Zastosowanie analizy mitochondrialnego DNA. w badaniach kryminalistycznych. Katarzyna Gawêda-Walerych Ireneusz So³tyszewski

Transkrypt

1 Katarzyna Gawêda-Walerych Ireneusz So³tyszewski Zastosowanie analizy mitochondrialnego DNA w badaniach kryminalistycznych perspektywy Analiza mitochondrialnego DNA (mtdna) jest rutynow¹ metod¹ stosowan¹ w badaniach kryminalistycznych przy ustalaniu pokrewieñstwa oraz w badaniach ewolucyjnych, antropologicznych i medycynie klinicznej. Znajduje swoje zastosowanie tam, gdzie standardowe genotypowanie w oparciu o uk³ady mikrosatelitarne STR nie jest mo liwe. W kryminalistyce takie badania wykonuje siê w przypadku œladów biologicznych o du ym stopniu degradacji b¹dÿ œladów z natury zawieraj¹cych ma³e iloœci j¹drowego DNA, takich jak koœci, zêby czy trzony w³osów. Ponadto niektóre sekwencje mtdna pozwalaj¹ na okreœlenie przynale - noœci gatunkowej œladów pochodzenia zwierzêcego. Budowa mitochondrialnego DNA Mitochondrium jest organell¹ komórkow¹ odpowiedzialn¹ za dostarczanie energii komórce w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Zawiera ono w³asny materia³ genetyczny kolist¹ dwuniciow¹ cz¹steczkê mitochondrialnego DNA o d³ugoœci ok pz. [9]. Ewentualne ró nice w d³ugoœci wynikaj¹ m.in. z insercji lub delecji nukleotydów. Jedna z nici mtdna zosta³a nazwana ciê k¹ H (od ang. heavy) ze wzglêdu na du ¹ zawartoœæ zasad purynowych, a druga lekk¹ L (od ang. light) z powodu du ej zawartoœci zasad pirymidynowych. Mitochondrialne DNA ró ni siê od j¹drowego DNA pod wieloma wzglêdami (tab. 1). Z punktu widzenia badañ kryminalistycznych g³ównymi zaletami mtdna s¹: du a liczba kopii w komórce i wy sza odpornoœæ na degradacjê w porównaniu z j¹drowym DNA. Uwa a siê, e druga z wymienionych cech wynika z kolistej struktury mtdna oraz przyjmowania przez niego konformacji superskrêconej [8]. Cechy te pozwalaj¹ na uzyskanie wyników nawet z bardzo zniszczonego materia³u, którego analiza z wykorzystaniem uk³adów STR j¹drowego DNA jest utrudniona lub niemo liwa. W odró nieniu od j¹drowego DNA (jdna) mtdna nie jest zwi¹zane z bia³kami histonowymi i nie zawiera intronów. MtDNA koduje 13 polipeptydów z ok. 80 podjednostek bia³kowych zaanga owanych w fosforylacjê oksydacyjn¹ oraz 2 rrna i 22 trna, co zapewnia mitochondriom ograniczon¹ autonomiê [1]. G³ówn¹ ró nicê stanowi sposób dziedziczenia: mtdna dziedziczone jest wy³¹cznie w linii matczynej. Wynika to z faktu, e mitochondria obecne w plemniku zawieraj¹ce ok. 100 kopii mtdna, po zap³odnieniu komórki jajowej, w której jest ok cz¹steczek mtdna, degeneruj¹ w wyniku niepoznanego dot¹d dobrze mechanizmu [5]. Poniewa mtdna nie podlega rekombinacji sekwencja wszystkich krewnych w linii matczynej jest identyczna na przestrzeni wielu generacji (wy³¹czaj¹c przypadki mutacji, polimorfizmów i zwi¹zanej z nimi heteroplazmii patrz dalej). Dlatego sekwencja mtdna traktowana jest jako pojedyncze locus lub tzw. haplotyp. Tabela 1 Podsumowanie g³ównych ró nic miêdzy mitochondrialnym i j¹drowym DNA The summary of basic differences between mtdna and nuclear DNA Cecha mtdna DNA jądrowe Lokalizacja Mitochondria Jądro komórkowe Liczba kopii 50-kilku tys. kopii w komórce: 2 do 10 kopii na jedno mitochondrium 2 kopie w komórce Struktura Kolista dwuniciowa cząsteczka Liniowa dwuniciowa cząsteczka Długość Ok pz Ok. 3,2 mld pz Procentowa zawartość regionu kodującego i niekodującego Region niekodujący ok. 7% genomu mitochondrialnego Region kodujący ok. 93% genomu mitochondrialnego Region niekodujący ok. 97% genomu jądrowego Region kodujący ok. 3% genomu jądrowego Dziedziczenie W linii matczynej Od obojga rodziców Źródło zmienności Mutacje Brak zjawiska rekombinacji Rekombinacja Mutacje PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05 5

2 Genom mitochondrialny wyró nia siê wy sz¹ czêstoœci¹ mutacji ni genom j¹drowy. Przyczyn¹ jest, jak siê uwa a, wysokie stê enie wolnych rodników uwalniaj¹cych siê w trakcie wêdrówki elektronów przez ³añcuch oddechowy. Te bardzo aktywne cz¹steczki uszkadzaj¹ nieos³oniête histonami DNA i prowadz¹ do zmian w materiale genetycznym. Powstawaniu zmian sprzyja dodatkowo niska wiernoœæ polimerazy replikuj¹cej mtdna oraz mniej sprawne ni w j¹drze komórkowym mechanizmy naprawcze w mitochondriach. St¹d niektóre regiony mtdna ewoluuj¹ 5 10 razy szybciej ni geny j¹drowego DNA wystêpuj¹ce w pojedynczych kopiach. Najwiêkszy stopieñ polimorfizmu obserwowany jest w obrêbie tzw. regionu kontrolnego (pêtli D, ang. D-loop) jest to jedyny fragment mtdna pozbawiony genów, który jest miejscem inicjacji transkrypcji [9]. Region kontrolny ma d³ugoœæ ok pz, co stanowi mniej ni 7% ca³ego genomu mitochondrialnego i obejmuje 2 regiony hiperzmienne HV1 i HV2 (ryc. 1). Zwykle HV1 obejmuje fragment na odcinku od do pz, a HV2 od 73 do 340 pz. Przedstawiciele populacji afroamerykañskiej ró ni¹ siê od siebie œrednio w 14 pozycjach nukleotydowych, a przedstawiciele rasy kaukaskiej œrednio w 8 pozycjach nukleotydowych w obszarze HV1/HV2. Czasami wyró nia siê tak e region HV3, który obejmuje obszar od 438 do 576 pz. W obrêbie tego regionu, od 515 do 524 pz wystêpuje polimorficzne dwunukleotydowe powtórzenie AC, które mo e mieæ od 3 do 7 powtórzeñ i mo na je A 16189C C Ryc. 1. Sekwencje mitochondrialnego DNA wykorzystywane w badaniach kryminalistycznych. Zaznaczono wysoce polimorficzne regiony HV1, HV2 i HV3 (kolor niebieski) w obszarze niekoduj¹cym, w obrêbie HV3 wyró niono (kolorem