etapów. W pierwszym powstaje półprodukt HA+HMDI lub β-tcp+hmdi, do którego w kolejnym etapie przyłączany jest modyfikator. Przebieg takich reakcji jest następujący: W kolbie trójszyjnej, okrągłodennej umieszczono uprzednio wysuszony (120 o C) biomateriał (HA lub β-tcp). Do kolby dodano czynnik sprzęgający (HMDI), katalizator (DBTDL) oraz rozpuszczalnik. Całość ogrzewano w temperaturze 60 o C stale mieszając przez 4h w atmosferze gazu obojętnego (argon). Po ostudzeniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej do powstałego półproduktu (HA+HMDI lub β-tcp+hmdi) dodano odpowiedni modyfikator wraz z rozpuszczalnikiem. Reakcję kontynuowano w tych samych warunkach przez kolejne 8h. Po upływie wymaganego czasu oraz 54

55 Część doświadczalna Rozdział 10 ponownym ostudzeniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej całość poddano filtracji pod próżnią. Otrzymany produkt przemyto etanolem i trzykrotnie DMF. Zmodyfikowany biomateriał wysuszono najpierw na powietrzu a następnie w suszarce w 60 C. W przypadku bezpośredniego połączenia warstwy wierzchniej biomateriału z cząsteczkami modyfikatora reakcja przebiega jednoetapowo. Warunki przebiegu procesu takich modyfikacji zostały dobrane w zależności od stosowanego modyfikatora. Przebieg procesu modyfikacji HA+PLLA. W kolbie trójszyjnej, okrągłodennej umieszczono zawiesinę wysuszonego w temp 120 o C HA w toluenie. Następnie, rozpuszczony, również w toluenie polimer wkraplano powoli do kolby. Całość mieszano mieszadłem mechanicznym z prędkością 800 obr/min oraz ogrzewano w temperaturze 105 o C, jednocześnie zawracając pary rozpuszczalnika pod chłodnicą zwrotną. Przebieg procesu modyfikacji β TCP+CL oraz β -TCP+PCL. W tych modyfikacjach wykorzystano zjawisko otwarcia pierścienia substancji modyfikującej i jej polimeryzację. Wysuszony (120 o C) biomateriał wraz z toluenem umieszczono w kolbie trójszyjnej, okrągłodennej, do której zamontowano aparat Deana- Starka wraz z chłodnicą oraz termometrem. Po odparowaniu części toluenu, dodano ε- kaprolakton lub poli(ε-kaprolakton) oraz katalizator. Reakcje prowadzono w atmosferze gazu obojętnego (argon). Temperaturę kontrolowano, aby nie przekroczyła 110 C. Po określonym czasie mieszanina reakcyjna została ostudzona do temperatury pokojowej, po czym otrzymany produkt umieszczono w wirówce o 2500 obr/s na 20 minut, aby odseparować fazę osadu od rozpuszczalnika. Końcowym etapem było przemycie modyfikatu chlorkiem metylenu, w celu usunięcia nieprzereagowanego poli(εkaprolaktonu). Przebieg procesu modyfikacji HA+LLA, HA+HMDI+LLA oraz TCP+LLA. Wysuszony (120 o C) HA lub HA+HMDI wraz z toluenem umieszczono w kolbie trójszyjnej, okrągłodennej, do której zamontowano aparat Deana-Starka wraz z chłodnicą oraz termometrem. Po odparowaniu 10 ml toluenu, dodano modyfikator lub 55

56 Część doświadczalna Rozdział 10 katalizator. Do całości dodano również toluen. Reakcje prowadzono w atmosferze gazu obojętnego (argon). Temperaturę kontrolowano, aby nie przekroczyła 110 C. Po zakończeniu procesu modyfikacji mieszaninę filtrowano pod obniżonym ciśnieniem a otrzymany osad przemyto dichlorometanem. Przebieg procesu modyfikacji HA+PHB i β TCP+PHB. Wysuszony (120 o C) biomateriał wraz z toluenem umieszczono w kolbie trójszyjnej, okrągłodennej, do której zamontowano aparat Deana-Starka wraz z chłodnicą oraz termometrem. Po odparowaniu części toluenu (około ml), dodano modyfikator. Reakcje prowadzono w atmosferze gazu obojętnego (argon). Temperaturę kontrolowano, aby nie przekroczyła 110 C. Po określonym czasie (15h) mieszanina reakcyjna została ostudzona do temperatury pokojowej, po czym otrzymany produkt filtrowano, aby odseparować fazę osadu od rozpuszczalnika. Końcowym etapem było przemycie modyfikatu chlorkiem metylenu lub chloroformem, w celu usunięcia nieprzereagowanego polimeru. Ilości substratów stosowanych podczas procesów modyfikacji biomateriałów ceramicznych zestawiono w tabeli 4. 56

57 Masa biomateriału [g] modyfikator Masa modyfikatora [g] Ilość HMDI [ml] Ilość DBTDL [ml] Rozpuszczalnik Ilość rozpuszczalnika [ml] Część doświadczalna Rozdział 10 Tabela 4 Zestawienie ilości wszystkich substratów stosowanych w trakcie modyfikacji warstwy wierzchnie HA oraz β-tcp HA 4 PEG ,06 DMF 75 4 PEG ,06 DMF 75 4 PEG 5 3 0,06 DMF 75 4 phema 2,3 3 0,06 DMF 75 2 PAA 3 1,5 0,06 Etanol 60 3 LLA 1,5-0,06 TFH 21 Toluen 40 2 LLA 1,5 1,5 0,06 TFH 21 Toluen 40 6 PLLA Toluen 60 4 MMA ,06 DMF 75 8 PHB Toluen 100 β-tcp 4 PEG 5 3 0,06 DMF 75 4 phema 2,3 3 0,06 DMF 75 8 PHB Toluen MMA ,06 DMF 75 3 LLA 1,5-0,06 TFH 21 Toluen 40 9 ε-cl 9-0,14 Toluen PCL 9-0,14 Toluen

58 Część doświadczalna Rozdział Synteza HA oraz β-tcp Standardowo do otrzymywania pochodnych z modyfikowaną warstwą wierzchnią stosowano materiały komercyjne HA oraz β-tcp. Natomiast w celu otrzymania materiału dwufazowego (ang. biphasic calcium phosphates, BCP) z modyfikowaną warstwą wierzchnią, podjęto próbę syntezy wyjściowych biomateriałów ceramicznych HA i β-tcp. W tym celu przeanalizowano istniejące doniesienia literaturowe dotyczące metod otrzymywania HA, β-tcp oraz BCP [80 84]. Na tej podstawie opracowano własny sposób syntezy zarówno wyjściowych materiałów jak i materiału dwufazowego. Synteza HA_1 - roztwór wodorofosforanu diamonu wraz ze środkiem porotwórczym (8,74 g CTAB) wkroplono z prędkością v=3ml/min do stale mieszanego (1000 rpm) roztworu czterowodnego azotanu (V). Stężenia roztworów zostały tak dobrane, aby stosunek molowy Ca/P wynosił 1,67 (rysunek 12). ph mieszaniny utrzymywano na poziomie 9 poprzez dodanie amoniaku. Całość ogrzano do temp. 90 o C. Po upływie 2 godzin ciągłego mieszania biały osad odstawiono na 24 godziny aby dojrzewał, następnie przemyto wodą destylowaną oraz 98% alkoholem etylowym oraz filtrowano pod próżnią, a także wysuszono w temp. 80 o C przez 12 godzin. HA otrzymano poprzez kalcynację w temperaturze 800 o C przez 2 godziny (piec ogrzewano z szybkością 5 o C/min). 58

59 Część doświadczalna Rozdział 10 Rysunek 12 Schemat otrzymania HA_1 Synteza HA_2- roztwór wodorofosforanu sodu wraz ze środkiem porotwórczym (5 g CTAB) wkroplono z prędkością v=3ml/min do stale mieszanego (1000 rpm) roztworu czterowodnego azotanu (V). Stężenia roztworów zostały tak dobrane aby stosunek molowy Ca/P wynosił 1,67 (rysunek 13). ph mieszaniny utrzymywano na poziomie 10,8 poprzez dodanie amoniaku. Całość ogrzano do temp. 100 o C. Po upływie 2 godzin ciągłego mieszania biały osad odstawiono na 24 godziny aby dojrzewał, następnie przemyto wodą destylowaną oraz 98% alkoholem etylowym oraz filtrowano pod próżnią a także wysuszono w temp. 80 o C przez 12 godzin. HA otrzymano poprzez kalcynację w temperaturze 800 o C przez 2 godziny (piec ogrzewano z szybkością 5 o C/min). 59

60 Część doświadczalna Rozdział 10 Rysunek 13 Schemat otrzymania HA_2 Synteza β-tcp_1- roztwór czterowodnego azotanu (V) wapnia wkroplono z prędkością v=3ml/min do stale mieszanego (1000 rpm) roztworu wodorofosforanu diamonu (rysunek 14). Stężenia roztworów zostały tak dobrane aby stosunek molowy Ca/P wynosił 1,5. ph mieszaniny utrzymywano na poziomie 10,8 poprzez dodanie amoniaku. Po upływie 16 godzin ciągłego mieszania biały osad przemyto wodą destylowaną oraz 98% alkoholem etylowym a następnie filtrowano pod próżnią oraz wysuszono w temp. 80 o C przez 24 godz. β-tcp otrzymano poprzez kalcynację w temperaturze 800 o C przez dwie godzin (piec ogrzewano z szybkością 5 o C/min). 60

61 Część doświadczalna Rozdział 10 Rysunek 14 Schemat otrzymywania β-tcp_1 Synteza β-tcp_2-roztwór wodorofosforanu diamonu wkroplono z prędkością v=3ml/min do stale mieszanego (1000 rpm) roztworu czterowodnego azotanu (V). Stężenia roztworów zostały tak dobrane aby stosunek molowy Ca/P wynosił 1,5 (rysunek 15). ph mieszaniny utrzymywano na poziomie 10 poprzez dodanie amoniaku. Po upływie 15 godzin ciągłego mieszania biały osad przemyto wodą destylowaną oraz 98% alkoholem etylowym a następnie filtrowano pod próżnią oraz wysuszono w temp. 100 o C przez 12 godzin. β-tcp otrzymano poprzez kalcynację w temperaturze 1000 o C przez osiem godzin (piec ogrzewano z szybkością 5 o C/min). 61

