(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/26 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/40 ( ) A61K 31/7105 ( ) A61K 31/711 ( ) A61K 31/7115 ( ) A61K 31/712 ( ) A61K 31/7125 ( ) A61K 31/395 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Modulowanie syntezy i degradacji hialuronianu w leczeniu choroby (30) Pierwszeństwo: AU AU (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/28 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/01 (73) Uprawniony z patentu: Alchemia Oncology Pty Limited, Hawthorn, AU (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 TRACEY JEAN BROWN, Flemington, AU GARY RUSSELL BROWNLEE, Camberwell, AU (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Dorota Rzążewska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 17977/13/P RO/DR EP Opis TŁO WYNALAZKU Modulowanie syntezy i degradacji hialuronianu w leczeniu choroby DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy generalnie modulowania syntezy i degradacji hialuronianu (HA). Bardziej szczegółowo, ujawnione są kompozycje i sposoby modulowania ekspresji genetycznego materiału kodującego syntazę HA (HAS) i inne enzymy lub receptory zaangażowane przede wszystkim w metabolizm hialuronianu lub modulowanie białek, które syntezują lub degradują hialuronian, w tym funkcję lub aktywność HAS. Kompozycje zawierają lub obejmują cząsteczki kwasu nukleinowego i interaktywne cząsteczki takie, jak przeciwciała i drobnocząsteczkowe inhibitory i analogi substratów HAS. Wynalazek ten obejmuje ponadto modulowanie proliferacji komórkowej, użyteczne w profilaktyce i/lub leczeniu chorób zapalnych, w tym stanów hiperproliferacyjnych takich, jak, ale nie wyłącznie, rak i łuszczyca, OPIS STANU TECHNIKI [0002] Bibliografia dla publikacji określonych w niniejszym opisie jest również zebrana na końcu opisu. [0003] Odniesienie do jakiegokolwiek stanu techniki w tym opisie nie jest i nie powinno być traktowane jako potwierdzenie lub inna formy sugestii, że ten stan techniki stanowi część ogólnej wiedzy w każdym kraju. [0004] Stany zapalne stanowią poważny czynnik sprawczy w licznych istotnych zaburzeniach medycznych. Zapalenie może wynikać z różnych bodźców z zewnątrz lub wewnątrz ciała. Jednak bodźce te wyzwalają komórki i procesy fizjologiczne w środowisku gospodarza. Choć podjęto znaczną ilość badań w celu zbadania charakteru komórkowego i cytokin procesu zapalnego, niewiele wiadomo na temat innych możliwych uczestników zapalenia. [0005] Jedną z takich klas uczestników są białka transbłonowych. Białka transbłonowe są zaangażowane w szereg aktywności sygnalizacyjnych oraz wykazują wiele aktywności enzymatycznych. [0006] Metabolizm hialuronianu (HA) jest skomplikowaną równowagą pomiędzy szybkością syntezy i degradacji HA, przy czym w zależności od odgrywanej roli fizjologicznej przez HA, starannie kontrolowana jest jednoczesna synteza i degradacja. Hialuronian jest syntezowany przez rodzinę różnych już powiązanych białek transbłonowych określanych jako izoformy syntazy hialuronianu (HAS) HAS1, 2 i 3, które różnią się między sobą w odniesieniu do czasowej i różnicowej ekspresji odpowiednio w trakcie embriogenezy oraz w dojrzałych tkankach, a także pod względem masy cząsteczkowej wytwarzanego HA. Polisacharyd macierzy zewnątrzkomórkowej HA lub jego postać kwasowa, kwas hialuronowy, jest liniowym polimerem o wysokiej masie cząsteczkowej, złożonym z powtarzających się jednostek dwucukrowych (β1-3) D-glukuroniano-(β1-4)N-acetylo-D-glukozaminy (Weissman & Meyer, J. Am. Chem. Soc. 76: 1753, 1954). Hialuronian jest degradowany przez rodzinę enzymów zwanych hialuronidazami, które są obecnie określane jako HYAL1, HYAL2, HYAL3 i PH-20,

3 2 przy czym podobnie jak enzymy, które wytwarzają HA, również różnią się od siebie pod względem ekspresji czasowej i różnicowej w różnych procesach fizjologicznych i stanach chorobowych. [0007] W pracach prowadzących do niniejszego wynalazku, stwierdzono, że HAS i HYAL są różnie eksprymowane w różnych stanach fizjologicznych. W szczególności, były one regulowane w górę podczas stanów chorobowych takich, jak stan zapalny lub rak. HAS, a zwłaszcza, HAS1, 2 i/lub 3 i HYAL1, 2 i/lub 3 stanowią użyteczne cele dla leki. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0008] W całym opisie, o ile kontekst nie wymaga inaczej, słowo zawierać, lub jego odmiany takie jak zawiera lub zawierający, będą rozumiane jako sugerujące włączenie określonej liczby całkowitej lub elementu lub grupy elementów lub liczb całkowitych, ale niewykluczenie jakiejkolwiek innej liczby całkowitej lub elementu lub grupy elementów lub liczb całkowitych. [0009] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe są określone przez numer identyfikacyjny sekwencji (SEQ ID NO:). SEQ ID NO: odpowiadają liczbowo identyfikatorom sekwencji <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), itd. Zestawienie numerów identyfikacyjnych sekwencji przedstawiono w Tabeli 1. Listy sekwencji znajdują się po zastrzeżeniach. [0010] Niniejszy wynalazek dotyczy związków, które są przeciwciałami, albo ich rekombinowanymi lub chimerycznymi lub pochodnymi postaciami, które antagonizują funkcję lub aktywność HAS, jak to opisano w zastrzeżeniach. [0011] Przeciwciała mogą być przeciwciałami monoklonalnymi lub poliklonalnymi. Zapewnione są również farmaceutyczne i inne kompozycje zawierające związki według niniejszego wynalazku. Związki według wynalazku do zastosowania w leczeniu zwierzęcia, zwłaszcza człowieka, z podejrzeniem lub podatnego na chorobę lub stan związany z poziomami HA lub ekspresją genu HAS i genu HYAL są określone w niniejszym dokumencie. Takie sposoby obejmują podawanie terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości jednego lub więcej związków lub kompozycji według niniejszego wynalazku osobnikowi wymagającemu leczenia lub podejrzewanego o wymaganie leczenia profilaktycznego. [0012] W związku z powyższym, jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy wyizolowanego związku, opisanego w zastrzeżeniach, zdolnego do zmniejszenia poziomu aktywności syntazy hialuronianu (HAS) 1. TABELA 1 Zestawienie numerów identyfikacyjnych sekwencji SEQ ID NO: OPIS 1 Sensowny starter dla ludzkiej HAS2 2 Antysensowny starter dla ludzkiej HAS2 3 Starter dla PCINeo 4 Sensowny starter dla GSP2

4 3 5 Sensowny starter dla GSP4 6 Sensowny starter dla HAS 1 7 Antysensowny starter dla HAS1 8 Sensowny starter dla HAS2 9 Sensowny starter dla HAS2 10 Antysensowny starter dla HAS2 11 Sensowny starter dla HAS2 12 Sensowny starter dla HAS3 13 Antysensowny starter dla HAS3 14 Sensowny starter dla HAS3 15 Sensowny starter dla GAPDH 16 Antysensowny starter dla GAPDH 17 Sensowny starter dla GAPDH 18 Sensowny starter dla HYAL1 19 Antysensowny starter dla HYAL1 20 Sensowny starter HYAL2 21 Antysensowny starter HYAL2 22 Sensowny starter HYAL3 23 Antysensowny starter HYAL3 24 Peptyd immunizujący HAS Peptyd immunizujący HAS Peptyd immunizujący HAS Sensowny starter dla HAS1 28 Sensowny starter dla HAS2 29 Sensowny starter dla HAS3 30 Sensowny starter dla GAPDH 31 Sensowny starter dla HYAL 1 32 Sensowny starter dla HYAL2 33 Sensowny starter dla HYAL3 34 Antysensowny starter dla HAS 1