jasnoniebieskim) dwunukleotydowe powtórzenie AC (3 7). W regionie koduj¹cym (kolor pomarañczowy) ó³tym kolorem wyró niono gen koduj¹cy cytochrom b. Miejsca SNP wystêpuj¹ licznie i s¹ rozsiane wzd³u ca³ej cz¹steczki mtdna, dlatego oznaczono jedynie przyk³adowy zestaw 11 miejsc SNP (czerwone strza³ki) [12], wykorzystywany do rozró niania haplotypów w obrêbie subhaplogrupy H1 (wyjaœnienie w tekœcie) Fig. 1. Mitochondrial DNA sequences used in forensic analysis. Highly polymorphic HV1, HV2 and HV3 regions from D-loop (non-coding region) are indicated with blue colour. Within HV3 region dinucleotide repeat of AC (3 7) is indicated with a pale-blue colour. Shown also cytochrome b gene (yellow) within the coding region (orange). Since SNP sites are dispersed throughout the whole mitochondrial genome, only 11 SNP sites are shown (red arrows), a panel that enables specifically to distinguish between haplotypes within sub-haplogroup H1 [12] (please find explanation in the text below) B 16189C uznaæ za mitochondrialny odpowiednik sekwencji STR (ang. short tandem repeat) [12]. Po raz pierwszy ca³y genom mitochondrialny (niæ lekka) zosta³ zsekwencjonowany przez Andersona i wspó³pracowników w 1981 r. [2]. Sekwencja ta nazwana Sekwencj¹ Referencyjn¹ z Cambridge CRS (ang. Cambridge Reference Sequence), stanowi standard, do którego odnosi siê wszystkie nowo zsekwencjonowane haplotypy, wymieniaj¹c jedynie pozycjê nukleotydu/ów, którym/i ró ni¹ siê od Sekwencji Referencyjnej, a tak e rodzaj polimorfizmu (insercja, delecja, substytucja). Pozycja nukleotydowa nr 1 (w ³añcuchu ciê kim) CRS, od której rozpoczyna siê numerowanie zosta³a przyjêta arbitralnie. W 1999 r. Andrews i wsp. [3] wprowadzili poprawki do CRS i obecnie obowi¹zuje Poprawiona Sekwencja Referencyjna z Cambridge (ang. Revised Cambridge Reference Sequence). Zjawisko heteroplazmii Populacja cz¹steczek mtdna wystêpuj¹cych u jednego osobnika zwykle jest jednorodna, tzn. ma tak¹ sam¹ sekwencjê, wystêpuje wtedy homoplazmia. Mo na jednak napotkaæ zjawisko heteroplazmii, czyli wystêpowania cz¹steczek mtdna o ró nej sekwencji w jednym organizmie, wynikaj¹ce z ju wy ej wspomnianej wy szej czêstoœci mutacji i ich kumulowania siê ze wzglêdu na niedoskona³e mechanizmy naprawcze. Heteroplazmia mo e byæ dwojakiego rodzaju: mo e polegaæ na punktowej substytucji (zamianie jednego nukleotydu na inny, np. T na C; ryc. 3). Mo e polegaæ równie na zmiennej d³ugoœci ci¹gów jednego nukleotydu, g³ównie cytozyny (tzw. heteroplazmia d³ugoœci) (por. ryc. 2 A, B, C). C AAACCCCCCCCCC TTTGGGGGGGGGG AAACCCCCCCCCCC TTTGGGGGGGGGG Ryc. 2. A Heteroplazmia d³ugoœci w pojedynczym w³osie polegaj¹ca na insercji dodatkowej cytozyny w pozycji W analizowanym w³osie obecne s¹ cz¹steczki mtdna o sekwencji identycznej z sekwencj¹ mtdna w innych tkankach i cz¹steczki zawieraj¹ce insercjê. B sekwencja mtdna z krwi obwodowej. C Schemat powstawania mutacji prowadz¹cych do heteroplazmii d³ugoœci traktów C (10C versus 11C) Fig. 2. A Length heteroplasmy in a single hair due to additional cytosine insertion in position In the sample there are both mtdna sequences with insertion, as well as sequences identical to those found in other tissues. B mtdna sequence from blood. C Example of mutation leading to length heteroplasmy of C-tracts (10C versus 11C) 6 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

3 KREW Ryc. 3. Fragment elektoferogramu pokazuj¹cy heteroplazmiê punktow¹ w regionie HV1. W analizowanym materiale (krew) wspó³wystêpuj¹ zarówno cz¹steczki z cytozyn¹ w pozycji 16093, jak i cz¹steczki z tymin¹ w tej samej pozycji Fig. 3. Partial sequencing electropherogram showing point heteroplasmy in HV1 region. In the analysed material (blood) there are both mtdna sequences with cytosine in position 16093, as well as with thymine in the same position Druga z wymienionych postaci heteroplazmii jest czêstsza, a za jej przyczynê uwa a siê zjawisko œlizgania siê polimerazy replikuj¹cej mtdna. Heteroplazmia d³ugoœci dotyczy najczêœciej obszarów miêdzy nukleotydami w HV1 i w HV2. Heteroplazmia mo e wystêpowaæ na kilku poziomach [4]: na poziomie organelli (mitochondrium), na poziomie komórki, na poziomie tkanki. Heteroplazmiê obserwuje siê najczêœciej we w³osach, ze wzglêdu na niewielk¹ liczbê komórek macierzystych, z których powstaje w³os, co warunkuje jego klonalny charakter. Dlatego miêdzy w³osami jednego cz³owieka mog¹ istnieæ wyraÿne ró - nice w mtdna. Bendall i wsp. [6] opisali zmienne poziomy heteroplazmii w trzonach ró - nych w³osów pochodz¹cych od tego samego cz³owieka. W organizmie w jednej tkance mo e wystêpowaæ 1 rodzaj mtdna (homoplazmia), a w innej tkance ró ne rodzaje mtdna, np. Sullivan [24] stwierdzi³ punktow¹ heteroplazmiê u 5 spoœród 12 w³osów (pochodz¹cych od tego samego dawcy) i homoplazmiê we krwi. W organizmie w jednej tkance mo- e wystêpowaæ wiele rodzajów mtdna (heteroplazmia), a w innej tkance tak- e ró ne rodzaje mtdna, np. Wilson [28] u jednej z badanych rodzin stwierdzi³ wystêpowanie heteroplazmatycznej substytucji we krwi, a tak- e we w³osach telogenowych. Ostatni z wymienionych rodzajów heteroplazmii spotykany jest najrzadziej. Heteroplazmia w obszarze HV1 lub HV2, polegaj¹ca na substytucji dotyczy zwykle 1 pz, zamiany nukleotydów w dwóch lub trzech miejscach wystêpuj¹ ze znacznie mniejsz¹ czêstoœci¹. Mo e ona teoretycznie wyst¹piæ w dowolnej pozycji sekwencji, jednak wyró nia siê tzw. gor¹ce miejsca, gdzie