62 Część doświadczalna Rozdział 10 Rysunek 15 Schemat otrzymywania β-tcp_2 Synteza BCP - roztwór czterowodnego azotanu (V) wapnia wkroplono z prędkością v=3ml/min do stale mieszanego (1000 rpm) roztworu dizasadowego fosforanu amonu. Stężenia roztworów zostały tak dobrane aby stosunek molowy Ca/P wynosił 1,6 (rysunek 16). ph mieszaniny utrzymywano na poziomie 11 poprzez dodanie amoniaku. Mieszaninę utrzymywano w temperaturze 40 o C przez 24 godziny. Po upływie doby wytrącony osad przemyto wodą destylowaną oraz 98% alkoholem etylowym a następnie filtrowano pod próżnią oraz wysuszono w temperaturze 100 o C przez 24 godziny. Końcowym etapem tej syntezy była kalcynacja materiału w temperaturze 1000 o C przez dwie godziny. 62

63 Część doświadczalna Rozdział 10 Rysunek 16 Schemat otrzymania BCP Modyfikacja materiału dwufazowego - w celu otrzymania dwufazowego materiału modyfikowanego za pomocą PEG jako materiałów wyjściowych użyto HA_2 oraz β- TCP_1. Pierwszym etapem było otrzymanie β-tcp_1 modyfikowanego PEG z użyciem czynnika sprzęgającego HMDI, tak jak zostało to opisane w punkcie W ten sposób otrzymano β-tcp_1+hmdi+peg. Kolejnym etapem było przyłączenie do modyfikatu HA_2. W tym celu również zastosowano HMDI oraz DBTDL. Końcowym produktem tej modyfikacji był β-tcp_1+hmdi+peg+hmdi+ha_2 (BCP+PEG) Obliczenie wydajności procesu modyfikacji Po przeprowadzeniu modyfikacji warstwy wierzchniej HA oraz β-tcp obliczono wydajności otrzymanych modyfikatów według następującego wzoru: M W P 100% (10) M S w którym: MP oznacza masę produktu po modyfikacji (modyfikatu), 63

64 Część doświadczalna Rozdział 10 MS to suma mas wszystkich substratów biorących udział w reakcji. W celu usunięcia nadmiaru nieprzereagowanego modyfikatora i obliczenia rzeczywistej wydajności reakcji otrzymane modyfikaty poddano wymyciu. Proces ten był przeprowadzany na dwa różne sposoby: poprzez ekstrakcję w aparacie Soxhleta lub wymycie próbek w SBF. Ekstrakcja polegała na przemywaniu zwrotnym w służącym do tego aparacie Soxhleta w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez okres minimum 15h. Rozpuszczalnik stosowany do ekstrakcji został dobrany indywidualnie w zależności od modyfikatora, tak, aby był on w nim rozpuszczalny, lecz jednocześnie by rozpuszczeniu nie uległ biomateriał (tabela 5). Tabela 5 Zestawienie rozpuszczalników użytych do ekstrakcji w trakcie wymywania w aparacie Soxhleta Rozpuszczalnik użyty do Numer próbki Nazwa próbki ekstrakcji w aparacie Soxhleta Modyfikaty HA 1. HA+HMDI+PEG_(5) etanol 2. HA+HMDI+PEG_(10) etanol 3. HA+HMDI+PEG_(20) etanol 4. HA+HMDI+pHEMA metanol 5. HA+HMDI+PAA etanol 6. HA+LLA chloroform 7. HA+HMDI+LLA chloroform 8. HA+PLLA chloroform 9. HA+HMDI+MMA etanol 10. HA+PHB chloroform Modyfikaty β-tcp 1. β-tcp+hmdi+peg etanol 2. β-tcp+hmdi+phema metanol 3. β-tcp+phb chloroform 4. β-tcp+hmdi+mma etanol 5. β-tcp+lla chloroform 6. β-tcp+ε-cl chloroform 7. β-tcp+pcl chloroform 64

65 Część doświadczalna Rozdział 10 Drugi rodzaj wymycia polegał na umieszczeniu próbek w SBF w cieplarce ustawionej na 36,6 o C na 7 dni. Po zakończeniu procesu wymycia próbkę poddano suszeniu, a następnie wykonano widmo w podczerwieni w celu identyfikacji zmian zachodzących na powierzchni modyfikowanego materiału Obliczenie stopnia pokrycia powierzchni W celu obliczenia w jakim stopniu powierzchnia biomateriału jest pokryta przez modyfikator skorzystano ze wzoru określającego liczbę grup modyfikatora na 1 nm 2 biomateriału (ρ): (%C) (11) [1200 (%C n MW(%C) S )] C We wzorze tym MW oznacza masę cząsteczkową modyfikatora, nc to ilość atomów węgla w modyfikacie, %C jest to zawartość procentowa węgla w próbce, natomiast SBET oznacza powierzchnię właściwą biomateriału przed modyfikacją. Powierzchnię właściwą wyrażoną w m 2 /g wyznaczono metodą adsorpcji polimolekularnej Braunauera, Emmetta i Tellera (BET) za pomocą sorptometru ASAP 2020, firmy Micrometric Instruments, Norcross, GA, USA. Badania te zostały wykonane w Zakładzie Technologii Chemicznej Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej. W celu wyznaczenia powierzchni właściwej analizowaną próbkę umieszcza się w kolumnie. Aby oczyścić powierzchnię materiału przez kolumnę przepuszcza się hel. Następnie obniża się w niej ciśnienie, aby odgazować próbkę. Kolejnym etapem jest przepuszczenie przez kolumnę azotu oraz zanurzenie jej w naczyniu z ciekłym azotem. Skroplony azot wnika w pory materiału, co skutkuje zmniejszeniem ilości tego gazu na wylocie i rejestracją piku na izotermie adsorpcji. Dzieje się tak dopóki cała powierzchnia próbki nie zostanie pokryta azotem, następuje wtedy usunięcie kolumny z naczynia z azotem i desorpcja gazu. Powierzchnię właściwą wyznacza się z równania izotermy adsorpcji BET. Procentowa zawartość węgla w modyfikacie została wyznaczona na podstawie analizy elementarnej. Badania wykonano w Środowiskowym Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej (ŚLUACH) znajdującym się na Wydziale Chemii Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu za pomocą aparatu EA Vario EL III (Elementar Analysensysteme GmbH). Po odgazowaniu próbki powstałe w jego wyniku gazy 65 BET

66 Część doświadczalna Rozdział 11 przenoszone są w strumieniu gazu obojętnego (hel) do komory spalania. Spalanie odbywa się w obecności katalizatorów w atmosferze tlenu. Produkty spalania tj. woda oraz dwutlenek węgla wprowadzane są do komory mieszania, następnie rozdzielane na kolumnie adsorpcyjnej i oznaczane przy pomocy detektora gazów. 11. Stosowane metody badań oraz aparatura badawcza Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) Aby wykonać widmo w podczerwieni materiałów proszkowych należy analizowane próbki przygotować w postaci pastylek. W celu otrzymania pastylki odważono na wadze analitycznej ok. 1,5 mg analizowanej próbki oraz 200 mg KBr. Proszki wsypano do moździerza i ucierano 15 min, aby dobrze się wymieszały. Następnie wymieszane proszki umieszczono w pastylkarce pod prasą o średnicy 13 mm (Specac, Cat. No.:GS03000). Pastylkarkę podłączono do próżni na 1 minutę, a po jej upływie przyłożono ciśnienie rzędu 4 MPa i przez kolejne 3 minuty utrzymywano je wraz z próżnią. Stosowanie próżni zapobiega adsorpcji wody z otoczenia poprzez odpowietrzenie materiału, natomiast podwyższone ciśnienie zapewnia transparentność otrzymanej pastylki. Gotową pastylkę umieszczono w metalowym uchwycie znajdującym się w komorze pomiarowej spektrometru (Vertex 70, Bruker). Pomiarów dokonano w zakresie środkowej podczerwieni ( cm -1 ) z rozdzielczością 4cm -1 w temperaturze pokojowej z szybkością 64 skany/min. Przed wykonaniem pomiaru widma próbki za każdym razem wykonywano najpierw widmo KBr w celu uzyskania widma tła odejmowanego automatycznie przez spektrometr od widma próbki. Pracowano w programie OPUS Operator Spektroskopia tłumionego całkowitego odbicia wewnętrznego, ATR Dużą zaletą metody ATR jest to że, w przeciwieństwie do metody FTIR w celu wykonania widma nie trzeba przegotowywać pastylki z KBr. Analizowany proszek umieszcza się bowiem bezpośrednio na płytce specjalnej przystawki w której znajduje się kryształ ZnSe. Badania wykonano na tym samym spektrometrze co widma FTIR z taką samą zdolnością rozdzielczą. 66

67 Część doświadczalna Rozdział Spektroskopia Ramana Badania wykonano w Katedrze Spektroskopii Optycznej na Wydziale Fizyki Technicznej Politechniki Poznańskiej. Pomiar widm Ramana również nie wymaga żadnego wcześniejszego przygotowania próbek. Próbki poddano analizie metodą ramanowskiego rozpraszania światła w obszarze spektralnym cm -1. Nie spolaryzowane widma Ramana zostały zarejestrowane za pomocą spektrometru invia Renishaw z systemem micro-raman pozwalającym na pomiar widma z rozdzielczością przestrzenną 0,1 μm. W trakcie badań rozdzielczość spektralna wynosiła 2 cm -1. Jako światła wzbudzającego użyto lasera o długości fali 785 nm. Wiązka lasera o średnicy 0,2 μm została skupiona na powierzchni próbki przez obiektyw mikroskopu Leica 50x o aperturze numerycznej równej 0,5. Aby uniknąć uszkodzeń próbki moc wzbudzania została ustawiona na 5mW. Położenie obiektywu mikroskopu było kontrolowane podczas pomiarów. Podczas pomiarów oraz do obróbki zarejestrowanych widm użyto oprogramowania WIRE Spektroskopia fotoelektronów w zakresie promieniowania X, XPS Badania wykonano w Laboratorium Analitycznym Wydziału Chemii Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. Analizy chemicznej składu powierzchniowego materiałów proszków dokonano metodą spektroskopii elektronowej XPS. Próbki analizowano w warunkach wysokiej próżni w wielokomorowym systemie UHV, Prevac. Przed analizą spektralną badane próbki nie były poddane mechanicznej lub chemicznej obróbce. Po zamontowaniu próbek na nośniku molibdenowym, proszki były odgazowane w temperaturze pokojowej do stałej, wysokiej próżni, w śluzie załadowczej systemu UHV. Następnie, po transferze nośnika z próbką do komory analitycznej systemu UHV wykonano właściwą analizę XPS. Jako źródło wzbudzające stosowano lampę achromatyczną Al/Mg. W trakcie zbierania widm próbki były równocześnie naświetlane niskoenergetycznym źródłem elektronów EFG (Elektron Flood Gun) celem eliminacji elektrostatycznego ładowania się preparatów. Do obróbki widm XPS oraz obliczeń ilościowego składu powierzchniowego badanych materiałów użyto oprogramowania CasaXPS. W celu normalizacji pomiarów spektroskopowych oś X widm XPS (energia wiązania EB) kalibrowano na pik węgla neutralnego C1s (EB =284,5 ev). 67