5 4 35 Antysensowny starter dla HAS2 36 Antysensowny starter dla HAS3 37 Antysensowny starter dla GAPDH 38 Antysensowny starter dla HYAL1 39 Antysensowny starter dla HYAL2 40 Antysensowny starter dla HYAL3 41 Sonda do hybrydyzacji dla HAS 1 42 Sonda do hybrydyzacji dla HAS2 43 Sonda do hybrydyzacji dla HAS3 44 Sonda do hybrydyzacji dla GAPDH 45 Sensowny starter dla HAS2 46 Antysensowny starter dla HAS2 47 Starter dla pcl-neo 48 Sensowny starter GSP2 49 Sensowny starter GSP4 50 Sensowny starter Alu 51 Antyensowny starter Alu KRÓTKI OPIS FIGUR [0013] Figura 1 jest graficzną i fotograficzną reprezentacją oznaczania RT-PCR w czasie rzeczywistym ekspresji mrna rodziny HAS i immunodetekcji HAS2 w transfektantach macierzystych MDA-MB 231 i antysensownych. A: Ekspresja i ilościowe oznaczanie mrna pod kątem HAS2 w macierzystych MDA-MB 231, klonach próbnych (sam wektor pcineo) i stabilnych MDA MB-231 eksprymujących antysensowne mrna do HAS2 (ASHAS2). B: Ekspresja i ilościowe oznaczanie HAS1 i HAS3 w transfektantach macierzystych, próbnych i ASHAS2. C: Immunodetekcja białka HAS2 na macierzystych MDA-MB 231 i, D: na stabilnych klonach eksprymujących antysensowne mrna do HAS2. Fotografie transfektantów macierzystych i ASHAS2 przy 400x powiększeniu. W komórkach macierzystych należy zauważyć, że obrzeże komórki barwi się dodatnio dla epitopu HAS2 (strzałki), który jest nieobecny w transfekowanych antysensownie, Panel D, E i F: Immunoreaktywność macierzystej MDA MB231 na CD44 (panel E) i antysensownie transfekowanych MDA-MB 231 (Panel F). Należy zauważyć całkowity brak zabarwienia w komórkach transfekowanych antysensownie.

6 5 Figura 2 jest graficznym przedstawieniem charakterystyki masy cząsteczkowej HA zsyntezowanego i ekspresji różnicowej genów macierzystych hialuronidazy za pomocą MDA-MB 23 macierzystych, transfekowanych próbnie i antysensownie HAS2. A: Komórki wysiano na poziomie komórek w 75cm 2 kolbach hodowlanych i hodowano przez 24h w kompletnej pożywce uzupełnionej 5µCi chlorowodorku D-[6-3 H]-glukozaminy. Aby określić MW 3 H-HA w pożywce, próbki poddano chromatografii wykluczania na Sephacryl S-1000 SF wymywane w 0.15M NaCl/fosforan ph 7.25 przy 13.6ml/h. Ta figura pokazuje różnice w masie cząsteczkowej syntetyzowanej przez macierzyste MDA-MD 231 i ich transfektowane odpowiedniki niosące antysensowny mrna do HAS2. B: Całkowity RNA ekstrahowany z macierzystego, próbnie i ASHAS2 transfekowany MDA-MD 231 analizowano za pomocą RT-PCR do wykrywania poziomu aktywności genów hialuronidazy, zauważalnych HYAL-1, 2 i 3. Produkty PCR zostały rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny. Zabarwione żele poddano analizy densytometrycznej w celu umożliwienia porównania poziomów dla każdego genu HYAL między macierzystymi, próbnie i ASHAS2 transfekowanymi komórkami. Należy zwrócić uwagę, że zarówno macierzyste, jak i próbnie transfekowane komórki MDA-MD 231 eksprymują porównywalne poziomy zarówno HYAL-1, jak i 2, lecz nie eksprymują HYAL-2. W przeciwieństwie do komórek transfekowanych ASHAS2, HYAL-2 nie jest eksprymowany, natomiast wykryto HYAL- 3, a HYAL-1 miał umiarkowanie zwiększoną ekspresję. Figura 3 jest graficznym przedstawieniem ilościowego oznaczenia i porównania HAS w macierzystych, transfekowanych próbnie i ASHAS2 MDA-MB 231. Komórki wysiano na poziomie /komórek w 25cm 2 kolbach hodowlanych i inkubowano w 37 C przez 24h, 48h, 72h, 96h, 120h i 144h. W każdym punkcie czasowym komórki trypsynizowano i liczono przy użyciu automatycznego licznika Coultera. Stężenie HA w zebranej pożywce hodowlanej oznaczano przy użyciu testu białka wiążącego kwas hialuronowy (HABP), z dostarczonymi wzorcami i buforem reakcyjnym Corgenix Inc (Colorado, USA). Synteza HA przez macierzyste i transfekowane próbnie MDA-MB 231 była porównywalna w czasie trwania eksperymentu. Natomiast, Synteza HA była istotnie wyższa w transfektantach ASHAS2, gdzie do pożywki hodowlanej uwolniono w przybliżeniu 2- do 7-razy więcej HA. Figura 4 jest graficznym przedstawieniem pokazującym charakterystykę proliferacji komórek w macierzystych, transfekowanych próbnie i ASHAS2 MDA MB 231. Macierzyste, próbne i ASHAS2 transfektanty zebrano przy w przybliżeniu 80% konfluencji i wysiano do 24-dołkowych płytek przy gęstości komórek komórek/dołek. Tempo wzrostu komórek śledzono następnie przez 24, 48, 72 i 96 godzin po wysianiu. Wszystkie liczby komórek oznaczano przy użyciu automatycznego licznika Coultera. Podczas gdy zarówno macierzyste, jak i próbnie transfekowane MDA-MB 231 wykazywały ekspotencjalny wzrost komórek do 72 godzin, gdy komórki stały się konfluentne, komórki transfekowane ASHAS2 wzrastały w znacznie wolniejszym tempie z przybliżonym okresem opóźnienia w podwojeniu komórek wynoszącym 24 godziny.

7 6 Figura 5 jest graficznym przedstawieniem wpływu inhibicji antysensownej HAS2 na cykl komórkowy. Transfekowane i kontrolne komórki wysiano na poziomie 2x10 5 komórek/25cm 2 kolby w obecności 2mM tymidyny i hodowano do 50% konfluencji. Komórki przemyto następnie zawrócono do normalnej pożywki hodowlanej i zbierano przez trypsynizację, przy następujących punktach czasowych; 0h, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h, 28h, 32h, i 36h następnie utrwalano w 95% w/v etanolu przez 2h w 4 C Komórki traktowano wstępnie 100µg/mL RNAazą (Sigma) i 50µg/ml jodku propidyny (Sigma) przez 30minut w 37 0 C przed oznaczaniem stadium cyklu komórkowego w urządzeniu analitycznym FACS-Calibur (Trade Mark) (Becton Dickinson, San Jose, CA). Panel A: populacja komórek w G 0 /G1; Panel B: w fazie S, i PANEL C: w fazie G 2 /M. Należy zauważyć opóźnienie 24 godzinne wejścia w fazę S w transfektantach ASHAS2 MDA MB 231. Figura 6 jest graficznym przedstawieniem wpływu hamowania HAS2 na zachowanie migracyjne wysoce metastatycznej linii komórkowej MDA MD 231. Szybkość migracji macierzystych, próbnie i antysensownie transfekowanych komórek badano za pomocą testu chemoinwazji w komorze Boydena jak opisano w materiałach i metodach. O ile macierzyste i próbne transfektanty wykazują 100% migracji, komórki niosące antysens do HAS2 były hamowane odnośnie migracji o 93%. Figura 7 jest graficznym przedstawieniem wpływu hamowania antysensu HAS2 na rakotwórczości i metastazy MDA MB 231. A: Macierzyste, próbne i ASHAS2 transfektanty zaszczepiono do warstwy tłuszczu sutkowego nagich myszy. Wzrost nowotworu pierwotnego śledzono przez 12 tygodniowy okres po implantacji po czym oznaczono rozmiar metastaz do innych organów za pomocą Alu PCR. Myszy zaszczepione macierzystymi lub próbnie transfekowanymi MDA MB 231 łatwo zawiązywały pierwotne nowotwory, które były porównywalne pod względem wzrostu w czasie trwania 12 tygodni eksperymentu. Myszy zaszczepione macierzystymi lub próbnie transfekowanymi MDA MB 231 łatwo zawiązywały pierwotne nowotwory, które były porównywalne pod względem wzrostu w czasie trwania 12 tygodni eksperymentu. Natomiast jednak myszy zaszczepione transfektantami ASHAS2 nie zawiązywały pierwotnych nowotworów. B: Metastazy do miękkich narządów u myszy zaszczepionych macierzystymi, próbnie i antysensownie transfekowanymi MDA MD 231. Zgodnie z oceną za pomocą Alu PCR, metastazy były najbardziej rozpowszechnione w mózgu i płucach, lecz wykryto je także w nerkach i wątrobie w próbkach przygotowanych z myszy, którym wstrzyknięto albo macierzyste albo próbne transfektanty komórek MDA- MD 231. Brak metastaz można wykryć w wyżej wymienionych narządach u myszy, którym wstrzykiwano transfektanty ASHAS2. Figura 8 jest schematycznym przedstawieniem pokazującym, że HAS 2 i HAS3 uwalniają HA o wysokiej masie cząsteczkowej, który jest szybko depolimeryzowany. Komórki MDA-MB 231 wysiano na poziomie 7.5x10 5 komórek/75cm 2 kolba hodowlana i hodowano przez 24h w pożywce wzrostowej zawierającej ± 400µg/ml DS i 250µCi D- [6-3 H]glukozaminy. Na zakończenie inkubacji, pożywkę i HA związany z komórką