heteroplazmia pojawia siê z wiêksz¹ czêstoœci¹ [9]. Za takie miejsce uznawana jest m.in. pozycja w regionie HV1 [20] zaznaczona na ryc. 3. Wg Huhne a [16] za heteroplazmiê uznaje siê sytuacjê, w której wysokoœæ drugiego piku (reprezentuj¹cego dany nukleotyd na elektroferogramie) przekracza 40% (inne Ÿród³a podaj¹ 25%) [20] wysokoœci piku g³ównego, co oznacza, e stosunek dwóch sekwencji musi byæ jak 1:2,5 (ewentualnie 1:4). Wystêpowanie heteroplazmii komplikuje interpretacjê sekwencjonowania obszarów HV1 i HV2, jednak nie dyskwalifikuje wykorzystania analizy mtdna jako dowodu w s¹dzie. Ponadto zdarza siê, e wystêpowanie charakterystycznej heteroplazmii w dwóch analizowanych i porównywanych próbkach mo e zwiêkszyæ si³ê dowodu w s¹dzie. Metodyka badawcza Techniki stosowane przy analizie mtdna nie odbiegaj¹ znacznie od technik stosowanych dla innych uk³adów polimorficznych. Poniewa podstawow¹ metod¹ analizy mtdna jest niezwykle czu³a reakcja sekwencjonowania, polegaj¹ca na okreœlaniu kolejnoœci zasad w DNA, g³ównym zagro eniem i problemem zwi¹zanym z analiz¹ mtdna jest mo liwoœæ wyst¹pienia kontaminacji i jej monitorowanie. Aby zapobiec artefaktom wynikaj¹cym z zanieczyszczenia matrycy do reakcji sekwencjonowania stosuje siê szczególne œrodki ostro - noœci, m.in. sekwencjonowaniu poddaje siê fragmenty z obu nici mtdna, a reakcjê, jeœli to mo liwe, przeprowadza siê dwukrotnie. Konieczne jest stosowanie kontroli negatywnych i pozytywnych procesu ekstrakcji i amplifikacji, które pozwalaj¹ na monitorowanie zanieczyszczeñ. Mimo to czasem, podczas analizy mtdna, obserwuje siê niski poziom zanieczyszczenia egzogennym DNA, jednak jest to dopuszczalne, poniewa nadal mo liwe jest uzyskanie prawid³owych wyników [4]. Badania prowadzone nad mieszaninami wykaza³y, e jeœli domieszka egzogennego DNA stanowi mniej ni 10% badanej próbki, wówczas nie wp³ynie negatywnie na interpretacjê wyniku [27]. Materia³y, z których najczêœciej izoluje siê mtdna, to wspomniane ju w³osy, koœci i zêby. Pozytywne wyniki badañ uzyskuje siê z fragmentu w³osa o d³ugoœci 1 2 cm, a niektóre laboratoria donosz¹, e wystarczy nawet 3 mm w³osa, jednak zawsze uzale nione jest to od jego œrednicy i stanu [20]. Pierwszym, bardzo wa nym etapem badañ jest oczyszczanie próbek. W³osy myje siê w detergencie/etanolu, a nastêpnie w wodzie, a tak e stosuje siê wstêpny etap trawienia proteinaz¹ w celu usuniêcia zewnêtrznych zanieczyszczeñ. W przypadku koœci i zêbów dodatkowo szlifuje siê ich powierzchniê i poddaje promieniowaniu UV, a potem mia d y na proszek. Ekstrakcjê DNA ca³kowitego z komórki przeprowadza siê za pomoc¹ standardowych procedur, jak metoda fenolowa czy izolacja przy u yciu cheleksu. Nastêpnie wykorzystuj¹c specyficzne startery zaprojektowane dla regionów hiperzmiennych HV1 i HV2 (ewentualnie HV3) przeprowadza siê reakcjê amplifikacji. Przy standardowym podejœciu na ka dy hiperzmienny region przypada jedna para starterów (ryc. 4a). Najczêstsza kombinacja starterów to L15971/L15997 i H16401/H16410 dla HV1 oraz L15/L29 i H 408/H484 dla HV2. Liczba cykli wynosi od 30 do 62. Wiêkszoœæ laboratoriów stosuje PCR bezpoœredni, niektóre tzw. nested PCR. Ten ostatni polega na zastosowaniu 2 rodzajów starterów: pary zewnêtrznej i wewnêtrznej do po- PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05 7

4 wielenia docelowego fragmentu. Do produktu powielonego za pomoc¹ pierwszej pary starterów dodaje siê kolejn¹ parê starterów, których miejsca wi¹zania znajduj¹ siê na krañcach sekwencji docelowej powielonej w pierwszej reakcji produkt tej drugiej reakcji amplifikacji jest krótszy. Metodê tê stosuje siê, aby zwiêkszyæ specyficznoœæ reakcji i iloœæ otrzymywanego produktu. W przypadku podejrzenia, e mtdna mo e byæ bardzo zdegradowane (fragmenty ok. 150 pz), do amplifikacji ka dego z regionów hiperzmiennych stosuje siê po 2 lub 4 (lub wiêcej zale nie od spodziewanego stopnia degradacji) krótkie startery, które amplifikuj¹ fragmenty zachodz¹ce na siebie (ryc. por. 4b i c). Wówczas uzyskiwane produkty amplifikacji maj¹ odpowiednio po: 250 i 140 pz (lub 80 pz) 14. Podejœcie to stosowane jest do próbek kopalnego DNA. Jakoœæ i iloœæ produktów reakcji PCR ocenia siê na 1-procentowym zmodyfikowanej metodzie opracowanej przez Fredericka Sangera w 1977 r. Polimeraza DNA wyd³u a komplementarn¹ do matrycy niæ DNA o kolejne nukleotydy zaczynaj¹c od koñca 3 startera. W mieszaninie reakcyjnej znajduj¹ siê oprócz zwyk³ych deoksynukleotydów, wyznakowane fluorescencyjnie dideoksynukleotydy (ka dy innym barwnikiem), które s¹ pozbawione grupy 3 OH. Przy³¹czenie siê dideoksynukleotydu uniemo - liwia wytworzenie wi¹zania fosfodiestrowego z kolejnym nukleotydem i tym samym dalsze wyd³u anie. W trakcie reakcji sekwencjonowania powstaje populacja fragmentów o ró nej d³ugoœci (ró ni¹cych siê o jedn¹ parê zasad) zakoñczonych wyznakowanymi dideoksynukleotydami, odpowiednio A, C, G lub T. Po oczyszczeniu produktów reakcji sekwencjonowania poddaje siê je rozdzia³owi elektroforetycznemu na p³ytowym lub kapilarnym sekwenatorze, który porz¹dkuje fragmenty pod wzglêdem ich d³ugoœci. Wzbudzone Interpretacja wyników W przypadku gdy sekwencje mtdna ze œladu biologicznego i materia³u porównawczego pobranego od podejrzanego ca³kowicie pokrywaj¹ siê, wówczas interpretujemy to jako zgodnoœæ lub e nie mo na wykluczyæ, i pochodz¹ z tego samego Ÿród³a. Wówczas nale y podaæ, ile razy uzyskany haplotyp pojawia siê w bazie sekwencji