68 Część doświadczalna Rozdział Osteoindukcyjność i bioaktywność Właściwości osteoindukcyjne oraz związaną z nimi bioaktywność przejawiające się zdolnością do narastania warstwy apatytu zbadano poprzez obserwacje zmian morfologii powierzchni badanych materiałów. W tym celu próbki inkubowano w płynie symulujących płyny ustrojowe SBF w temperaturze ciała (37 o C) przez okres minimum 30 dni. Następnie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) z przystawką analityczną EDS oznaczano przyrost hydroksyapatytu, który świadczy o możliwości międzyfazowego połączenia materiału z tkanką żywą. W trakcie trwania eksperymentu co trzy dni mierzono wartość ph. Dla wybranych próbek wykonano również pomiar potencjału dzeta oraz rejestrowano widma ATR i Ramana (rysunek 17). Rysunek 17 Schemat procedury stosowanej podczas badania zdolności do narastania warstwy apatytu na powierzchni biomateriałów Płyn symulujący środowisko ustrojowe (osocze krwi) został przygotowany według procedury opracowanej przez Tadashi Kokubo [64,85 89]. W celu przygotowania 1000 ml SBF należy najpierw 700 ml wody destylowanej umieścić w termostatowanym w 36,5 1,5 o C plastikowym pojemniku wyposażonym w mieszadło magnetyczne. Temperatura oraz mieszanie utrzymywane są przez cały czas przygotowania SBF. Następnie odczynniki z tabeli 6 w kolejności od 1 do 8 należy z zachowaniem kolejności rozpuścić w wodzie destylowanej znajdującej się w pojemniku. 68

69 Część doświadczalna Rozdział 11 Tabela 6 Kolejność oraz ilość odczynników potrzebnych do przygotowania 1l roztworu SBF Lp. Odczynnik Ilość 1. NaCl 8,035 g 2. NaHCO3 0,355 g 3. KCl 0,225 g 4. K2HPO4 3H2O 0,231 g 5. MgCl2 6H2O 0,311 g 6. 1,0M HCl 39 ml 7. CaCl2 0,292 g 8. Na2SO4 0,072 g 9. Tris 6,118 g 10. 1,0 M HCl 0-5 ml Przed dodaniem Tris poziom wody uzupełnia się do 900 ml i sprawdza się czy ph roztworu mieści się w zakresie od 1 do 3. Tris należy dodawać małymi partiami, kontrolując przed dodaniem kolejnej czy poprzednia partia została zupełnie rozpuszczona oraz czy nie doszło do gwałtownej zmiany wartości ph. Wartość ph roztworu w trakcie dodawania Tris powinna stopniowo wzrastać i gdy osiągnie poziom 7,3 0,05 należy upewnić się że temperatura mieści się w zakresie o C. Tris dodaje się do momentu gdy wartość ph roztworu nie przekracza 7,45 0,01. Wtedy powoli wkrapla się część 1,0 M HCl, stale kontrolując ph, które nie powinno spaść poniżej 7,4. Przy wartości 7,42 0,01 dodaje się kolejną porcję Tris i tak naprzemiennie aż do wykorzystania całej ilości tego odczynnika. Końcowym etapem jest uzupełnienie zawartości pojemnika do 1000 ml. Przygotowany w ten sposób SBF ma wartość ph dokładnie 7,4 w temperaturze 36,5 o C. Należy pamiętać o tym że ph SBF spada wraz ze wzrostem temperatury z szybkością 0,05/ o C. SBF pozostawia się do ostygnięcia do temperatury 20 o C, a następnie uzupełnia jeszcze raz do poziomu 1000 ml, gdyż objętość po ostudzeniu zmniejsza się. Gotowy płyn przechowuje się w lodówce w temperaturze od 5 do 10 o C przez okres nie dłuższy niż 30 dni. 69

70 Część doświadczalna Rozdział 11 Skład oraz stężenie jonów SBF jest zbliżony do wartości występujących w osoczu ludzkiej krwi (tabela 7). Tabela 7 Porównanie stężenia jonów osocza krwi oraz roztworu SBF Stężenie jonu [mm] Jon Osocze krwi SBF Na + 142,0 142,0 K + 5,0 5,0 Mg 2+ 1,5 1,5 Ca 2+ 2,5 2,5 Cl - 103,0 147,8 HCO 27,0 4,2 3 2 HPO 1,0 1,0 4 2 SO 0,5 0,5 4 ph 7,2-7,4 7,4 Procedura otrzymania pastylki do badań właściwości bioaktywnych (osteoindukcyjnych) oraz degradacyjnych jest analogiczna do otrzymania pastylki do wykonania widma metodą FTIR. Różnica jest taka, że pastylki przechowywane w płynach ustrojowych nie zawierają KBr, gdyż wykonane są w całości z badanego biomateriału. Materiały proszkowe (ok. 150 mg) sprasowano w temperaturze pokojowej za pomocą tabletkarki (Specac, Cat. No.:GS03000). Pastylkarkę podłączono do próżni na 1 minutę, a po jej upływie przyłożono ciśnienie rzędu 4 MPa i przez kolejne 3 minuty utrzymywano je wraz z próżnią. Otrzymano w ten sposób pastylki o średnicy 13 mm oraz wysokości 2 mm. Dla porównania efektów podczas trwania eksperymentu w niektórych próbkach co tydzień wymieniano SBF, aby zapewnić dopływ świeżych jonów. Materiały analizowano w odstępach tygodniowych, czyli po 7, 14, 21 oraz 28 dniach. Pastylki (bez wcześniejszej sterylizacji) moczono w 35 ml SBF. Objętość ta (Vs w ml) została obliczona z następującego równania [85]: 70

71 Część doświadczalna Rozdział 11 w którym Sa to powierzchnia zewnętrzna próbki [mm 2 ]. V s S a 10 (12) Po upływie określonego czasu próbki wyjmowano z roztworów, obficie przemywano wodą destylowaną, suszono w temperaturze 60 o C a następnie ważono. Każdy pomiar został wykonany pięciokrotnie. Raz wyjęte próbki nie były ponownie zanurzane SEM/EDS Zarówno badania mikroskopowe jak i składu chemicznego wykonano w Zakładzie Metaloznawstwa i Inżynierii Powierzchni na Wydziale Budowy Maszyn i Zarządzania Politechniki Poznańskiej. Morfologia powierzchni została zarejestrowana za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego Tescan Vega 5135 przy napięciu przyspieszającym 12 kev. Badania składu chemicznego metodą EDS przeprowadzono na mikronanalizatorze (spektrometrze) PGT Avalon. Próbki przed obserwacją mikroskopową pokrywane były próżniowo cienką warstwą złota Pomiar ph Stabilność materiałów oceniono na podstawie zmiany wartości ph roztworów wodnych, w których inkubowano próbki. Pomiarów dokonano używając skalibrowanego pehametru Lab 850 firmy Schott Instruments. ph wodnych roztworów symulujących środowisko ustrojowe (SBF, płyn Ringera oraz Tris-HCl) mierzono co trzy dni w temperaturze ciepłoty ciała ludzkiego (37 o C) Degradowalność W celu oceny zdolności degradacyjnych pastylki (wykonane w identyczny sposób jak w przypadku badań bioaktywności) badanych biomateriałów zanurzono a następnie inkubowano w roztworze buforowym Tris-HCl oraz płynie Ringera [90]. Stosunek objętości płynu do masy próbki wynosił 200 ml/g [91]. Po upływie określonego czasu, czyli 30 dni, pastylki wyjęto z roztworów, przemyto obficie wodą destylowaną oraz suszono w temperaturze 60 o C do momentu uzyskania stabilnej masy (z dokładnością do 0,01 mg). Wszystkie pomiary powtórzono co najmniej 3 razy. Wartości otrzymane ze wszystkich pomiarów uśredniono. Ocenę zdolności degradacyjnych przeprowadzono na podstawie oceny spadku masy oraz analizy widm ATR. 71

72 Część doświadczalna Rozdział Masa względna i sorpcja wody Spadek lub wzrost masy pastylek biomateriałów podczas inkubacji w różnych roztworach symulujących płyny ustrojowe oraz buforowych (tj. SBF, płyn Ringera lub Tris-HCl) mierzono na podstawie wyznaczonej masy względnej. Masa względna (ang. relative weight, RW) jest to stosunek masy pastylki (wysuszonej) po przechowywaniu przez czas t (Mt) do jej masy początkowej (M0) pomnożonej przez 100%, zgodnie z równaniem: M RW M t 0 100[%] (13) Natomiast zdolność do wchłaniania wody, czyli sorpcji (ang. water uptake, WU) oblicza się z następującego wzoru [92]: MM M0 WU 100% (14) M 0 w którym MM to masa mokrej pastylki. Masę tą wyznacza się ważąc pastylkę po wyjęciu z płynu, w którym była inkubowana, po przemyciu wodą destylowaną oraz osuszeniu za pomocą bibuły w celu usunięcia znajdującego się na powierzchni nadmiaru wody Potencjał dzeta Badania pomiaru potencjału elektrokinetycznego dzeta wykonano w Zakładzie Technologii Chemicznej Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej stosując aparat Zetasizer nano firmy Malvern Instruments Co. (UK) wyposażony w autotitrator. W celu przeprowadzenia pomiarów potencjału dzeta odpowiednią ilość badanej próbki zawieszono w 25 cm 3 0,001 M NaCl lub roztworu SBF. Przygotowaną zawiesinę umieszczono w kuwecie. Jej zawartość mieszano przez cały czas prowadzenia pomiarów. Następnie zawiesinę miareczkowano roztworami 0,2 M HCl oraz 0,2 M NaOH i za pomocą szklanej elektrody mierzono ph. Titrator przez zadozowanie odpowiedniej ilości kwasu bądź zasady utrzymuje wartość ph na odpowiednim poziomie. Część próbki przepompowano do celki kapilarnej umieszczonej wewnątrz aparatu, w celu pomiaru ruchliwości elektroforetycznej, która umożliwia obliczenie potencjału dzeta. 72