8 7 usunięto i poddano dializie (wykluczanie M r 5 kda). Po uzasadnieniu, nie ulegającym dializie Dpm był HA (jak określono przez trawienie hialuronidazą ze Streptomyces) poddano go chromatografii wykluczania na żelu Sephacryl S-1000 wymywane w 0.15M NaCl/bufor fosforanowy, ph 7.25 przy 13.6ml/h. Różnice w M r uwolnionego (Figury 1A, C, E & G) i HA związanego z komórką (Figury 1B, D, F & G) oznaczano w następującej linii komórkowej: (Fig 1A, B) linia komórkowa MDA-MB 453, (Fig 1C, D) MDA-MB 231, (Fig 1E, F) BT-549 i (Fig 1G, H) Hs578T. Aby oznaczyć ilościowo HA wytwarzane przez linie komórkowe, hodowle traktowano 400µg/ml siarczanu dekstranu ( - ) i dla identyfikacji produktów degradacji HA hodowle nie zawierały siarczanu dekstranu (o-o). Figura 9 jest schematycznym przedstawieniem ukazującym porównanie potencjału inwazyjności ludzkich linii komórkowych raka piersi i receptorów HA. Potencjał inwazyjności linii komórkowych piersi ( - ) został zbadany za pomocą testu chemoinwazji komory Boydena jak opisano w Materiałach i metodach. Komórki, które przemierzyły matrigel i rozprzestrzeniły się na dolnej powierzchni filtra wyrażono jako procent liczby komórek oznaczonej dla linii komórkowej Hs578T. Przedstawione dane stanowią średnią ± SD, średnie z eksperymentów w trzech powtórzeniach przeprowadzono w dwóch różnych dniach. Uwaga: rozbieżność procentowa pomiędzy potrójnymi oznaczeniami < 2%. Ilościowe oznaczanie receptorów HA (A) CD44 i (B) RHAMM określono metodą immunoblottingu, gdzie immunoreaktywne pasma oznaczano ilościowo za pomocą analizy densytometrii stosując ProXpress [znak towarowy] Imager, a dane analizowano za pomocą oprogramowania Phoretix 1D. Figura 10 jest reprezentacją graficzną i fotograficzną ekspresji mrna rodziny syntazy hialuronianu i immunodetekcja HAS2 w odpowiednio macierzystych MDA-MB 231 i antysensownych transfektantach. A: Całkowity RNA ekstrahowano z eksponencjalnie dzielących się kultur macierzystych MDA-MB 231, próbne transfektanty i stabilne klony eksprymujące mrna ASHAS2. Poziom mrna pod kątem HAS2 oznaczono ilościowo za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. B: Immunodetekcja białka HAS2 na stabilnych klonach eksprymujących antysensowne mrna do HAS2 macierzystych MDA-MB 231 i, C: na macierzystej linii komórkowej MDA-MB 231. (Pasek skali 20µm). Figura 11 jest graficznym przedstawieniem porównującym ekspresję genu hialuronidazy przez macierzyste, próbnie i antysensownie HAS2 transfekowane MDA-MB 231. Całkowity RNA ekstrahowany z macierzystych, próbnie i antysensownie HAS2 transfekowanych MDA-MB 231 analizowano za pomocą RT-PCR w celu wykrycia obecności genów hialuronidazy, HYAL-1, 2 i 3. Produkty PCR rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny. Objętość pasma w żelach barwionych poddano następnie analizie densytometrycznej w celu umożliwienia porównania poziomów dla każdej ekspresji genów HYAL między macierzystymi, próbnie i ASHAS2 transfekowanymi komórkami. Zamknięty pasek: HYAL1; otwarty pasek:

9 8 HYAL2; zakreskowany po przekątnej pasek: HYAL3. Uwaga: rozbieżność procentowa pomiędzy potrójnymi oznaczeniami < 2%. Figura 12 jest reprezentacją fotograficzną pokazującą reaktywność immunohistochemiczną macierzystych MDA-MB 231 i antysensownych transfektantów wobec CD44. Subkonfluentne stabilne transfektanty MDA-MB 231 eksprymujące antysensowne mrna do HAS2 (A), i (B) macierzyste MDA-MB 231 poddano reakcji z przeciw ludzkimi CD44. (Pasek skali 20µm). Figura 13 jest graficznym przedstawieniem ilościowego oznaczania i porównania syntezy hialuronianu w macierzystych, transfekowanych próbnie i ASHAS2 MDA-MB 231. Komórki wysiano na poziomie /komórek w 25cm 2 kolbach hodowlanych i inkubowano w 37 C przez 24, 48, 72, 96, 120 i 144h. W każdym punkcie czasowym komórki strypsynizowano i oznaczono przy użyciu automatycznego licznika Coultera. Stężenie HA w zebranej pożywce hodowlanej oznaczano przy użyciu testu białka wiążącego kwas hialuronowy (HABP). Syntezę HA przez macierzyste i transfekowane próbnie MDA-MB 231 wyrażono jako zsyntezowany HA (pg/komórkę). Dane przedstawiające średnią z potrójnych oznaczeń w każdym punkcie czasowym ± SD. Δ-Δ: macierzyste MDA-MB 231; : próbne transfektanty; - : transfektanty ASHAS2. Figura 14 jest graficznym przedstawieniem charakterystyki masy cząsteczkowej HA zsyntezowanego przez macierzyste i stabilne transfektanty MDA-MB 231 niosące ASHAS2. Komórki wysiano na poziomie komórek w 75cm 2 kolbach hodowlanych i hodowano przez 24h w kompletnej pożywce uzupełnionej 250µCi chlorowodorku D-[6-3 H]-glukozaminy. Aby oznaczyć MW 3 H-HA w pożywce, próbki poddano chromatografii wykluczania na Sephacryl S-1000 SF wymywane w 0.15M NaCl/fosforan ph 7.25 przy 13.6ml/h. Ta figura pokazuje różnice masy cząsteczkowej zsyntetyzowanej przez macierzyste MDA-MB 231 i ich transfekowane odpowiedniki niosące antysensowne mrna do HAS2. Eluowane frakcje okazały się HA co oznaczono za pomocą trawienia hialuronidazą Streptomyces. ( - : linia komórek macierzystych; - : stabilne transfektanty ASHAS2 MDA-MB 231) Figura 15 jest graficznym przedstawieniem pokazującym wpływ inhibicji antysensownej HAS2 na proliferację komórek i cykl komórkowy w macierzystych, transfekowanych próbnie i ASHAS2 MDA-MB 231. A: Macierzyste, próbne i ASHAS2 transfektanty zebrano przy w przybliżeniu 80% konfluencji i wysiano do 24-dołkowych płytek przy gęstości komórek 5 103komórek/dołek (2.5cm 2 ). Tempo wzrostu komórek śledzono następnie dla 24, 48, 72 i 96h po wysianiu. Wszystkie liczby komórek oznaczano przy użyciu automatycznego licznika Coultera. Dane reprezentują średnią z potrójnych oznaczeń w każdym punkcie czasowym ± SD. : Stabilne transfektanty ASHAS2; : linia komórek macierzystych; : próbne transfektanty. Uwaga: rozbieżność procentowa pomiędzy potrójnymi oznaczeniami < 2%. B: Transfekowane i kontrolne komórki wysiano na poziomie 2x10 5 komórek/25cm 2 kolbę w obecności 2mM tymidyny i hodowano do 50% konfluencji. Komórki zebrano i udział komórek w określonym etapie cyklu komórkowego oznaczono następnie na urządzeniu analitycznym FACS-Calibur.