mtdna osób niespokrewnionych. Gdy sekwencje ró ni¹ siê nieznacznie, wówczas nale y sprawdziæ, czy ró nice te nie wynikaj¹ z heteroplazmii. W tym celu nale y przeprowadziæ szczegó³ow¹ analizê, jeœli jest to mo liwe, wielu próbek porównawczych np. krwi, nab³onka etc. Laboratorium FBI w Stanach Zjednoczonych analizuje w takich przypadkach do 5 dodatkowych próbek porównawczych [10]. Ze wzglêdu na czêst¹ heteroplazmiê w³osów fragmenty w³osów ³¹czy siê, tworz¹c 1 wspóln¹ próbkê, z której izoluje siê a) HV1: HV2: matryca mtdna b) c) fragmenty 250 pz fragmenty 140 pz Ryc. 4. Rysunek obrazuj¹cy trzy ró ne sposoby zaprojektowania reakcji amplifikacji regionów HV1/HV2 w zale noœci od spodziewanego stopnia degradacji DNA mitochondrialnego; a) tradycyjna amplifikacja, w której z regionu HV1 i HV2 powstaje po jednym produkcie; b) po u yciu 2 par starterów do ka dego z regionów HV1/HV2, powstaj¹ po dwa produkty; c) po u yciu 4 par starterów do ka dego z regionów HV1/HV2, powstaj¹ po cztery produkty Fig. 4. Three different strategies of HV1/HV2 regions' amplification depending on the estimated mtdna degradation state; a) standard strategy produces one product from each region; b) application of 2 primer pairs for both HV1 and HV2 results in two products for each one; c) application of 4 primer pairs for both HV1 and HV2 results in four products for each one elu agarozowym, a nastêpnie poddaje siê je oczyszczaniu, aby pozbyæ siê starterów. Kolejno przeprowadza siê reakcjê sekwencjonowania amplifikowanych regionów hiperzmiennych, z regu³y z u yciem takich samych starterów, jak do reakcji PCR. Sekwencjonowanie opiera siê na œwiat³em laserowym fluorescencyjne barwniki emituj¹ promieniowanie o czterech odmiennych d³ugoœciach fali, co pozwala odró niæ od siebie odpowiednie nukleotydy: A, C, G i T. Ostatecznie uzyskujemy sekwencjê analizowanych regionów w postaci chromatogramu (ryc. 2 A, B; 3). materia³ genetyczny. Jeœli porównywane sekwencje ró ni¹ siê choæ jednym nukleotydem i nie wynika to z heteroplazmii, wówczas wynik jest nierozstrzygaj¹cy. W przypadku heteroplazmii d³ugoœci homopolimerycznych traktów nukleotydowych trudne jest jedno- 8 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

5 znaczne okreœlenie liczby nukleotydów w takim ci¹gu, i dlatego do celów interpretacyjnych wczeœniej zak³ada siê, e ci¹g obejmuje okreœlon¹ liczbê zasad. Jeœli dwie porównywane sekwencje mtdna wykazuj¹ tak¹ sam¹ heteroplazmiê wówczas interpretujemy taki przypadek jako zgodnoœæ lub e nie mo na wykluczyæ, i pochodz¹ z tego samego Ÿród³a. Jeœli jedna z próbek jest homoplazmatyczna, a druga heteroplazmatyczna, ale jedna z sekwencji próbki heteroplazmatycznej jest taka sama jak sekwencji homoplazmatycznej, wówczas b³êdem by³oby orzeczenie wykluczenia. Jeœli obie próbki wydaj¹ siê homoplazmatyczne, a ró ni¹ siê nieznacznie (np. w jednej pozycji nukleotydowej), konieczna jest powtórna analiza [10]. Bazy sekwencji DNA mitochondrialnego Na œwiecie istnieje kilka ogólnie dostêpnych baz danych sekwencji mtdna, m.in. populacyjna baza stworzona przez SWGDAM (Grupa Robocza ds. Metod Analizy DNA). Dzia³a ona w oparciu o oprogramowanie MitoSearch, opracowane przez FBI, pozwalaj¹ce na przeszukiwanie ca³ego regionu kontrolnego mtdna, identyfikacjê oraz obliczenie ile razy konkretna sekwencja pojawia siê w bazie danych. Od 2001 r. FBI prowadzi Program Narodowej Bazy Danych DNA Osób Zaginionych (CO- DISmt). Celem projektu jest gromadzenie profili mitochondrialnego DNA niezidentyfikowanych szcz¹tków ludzkich i dowodów rzeczowych przydatnych do ich identyfikacji, jak równie materia³u referencyjnego od krewnych (w linii matczynej) osób zaginionych [8]. Inna baza elektroniczna mtdna (Group s mitochondrial DNA population database Project EMPOP) powsta³a z inicjatywy ED- NAP (Europejskiej Grupy Oznaczania Profili DNA). Dane nap³ywaj¹ z laboratoriów kryminalistycznych z ró - nych pañstw. W 2003 roku przeprowadzono test analizy DNA mitochondrialnego, w którym wziê³o udzia³ 21 laboratoriów europejskich i 2 z kontynentu amerykañskiego. Celem projektu by³o stwierdzenie, czy laboratoria stosuj¹ce ró ne metody i strategie analizy uzyskaj¹ jednolite i zgodne wyniki, a tak e ocena Ÿróde³ mo liwych b³êdów. Analiza projektu wykaza³a du ¹ zgodnoœæ co do uzyskiwanych wyników oraz znikom¹ liczbê b³êdów i pos³u y³a do opracowania wytycznych, w oparciu o które konstruowana jest baza mtdna wysokiej jakoœci [2]. Bazy populacyjne umo liwiaj¹ przyporz¹dkowanie haplotypów do okreœlonych haplogrup, czyli zbiorów haplotypów charakteryzuj¹cych siê wspólnymi polimorfizmami w obrêbie ca³ego genomu mitochondrialnego. Np. ok. 99% przebadanych haplotypów mtdna dla rasy kaukaskiej (w Europie i Stanach Zjednoczonych) mo na zaklasyfikowaæ do 10 g³ównych haplogrup: H, I, J, K, M, T, U, V, W i X. Najczêstsz¹ haplogrup¹ jest grupa H, która wg danych SWGDAM wystêpuje z czêstoœci¹ 45,7%. Kolejne czêsto wystêpuj¹ce haplogrupy to: U (15,6%), T (10,5%), J (10%), i K (8,9%) [9]. W obrêbie haplogrup mo na dodatkowo wyró niæ subhaplogrupy, np. haplogrupê H mo na podzieliæ na 7 subhaplogrup: H1-H7. O przynale noœci do haplogrupy czy subhaplogrupy decyduje podobieñstwo sekwencji haplotypów, które wskazuje na ich wspólne pochodzenie. Najwiêkszym problemem baz danych mtdna jest jak na razie niewielka liczba zgromadzonych haplotypów, co mo e prowadziæ do uzyskiwania zawy onych wartoœci czêstoœci danego haplotypu w populacji. W miarê