73 Część doświadczalna Rozdział Uwalnianie leku W celu jak najdokładniejszego symulowania formy w jakiej otrzymane materiały będą docelowo stosowane zmodyfikowane biomateriały (proszki) zostały uformowane w scaffoldy (rusztowania). Proces przygotowania scaffoldów składał się z kilku etapów. Modyfikowany materiał ceramiczny mieszano ze środkiem porotwórczym (NaCl o wielkości cząstek od 200 do 400 mikrometrów) oraz materiałem polimerowych (PHB, Tg=172 o C) za pomocą mieszadła magnetycznego (t=30 min). Stosunek wagowy NaCl do sumarycznej ilości PHB i modyfikowanego HA regulowano tak, aby otrzymać odpowiednią porowatość scaffoldu: 50 lub 80% (1:1 lub 4:1). Następnie, wymieszane materiały proszkowe wygrzewano w piecu w temperaturze 180 o C, po czym formowano walec (d=13 mm, h=15 mm) poprzez prasowanie jednoosiowe w pastylkarce ze stali nierdzewnej (5 MPa, 5 min). Kolejnym etapem było zanurzenie sprasowanego walca w wodzie destylowanej, tak aby całość NaCl została usunięto, a otrzymany scaffold miał odpowiednią porowatość. W tym celu co kilka godzin wymieniano wodę. Gotowy scaffold suszono w temp. 50 o C przez ok. 48 godzin do otrzymania stałej masy. Porowatość scaffoldu wyznaczono metodą piknometryczną stosując etanol jako medium. Substancja aktywna (ibuprofen) była wprowadzona do scaffoldu na skutek sorpcji. Badania dostępności farmaceutycznej prowadzono w termostatowanej łaźni wodnej z wytrząsaniem (100 rpm). Scaffoldy były umieszczone w 200 ml buforu fosforanowego o ph równym 7,4. Każdy scaffold zawierał 150 mg ibuprofenu. Porcję próbki (5 ml) pobierano za pomocą strzykawki z filtrem, następnie badano jej absorbancję przy długości fali 264 nm. Czas badania dla każdej próbki wynosił trzy dni. Eksperyment powtarzano trzykrotnie. 73

74 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 WYNIKI I DYSKUSJA 12. Ocena procesu modyfikacji Widma FTIR modyfikatów umieszczone na poniższych rysunkach zostały zaprezentowane razem z widmami biomateriałów niemodyfikowanych oraz widmami modyfikatorów. Widma ATR biomateriałów po modyfikacji zestawiono wraz z widmami biomateriałów niemodyfikowanych. Ponieważ za poszczególne pasma widoczne zarówno w widmach FTIR jak i ATR odpowiadają sygnały w obszarach identycznych liczb falowych, szczegółowa interpretacja widm wszystkich modyfikatów została zestawiona w tabelach Hydroksyapatyt oraz jego modyfikaty Hydroksyapatyt niemodyfikowany Widma FTIR oraz ATR dla hydroksyapatytu niemodyfikowanego zaprezentowano, odpowiednio na rysunkach 18 oraz 19. Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm wraz z odpowiadającą im liczbą falową przedstawiono w tabeli 8. Najbardziej charakterystycznym dla tego związku pasmom pochodzących od grup fosforanowych 3 PO 4 odpowiadają liczby falowe 470, 566, 603, 960, 1033 oraz 1096 cm -1, za które odpowiedzialne są cztery rodzaje drgań: ν1, ν2, ν3, i ν4. Rysunek 18 Widmo FTIR hydroksyapatytu niemodyfikowanego 74

75 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Wszystkie pasma należące do grup fosforanowych widoczne w widmie (rys. 18) są typowe dla tetraedrycznej struktury apatytowej [93,94]. Szerokie pasmo w zakresie liczb falowych cm -1 odpowiada drganiom rozciągającym ν3, natomiast pasmo w zakresie cm -1 związane jest z drganiami zginającymi ν3. Ponadto dwa wąskie pojedyncze pasma zaobserwowane przy liczbach falowych 470 oraz 960 cm -1 należą odpowiednio do drgań zginających ν2 oraz rozciągających ν1. W widmie HA widoczne są również dodatkowe zaadsorbowanej wody. jony, takie jak, NO 3, 2 CO 3 oraz pasma pochodzące od Rysunek 19 Widmo ATR hydroksyapatytu niemodyfikowanego Pasmo w położeniu 1400 cm -1 świadczy o obecności jonu pochodzącego od grup azotowych NO 3, będących wynikiem zanieczyszczeń pozostałych po syntezie HA. Widmo FTIR dowodzi, że użyty w pracy HA należy do grupy hydroksyapatytów węglanowych, gdyż w swojej strukturze ma liczne podstawienia grup 2 CO 3. Szerokie pasma pochodzące od grup węglanowych znajdują się w położeniu liczb falowych 877 oraz 1424 cm -1 [95,96]. Pasma o liczbach falowych 1634 oraz 3419 cm -1 związane są z drganiami O-H wynikającymi z obecności zaadsorbowanej w materiale wody [97]. Kolejne typowe dla HA szerokie pasmo drgań rozciągających oraz zginających charakterystyczne dla grup hydroksylowych OH widoczne są przy liczbie falowej 3670 cm -1 i 632 cm -1. Czasami w widmach FTIR widoczne są również pasma pochodzące 75

76 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 od dwutlenku węgla pochłoniętego z atmosfery. Można je jednak wyeliminować za pomocą oprogramowania OPUS, które wykorzystywano podczas rejestracji widm. Tabela 8 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA niemodyfikowanego [94,95] pasmo rodzaj drgań lub pasma liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol fosforanowe fosforanowe fosforanowe PO zginające ν PO zginające ν PO zginające ν hydroksylowe OH - konstytucyjne 632 węglanowe fosforanowe fosforanowe fosforanowe azotowych węglanowe CO ν PO rozciągające ν PO rozciągające ν PO rozciągające ν NO CO ν H2O adsorbcyjne ν CO2 rozpuszczalne ν H2O adsorbcyjne 3419 hydroksylowe OH - konstytucyjne 3670 Tak jak w widmie FTIR HA niemodyfikowanego również w widmie Ramana (rys. 20) zostały zarejestrowane cztery rodzaje drgań charakterystyczne dla tetraedrycznej 76

77 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 budowy grup fosforanowych w apatycie. Najbardziej intensywne, pojedyncze pasmo (962 cm -1 ) pochodzi od symetrycznych drgań rozciągających ν1. Rysunek 20 Widmo Ramana HA niemodyfikowanego Pasma w położeniu 435 oraz 450 cm -1 przypisuje się drganiom zginającym ν2. Ponadto, zarejestrowano dwa pasma drgań asymetrycznych, pierwsze przy 1060 cm -1 należące do drgań rozciągających ν3 oraz drugie przy 590 cm -1, za które odpowiedzialne są drgania zginające ν4 [98,99] HA+HMDI+PEG Rysunek 21 Widmo FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego PEG (b) oraz PEG (c) Widma HA modyfikowanego PEG z użyciem czynnika sprzęgającego przedstawiono na rysunkach 21-23b. W porównaniu z widmami HA niemodyfikowanego (rys a) w widmach HA+HMDI+PEG widoczne są dodatkowe pasma. Pasma te pochodzą zarówno od PEG jak i czynnika sprzęgającego. 77

78 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 22 Widmo ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego PEG (b) W widmach FTIR oraz ATR w obszarze liczb falowych 3441 oraz 3337 cm -1 zarejestrowano charakterystyczne pasma grup hydroksylowych (OH) oraz aminowych (NH) za które odpowiedzialne są drgania rozciągające. Tabela 9 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA niemodyfikowanego nazwa pasmo symbol rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] eterowa C-O-C rozciągające 1255 metylenowa CH2 zginające 1462 zginające 1479 amidowa C(O)NH rozciągające 1575 karbonylowa C=O rozciągające 1625 metylenowa CH2 rozciągające 2857 rozciągające 2934 aminowa NH rozciągające 3337 hydroksylowa OH rozciągające 3441 Zaobserwowano również podwójne pasma drgań rozciągających oraz zginających odpowiednio przy liczbach falowych 2934, 2859 cm -1 oraz 1479 i 1462 cm -1 pochodzące 78

79 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 od grup metylenowych (-CH2). Kolejnymi widocznymi w widmie zmianami są silne pasma w okolicach liczby falowej 1625 oraz 1575 cm -1, za które odpowiedzialne są odpowiednio grupy karbonylowa (C=O) oraz amidowa (C(O)NH). Analiza widm Ramana również potwierdziła obecność polimeru na powierzchni HA (rys. 23), jednakże intensywność pasm jest znacznie mniejsza niż w przypadku podczerwieni. Rysunek 23 Widmo Ramana HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego PEG (b) oraz PEG (c) Poniżej, na rysunku 24 przedstawiono prawdopodobny przebieg reakcji pomiędzy HA a HMDI a następnie PEG. W reakcji tej zastosowano również katalizator, który przyspiesza szybkość reakcji oraz kontroluje równowagę pomiędzy propagacją łańcucha oraz zakończeniem reakcji [100,101]. Jak powszechnie wiadomo, związki cynoorganiczne są bardzo efektywne i często stosowane do katalizowania reakcji pomiędzy grupami hydroksylowymi a izocyjanianami. Jednakże, mechanizm tych reakcji nadal nie jest poznany, pomimo prób wielu grup badawczych [96,100]. Propozycja stworzona podczas realizacji niniejszej pracy jest następująca. Najbardziej aktywnymi miejscami na powierzchni HA są grupy hydroksylowe [ ]. W pierwszym etapie reakcji tworzy się wiązanie pomiędzy węglem pochodzącym z grup izocyjanianowych (N-C=O) HMDI a tlenem z grupy hydroksylowej (OH) HA. W kolejnym etapie utworzony w ten sposób półprodukt reaguje z polimerem. Reakcja ta zachodzi pomiędzy drugim węglem grupy izocyjanianowej a tlenem pochodzącym od polimeru (rys. 24). 79