10 9 B: populacja komórek w G 0 /G1; C: w fazie S, i D: w fazie G 2 /M. Uwaga: opóźnienie 24 godzinne wejścia w fazę S w transfektantów ASHAS2 MDA-MB 231. : Stabilne transfektanty ASHAS2; : linia komórek macierzystych; : próbne transfektanty. Figura 16 jest graficznym przedstawieniem pokazującym hamowanie inwazyjności in vitro MDA-MB 231 eksprymujących antysensowne mrna do HAS2. Potencjał inwazyjności macierzystych MDA-MB 231, komórek transfekowanych próbnie (jedynie wektorem) i antysensownie HAS2 zostały zbadane za pomocą testu chemoinwazji w komorze Boydena. Komórki, które przemierzyły matrigel i rozprzestrzeniły się na dolnej powierzchni filtra wyrażono jako procent liczby komórek określonej dla macierzystej linii komórek MDA-MB 231. Przedstawione dane stanowią średnią z trzech powtórzeń eksperymentów przeprowadzonych w dwu różnych dniach ± SD. Uwaga: rozbieżność procentowa pomiędzy potrójnymi oznaczeniami < 2%. Figura 17 jest graficznym przedstawieniem pokazującym wpływ inhibicji antysensownej HAS2 na rakotwórczość i metastazy w MDA-MB 231. A: Macierzyste, próbne i ASHAS2 transfektanty zaszczepiono do warstwy tłuszczu sutkowego nagich myszy. Wzrost nowotworu pierwotnego śledzono przez 12-tygodniowy okres z progresją guza rejestrowaną dwa razy w tygodniu. Wykreślone wyniki reprezentują średnią objętość guza (mm 3 ) ± SEM, gdzie n = B: Alu PCR została wykorzystana do określenia zakresu metastaz do miękkich narządów z mózgu, nerek, wątroby i płuc. Wyniki są wyrażone jako procent DNA ludzkiego nowotworu w miękkich organach myszy, n = 8 na grupę. Figura 18 jest graficznym przedstawieniem pokazującym wpływ inhibicji antysensownej HAS2 na metastazę i przeżycie zwierząt. A: Alu PCR została wykorzystana do określenia zakresu metastaz do miękkich narządów po wszczepieniu wewnątrzsercowym nagich myszy z mózgu, nerek, wątroby, płuc i kości. Wyniki są wyrażone jako procent DNA ludzkiego nowotworu w miękkich organach u myszy, n = 9 na grupę. Nie wykryto metastaz do tych organów, gdy zwierzęta zaszczepiono komórkami MDA-MB 231 transfekowanymi ASHAS2. B: Wskaźnik przeżycia myszy macierzystych, próbnych i ASHAS2 transfektantów wykreślono za pomocą programu statystycznego Prism (Przeżycie Kaplan-Meier) wobec dni, które upłynęły od zaszczepienia wewnątrzsercowego. Nie było różnicy we wskaźniku przeżycia zwierząt (P=0.0840) między myszami macierzystymi i transfekowanymi próbnie. Krzywa przeżycia ASHAS2 różniła się istotnie (P<0.0001) z obu grup kontrolnych. MDA-MB 231 transfektanty ASHAS2 (ciągła); linia komórek macierzystych (krótka kreska); próbne transfektanty (długa kreska). SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH PRZYKŁADÓW WYKONANIA [0014] Ujawnione są tu związki, korzystnie nukleotydy i podobne formy do zastosowania w modulowaniu funkcji HAS lub ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących HAS i, w szczególności HAS1, HAS2 i/lub HAS3 lub cząsteczki kwasu nukleinowego wymaganej do lub ułatwiającej ekspresję materiału genetycznego HAS (np. region promotora). W stosowanym tu

11 10 kontekście, odniesienie do HAS obejmuje jakąkolwiek cząsteczkę o takiej samej funkcji. W korzystnym aspekcie, odniesienie do HAS, obejmuje odniesienie do izoform HAS1, HAS2 lub HAS3. W szczególności HAS jest HAS2 lub HAS3. Ujawniono także związki, korzystnie nukleotydy i podobne formy do zastosowania w modulowaniu funkcji HYAL lub ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących HYAL i, w szczególnym przykładzie wykonania, HYAL1, HYAL2, HYAL3 i/lub PH-20, lub cząsteczki kwasu nukleinowego wymaganej do lub ułatwiającej ekspresję materiału genetycznego HYAL (np. region promotora). W stosowanym tu kontekście, odniesienie do HYAL obejmuje jakąkolwiek cząsteczkę o takiej samej funkcji. Korzystnie, odniesienie do HYAL, obejmuje odniesienie do izoform HYAL1, HYAL2, HYAL3 i/lub PH-20. W szczególności HYAL oznacza HYAL1, HYAL2 lub HYAL3. [0015] Związki opisane w niniejszym dokumencie mogą być stosowane do ekspresji regulowanej w dół materiału genetycznego HAS i HYAL. Osiąga się to poprzez dostarczanie oligonukleotydów, które specyficznie hybrydyzują lub w inny sposób oddziałują z jedną lub większą liczbą cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących HAS i/lub HYAL lub cząsteczką kwasu nukleinowego wymaganą do lub ułatwiającą ekspresję genów HAS i/lub HYAL. W stosowanym tu kontekście, określenia kwas nukleinowy i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca HAS lub HYAL zostały wykorzystane dla wygody, aby objąć DNA kodujący HAS, RNA (w tym pre-mrna i mrna lub ich części) transkrybowane z takiego DNA, a także cdna pochodzące z takich RNA. Hybrydyzacja lub oddziaływanie opisanego tu związku z docelowym kwasem nukleinowym może obejmować celowanie antysensowne lub sensowne. To ostatnie jest tu określane jako supresja sensowna. W związku z tym zapewnia to hamowanie antysensowne lub sensowne. Takie hamowanie antysensowne lub sensowne jest zwykle oparte na hybrydyzacji opartej na wiązaniu wodorowym pasm lub odcinków oligonukleotydów tak, że co najmniej jedno pasmo lub odcinek jest rozszczepiany, degradowany lub w inny sposób odłączane. Alternatywnie potranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS) można osiągnąć za pomocą supresji sensownej (zwanej formalnie jako kosupresja). W jeszcze innym rozwiązaniu alternatywnym, można stosować kompleksy zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego i białka (na przykład rybonukleazy) takie jak RNAi, rybozymy i DNAzymy. [0016] Docelowe cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują sekwencje kodujące HAS i HYAL, region promotora, region regulatorowy 3 lub sekwencję nukleotydową, których ekspresja, ułatwia lub hamuje ekspresję genów HAS lub HYAL (np. gen regulatorowy, gen aktywatorowy lub gen reporterowy). [0017] Funkcje cząsteczki kwasu nukleinowego, które mają być regulowane w dół obejmują replikację, transkrypcję i/lub translację. W przypadku, gdy cząsteczką kwasu nukleinowego jest RNA, związki mogą kierować translokacją RNA w miejscu translacji, translokacją RNA do miejsc w komórce, które są odległe od miejsca syntezy RNA, translacją białka z RNA, składaniem RNA, otrzymując jeden albo więcej składników RNA, i aktywnością katalityczna lub tworzeniem kompleksów z udziałem RNA, które mogą być zaangażowane w lub ułatwione przez RNA. Jednym korzystnym efektem takiego oddziaływania z funkcją docelowego kwasu nukleinowego jest zmniejszenie poziomu ekspresji materiału genetycznego HAS i/lub HYAL i