nap³ywania nowych haplotypów liczba sekwencji, które pojawiaj¹ siê w bazie tylko raz bêdzie siê zmniejszaæ. Stworzenie bazy obejmuj¹cej reprezentatywn¹ i znacz¹c¹ grupê haplotypów dla danej populacji jest trudniejsze i wymaga wiêkszej liczby danych ni w przypadku markerów j¹drowych. Struktura populacji mtdna jest odmienna od populacji uk³adów autosomalnych STR charakteryzuje siê mniej równomiernym rozk³adem, co mo e wynikaæ ze wspomnianego ju dziedziczenia odmatczynego, braku rekombinacji, czy tzw. efektu za³o yciela. Zastosowanie Analizê mtdna po raz pierwszy wykorzystano w 1996 r. w postêpowaniu s¹dowym w sprawie Paula Ware a oskar onego o dokonanie gwa³tu i morderstwa 4-letniej dziewczynki [13]. Paul Ware mieszkaniec stanu Tennessee (USA) i opiekun dziewczynki zosta³ znaleziony nietrzeÿwy obok cia³a dziewczynki. Jedynymi œladami z miejsca zbrodni by- ³o kilka w³osów znalezionych w ³ó ku i jeden ujawniony w krtani dziewczynki. Analiza porównawcza mitochondrialnego DNA z wybranych w³osów i materia³u porównawczego (œlina podejrzanego) wykaza³a zgodnoœæ sekwencji, natomiast sekwencja mitochondrialnego DNA z krwi ofiary by³a odmienna. W bazie danych mtdna FBI (obejmuj¹cej wówczas 742 haplotypy) sekwencja mtdna od Paula Ware a nie wyst¹pi³a ani razu. Oskar- ony zosta³ uznany za winnego zarzucanego mu czynu. Dziedziczenie odmatczyne i brak rekombinacji oznaczaj¹ce, e krewni w linii matczynej maj¹ tak¹ sam¹ sekwencjê u³atwia identyfikacjê osób zaginionych b¹dÿ zw³ok lub szcz¹tków N.N., polegaj¹c¹ na porównaniu sekwencji mtdna wyizolowanego ze œladów biologicznych z próbkami referencyjnymi od krewnych w linii matczynej. Opracowanie metod analizy mtdna stwarza szansê na rozwik³anie wielu aktualnie prowadzonych spraw kryminalnych, ale tak e tych, które w przesz³oœci nie doczeka³y siê wyjaœnienia. Przyk³adem mo e byæ zaginiêcie 61-letniego pacjenta w 1979 r. w USA, który oddali³ siê z oœrodka opieki medycznej dla weteranów [8]. Mimo intensywnych poszukiwañ mê czyzny nie uda³o siê odnaleÿæ. Ponad 10 lat póÿniej w pobli u oœrodka pies przypadkowo wykopa³ czaszkê ludzk¹ i sprawê przekazano do laboratorium FBI. W 1999 r. analiza mitochondrialnego DNA wykaza³a zgodnoœæ profilu uzyskanego z czaszki z sekwencj¹ pochodz¹c¹ od brata zaginionego mê czyzny. Sprawê zamkniêto, og³aszaj¹c, i odnalezione szcz¹tki nale ¹ do zaginio- PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05 9

6 A Ponadto analiza mtdna stanowi cenne Ÿród³o informacji w badaniach antropologicznych i ewolucyjnych. Po raz pierwszy kopalne mtdna wyizolowano w 1977 r. ze szcz¹tków cz³owieka neandertalskiego, odkrytych w jaskini Feldhofer w Niemczech [21]. W kolejnych latach podczas prac wykopaliskowych w jaskini Mezmaiskaya na Kaukazie zosta³y odkryte szcz¹tki dziecka neandertalskiego. Z ebra wyizolowano mtdna, a nastêpnie zsekwencjonowano region HV1 przy u yciu specyficznych starterów. Porównanie uzyskanej sekwencji z CRS wykaza³o 22 substytucje i 1 insercjê, podobne wyniki uzyskano przy porównaniu ze wspó³czesnymi sekwencjami azjatyckimi i afrykañskimi, co sugerowa³o, e pochodz¹ce od neandertalczyka sekwencje nie s¹ blisko spokrewnione ze wspó³czesnym mtdna ludzkim i tworz¹ odrêbn¹ grupê. Z kolei przy porównaniu mtdna pobranego ze szcz¹tków z Mezmaiskaya i z Feldhofer stwierdzono jedynie 12 ró nic (substytucji), co sugerowa³o, e sekwencje te s¹ bli ej spokrewnione ze sob¹ ni ze wspó³czesnymi sekwencjami mtdna. Kolejny kopalny mtd- B C NA wyizolowany ze szcz¹tków cz³owieka neandertalskiego w jaskini Vindija w Chorwacji ró ni³ siê w 6 pozycjach nukleotydowych (substytucje) od sekwencji mtdna pobranego ze szcz¹tków z Mezmaiskaya i Feldhofer, co wskazywa³o na jeszcze bli sze pokrewieñstwo. Trzeba zaznaczyæ, e ró nice miêdzy sekwencjami wspó³czesnego mtdna ludzkiego wynosz¹ œrednio ok. 5 substytucji. Analiza mtdna zosta³a tak e wykorzystana do rozwi¹zania g³oœnej sprawy domniemanych szcz¹tków cara Miko³aja II z dynastii Romanowów [17]. Odnalezione fragmenty koœci licz¹ce ponad 70 lat porównano z materia³em referencyjnym pobranym od yj¹cych potomków rodziny carskiej. Sekwencja uzyskana od Filipa, ksiêcia Edynburga, by³a zgodna z sekwencj¹ uzyskan¹ w trakcie analizy domniemanych szcz¹tków carycy i jej dzieci. Podobnie sekwencje dwojga z yj¹cych krewnych cara Miko³aja wykazywa³y zgodnoœæ z sekwencj¹ uzyskan¹ w trakcie analizy jego domniemanych szcz¹tków, z wyj¹tkiem ró nicy dotycz¹cej jednej zasady. By³ to pierwszy odnotowany w medycynie s¹dowej przypadek heteroplazmii, ujawniony podczas analizy prowadzonej przez Forensic Science Service w Wielkiej Brytanii w 1994 r., co przy ówczesnym niewielkim zakresie wiedzy na temat zjawiska heteroplazmii zasia³o w¹tpliwoœci co do wiarygodnoœci uzyskanych wyników. Jednak niezale na analiza sekwencji mitochondrialnej korzeń trzon Ryc. 5. Typowe œlady biologiczne, z których izoluje siê mtdna. A. Koœci czaszki ludzkiej wraz z zêbami. B. Fragment koœci przedramienia i fragmenty tkanki chrzêstnej, Fot. Andrzej Chmiel, C. W³os telogenowy. Zaznaczono trzon i korzeñ. Zdjêcie mikroskopowe, powiêksz. 