80 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 24 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą PEG, z użyciem HMDI Wyniki analizy spektralnej HA+HMDI+PEG zamieszczono na rysunku 25 oraz w tabeli 10. Analiza spektralna potwierdza znaczący udział polimeru w składzie chemicznym warstwy powierzchniowej badanego materiału. Sygnały pochodzące od atomu węgla (C 1s) wskazują na obecność czterech różnych rodzajów wiązań węgla. Pik o największej intensywności, o energii wiązania 284,70 ev należy do dwóch rodzajów wiązań węgla C-C oraz C-H. Sygnały o energii wiązania 286,20 ev oraz 287,47 ev są przypisane odpowiednio do grup eterowych C-O-C oraz karbonylowych C=O. Kolejny sygnał grup węglanowych został również zidentyfikowany przy wartości energii wiązania 288,80 ev. Potwierdza to rezultaty uzyskane na podstawie analizy widm FTIR, a mianowicie, że HA używany w pracy jest HA węglanowym. Sygnał pochodzący od Ca 2p złożony jest z dwóch linii: Ca 2p ½ (350,85 ev) należącym do apatytu oraz Ca 2p 3/2 przypisanym do wiązania Ca-O. Sygnał przy 398,83 ev jest charakterystyczny dla atomu N 1s, który potwierdza obecność wiązania N-C w HMDI w warstwie wierzchniej modyfikowanego HA. Dwa sygnały pochodzące od tlenu o energiach wiązania odpowiednio 530,90 ev oraz 532,48 ev zostały przypisane do grup ortofosforanowych 3 PO4 oraz grup hydroksylowych OH. Również sygnał fosforu P 2p z energią wiązania 134,08 ev odpowiedzialny jest za grupę 3 PO 4. 80

81 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 25 Szerokopasmowe widmo XPS HA+HMDI+PEG. Na widmie zaznaczono regiony pasm spektralnych przejść elektronowych użyte do obliczeń chemicznego, powierzchniowego składu badanej próbki Reakcja modyfikacji powierzchni HA za pomocą polimeru (PEG) oraz z udziałem czynnika sprzęgającego (HMDI) została potwierdzona metodami spektroskopii w podczerwieni, Ramana oraz fotoelektronów. Otrzymane rezultaty wskazują na obecność PEG oraz HMDI na powierzchni HA. Najbardziej charakterystyczne pasma zarejestrowane w widmie FTIR (C=O, C(O)NH, CH2) są tożsame z wynikami innych autorów [102,105]. 81

82 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 10 Analiza XPS składu powierzchniowego HA+HMDI+PEG HA+HMDI+PEG pierwiastek energia wiązania (ev) powierzchnia % at wiązanie C 1s 284, ,18 64,98 C-C, C-H C 1s 286,20 854,32 20,94 C-O-C, C 1s 287,47 384,74 9,43 C=O C 1s 288,80 189,50 4,64 -CO 3 O 1s 530, ,16 86,67 3 PO 4, Ca-O O 1s 532,48 532,13 13,33 P-OH Ca 2p 3/2 347,30 574,03 100,00 Ca-O Ca 2p 1/2 350,85 287,01 - N 1s 398, , ,00 N-C P 2p 134,08 164,60 100,00 3 PO HA+HMDI+pHEMA Zmiany jakie zaszły na powierzchni hydroksyapatytu po modyfikacji z użyciem poli(hema) jako modyfikatora przedstawiono na poniższym rysunkach (rys. 26b, 27b). Zaobserwowane zmiany są analogiczne do poprzedniego modyfikatu gdyż za pasma widoczne w widmie odpowiedzialne są te same grupy funkcyjne, co w przypadku hydroksyapatytu modyfikowanego przy użyciu PEG. 82

83 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 26 Widmo FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego phema (b) oraz phema (c) Zarówno w widmach FTIR (rys. 26b) HA+HMDI+pHEMA jak i ATR (rys. 27b) widocznymi różnicami w stosunku do HA+HMDI+PEG (rys. 21b oraz 22b) są dwa pasma. Pierwsze to dodatkowy sygnał pochodzący od drgań rozciągających grupy karbonylowej (1720 cm -1 ). Sygnał ten jest zdecydowanie bardziej intensywny w przypadku widma ATR niż FTIR. Rysunek 27 Widmo ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego phema (b) 83

84 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Oznacza to, że grupa karbonylowa pochodząca od phema została przyłączona do części warstwy wierzchniej znajdującej się bliżej jej zewnętrznej krawędzi niż w przypadku grupy pochodzącej od HMDI. Za drugi sygnał odpowiedzialne są drgania zginające grup metylenowych (1462, 1479 cm -1 ) i chociaż grupy te są obecne również w modyfikacie z PEG, są one mniej intensywne niż w przypadku modyfikatu z phema. Tabela 11 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA+HMDI+pHEMA pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1255 metylenowa CH2 zginające 1462 zginające 1479 amidowa C(O)NH rozciągające 1575 karbonylowa C=O rozciągające metylenowa CH2 rozciągające 2837 rozciągające 2933 aminowa NH rozciągające 3337 hydroksylowa OH rozciągające

85 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 28 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą phema, z użyciem HMDI Proponowany schemat reakcji pomiędzy HA a phema z użyciem czynnika sprzęgającego przedstawiono na rys. 28. Tak jak w przypadku poprzedniej reakcji, reakcja ta składa się z dwóch etapów. Pierwszy etap jest identyczny do reakcji HA+HMDI+PEG. Natomiast w drugim etapie węgiel z izocyjanianu reaguje z grupą hydroksylową pochodzącą z polimeru. Rysunek 29 Szerokopasmowe widmo XPS próbki HA+HMDI+p-HEMA Na widmie zaznaczono regiony spektralnych przejść elektronowych użyte do obliczeń chemicznego, powierzchniowego składu badanej próbki 85

86 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 12 Analiza XPS składu powierzchniowego HA+HMDI+pHEMA HA+HMDI+pHEMA pierwiastek energia wiązania (ev) powierzchnia % at wiązanie C 1s 284, ,51 58,33 C-C, C-H C 1s 285, ,07 25,15 C-O-C C 1s 287,57 583,86 5,66 C=O C 1s 288,45 869,49 8,43 O=C-O- C 1s 289,30 250,00 2,42 -CO3 O 1s 529,83 999,82 6,73 3 PO 4, Ca-O O 1s 531, ,74 83,86 N-C=O O 1s 533, ,83 9,41 C-O-C Ca 2p 3/2 348, ,91 100,00 Ca-O Ca 2p 1/2 351, ,95 - N 1s 399, ,18 89,20 N-C N 1s 400,49 434,94 10,80 NH P 2p 134,52 873,93 100,00 3 PO 4 Wyniki analizy spektralnej XPS próbki polimerowej na bazie nośnika nieorganicznego - hydroksyapatytu wraz z interpretacją stanu i składu chemicznego 86

87 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 powierzchni badanej próbki zamieszczono na rysunku 29 oraz w tabeli 12. Jak wynika z analizy spektralnej na powierzchni nośnika (HA) znajdują się grupy mogące świadczyć o obecności poliuretanu na bazie metylenodiizocyjanianu (HMDI) oraz żywicy akrylowej, jako polimetakrylanu hydroksyetylowego (phema). Porównując wyniki analizy spektralnej materiału HA+HMDI+pHEMA z poprzednim modyfikatem zaobserwowano kilka różnic, mianowicie w przypadku modyfikatu z phema zostały zarejestrowane trzy dodatkowe sygnały. Pierwszy, o energii wiązania 288,45 ev przypisano grupie karbonylowej C=O (C 1s). Kolejny sygnał należy do tlenu (O 1s), posiada energię wiązania 531,55 ev i odpowiada za wiązanie N- C=O w grupie izocyjanianowej. Ostatni, trzeci sygnał różniący oba związki to sygnał pochodzący od azotu N 1s o energii wiązania 400,49 ev, charakterystyczny dla wiązania N-H HA+HMDI+PAA Rysunek 30 Widmo FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego PAA (b) oraz PAA (c) W widmie FTIR HA+HMDI+PAA (rys. 30) mimo zastosowania czynnika sprzęgającego większość pasm pochodzi od modyfikatora. W przypadku tego modyfikatu zachodzi ciekawe zjawisko przysłaniania pasm grup funkcyjnych jednego związku (HMDI) przez pasma pochodzące od innego materiału (PAA). 87

88 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 31 Widmo ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego PAA (b) I tak, w zakresie liczb falowych cm -1 pasma charakterystyczne dla grupy karbonylowej oraz amidowej (widoczne w widmach poprzednio analizowanych materiałów zostały przysłonięte przez szerokie i bardzo intensywne pasmo grupy karbonylowej pochodzącej od PAA (1587 cm -1 ). Dwa podwójne sygnały przy 2857 i 2934 cm -1 oraz 1462 i 1479 świadczą o przyłączeniu się grup CH2. Co ciekawe w widmie ATR HA modyfikowanego PAA pasma pochodzące od modyfikatora są znacznie mniej intensywne niż miało to miejsce w widmach FTIR. Oznacza to, że w zewnętrznej warstwie modyfikatu zostało przyłączone mniej PAA niż w jego wewnętrznej części. Tabela 13 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA+HMDI+PAA pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol węgel-węgiel C-C rozciągające 1409 metylenowa CH2 zginające 1462 zginające 1479 karbonylowa C=O rozciągające 1587 metylenowa CH2 rozciągające 2837 rozciągające

89 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Proponowany przebieg reakcji modyfikacji HA za pomocą soli sodowej kwasu PAA, z użyciem HMDI przedstawiono na rysunku 32. Biorąc pod uwagę, że jest to reakcja dwustopniowa, pierwszy jej etap przebiega identycznie jak w przypadku dwóch pierwszych modyfikacji. Natomiast drugi etap polega na dołączeniu łańcucha polimerowego. Następuje to poprzez utworzenie wiązania pomiędzy dwoma atomami węgla, z grupy izocyjanianowej HMDI oraz polimeru. Rysunek 32 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą soli sodowej kwasu PAA, z użyciem HMDI HA+LLA W przypadku HA modyfikowanego LLA w widmach FTIR, ATR oraz Ramana zaobserwowano pasma sugerujące odmienny od pozostałych przebieg reakcji (rys b). Sygnały przy liczbach falowych 1320 oraz 1589 cm -1 świadczą o występowaniu w modyfikacie grupy COO - najprawdopodobniej pochodzącej od mleczanu wapnia. 89

90 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 33 Widmo FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego LLA (b) oraz LLA (c) Powstanie tego związku podczas modyfikacji sugeruje, że w tym przypadku reakcja HA z LLA nie zachodzi poprzez rozerwania wiązania pomiędzy tlenem a wodorem w grupie OH, lecz z udziałem Ca [34]. Rysunek 34 Widmo ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz modyfikowanego HA LLA (b) Oprócz grup mleczanowych w widmach zarejestrowano również pasma drgań rozciągających charakterystyczne dla grupy karboksylowej (1720 cm -1 ), eterowej (1255 cm -1 ) oraz metylenowej (2879, 2948 cm -1 ). 90