12 11 stąd poziomów HAS i/lub HYAL. Hamowanie jest korzystną postacią modulowania ekspresji i mrna jest korzystnym docelowym kwasem nukleinowym. [0018] Jak podano w opisie, hybrydyzacja oznacza parowanie komplementarnych nici kwasów nukleinowych. Korzystny mechanizm parowania wymaga wiązania wodorowe, które może być wiązaniem wodorowym Watson-Cricka, Hoogsteena lub odwróconym Hoogsteena, pomiędzy komplementarnymi zasadami nukleozydowymi lub nukleotydowymi (nukleotydami) nici oligomerycznych związków. Na przykład, adenina i tymina są komplementarnymi nukleotydami, które parują się przez tworzenie wiązań wodorowych. Hybrydyzacja może występować w różnych warunkach. [0019] Związek antysensowny lub sensowny jest specyficznie zdolny do hybrydyzacji, gdy wiązanie związku do docelowego kwasu nukleinowego zakłóca normalne funkcjonowanie docelowego kwasu nukleinowego, powodując utratę aktywności, i występuje odpowiedni stopień komplementarności aby uniknąć niespecyficznego wiązania związku antysensownego lub sensownego do innych niż docelowe sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach, w których specyficzne wiązanie jest pożądane, tj., w warunkach fizjologicznych w przypadku testów in vivo lub terapeutycznego leczenia i w warunkach, w których testy są wykonywane w przypadku testów in vitro. [0020] Związek sensowny obejmuje RNAi lub inny kompleks, który zawiera PTGS. [0021] Jak podano w opisie, wyrażenie ostre warunki hybrydyzacji lub ostre warunki odnosi się do warunków, w których związek ujawniony w niniejszym dokumencie będzie hybrydyzować ze swoją sekwencją docelową, ale z minimalną liczbą innych sekwencji. Ostre warunki są zależne od sekwencji i będą różne w różnych okolicznościach i ostre warunki, zgodnie, z którymi związki oligomeryczne hybrydyzują do sekwencji docelowej są określane charakterem i składem związków oligomerycznych i testów, w których są one badane. [0022] Komplementarny, w stosowanym tu kontekście, odnosi się do zdolności do precyzyjnego parowania pomiędzy dwoma nukleotydami oligomerycznego związku. Na przykład, jeśli nukleotyd w określonej pozycji oligonukleotydu (związku oligomerycznego), jest zdolny do tworzenia wiązania wodorowego z nukleotydem w określonym położeniu docelowego kwasu nukleinowego, przy czym docelowy kwas nukleinowy jest DNA, RNA lub cząsteczką oligonukleotydu, wówczas pozycja wiązania wodorowego między oligonukleotydem i docelowym kwasem nukleinowym jest uważana za pozycję komplementarną. Oligonukleotyd i dalej DNA, RNA lub cząsteczka oligonukleotydu są komplementarne ze sobą, gdy wystarczająca liczba komplementarnych pozycji w każdej cząsteczce jest zajęta przez nukleotydy, które mogą tworzyć ze sobą wiązania wodorowe. Zatem, zdolny do specyficznej hybrydyzacji i komplementarny są określeniami, które są stosowane w celu wskazania odpowiedniego stopnia precyzyjnego parowania lub komplementarności nad wystarczającą liczbę nukleotydów w taki sposób, że występuje stabilne i specyficzne wiązanie pomiędzy oligonukleotydem i docelowym kwasem nukleinowym. [0023] Jest to zrozumiałe w tej dziedzinie, że sekwencja związku antysensownego lub sensownego nie musi być w 100% komplementarna do jego docelowego kwasu nukleinowego,

13 12 aby była zdolna do specyficznej hybrydyzacji. Ponadto, oligonukleotyd może hybrydyzować na jednym lub większej liczbie odcinków tak, że uczestniczące lub sąsiednie odcinki nie są zaangażowane w przypadku zdarzenia hybrydyzacji (np. struktura pętli lub struktura typu spinki do włosów). Korzystne jest tu, że opisane tu związki antysensowne lub sensowne zawierają co najmniej 70% komplementarności sekwencji z regionem docelowym w obrębie docelowego kwasu nukleinowego; jak 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 lub 100% komplementarności z sekwencją kwasu nukleinowego, do których są celowane. Na przykład, związek antysensowny lub sensowny, w którym 18 z 20 nukleotydów związku antysensownego lub sensownego jest komplementarnych z regionem docelowym, a zatem by specyficznie hybrydyzował, stanowiłby 90 proc komplementarności. W tym przykładzie, pozostałe niekomplementarne nukleotydy mogą być łączone lub przeplatane z komplementarnymi nukleotydami i nie muszą być w bezpośredniej bliskości ze sobą lub do komplementarnych nukleotydów. Jako taki, związek antysensowny lub sensowny, który ma 18 nukleotydów długości z 4 (czterema) niekomplementarnymi nukleotydami, które są flankowane przez dwa regiony pełnej komplementarności z docelowym kwasem nukleinowym miałyby 77.8% całkowitej komplementarności z docelowym kwasem nukleinowym. [0024] Procent komplementarności związku antysensownego lub sensownego z regionem docelowego kwasu nukleinowego można określić rutynowo przy użyciu programów BLAST (ang. basic local alignment search tools) i programów PowerBLAST znanych w dziedzinie (Altschul i wsp., J Mol. Biol. 215: , 1990; Zhang i Madden, Genome Res. 7: , 1997). [0025] Związki, w odniesieniu do zastosowań opisanych w niniejszym dokumencie obejmują antysensowne lub sensowne kwasy nukleinowe, antysensowne lub sensowne związki oligomeryczne, antysensowne lub sensowne oligonukleotydy, rybozymy, oligonukleotydy sensowne, cząsteczki sensowne o pełnej długości, oligonukleotydy zewnętrznych sekwencji sterujących (EGS), produkty alternatywnego splicingu, startery, sondy i inne oligomeryczne związki, które hybrydyzują z co najmniej częścią docelowego kwasu nukleinowego. Jako takie, związki te mogą być wprowadzane w postaci jednoniciowej, dwuniciowej, kolistej lub typu spinki do włosów, a także mogą zawierać elementy strukturalne takie, jak wewnętrzne lub końcowe wybrzuszenia lub pętle. Po wprowadzeniu do układu, związki mogą wywoływać działanie jednego lub więcej enzymów lub białek strukturalnych w celu dokonania modyfikacji docelowego kwasu nukleinowego. [0026] W stosowanym tu kontekście, cząsteczka antysensowna lub sensowna zawiera cząsteczkę RNA, która, przez wiązanie z sekwencją komplementarną w obu RNA lub DNA, hamuje funkcję i/lub zakończenie syntezy drugiej cząsteczki. Bierze ona udział w regulacji różnych układów in vivo. Sztuczne antysensowne lub sensowne RNA są stosowane do hamowania translacji specyficznych cząsteczek mrna zarówno w żywych komórkach eukariotycznych (i bakteryjne) oraz w systemach bez komórek. [0027] Jeden nieograniczający przykład takiego enzymu to RNA-za H, komórkowa endonukleaza, która rozszczepia nić RNA od dupleksu RNA:DNA. W dziedzinie wiadomo, że