20x, Fot. K. Gawêda-Walerych Fig. 5. Standard materials used in mtdna analysis. A. Human skull bones with teeth, B. Arm bone fragment with cartilage tissue fragments, Photo: Andrzej Chmiel, C. Telogen hair: root and hair shaft shown. Microscopic slide, magnification 20x, Photo: K. Gawêda-Walerych nego pacjenta, i przekazano je rodzinie w celu pochówku. W innym nierozstrzygniêtym przypadku, dotycz¹cym morderstwa, badanie mtdna dwóch w³osów, których wczeœniejsza analiza mikroskopowa sugerowa³a, e pochodz¹ od 1 osoby, wykaza³a, e w rzeczywistoœci pochodz¹ one od 2 ró nych osób. W kolejnej sprawie analiza mtdna ze szcz¹tków ludzkich (po porównaniu z profilem domniemanego rodzeñstwa) wykluczy³a pokrewieñstwo, a tym samym zak³adan¹ wczeœniej to samoœæ tych szcz¹tków [8]. Technologiê sekwencjonowania mtdna wykorzystano ju wielokrotnie m.in. do identyfikacji szcz¹tków cia³ ofiar wojny w Wietnamie [15], a tak e ofiar katastrof masowych takich, jak atak terrorystyczny na World Trade Center 11 wrzeœnia 2001 r. [7]. W tym ostatnim przypadku sekwencjonowanie mtdna przeprowadzi³a firma Celera Genomics (znana z prac nad sekwencjonowaniem ludzkiego genomu). Jeœli chodzi o rutynowe badania z wykorzystaniem mtdna stanowi¹ one czêsto ostatni¹ deskê ratunku podczas analizy œladów biologicznych, w których ze wzglêdu na wysok¹ degradacjê DNA j¹drowego z powodu wieku lub specyficznego charakteru materia³u, analiza uk³adów STR zawodzi. Do materia³ów takich nale ¹ w³osy (telogenowe lub same trzony), a tak e zêby i koœci (ryc. 5). ze ekshumowanych szcz¹tków brata cara Georgija Romanowa, przeprowadzona w Armed Forces DNA Identification Laboratory w Stanach, wykaza³a wystêpowanie takiej samej heteroplazmii, co rozwia³o w¹tpliwoœci i potwierdzi³o hipotezê, e badane szcz¹tki nale ¹ do cara Miko³aja II. Analiza mtdna odgrywa równie rolê w medycynie klinicznej. Wyró - 10 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

7 niono wiele chorób wywo³anych mutacjami mtdna. Dotykaj¹ one g³ównie tkanek nerwowej i miêœniowej, nerek i tkanki wytwarzaj¹cej hormony, których funkcjonowanie w du ym stopniu zale y od prawid³owo dzia³aj¹cych mitochondriów. S¹ to choroby daj¹ce bardzo heterogenne objawy, g³ównie neuropatologie (g³uchota, œlepota) i miopatologie (degeneracja i parali miêœni, padaczki, ataksje). Zmiany w mitochondrialnym DNA maj¹ zwi¹zek równie z niektórymi formami cukrzycy. Nadal toczy siê dyskusja odnoœnie do roli zmian w mtdna w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona czy Alzheimera. Wykazano równie, e wystêpowanie okreœlonych mutacji/polimorfizmów mo e byæ zwi¹zane z wiêkszym b¹dÿ mniejszym ryzykiem zapadniêcia na dan¹ chorobê, np. posiadanie haplotypu przynale ¹cego do haplogrupy U zwiêksza u mê - czyzn ryzyko zapadniêcia na chorobê Alzheimera w porównaniu z najbardziej popularn¹ haplogrup¹ H. Tymczasem przynale noœæ do tej samej haplogrupy u kobiet zwi¹zana jest ze zmniejszeniem ryzyka zachorowania [26]. Mitochondria wi¹ ¹ siê równie z procesem starzenia, który wg mitochondrialnej teorii starzenia wynika z akumulacji uszkodzeñ w tych organellach w trakcie ycia osobniczego prowadz¹c do os³abienia i upoœledzenia funkcji organizmu. Ostatnio zyskuje na znaczeniu analiza mtdna ze œladów pochodzenia zwierzêcego (g³ównie sierœci zwierz¹t domowych), gdy umo liwia okreœlenie ich przynale noœci gatunkowej. Metoda ta jest przydatna w przypadku: nielegalnego handlu produktami pochodz¹cymi od zwierz¹t zagro onych wyginiêciem, k³usownictwem czy wypadkami drogowymi, w których uczestnicz¹ zwierzêta. Do okreœlenia przynale noœci gatunkowej wykorzystywany jest gen koduj¹cy cytochrom b (ryc. 1) [23]. Sekwencja nukleotydowa tego genu jest specyficzna dla danego gatunku. Jedna para starterów komplementarnych do konserwatywnych regionów flankuj¹cych gen cytochromu b pozwala na amplifikowanie tego genu z materia³u pochodz¹cego od ró - nych gatunków zwierz¹t. Produkt reakcji jest sekwencjonowany, a uzyskan¹ sekwencjê porównuje siê z zawartoœci¹ bazy nukleotydowej, np. GenBank [29], która obejmuje znane sekwencje mtdna, z wykorzystaniem narzêdzia internetowego BLAST [30]. Metoda ta umo liwi³a wykazanie, e np. sprzedawcy produktów u ywanych w chiñskiej medycynie tradycyjnej czêsto oszukuj¹ i zamiast koœci tygrysa czy rogu nosoro ca klient nabywa produkt, który w rzeczywistoœci pochodzi od krowy lub œwini [19]. Zwiêkszanie si³y dyskryminacji analizy mitochondrialnego DNA poszukiwanie nowych metod i markerów Badania populacyjne wykaza³y, e rozk³ad czêstoœci haplotypów mtdna jest nierównomierny: np. ponad 50% populacji kaukaskiej charakteryzuje siê unikatowym haplotypem HV1/HV2 (pojawiaj¹cym siê 1 raz w bazie danych), podczas gdy najczêstszy haplotyp HV1/HV2 wystêpuje u ok. 7% populacji. I w³aœnie u tych 7% najbardziej manifestuje siê niska wartoœæ si³y dyskryminacji [12]. Oznacza to, e jeœli przeprowadzamy standardowe sekwencjonowanie jedynie regionów HV1/HV2, wówczas mo e siê zdarzyæ, e haplotypy HV1/HV2 podejrzanego i ofiary s¹ identyczne. Budowle i wsp. [11] obliczyli, e prawdopodobieñstwo przypadkowej zgodnoœci (ang. Random Match Probability) dla regionów HV1/HV2 wynosi ok. 0,005 0,025. Dlatego ostatnio wiele wysi³ku poœwiêca siê na opracowanie metod, które pozwoli³yby na rozró nianie osób maj¹cych taki sam haplotyp HV1/HV2. Sekwencjonowanie ca³ej cz¹steczki mtdna na pewno rozwi¹za³oby powy szy problem, gdy niezmiernie rzadko zdarza siê, eby dwie osoby mia³y identyczn¹ sekwencjê mtdna, jednak jest to bardzo czasoch³onne i kosztowne. Dalsze ró nicowanie œladów przez analizê regionu HV3 równie mo e byæ nierozstrzygaj¹ce. Du ¹ nadziejê pok³ada siê w analizie dodatkowych markerów SNP (ang. single nucleotide polymorphism polimorfizm pojedynczego nukleotydu). Powstawanie SNP wynika z mutacji punktowych prowadz¹cych do zamiany