91 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 114 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA+LLA pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1255 mleczanowa COO węgel-węgiel C-C rozciągające 1409 karbonylowa C=O rozciągające 1720 metylowa CH3 rozciągające 2879 rozciągające 2948 Rysunek 35 Widmo Ramana HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego LLA (b) oraz LLA (c) Szczegółowy przebieg reakcji został przedstawiony na rys. 36. W pierwszym etapie reakcji HA z kwasem mlekowym tworzy się wiązanie pomiędzy Ca a grupą karboksylową kwasu i tworzy się mleczan wapnia. W kolejnym etapie, pod wpływem działania katalizatora następuje reakcja propagacji składająca się z koordynacji laktydu 91

92 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 z grupami hydroksylowymi utworzonego wcześniej mleczanu wapnia, w ten sposób, że następuje rozszczepienie wiązania grupy acylowej w laktydzie i aktywacja grupy hydroksylowej w mleczanie. Proces ten powtarza się, a jego końcowym efektem jest polimer (PLLA) zaszczepiony na powierzchni HA. Rysunek 36 Schemat reakcji zachodzącej podczas modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą LLA HA+HMDI+LLA Proces niniejszej modyfikacji przeprowadzono z użyciem czynnika sprzęgającego. Przypuszcza się, że reakcja ta zachodzi poprzez grupy OH (rys. 40), pomimo tego, iż w przypadku bezpośredniego połączenia HA oraz LLA reakcja może przebiegać z udziałem Ca. 92

93 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 37 Widmo FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego LLA z użyciem czynnika sprzęgającego (b) oraz LLA (c) Niestety, potwierdzenie powyższego założenia jest utrudnione, gdyż pasmo grupy mleczanowej COO - zarówno w widmie FTIR jak i ATR pokrywa się z sygnałem pochodzącym od HMDI (liczba falowa około cm -1 ). Rysunek 38 Widmo ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego LLA z użyciem czynnika sprzęgającego (b) Pozostałe dodatkowe pasma zarejestrowane w widmach HA+HMDI+LLA (rys. nr37-39b) pochodzą od modyfikatora (tab. 15). Są to pasma grup metylenowych zarówno rozciągających (2839, 2833 cm -1 ) jak i zginających (1462, 1479 cm -1 ). 93

94 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 15 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA+HMDI+LLA pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1255 metylenowa CH2 zginające 1462 zginające 1479 amidowa C(O)NH rozciągające 1575 karbonylowa C=O rozciągające 1625 metylenowa CH2 rozciągające 2837 rozciągające 2933 Rysunek 39 Widmo FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego LLA z użyciem czynnika sprzęgającego (b) oraz LLA (c) 94

95 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 40 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą LLA, z użyciem HMDI HA+PLLA Modyfikacja ta została przeprowadzona w celu porównania jej rezultatów z modyfikacją za pomocą monomeru (LLA), podczas której zachodzi polimeryzacja [34,106,107]. Jednak jak widać na rys. 37b, 38b oraz 41b, 42b. choć widma HA+LLA oraz PLLA wykazują pewne podobieństwa, nie można stwierdzić, że całkowicie się pokrywają. Rysunek 41 Widma FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego PLLA (b) oraz PLLA (c) Ciekawą rzeczą jest to, iż główną różnicą pomiędzy tymi dwoma widmami jest brak szerokiego pasma grupy mleczanowej w przypadku modyfikatu przedstawionego na powyższym rysunku. Jednak pasma te są widoczne w widmie ATR modyfikatu HA+PLLA, co powoduje że nie można jednoznacznie stwierdzić w jaki sposób PLLA łączy się HA. 95

96 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 42 Widma ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego PLLA (b) Tabela 16 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA+PLLA pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1255 amidowa C-C rozciągające 1413 karbonylowa C=O rozciągające 1720 metylowa CH3 rozciągające 2837 rozciągające

97 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Poniżej (rys. 43) zaproponowano jeden z możliwych przebiegów reakcji pomiędzy HA a PLLA, jednakże, są to tylko przypuszczenia, gdyż dokładna struktura tego związku nie została zbadana. Rysunek 43 Proponowany schemat reakcji zachodzącej pomiędzy HA oraz PLLA HA+HMDI+MMA Tak jak w poprzednich modyfikacjach z zastosowaniem czynnika sprzęgającego, również w tym przypadku w widmach FTIR (rys. 44b) oraz ATR (rys. 45b) zarejestrowano charakterystyczne pasma pochodzące od HMDI. W związku z tym, że sygnały należące do MMA (rys. 44c) znajdują się w położeniu tych samych liczb falowych nie można jednoznacznie stwierdzić, które dokładnie pochodzą od MMA a które od HMDI. Rysunek 44 Widma FTIR HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego MMA (b) oraz MMA (c) Ze względu na to, że pasma te nakładają się na siebie prawdopodobnie występuje tu efekt przysłonięcia jednych pasm przez drugie. 97

98 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 45 Widma ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego MMA (b) Tabela 17 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR HA+HMDI+MMA pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1254 metylenowa CH2 zginające 1479 zginające 1461 amidowa C(O)NH rozciągające 1573 karbonylowa C=O rozciągające 1630 metylenowa CH2 rozciągające 2858 rozciągające 2934 aminowa NH rozciągające

99 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tak jak w przypadku poprzednich modyfikatów, w widmie Ramana (rys. 46b) zostały zidentyfikowane pasma świadczące o powodzeniu procesu modyfikacji warstwy wierzchniej HA lecz wszystkie dodatkowe pasma cechują się niską intensywnością. Rysunek 46 Widma Ramana HA niemodyfikowanego (a), HA modyfikowanego MMA (b) oraz MMA (c) Przedstawiony poniżej (rys. 47) schemat reakcji HA+HMDI+MMA wydaje się być najbardziej prawdopodobny, pomimo braku dodatkowych badań potwierdzających strukturę otrzymanego związku. Założono, iż MMA nie polimeryzuje do PMMA w trakcie reakcji modyfikacji oraz następuje rozerwanie podwójnego wiązania pomiędzy atomami węgla w MMA z jednoczesnym przyłączeniem węgla z grupy izocyjanianowej HMDI. 99

100 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 47 Proponowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą MMA, z użyciem HMDI HA+PHB W widmach FTIR, ATR oraz Ramana HA modyfikowanego za pomocą PHB (rys b) zaobserwowano pasma wszystkich charakterystycznych dla polimeru grup. Najbardziej intensywny dla podczerwieni sygnał, w obszarze liczby falowej 1700 cm -1 pochodzi od drgań rozciągających grupy karbonylowej. Sygnał ten został również zarejestrowany w widmie Ramana, natomiast ma on mniejszą intensywność. Rysunek 48 Widma FTIR HA niemodyfikowanego (a), modyfikowanego PHB (b) oraz PHB (c) 100

101 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Dwa podwójne pasma, jedno drgań zginających (1462, 1479 cm -1 ), a drugie rozciągających (2857, 2934 cm -1 ) należą do węglowodorów alifatycznych (CH, CH2, CH3) [108]. Kolejnym charakterystycznym dla PHB pasmem widocznym w widmie FTIR oraz ATR jest pasmo drgań rozciągających grupy eterowej z liczbą falową 1255 cm -1. Rysunek 49 Widmo ATR HA niemodyfikowanego (a) oraz HA modyfikowanego PHB (b) Rysunek 50 Widma FTIR HA niemodyfikowanego (a), modyfikowanego PHB (b) oraz PHB (c) Ponadto, w widmie Ramana zostały zarejestrowane również dodatkowe pasma zlokalizowane przy 870 cm -1 oraz 1185 cm -1 pochodzące odpowiednio od wiązania C-C oraz grupy C-O-C. 101

102 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 18 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm zarejestrowanych w widmie FTIR HA+PHB pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1210 węglowodory alifatyczne CH3 CH2 CH zginające 1479 zginające 1462 karbonylowa C=O rozciągające 1600 węglowodory alifatyczne CH3 CH2 CH rozciągające 2857 rozciągające 2934 Sugerowany schemat reakcji zachodzącej pomiędzy HA a PHB przedstawiona na rys. 51. Jak już zostało napisane wcześniej, aktywnymi miejscami na powierzchni HA, tworzącymi wiązania chemicznych są grupy hydroksylowe, dlatego właśnie one są zdolne do reagowania z różnymi związkami organicznymi, m.in. polimerami [102]. Rysunek 51 Proponowany schemat reakcji zachodzącej pomiędzy warstwą wierzchnią HA oraz PHB 102

103 Wyniki i dyskusja Rozdział β-fosforan trójwapniowy oraz jego modyfikaty β-fosforan trójwapniowy niemodyfikowany Widma FTIR oraz ATR β-tcp przedstawiono na rysunkach 52 oraz 53, natomiast wszystkie charakterystyczne pasma wraz z przypisanym rodzajem drgań oraz liczbą falową zestawiono w tabeli. Tak jak w przypadku HA głównymi pasmami widocznymi w widmie są pasma pochodzące od grup fosforanowych cztery różne rodzaje drgań ν1- ν4. 3 PO 4, za które odpowiedzialne są Rysunek 52 Widmo FTIR β-fosforanu trójwapniowego niemodyfikowanego Są to pasma w zakresie liczb falowych cm -1 (w widmie ATR widoczne jedynie do 600 cm -1 ). Szerokie, podwójne pasmo drgań zginających ν4 zarejestrowano przy liczbach falowych 551 oraz 605 cm -1 [82]. Bardzo mało intensywne pasma pochodzące od drgań zginających ν2 oraz rozciągających ν1 i ν3 zaobserwowano odpowiednio przy liczbach falowych 475 oraz 945, 970 i Natomiast najbardziej intensywny sygnał odpowiada drganiom rozciągającym ν3 (P-O) znajdującym się w położeniu 1044 cm -1 [109]. 103

104 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 53 Widmo ATR β-fosforanu trójwapniowego niemodyfikowanego W porównaniu z HA w widmie FTIR β-tcp zaobserwowano mniej dodatkowych pasm świadczących o zanieczyszczeniach tego związku. Tego typu pasmem często pojawiającym się w widmie β-tcp jest pasmo drgań zginających P-O(H) pochodzące od jonu 2 HPO4 w położeniu 720 cm -1 [ ]. Dwa dodatkowe pasma przy liczbach falowych 1634 oraz 3430 cm -1 związane są z zaadsorbowaną wodą [81,112,113]. Szerokie pasmo pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych charakterystyczne dla HA (3570 cm -1 ) świadczy o obecności niewielkiej ilości tego związku w analizowanym materiale. Jest to spowodowane niepełną przemianą HA w β- TCP podczas procesu syntezy. 104