14 13 jednoniciowe związki antysensowne lub sensowne, które są podobne do DNA wywołują RNazę H. Aktywacja RNazy H, w związku z tym powoduje rozszczepienia docelowego RNA, tym samym zwiększając bardzo skuteczność hamowania mediowanego oligonukleotydami ekspresji genu. Podobne role były postulowane dla innych rybonukleaz takich, jak te w RNazie III i rodzinie rybonukleaz L enzymów. [0028] Podczas, gdy korzystne postaci związków antysensownych lub sensownych są jednoniciowymi oligonukleotydami, można użyć wiele form struktur dwuniciowych takich, jak cząsteczki dwuniciowego RNA (dsrna), mirna, cząsteczki krótkiego oddziałującego RNA (sirna) pełnej długości dsrna. [0029] Małe interferujące RNA (sirna) mają ważną rolę w zjawisku interferencji RNA (RNAi). W RNAi, dsrna wprowadzone do niektórych organizmów lub komórek są degradowane do około 22 fragmentów nukleotydowych. Te cząsteczki sirna z 22 nukleotydami następnie wiążą się z komplementarną częścią docelowego mrna i tagują go w celu degradacji; [0030] Druga klasa regulacyjnych małych RNA jest określana jako małe czasowe RNA. Przykładem tej grupy są w RNA o w przybliżeniu 22 nukleotydach lin-4 i let-7. Te cząsteczki RNA odgrywają istotną rolę w regulacji czasowej rozwoju C. elegans. Są one początkowo przetwarzane z transkryptu ssrna o w przybliżeniu 70 nukleotydach złożonych w strukturę typu łodyżki i pętelki. Uważa się, że o przetworzeniu, te ssrna zapobiegają translacji docelowych mrna przez wiązanie do celów regionów niepodlegających translacji (UTR) komplementarnych 3. Dicer, enzym RNAaza przetwarza oba rodzaje RNA (Grishok i wsp. Science 287(562): , 2000). [0031] W stosowanym tu kontekście, określenie związek oligomeryczny odnosi się do polimeru lub oligomeru zawierającego wiele jednostek monomerycznych. W stosowanym tu kontekście, określenie oligonukleotyd dotyczy oligomeru lub polimeru kwasu rybonukleinowego (RNA) lub kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub jego mimetyków, chimer, analogów i homologów. Termin ten obejmuje oligonukleotydy składające się z naturalnie występujących nukleotydów, cukrów i kowalencyjnych wiązań wewnątrznukleozydowych (szkieletu), a także oligonukleotydy mające niewystępujące naturalnie części, które działają podobnie. Takie zmodyfikowane lub podstawione oligonukleotydy są często preferowanymi postaciami natywnymi, ze względu na pożądane właściwości takie, jak, na przykład, wzmożony wychwyt komórkowy, zwiększone powinowactwo do docelowego kwasu nukleinowego i większa stabilność w obecności nukleaz. [0032] Podczas gdy oligonukleotydy mogą być stosowane w opisanych tu sposobach, stosowane mogą być również inne rodziny związków w tym, bez ograniczania do wymienionych, analogi i mimetyki oligonukleotydowe takie, jak te opisane w niniejszym dokumencie. [0033] Związki opisane powyżej zawierają korzystnie od około 10 do około 2000 nukleotydów (tj. od około 10 do około 2000 połączonych nukleozydów), np. związki mające 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,

15 14 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680,690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280, 1290, 1300, 1310, 1320, 1330, 1340, 1350, 1360, 1370, 1380, 1390, 1400, 1410, 1420, 1430, 1440, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490, 1500, 1510, 1520, 1530, 1540, 1550, 1560, 1570, 1580, 1590, 1600, 1610, 1620, 1630, 1640, 1650, 1660, 1670, 1680,1690, 1700, 1710, 1720, 1730, 1740, 1750, 1760, 1770, 1780, 1790, 1800, 1810, 1820, 1830, 1840, 1850, 1860, 1870, 1880, 1890, 1900, 1910, 1920, 1930, 1940, 1950, 1960, 1970, 1980, 1990 lub 2000 nukleotydów długości. [0034] Związki antysensowne lub sensowne o długości nukleotydów obejmujące odcinek co najmniej dziesięciu (10), jak 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 lub 30 następujących po sobie nukleotydów wybranych z ilustracyjnych związków antysensownych lub sensownych są uważane również za odpowiednie związki antysensowne lub sensowne. [0035] Przykładowe korzystne związki antysensowne lub sensowne obejmują sekwencje oligonukleotydowe, które zawierają co najmniej 10 kolejnych nukleotydów z 5'-konca jednego z ilustratywnych preferowanych związków antysensownych lub sensownych (przy czym pozostałe nukleotydy są konsekutywnym odcinkiem tego samego oligonukleotydu rozpoczynającego się bezpośrednio przed 5'-końcem związku antysensownego lub sensownego, który jest zdolny do specyficznej hybrydyzacji do docelowego kwasu nukleinowego i kontynuując aż oligonukleotyd zawiera około 10 do około 2000 nukleotydów). Podobnie korzystne związki antysensowne lub sensowne są reprezentowane przez sekwencje oligonukleotydowe, które zawierają co najmniej 10 konsekutywnych nukleotydów od końca 3 jednego z ilustracyjnych korzystnych związków antysensownych lub sensownych (przy czym pozostałe nukleotydy są konsekutywnym odcinkiem tego samego oligonukleotydu rozpoczynającego się bezpośrednio przed końcem 3 związku antysensownego lub sensownego, który jest zdolny do specyficznej hybrydyzacji do docelowego kwasu nukleinowego i kontynuując aż oligonukleotyd zawiera około 10 do około 2000 nukleotydów). Znawca w dziedzinie uzbrojony w zilustrowane tu korzystne związki antysensowne lub sensowne będzie w stanie, bez zbędnego eksperymentowania, zidentyfikować dalsze korzystne związki antysensowne lub sensowne. [0036] Związki kandydaci są również określane w niniejszym dokumencie jako związki wiodące. W niniejszym ujawnieniu, docelowy kwas nukleinowy koduje HAS lub HYAL albo jest genem wymaganym do ekspresji genów HAS lub HYAL. Jak wskazano powyżej, określenie HAS obejmuje izoformy HAS1, HAS2 i HAS3. HAS2 i HAS3 są szczególnie korzystne. Jak wskazano powyżej, określenie HYAL obejmuje izoformy HYAL1, HYAL2, HYAL3 i PH-20. HYAL1, HYAL2 i HYAL3 są szczególnie korzystne. [0037] Proces celowania zwykle obejmuje również określenie co najmniej jednego regionu docelowego, odcinka, lub miejsca w obrębie docelowego kwasu nukleinowego dla