pojedynczych nukleotydów na inne w sekwencji DNA. Wyniki sekwencjonowania ca³ego genomu mitochondrialnego ujawni³y wystêpowanie wielu miejsc SNP, które mog¹ pomóc w sklasyfikowaniu badanych próbek do jednej z haplogrup (okreœlone SNP decyduj¹ o przynale noœci do konkretnej haplogrupy, a w rezultacie do subhaplogrupy). Coble i wsp. [12] na podstawie zsekwencjonowania ca³ej cz¹steczki mtdna u 241 osób wyró nili 209 ró - nych haplotypów, wœród nich 18 haplotypów HV1/HV2. Haplotypy te wchodz¹ w sk³ad 5 haplogrup rasy kaukaskiej: H, J, T, V i K. Klasyfikacja ta umo liwi³a znalezienie takiej kombinacji miejsc SNP, która by³aby szczególnie przydatna w praktyce kryminalistycznej i pos³u y³aby do stworzenia zestawów pozwalaj¹cych na rozró nienie, w trakcie 1 reakcji multipleksowej, takich samych haplotypów HV1/HV2 w obrêbie konkretnej haplogrupy lub subhaplogrupy. Kierowano siê nastêpuj¹cymi kryteriami: 1. Wybrane miejsca SNP powinny byæ neutralne z punktu widzenia chorób genetycznych (ogólnie fenotypu); 2. Wybrane miejsca SNP powinny charakteryzowaæ siê du ¹ zmiennoœci¹ w populacji; 3. Wybrane miejsca SNP powinny siê wzajemnie uzupe³niaæ (w kwestii si³y dyskryminacji), tak, aby jak najmniejsza liczba miejsc SNP dawa³a najwy sze wartoœci si³y dyskryminacji. Kieruj¹c siê powy szymi kryteriami badacze wybrali miejsca SNP zarówno z regionu kontrolnego (poza obszarem HV1/HV2), jak i regionu koduj¹cego i po³¹czyli je w grupy po 7 11 miejsc. Na ryc. 1 zaznaczono jeden z takich zestawów, obejmuj¹cy 11 miejsc SNP do specyficznego rozró niania haplotypów w obrêbie subhaplogrupy H1. Skonstruowane w powy szy sposób zestawy multipleksowe markerów SNP pozwalaj¹ PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05 11

8 na szybkie przeszukiwanie sekwencji mtdna w celu zawê enia krêgu podejrzanych lub liczby œladów wybieranych do dalszej analizy (sekwencjonowania), gdy konkretna sprawa obejmuje du ¹ liczbê dowodów rzeczowych. W ci¹gu ostatnich lat powsta³y nowe metody analizy markerów SNP: SSCP, mikromacierze DNA, dyskryminacja alleliczna przy u yciu reakcji PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR), czy rekcja minisekwencjonowania. Ostatnia z wymienionych metod jest z powodzeniem stosowana i polega na wykonaniu multipleksowej reakcji PCR, w której starter jest tak zaprojektowany, e hybrydyzuje (przy³¹cza siê) bezpoœrednio tu przy badanym miejscu SNP, a nastêpnie jest wyd³u- any o 1 nukleotyd przez fluorescencyjnie wyznakowany dideoksynukleotyd (ryc. 6). Dodanie dideoksynukleotydu uniemo liwia dalsze wyd³u anie ³añcucha DNA przez polimerazê. Wyznakowane fluorescencyjnie produkty amplifikacji s¹ nastêpnie rozdzielane i wizualizowane na sekwenatorze. Na rynku dostêpne s¹ komercyjne zestawy np. SNaPshot (Applied Biosystems) pozwalaj¹ce na jednoczesn¹ analizê 10 markerów SNP lub zestawy multipleksowe opracowane przez laboratoria kryminalistyczne obejmuj¹ce 17 SNP. Podsumowanie Ogonek oligonukleotydowy aby zróżnicować ruchliwość elektroforetyczną Od pocz¹tku lat 90. analiza mitochondrialnego DNA stanowi cenne narzêdzie wykorzystywane w badaniach kryminalistycznych. Pozwala ona na uzyskanie wyników z materia- ³ów zniszczonych dzia³aniem czasu, czynników fizycznych i biologicznych, próbek bardzo zdegradowanych takich, jak zwêglone szcz¹tki ludzkie i zwierzêce, w³osy, koœci, zêby, itp. Obecnie nastêpuje szybki rozwój technik, które umo liwi¹ analizê mtdna na szersz¹ skalê. Oprócz standardowej analizy sekwencjonowania regionów HV1/HV2 i HV3, dodatkowa analiza wybranych przez badaczy markerów SNP obecnych w ca³ej cz¹steczce pozwoli na zwiêkszenie si³y dyskryminacji, a tym samym wiêksz¹ przydatnoœæ i znaczenie analizy mtdna w kryminalistyce. Poszerzanie baz danych mtdna o nowe profile pozwoli na precyzyjniejsze opracowanie statystyczne uzyskiwanych wyników. Starter oligonukleotydowy: pz Amplifikowana matryca DNA W mitochondrialnym DNA tkwi du- y potencja³, a mo liwoœci zastosowañ obejmuj¹ coraz wiêcej dziedzin. Nale y jednak równie pamiêtaæ o ograniczeniach, jakie narzuca specyfika analizy mitochondrialnego DNA, zwi¹zana ze sposobem dziedziczenia oraz struktur¹ populacji. BIBLIOGRAFIA Fluorescencyjnie znakowane ddntp (dideoksynukleotydy) z polimerazą SNP Ryc. 6. Metoda minisekwencjonowania: detekcja SNP w regionie koduj¹cym mtdna. Starter SNP jest wyd³u any o jedn¹ parê zasad [25]. Fig. 6. Minisequencing method: SNP detection within mtdna coding region. Specific SNP primer is elongated with one fluorescently labeled base. [25]. 1. Alberts B.: Molecular biology of the cell, the genomes of mitochondria and chloroplasts, 1994, s Anderson S., Bankier A., Barrell B., de Bruijn M., Coulson A., Drouin J., Eperon I., Nierlich D., Roe B., Sanger F., Schreier P., Smith A., Staden R., Young I.: Sequence and organization of the human mitochondrial genome, Nature 1981, nr 290, s Andrews R., Kubacka I., Chinnery P., Lightowlers R., Turnbull D., Howell N.: Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA, Nat. Genet. 1999, nr 23, s Bar W., Brinkmann B., Budowle B., Carracedo A., Gill P., Holland M., Lincoln P.J., Mayr W., Morling N., Olaisen B., Schneider P.M., Tully G., Wilson M.: DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing, Int. J. Legal. Med. 2000, nr 113, s Bartnik E.: Choroby dziedziczne II. Defekt genomu mitochondrialnego. W: Biologia molekularna w medycynie, Elementy genetyki klinicznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001, s Bendall K.E., Macaulay V.A., Sykes B.C.: Variable levels of a heteroplasmic point mutation in individual hair roots, Am. J. Hum. Genet. 