105 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 19 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp niemodyfikowanego pasmo rodzaj drgań lub pasma liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol fosforanowe fosforanowe fosforanowe wodorofosforanowa fosforanowe fosforanowe fosforanowe fosforanowe PO zginające ν PO zginające ν PO zginające ν HPO 4 zginające ν5 720 PO rozciągające ν PO rozciągające ν PO rozciągające ν PO rozciągające ν H2O adsorbcyjne 1634 H2O adsorbcyjne 3430 hydroksylowe OH - konstytucyjne 3570 Rysunek 54 Widmo Ramana niemodyfikowanego β-tcp 105

106 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tak jak w widmach FTIR oraz ATR β-tcp również w przypadku widma Ramana (rys. 54) otrzymane rezultaty są analogiczne do tych zarejestrowanych dla HA. Podwójne pasmo o największej intensywności (964 i 965 cm -1 ) należy do drgań rozciągających ν1 grup fosforanowych 3 PO 4. Kolejne pasma drgań zginających ν1 oraz ν4 zostały zaobserwowane odpowiednio, w zakresach oraz cm -1. Ponadto, zarejestrowano także pasmo asymetrycznych drgań rozciągających ν3 położeniu 1090 cm -1 [109,114]. w β-tcp+hmdi+peg Widma wszystkich modyfikatów wraz z tabelami w których zestawiono zarejestrowane pasma przedstawiono poniżej. Rysunek 55 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego PEG (b) oraz PEG (c) W przypadku modyfikatów β-tcp otrzymano analogiczne rezultaty do modyfikacji HA. Tak jak wspomniano już wcześniej, podstawową różnicą między tymi dwoma biomaterałami jest brak grupy hydroksylowej w strukturze β-tcp. 106

107 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 56 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego PEG (b) W związku z tym, reakcja pomiędzy β-tcp oraz czynnikiem sprzęgającym bądź modyfikatorem zachodzi z udziałem grup fosforanowych. Potwierdzeniem tej teorii może być zmniejszenie intensywności pasm pochodzących od grup liczb falowych 1044, 1150 oraz 551 i 605 cm PO 4 w obszarze Tabela 20 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp+hmdi+peg pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1254 metylenowa CH2 zginające 1460 zginające 1478 amidowa C(O)NH rozciągające 1578 karbonylowa C=O rozciągające 1620 metylenowa CH2 rozciągające 2856 rozciągające 2934 aminowa NH rozciągające 3354 hydroksylowa OH rozciągające 3530 Porównując widma FTIR oraz ATR HA oraz β-tcp modyfikowanych PEG za pomocą czynnika sprzęgającego stwierdzono że zarejestrowano identyczne pasma w 107

108 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 obszarach analogicznych liczb falowych. Zarówno w widmie FTIR jak i ATR intensywność pasm jest mniejsza w modyfikacie β-tcp niż HA. Ze względu na to, że β- TCP nie zawiera w swojej strukturze reaktywnych grup hydroksylowych reakcja w przypadku tego materiału jest bardziej skomplikowana niż dla HA. W niniejszej pracy podjęto próbę przedstawienia prawdopodobnych przebiegów takich reakcji. Dane na ten temat nie zostały dotychczas opublikowane przez innego autora, więc są to jedynie sugerowane schematy. Dla reakcji z użyciem czynnika sprzęgającego pierwszy etap zachodzi poprzez grupy fosforanowe, z rozerwaniem wiązania podwójnego pomiędzy fosforem a tlenem (rys. 57). W miejscu jednego z połączeń P-O tworzą się wiązania P-C oraz N-O. Drugi etap reakcji jest identyczny z HA. Rysunek 57 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą PEG, z użyciem HMDI Wyniki analizy spektralnej β-tcp+hmdi+peg zamieszczono na rysunku 58 oraz w tabeli 21. Również w przypadku tego materiału analiza spektralna potwierdza istotny udział polimeru w składzie chemicznym warstwy powierzchniowej badanego materiału. Tak jak w HA+HMDI+PEG sygnały pochodzące od atomu węgla (C 1s) świadczą o obecności czterech różnych rodzajów wiązań węgla. Sygnał charakteryzujący się największą intensywnością, z energią wiązania 284,70 ev odpowiada za dwa typy wiązań węgla C-C oraz C-H. Piki o energii wiązania odpowiednio 286,20 ev oraz 287,30 ev są przypisane do grup C-O-C, C-N oraz C=O. Ostatni sygnał dla węgla został 108

109 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 zidentyfikowany przy wartości energii wiązania 289,00 ev i pochodzi od grup izocyjanianowych O=C-N w HMDI. W składzie chemicznym warstwy powierzchniowej analizowanego modyfikatu wykryto aż cztery sygnały pochodzące od tlenu. Posiadają one energie wiązania odpowiednio 530,25, przyporządkowane wiązaniom grup C=O, 531,52, 532,74 oraz 527,61 ev zostały 3 PO 4, N-C=O, oraz C-O-C. Również jeden z sygnałów fosforu P 2p (z energią wiązania 133,89 ev) odpowiedzialny jest za grupę 3 PO 4. Rysunek 58 Szerokopasmowe widmo XPS β-tcp+hmdi+peg. Na widmie zaznaczono regiony pasm spektralnych przejść elektronowych użyte do obliczeń chemicznego, powierzchniowego składu badanej próbki Podwójny sygnał pochodzący od Ca 2p (346,13 oraz 348,10 ev) należy do tlenku wapnia Ca-O. Sygnał przy 399,01 ev jest charakterystyczny dla atomu N 1s, który potwierdza obecność wiązania N-C w HMDI w warstwie wierzchniej modyfikowanego β- TCP. Ponadto, oprócz pasm charakterystycznych dla nośnika fosforanowego w widmie widoczne są pasma jonów cyny Sn pochodzące od katalizatora. Fakt, że pasma te nie były widoczne w HA może świadczyć o nadmiarze użytego katalizatora w przypadku β- TCP. 109

110 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 21 Analiza XPS składu powierzchniowego β-tcp+hmdi+peg β-tcp+hmdi+peg pierwiastek energia wiązania (ev) powierzchnia % at wiązanie C 1s 284, ,32 52,19 C-C, C-H C 1s 286, ,74 25,51 C-O-C, C-N C 1s 287, ,91 18,40 C=O C 1s 289,00 296,07 3,90 O=C-N- O 1s 530, ,59 24,36 C=O O 1s 531, ,26 40,44 3 PO 4, N-C=O O 1s 532, ,75 32,81 C-O-C O 1s 527,61 227,09 2,39 Ca 2p 3/2 346,13 152,38 7,80 CaO Ca 2p 3/2 348, ,61 92,20 CaO N 1s 399, ,129 94,04 N-C N 1s 396,51 124,942 5,96 P 2p 133,89 453,13 78,97 3 PO 4 P 2p 135,00 120,68 21,03 P2O5 Sn 3d 5/2 484,70 86,93 18,81 Sn Sn 3d 5/2 486,93 375,14 81,19 SnO β-tcp+hmdi+phema Ze względu na podobieństwo widm FTIR modyfikatów HA oraz β-tcp w poniższych opisach zostaną uwzględnione jedynie różnice występujące pomiędzy poszczególnymi widmami. 110

111 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 59 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego phema (b) oraz phema (c) W przypadku modyfikatów β-tcp+hmdi+phema oraz HA+HMDI+pHEMA zarejestrowano dwie podstawowe różnice. Pierwsza z nich dotyczy drgań rozciągających grupy karbonylowej (1720 cm -1 ), które są wyraźnie bardziej widoczne w widmie modyfikowanego β-tcp (rys 59b). Rysunek 60 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego phema (b) Druga różnica związana jest z mniejszą intensywnością drgań zginających grupy metylenowej w zakresie liczny falowej od 1462 do 1477 cm -1 w widmie omawianego modyfkatu. Podobnie sytuacja wygląda w przypadku widm ATR (rys 27b oraz 60b). W widmach tych wszystkie omówione powyżej zmiany również zostały zarejestrowane, 111

112 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 jednakże intensywność pasm modyfikatu β-tcp+hmdi+phema jest mniejsza niż modyfikatu HA+HMDI+pHEMA. Tabela 22 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp+hmdi+phema pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1257 metylenowa CH2 zginające 1462 zginające 1477 amidowa C(O)NH rozciągające 1573 karbonylowa C=O rozciągające 1619 rozciągające 1720 metylenowa CH2 rozciągające 2868 rozciągające 2934 aminowa NH rozciągające 3333 hydroksylowa OH rozciągające 3530 Reakcja przedstawiona na rysunku 53 jest proponowanym schematem reakcji zachodzącej podczas modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą phema z użyciem HMDI. Pierwszy jej etap został opisany przy poprzedniej reakcji TCP+HMDI+PEG, natomiast etap drugi pokrywa się z drugim etapem reakcji HA+HMDI+pHEMA. 112

113 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 61 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą phema, z użyciem HMDI Wyniki analizy spektralnej XPS β-tcp+hmdi+phema wraz z interpretacją stanu i składu chemicznego powierzchni badanej próbki zamieszczono na rysunku 62 oraz w tabeli 23. Jak wynika z analizy spektralnej na powierzchni nośnika (β-tcp) znajdują się grupy świadczące o obecności izocyjanianów na bazie metylenodiizocyjanianu (HMDI) oraz żywicy akrylowej, jako polimetakrylanu hydroksyetylowego (phema). W przypadku modyfikatu β-tcp+hmdi+phema otrzymane rezultaty analizy spektralnej są analogiczne do próbki poprzedniej (β-tcp+hmdi+peg). 113

114 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 62 Szerokopasmowe widmo XPS β-tcp+hmdi+phema. W wysokoenergetycznej części widma XPS (powyżej EB =900 ev) widoczne są szerokie pasma Augera tlenu i cyny. Regiony spektralne, dla których wykonano wysokorozdzielczą analizę XPS są zaznaczone na widmie kolorem niebieskim 114