16 15 konsekutywnego oddziaływania antysensownego lub sensownego tak, że powoduje to pożądany efekt, np. zmniejszenie ekspresji. Jak podano w opisie, określenie region definiuje się jako części docelowego kwasu nukleinowego, zawierającą co najmniej jedną identyfikację struktury, funkcji lub właściwości. W regionach kwasów nukleinowych docelowych są odcinki. Odcinki są określane jako mniejsze części regionów lub podczęści w ramach docelowego kwasu nukleinowego. Miejsca w stosowanym tu kontekście, są określone jako pozycje w docelowym kwasie nukleinowym. [0038] Ponieważ, co wiadomo w dziedzinie, kodonem inicjacji translacji jest typowo 5'-AUG (w transkrybowanych cząsteczkach mrna; 5'-ATG w odpowiedniej cząsteczce DNA), kodon inicjacji translacji jest również określany jako kodon AUG, kodon start lub kodon start AUG. Niewielka część genów ma kodon inicjacji translacji o sekwencji RNA 5'-GUG, 5'-UUG lub 5'-CUG, i wykazano, że 5'-AUA, 5'-ACG oraz 5'-CUG funkcjonują in vivo. Zatem, określenia kodon inicjacji translacji i kodon start może obejmować wiele sekwencji kodonów, chociaż aminokwasem inicjatorem w każdym przypadku jest zazwyczaj metionina (w komórkach eukariotycznych). W dziedzinie znane jest również, że geny eukariotyczne mogą mieć dwa lub więcej alternatywnych kodonów start; z których każdy może być korzystnie wykorzystywany do inicjacji translacji w określonym rodzaju komórki lub tkanki, lub w danym zestawie warunków. W stosowanym tu kontekście, kodon start i kodon inicjacji translacji odnoszą się do kodonu lub kodonów, które są stosowane in vivo zainicjowania translacji mrna transkrybowanego z genu kodującego HAS, niezależnie od sekwencji takich kodonów. W dziedzinie wiadomo również, że kodon terminacji translacji (lub kodon stop ) genu może mieć jedną z trzech sekwencji, tj. 5'-UAA, 5'-UAG i 5'-UGA (odpowiadającymi im sekwencjami DNA są odpowiednio 5'-TAA, 5'-TAG i 5'-TGA). [0039] Określenia region kodonu start i region kodonu inicjacji translacji odnoszą się do części takiego mrna lub genu, który obejmuje od około 25 do około 50 sąsiadujących nukleotydów w obu kierunkach (tj. -5' lub 3') od kodonu inicjacji translacji. Podobnie, określenia region kodonu stop i region kodonu terminacji translacji odnosi się do części takiego mrna lub genu, który obejmuje od około 25 do około 50 ciągłych nukleotydów w obu kierunkach (tj. 5' lub 3') od kodonu terminacji translacji. W rezultacie, region kodonu start (lub region kodonu inicjacji translacji ) i region kodonu stop (lub region kodonu terminacji translacji ) są wszystkie regionami, które mogą być skutecznym celem opisanych tu związków antysensownych lub sensownych. [0040] Otwarta ramka odczytu (ORF) lub region kodujący, który jest znany w dziedzinie w odniesieniu do obszaru pomiędzy kodonem inicjacji translacji i kodonem terminacji translacji, jest również obszarem, który może być skutecznym celem. Korzystnym regionem jest region wewnątrzgenowy zawierający kodon inicjacji lub terminacji translacji otwartej ramki odczytu (ORF) genu. [0041] Inne regiony docelowe zawierają podlegający translacji region 5' (5'UTR), znanych w dziedzinie w odniesieniu do części mrna w kierunku 5' od kodonu inicjacji translacji,, a więc zawierający nukleotydy pomiędzy stroną 5' cap i kodonem inicjacji translacji mrna (lub odpowiadających mu nukleotydów na genie), i nie podlegający translacji region 3 (3'UTR),

17 16 znany w dziedzinie w odniesieniu do fragmentu mrna w kierunku 3' od kodonu terminacji translacji, a więc zawierający nukleotydy pomiędzy kodonem terminacji translacji i końcem 3' mrna (lub odpowiadających mu nukleotydów na genie). Miejsce kap 5' mrna obejmuje N7- metylowaną resztę guanozyny przyłączoną do reszty najbardziej 5' mrna przez wiązanie 5'-5'- trifosforanu. Uważa się, że region kap 5 mrna sam zawiera strukturę kap 5' a także pierwsze 50 nukleotydów w sąsiedztwie miejsca kap. Korzystne jest również, aby brać za cel region kap 5. [0042] Chociaż niektóre eukariotyczne transkrypty mrna są bezpośrednio poddawane translacji, wiele zawiera jeden lub więcej regionów, znanych jako introny, które są wycinane z transkryptu przed translacją. Pozostające (i dlatego poddawane translacji) regiony są znane jako egzony i są łączone ze sobą w celu utworzenia ciągłej sekwencji mrna. Celowanie do miejsc składania, tj. węzłów intron-egzon lub węzłów egzon-intron, może być szczególnie użyteczne w sytuacjach, gdy nieprawidłowe składanie ma udział w chorobie, lub gdy nadprodukcja konkretnego produktu składania jest zaangażowana w chorobę. Nieprawidłowe węzły fuzyjne z powodu przegrupowania lub delecji są również korzystnymi miejscami docelowymi. Transkrypty mrna wyprodukowane przez proces składania dwóch (lub więcej) mrna z różnych źródeł genów są znane jako transkrypty fuzyjne. Wiadomo również, że introny mogą być skutecznie brane na cel za pomocą związków antysensownych lub sensownych celujących w, na przykład, DNA lub pre-mrna. [0043] W dziedzinie wiadomo również, że alternatywne transkrypty RNA mogą być wytwarzane z tego samego regionu genomowego DNA. Te alternatywne transkrypty są ogólnie znane jako warianty. Dokładniej, warianty pre-mrna są transkryptami produkowanymi z tego samego genomowego DNA, który różni się od innych transkryptów wyprodukowanych z tego samego genomowego DNA pod względem ich pozycji start lub stop i zawierają zarówno sekwencję intronową, jak i egzonową. [0044] Po wycięciu jednego lub więcej regionów egzonów lub intronów, lub ich części w trakcie składania, warianty pre-mrna produkują mniejsze warianty mrna. W związku z tym, warianty mrna są przetwarzanymi wariantami pre-mrna i każdy unikalny wariant pre-mrna musi produkować unikalny wariant mrna w wyniku składania. Te warianty mrna są również znane jako alternatywne warianty składania. Gdy następuje brak składania wariantu premrna, wówczas wariant pre-mrna jest identyczny z wariantem mrna. [0045] W dziedzinie wiadomo również, że warianty mogą być wyprodukowane przez wykorzystanie alternatywnych sygnałów, aby rozpocząć lub zatrzymać transkrypcję i że premrna i mrna może posiadać więcej niż jeden kodon start lub kodon stop. Warianty pochodzące z pre-mrna lub mrna, które alternatywne wykorzystują kodony start znane są alternatywne warianty startu tego pre-mrna lub mrna. Te transkrypty, które wykorzystują alternatywne kodon stop, są znane jako alternatywne warianty stop tego pre-mrna lub mrna. Jednym szczególnym rodzajem alternatywnego wariant stopu jest wariant polia, w którym wiele wyprodukowanych transkryptów wynika z alternatywnego wyboru jednego z sygnałów stop polia za pomocą maszyny transkrypcyjnej, produkując w tym samym transkryptu, które kończą się przy unikalnych miejscach polia.

18 17 [0046] Typy opisanych tu wariantów są również korzystnymi docelowymi kwasami nukleinowymi. [0047] Lokalizacje na docelowym kwasie nukleinowym, do których hybrydyzują korzystne związki antysensowne lub sensowne, są w dalszej części opisu zwane jako korzystne odcinki docelowe. W stosowanym tu kontekście określenie korzystny odcinek docelowy definiuje się jako co najmniej 10 nukleotydową część regionu docelowego, na którą skierowany jest aktywny związek antysensowny lub sensowny. Nie chcąc się wiązać żadną teorią, obecnie uważa się, że te segmenty docelowe stanowią części docelowego kwasu nukleinowego, który jest dostępny dla hybrydyzacji. [0048] Choć specyficzne sekwencje pewnych korzystnych docelowych odcinków są określone w niniejszym dokumencie, znawca w dziedzinie rozpozna, że służą one do zilustrowania i opisania konkretnych przykładów wykonania. Dodatkowe korzystne odcinki docelowe mogą być zidentyfikowane przez znawcę. [0049] Odcinki docelowe o długości nukleotydów obejmujące odcinek co najmniej dziesięciu (10) konsekutywnych nukleotydów wybranych z ilustratywnych korzystnych odcinków docelowe również są uważane za odpowiednie do bycia celem. [0050] Odcinki docelowe mogą zawierać sekwencje DNA lub RNA, które zawierają co najmniej 8 konsekutywnych nukleotydów od końca 5 jednego z ilustratywnych korzystnych odcinków docelowych (przy czym pozostałe nukleotydy są konsekutywnym odcinkiem tego samego DNA lub RNA rozpoczynającego się tuż powyżej końca 5 docelowego odcinka i ciągnące się aż DNA lub RNA zawiera około 10 do około 2000 nukleotydów). Podobnie korzystne odcinki docelowe są reprezentowane przez sekwencje DNA lub RNA, które zawierają co najmniej 10 konsekutywnych nukleotydów od końca 3 jednego z ilustratywnych korzystnych odcinków docelowych (przy czym pozostałe nukleotydy są konsekutywnym odcinkiem tego samego DNA lub RNA rozpoczynającego się tuż poniżej końca 3 docelowego odcinka i ciągnące się aż DNA lub RNA zawiera około 10 do około 2000 nukleotydów). Znawca w dziedzinie posiadający zilustrowane tu korzystne odcinki docelowe będzie w stanie, bez zbędnego eksperymentowania, zidentyfikować dalsze korzystne odcinki docelowe. [0051] Gdy zidentyfikowano jeden lub więcej docelowych regionów, odcinków lub miejsc, dobiera się związki antysensowne lub sensowne, które są wystarczająco komplementarne do celu, tj. hybrydyzują wystarczająco dobrze i z wystarczającą specyficznością, otrzymując pożądany efekt, tj. aby zmniejszyć ekspresję genu HAS i/lub HYAL lub poziomy HAS i/lub HYAL. [0052] Korzystne odcinki docelowe zidentyfikowane w niniejszym dokumencie mogą być stosowane w przesiewaniu dla dodatkowych związków, które modulują ekspresję genu HAS i/lub HYAL. Modulatory stanowią te związki, które zmniejszają lub zwiększają ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego HAS i/lub HYAL i które zawierają co najmniej 10- nukleotydową część komplementarną z korzystnym docelowym odcinkiem. Sposób przesiewania obejmuje etapy kontaktowania korzystnego docelowego odcinka cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego HAS i/lub HYAL z jednym lub większą liczbą kandydatów na