1997, nr 61, s Brenner C.H., Weir B.S.: Issues and strategies in the DNA identification of World Trade Center victims, Theor Popul Biol 2003, nr 63, s Bridgeford A.N., Wraxall B.G.D.: Mitochondrial DNA analysis: casework examples and database compilation, California Association of Criminalists 97 th Semi-annual Seminar, Budowle B., Allard M., Wilson M., Chakraborty R.: Forensics and mitochondrial DNA: applications, debates, and foundations, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2003, nr 4, s Budowle B., DiZinno J.A., Wilson M.R.: Interpretation guidelines for mitochondrial DNA sequencing, mega.com/geneticidproc/ussymp10- proc//content/37budowle.pdf 11. Budowle B., Wilson M., DiZinno J., Stauffer C., Fasano M., Holland M., Monson K.: Mitochondrial DNA regions HVI and HVII population data, Forensic Science International 1999, nr 103, s Coble M.D., Just R.S., O'Callaghan J.E., Letmanyi I.H., Peterson C.T., Irwin J.A., Parsons T.J.: Single nucleotide polymorphisms over the entire mtdna genome that increase the power of foren- 12 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

9 sic testing in Caucasians, Int. J. Legal Med. 2004, nr 118, s Davis C.L.: Mitochondrial DNA: State of Tennessee v. Paul Ware Profiles in DNA 1998, nr 103, s. 6 7, promega. com//profiles/103/103_06.html. 14. Gabriel M.N., Huffine E.F., Ryan J.H., Holland M.M., Parsons T.J.: Improved mtdna sequence analysis of forensic remains using a mini-primer set amplification strategy, J. Forensic Sci. 2001, nr 46, s Holland M.M., Fisher D.L., Mitchell L.G., Rodriquez W.C., Canik J.J., Merril C.R., Weedn V.W.: Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remains: identification of remains from the Vietnam War, J. Forensic Sci. 1993, nr 38, s Huhne J., Pfeiffer H., Waterkamp K., Brinkmann K.: Mitochondrial DNA in human hair shafts-existence of intra-individual differences?, Int. J. Legal Med. 1999, nr 112, s Ivanov P.L., Wadhams M.J., Roby R.K., Holland M.M., Weedn V.W., Parsons T.J.: Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the Grand Duke of Russia Georgij Romanov establishes the authenticity of the remains of Tsar Nicholas II, Nat. Genet. 1996, nr 12, s Isenberg A., Moore J.: Mitochondrial DNA analysis at the FBI laboratory, Forensic Science Communications 1999, nr 1, backissu/july1999/dnalist.htm 19. Jobling M.A., Gill P.: Encoded evidence: DNA in forensic analysis, Nat. Rev. Genet. 2004, nr 5, s Melton T., Nelson K.: Forensic mitochondrial DNA analysis: two years of commercial casework experience in the United States, Croat. Med. J. 2001, nr 42, s Ovchinnikov I., Goodwin W.: The Isolation and Identification of Neanderthal Mitochondrial DNA Profiles in DNA 2000, nr 402, s. 9 11, Parson W., Brandstatter A., Alonso A., Brandt N., Brinkmann B., Carracedo A., Corach D., Froment O., Furac I., Grzybowski T., Hedberg K., Keyser-Tracqui C., Kupiec T., Lutz-Bonengel S., Mevag B., Ploski R., Schmitter H., Schneider P., Syndercombe- -Court D., Sorensen E., Thew H., Tully G., Scheithauer R.: The EDNAP mitochondrial DNA population database (EM- POP) collaborative exercises: organisation, results and perspectives, Forensic Sci. Int. 2004, nr 139, s Parson W., Pegoraro K., Niederstatter H., Foger M., Steinlechner M.: Species identification by means of the cytochrome b gene, Int. J. Legal Med. 2000, nr 114, s Sullivan K., Alliston-Greiner R., Archampong F., Piercy R., Tully G., Gill P., Lloyd-Davies C.: A single difference in mtdna control region sequence observed between hairshaft and reference samples from a single donor, Proceeding from the seventh international symposium on human identification, Promega, Madison, 1996, s Vallone P., Coble M., Letmanyi I., Parsons T., Butler J.: Multiplex Detection of 10 SNPs Located in the coding region of the mitochondrial genome, cstl.nist.gov/biotech/strbase/pub_pres// ValloneASHGposter2002.pdf 26. Van der Walt J.M., Dementieva Y.A., Martin E.R., Scott W.K., Nicodemus K.K., Kroner C.C., Welsh-Bohmer K.A., Saunders A.M., Roses A.D., Small G.W., Schmechel D.E., Murali Doraiswamy P., Gilbert J.R., Haines J.L., Vance J.M., Pericak-Vance M.A.: Analysis of European mitochondrial haplogroups with Alzheimer disease risk, Neurosci. Lett. 2004, nr 365, s Wilson M., Polanskey D., Butler J., DiZinno J., Replogle J., Budowle B.: Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts, Biotechniques 1995, nr 18, s Wilson M.R., Polanskey D., Replogle J., DiZinno J.A., Budowle B.: A family exhibiting heteroplasmy in the human mitochondrial DNA control region reveals both somatic mosaicism and pronounced segregation of mitotypes, Hum. Genet. 1997, nr 100, s nk/index.html W Bibliotece CLK KGP mo na skorzystaæ z nastêpuj¹cych czasopism zagranicznych Archiv für Kryminologie Computers and Security Fingerprint Whorld Forensic Science International Forensic Science Review Foto Magazin Guns and Ammo International Journal of Legal Medicine Internationales Waffen-Magazin Visier International Defense Review Journal of Forensic Identification Journal of Forensic Sciences Kriminalistik Masterruzhie Science and Justice Verkehrsunfall und Fahrzeugtechnik Wirtschaftsschutz und Sicherheitstechnik Biblioteka czynna jest codziennie w godz , tel PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05 13