115 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 23 Analiza XPS składu powierzchniowego β-tcp+hmdi+phema β-tcp+hmdi+phema pierwiastek energia wiązania (ev) powierzchnia % at wiązanie C 1s 284, ,33 61,78 C-C, C-H C 1s 286, ,76 23,17 C-OH, C-O-C, C-N C 1s 287,41 160,92 2,45 C=O C 1s 288,80 826,52 12,60 O-C=O O 1s 529,10 600,00 7,19 Ca-O O 1s 531, ,68 78,66 3 PO 4, C=O O 1s 532, ,35 14,15 C-O-C Ca 2p 3/2 348, ,72 100,00 Ca-O Ca 2p 1/2 351,70 773,86 - P 2p 134,64 312,09 82,43 3 PO 4 P 2p 135,51 66,54 17,57 P2O5 N 1s 399, ,79 100,00 N-C Sn 3d 5/2 485, ,27 100,00 SnO2 Sn 3d 3/2 493, , β-tcp+phb W przypadku tego materiału większość pasm widocznych w widmach FTIR (rys. 63b) oraz ATR (rys. 64b) pokrywa się z pasmami widm HA+PHB (rys. 48b i 49b). Można jednak zauważyć, że w widmach ATR modyfikatu β-tcp+phb pasma pochodzące od modyfikatora są bardziej intensywne niż w widmie modyfikatu HA+PHB. Prawdopodobnie oznacza to, że więcej modyfikatora znajduje się w warstwie wierzchniej β-tcp niż w przypadku modyfikatu HA. 115

116 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 63 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego PHB (b) oraz PHB (c) Jedyną, oczywistą różnicą jest wyraźnie brak pasm, za które odpowiedzialne są drgania rozciągające grup hydroksylowych w obszarze liczby falowej 3670 cm -1. Jest to spowodowane brakiem tych grup w niemodyfikowanym β-tcp. Rysunek 64 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego PHB (b) Również widmo Ramana (rys. 65) potwierdziło obecność polimeru na powierzchni β-tcp. W widmie β-tcp+phb (rys. 65b) widoczne są pasma charakterystyczne dla polimeru oraz fosforanu. Natomiast, tak jak to miało miejsce w przypadku podczerwieni, również pasma widma Ramana mają mniejszą intensywność niż te same pasma w HA. 116

117 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 65 Widma Ramana β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego PHB (b) oraz PHB (c) Tabela 24 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp+phb pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1210 węglowodory alifatyczne CH3 CH2 CH zginające 1475 zginające 1464 karbonylowa C=O rozciągające 1600 węglowodory alifatyczne CH3 CH2 CH rozciągające 2856 rozciągające 2935 Zaproponowany schemat reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą PHB jest porównywalny z reakcją HA+PHB, z tą różnicą, że podczas poniższej reakcji (rys. 66) nie tworzy się woda. 117

118 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 66 Sugerowany przebieg reakcji zachodzącej podczas modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą PHB β-tcp+hmdi+mma Nie wykryto różnic pomiędzy widmami FTIR oraz ATR β-tcp (rys. 67b, 68b) oraz HA (rys. 44b, 45b) modyfikowanych MMA z wykorzystaniem czynnika sprzęgającego. Rysunek 67 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego MMA (b) oraz MMA (c) 118

119 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 68 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego MMA (b) Tabela 25 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp+hmdi+mma pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1253 metylenowa CH2 zginające 1476 zginające 1462 amidowa C(O)NH rozciągające 1574 karbonylowa C=O rozciągające 1619 metylenowa CH2 rozciągające 2857 rozciągające 2934 aminowa NH rozciągające

120 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Również proponowany schemat tej reakcji (rys. 69) jest zbliżony do TCP+HMDI+PEG (I etap) oraz do HA+HMDI+MMA (II etap). Rysunek 69 Sugerowany przebieg reakcji modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą MMA, z użyciem HMDI β-tcp+lla Widmo FTIR dla modyfikatów β-tcp z LLA (rys. 70b) jest podobne do widma modyfikatu HA (rys. 33). Obecność jonu mleczanowego przy liczbach falowych 1320 oraz 1589 cm -1 sugeruje, że także ta reakcja zachodzi z udziałem Ca, a nie grup fosforanowych. 120

121 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 70 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego LLA (b) oraz LLA (c) Wszystkie zmiany zarejestrowane w widmie FTIR zostały również zidentyfikowane w widmie ATR modyfikatu (rys. 71b). Rysunek 71 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego LLA (b) 121

122 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 26 Zestawienie wszystkich charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp+lla pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol eterowa C-O-C rozciągające 1255 mleczanowa COO węgel-węgiel C-C rozciągające 1409 karbonylowa C=O rozciągające 1720 metylowa CH3 rozciągające 2879 rozciągające 2948 Również schemat reakcji zachodzącej pomiędzy β-tcp a LLA (rys. 72) pokrywa się ze schematem reakcji HA+LLA. W przeciwieństwie do poprzednich reakcji β-tcp biorą w nim udział jony wapnia, które reagują z grupami karboksylowymi kwasu mlekowego z utworzeniem mleczanu wapnia. 122

123 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 72 Schemat reakcji zachodzącej podczas modyfikacji warstwy wierzchniej HA za pomocą LLA β-tcp+ ε-cl Modyfikacja ta nie ma swojego odpowiednika wśród modyfikacji HA. W widmie FTIR modyfikatu (rys. 73b) zarejestrowano dodatkowe pasma świadczące o pomyślnym przeprowadzeniu procesu modyfikacji. Chociaż te same pasma zaobserwowano w widmie ATR modyfikatu (rys. 74b), jednakże są one zdecydowanie mniej intensywne. Mała intensywność pasm zarówno w widmie FTIR jak i ATR może oznaczać że ilość przyłączonego modyfikatora jest niewielka. 123

124 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 73 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego ε-cl (b) oraz ε-cl (c) W obszarze liczby falowej 1733 cm -1 zaobserwowano charakterystyczne pasma drgań rozciągających grupy karbonylowej (C=O). Zarejestrowano również podwójne pasma drgań rozciągających oraz zginających odpowiednio przy liczbach falowych 2923, 2830 cm -1 oraz 1479 i 1415 cm -1 pochodzące od grup metylenowych (CH2). Rysunek 74 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego ε-cl (b) Kolejną widoczną w widmach (rys. 73b oraz 74b) modyfikatu różnicą pomiędzy widmem β-tcp niemodyfikowanego jest pojawienie się słabego pojedynczego sygnału w okolicy liczby falowej 3540 cm -1, za który odpowiedzialne są drgania rozciągające grupy hydroksylowej (OH). 124

125 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Tabela 27 Zestawienie charakterystycznych pasm widocznych w widmie FTIR β-tcp+ε-cl Pasmo rodzaj drgań liczba falowa [cm -1 ] nazwa symbol metylowa CH3 zginające 1415 zginające 1479 karbonylowa C=O rozciągające 1733 metylowa CH3 rozciągające 2830 rozciągające 2923 hydroksylowa OH rozciągające 3540 Reakcja pomiędzy β-tcp a ε-cl zachodzi poprzez otwarcie pierścienia podczas której dochodzi do polimeryzacji. Również w tej reakcji, tak jak w β-tcp+lla biorą udział jony wapnia oraz grupy karboksylowe kwasu. Do utworzenia wiązania pomiędzy tymi dwoma związkami dochodzi na drodze nukleofilowego ataku anionów hydroksylowych z HA na wiązanie pomiędzy grupą acylową a tlenem w laktonie (rys. 75). W kolejnym etapie, analogicznie do reakcji HA+LLA oraz β-tcp+lla dochodzi do propagacji łańcucha z udziałem katalizatora. 125

126 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Rysunek 75 Schemat reakcji zachodzącej podczas modyfikacji warstwy wierzchniej β-tcp za pomocą ε-cl β-tcp+pcl Modyfikacja ta, tak samo jak modyfikacja HA+PLLA została przeprowadzona w celu porównania jej rezultatów z modyfikacją za pomocą monomeru (ε-cl). Podczas modyfikacji ε-cl powinna zachodzić polimeryzacja [115]. W efekcie wynikiem obu procesów z użyciem monomeru i polimeru winien być modyfikat o zbliżonych właściwościach. Rysunek 76 Widma FTIR β-tcp niemodyfikowanego (a), modyfikowanego PCL (b) oraz PCL (c) 126

127 Wyniki i dyskusja Rozdział 12 Jednak, analizując widmo przedstawione na rys. 76b nie zaobserwowano żadnych znaczących zmian w porównaniu z materiałem niemodyfikowanym. Również analiza widma wykonanego techniką ATR nie wykazała żadnych zmian w modyfikacie (rys. 77b) w porównaniu do widma niemodyfikowanego β-tcp (rys. 77a). Rysunek 77 Widma ATR β-tcp niemodyfikowanego (a) oraz β-tcp modyfikowanego PCL (b) Oznacza to, że PCL nie został trwale połączony z β-tcp. W związku z tym materiał ten nie był wykorzystywany w dalszych badaniach. 13. Wydajność przeprowadzonych procesów modyfikacji Po przeprowadzeniu procesów usunięcia nadmiaru modyfikatora możliwe było określenie rzeczywistej wartości wydajności modyfikacji, gdyż wartość otrzymana przed wymyciem jest jedynie wartością pozornej wydajności. Stwierdzono, że niezależnie od zastosowanej metody oczyszczania modyfikatów, dla każdej z analizowanych próbek występuje jednoznaczna tendencja spadkowa wydajności pozornej modyfikacji po przeprowadzeniu procesu wymycia. Różnica pomiędzy wartością pozornej i rzeczywistej wydajności jest zawsze większa w przypadku wymycia w aparacie Soxhleta niż w SBF. Świadczy to o większej efektywności pierwszej metody. 127

128 Wyniki i dyskusja Rozdział 13 Rysunek 78 Wykres przedstawiający porównanie wydajności modyfikatów HA przed oraz po oczyszczenia związków Zauważono również, że w większości przypadków największe wydajności przed wymyciem uzyskano dla modyfikacji bez użycia czynnika sprzęgającego. Jednocześnie reakcje te charakteryzują się największym spadkiem wydajności po przeprowadzeniu procesu wymywania próbek, co oznacza, że modyfikator został użyty w nadmiarze. Stwierdzono także, iż większość modyfikacji (z wyjątkiem phema oraz LLA) przebiega ze zbliżoną wydajnością dla HA oraz dla β-tcp. Zauważono również, że dodatek większej ilości modyfikatora w przypadku modyfikacji PEG nie wpływa znacząco na wydajność otrzymanego modyfikatu. Warstwa wierzchnia modyfikowanego HA jest zdolna do reakcji jedynie z określoną ilością modyfikatora, ze względu na ograniczoną liczbę miejsc aktywnych zdolnych do reakcji z czynnikiem sprzęgającym lub modyfikatorem. Po przekroczeniu tej ilości, w miarę zwiększania dodatku modyfikatora wydajność procesu spada. W przypadku reakcji HA+HMDI+PEG odpowiednią ilością modyfikatora wydaje się być wartość między 5 a 10 g, gdyż po dodaniu większej ilości PEG zaobserwowano spadek wydajności przeprowadzonej reakcji. 128