19 18 modulatorów, i wybierania jednego lub większej liczby kandydatów na modulatory, które zmniejszają lub zwiększają ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego HAS i/lub HYAL. Gdy okaże się, że kandydat na modulator lub modulatory są zdolne do modulowania (na przykład zmniejszania albo zwiększania) ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego HAS i/lub HYAL, modulator może być następnie stosowany w dalszych badawczych badaniach funkcji HAS i/lub HYAL, lub do zastosowania jako środek badawczy, diagnostyczny lub terapeutyczny. [0053] Korzystne odcinki docelowe mogą być również połączone z ich odpowiednimi komplementarnymi związkami antysensownymi lub sensownymi takimi, jak te tu opisane, aby utworzyć ustabilizowane dwuniciowe (zdupleksowane) oligonukleotydy. [0054] W stanie techniki pokazano, że takie dwuniciowe ugrupowania oligonukleotydów modulują docelową ekspresję i regulują translację, jak również przetwarzanie RNA przez mechanizm antysensowny lub sensowny. Ponadto dwuniciowe ugrupowania mogą ulegać modyfikacjom chemicznym (Fire i wsp., Nature 391: , 1998; Timmons i Fire, Nature 395: 854, 1998; Timmons i wsp., Gene 263: , 2001; Tabara i wsp., Science 282: , 1998; Montgomery i wsp., 1998, supra; Tuschl i wsp., Genes Dev. 13: , 1999; Elbashir i wsp., Nature, 411: , 2001, Elbashir i wsp., Genes Dev. 15: , 2001). Na przykład, pokazano, że te dwuniciowe ugrupowania hamują cel przez klasyczną hybrydyzację nici antysensownej lub sensownej dupleksu do celu, tym samym wywołując enzymatyczną degradację celu (Tijsterman i wsp., 2002, powyżej). [0055] Jak wskazano powyżej, ujawnione są interaktywne cząsteczki specyficzne dla HAS, w tym jedna lub więcej HAS1, 2 i/lub 3 i które modyfikują funkcję lub aktywność HAS. Ponadto ujawnione są interaktywne cząsteczki charakterystyczne dla HYAL, w tym jedna lub więcej z HYAL1, HYAL2, HYAL3 i/lub PH-20 i które modyfikują funkcję lub aktywność HAS. [0056] Ujawnieni są tu antagoniści HAS i/lub funkcji lub aktywności HAS. Tacy antagoniści są użyteczni w zmniejszaniu efektów HAS i/lub HYAL, a tym samym zmniejszaniu lub podnoszeniu poziomu HA. [0057] Określenie antagonista obejmuje zmodyfikowaną cząsteczkę HAS i/lub HYAL lub substrat HAS i/lub HYAL, jak również ich homologii lub chemiczne równoważniki lub analogi. Korzystnie obejmuje ono interaktywne cząsteczki takie, jak przeciwciała i drobnocząsteczkowe inhibitory. [0058] Interaktywne cząsteczki takie, jak, bez ograniczania do wymienionych, przeciwciała i inne immunoglobuliny, obejmują fragmenty, pochodne, części wiążące antygen, postaci rekombinowane, postaci chimeryczne, a także deimmunizowane, w tym ich postacie humanizowane skierowane na przedmiotowe modulatory i drobnocząsteczkowe inhibitory. [0059] W związku z powyższym, niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał, które wiążą się, lub w inny sposób oddziałują z HAS i/lub HYAL i które zmniejszają funkcję lub aktywność HAS i/lub HYAL.

20 19 [0060] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego związku, który zmniejsza poziom aktywności syntazy hialuronianu (HAS) 1, przy czym wspomniany związek jest przeciwciałem specyficznym względem sekwencji aminokwasów wybranej z SEQ ID NO: 25 lub 26. [0061] Przeciwciała mogą być przeciwciałami monoklonalnymi lub poliklonalnymi, chociaż korzystne są przeciwciała monoklonalne. Generalnie, przeciwciała są w postaci wydzielonej, jednorodnej lub całkowicie lub częściowo oczyszczonej. [0062] Przeciwciała mogą być także humanizowane lub chimeryczne lub są ludzkimi przeciwciałami odpowiednimi do podawania ludziom. Obejmują one przeciwciała humanizowane przygotowane, na przykład, z mysich przeciwciał monoklonalnych, oraz ludzkie przeciwciała monoklonalne, które można wytworzyć, na przykład, przy użyciu myszy transgenicznych, jak opisano poniżej, lub za pomocą prezentacji fagowej. Humanizowane przeciwciało obejmuje przeciwciało deimmunizowane. [0063] Przeciwciała skierowane przeciw HAS takim, jak HAS1, 2 lub 3 lub ich immunogennym częściom lub immunologicznymi cząsteczkami homologicznymi i są specyficzne dla aminokwasów wybranych z SEQ ID NO: 25 lub 26. [0064] Odniesienie do przeciwciała lub przeciwciał obejmuje odniesienie do wszystkich różnych postaci przeciwciał, w tym między innymi: pełnych przeciwciał (np. o nienaruszonym regionie Fe), w tym, na przykład, przeciwciał monoklonalnych; fragmentów przeciwciał wiążących antygen, w tym, na przykład fragmentów Fv, Fab, Fab 'i F (ab') 2 ; humanizowanych przeciwciał; ludzkich przeciwciał (np. wyprodukowanych w zwierzętach transgenicznych lub poprzez ekspresję fagową); i polipeptydów będących pochodnymi immunoglobulin wytwarzanych poprzez techniki inżynierii genetycznej. O ile nie określono inaczej, określenia przeciwciało lub przeciwciała i w stosowanym tu kontekście obejmują zarówno pełne przeciwciała, jak i ich fragmenty wiążące antygen. [0065] O ile nie zaznaczono inaczej, specyficzność w odniesieniu do przeciwciała według niniejszego wynalazku ma oznaczać, że przeciwciało wiąże się w zasadzie tylko z jego docelowym antygenem bez znaczącego wiązania z niespokrewnionymi białkami. Jednakże, możliwe jest, że przeciwciało będzie zaprojektowane lub wybrane do wiązania się z dwoma lub większą liczbą spokrewnionych białek, białko spokrewnione obejmuje różne warianty składania lub fragmenty tego samego białka lub homologiczne białka z różnych gatunków. Takie przeciwciała są wciąż uważane na wykazujące specyficzność dla tych białek i są objęte zakresem niniejszego wynalazku. Określenie zasadniczo oznacza w tym kontekście, że nie ma wykrywalnego wiązania z nie docelowym antygenem, powyżej podstawowych, tj. nieswoistych, poziomów. [0066] Przeciwciała według niniejszego wynalazku można wytworzyć za pomocą dobrze znanych procedur. Patrz, na przykład, przeciwciała monoklonalne, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysers, Kennet i wsp. (eds.), Plenum Press, New York (1980); i Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow i Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).