SESJA 6 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA PLAKATY

Transkrypt

1 SESJA 6 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA PLAKATY

2 152 SESJA 6 PLAKATY P06-01 AKTYWNOŚĆ BŁONOWA KWASU MERULINOWEGO Maria Stasiuk, Arkadiusz Kozubek Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Wrocławskiego, Zakład Lipidów i Liposomów, Wrocław Kwas merulinowy zaliczany jest do lipidów rezorcynolowych. Występują one głownie u szeregu roślin, mikroorganizmów oraz grzybów [Kozubek A., Tyman J. H. P. (1999), Chem. Rev. 99, 1, Giannetti B. M., Stegich W., Quack W., Anke T., Oberwinkler F. (1978), Z. Naturforsch 33c, 807 ]. Związki te wykazują charakter amfifilowy [ Kozubek A. (1995), Acta Biochim. Polon. 42, 247]. Lipidy rezorcynolowe wykazują powinowactwo do dwuwarstwy fosfolipidowej, wbudowanie cząsteczek tych związków do dwuwarstwy skutkuje wzrostem jej przepuszczalności dla małych nieelektrolitów i kationów [Kozubek A., Demel R., A. (1980), Biochim. Biophys. Acta 603, 220]. Badania nad właściwościami biologicznymi kwasu merulinowego wykazały, że hamuje on całkowicie syntezędna, RNA oraz białka w komórkach Bacillus brevis [Giannetti B. M., Stegich W., Quack W., Anke T., Oberwinkler F. (1978), Z. Naturforsch 33c, 807]. Wyniki przedstawianych doświadczeń dowodzą, że kwas merulinowy wykazuje aktywność hemolityczną w stosunku do erytrocytów owczych, zarówno w przypadku, kiedy związek ten znajduje sięw środowisku w formie wolnej, jak i wbudowany w błonęliposomową. Aktywność hemolityczna liposomowej i wolnej formy kwasu merulinowego zostaje całkowicie lub częściowo zahamowana przez obecność w środowisku odpowiednio albumin (np. BSA) lub kationów metali dwuwartościowych. W stężeniach sublitycznych kwas merulinowy wykazuje zdolność do obniżania poziomu hemolizy hypotonicznej. Dodatkowo wykazano, że kwas merulinowy wywiera istotny wpływ na zmianęładunku powierzchniowego błony oraz wykazuje zdolność do modulowanie aktywności acetylocholinesterazy błony erytrocytów owczych. P06-02 WPŁYW SFINGOZYNY NA AKTYWNOŚĆ FOSFOLIPAZY D W KOMÓKACH GLEJAKA C6 Marta Bobeszko A, Anna Dygas A, Irena Nalepa B, Jolanta Barańska A A: Instytut Biologii Doświadczalnej, PAN, Warszawa B: Instytut Farmakologii, PAN Celem pracy było zbadanie czy sfingozyna (inhibitor kinazy białkowej C, PKC) aktywuje fosfolipazęd (PLD) w procesie zależnym od aktywności PKC i porównanie działania tego związku z innymi inhibitorami tego enzymu (imipramina, propranolol i GF109203X). Badania prowadzono na glejaku C6. Komórki inkubowano z radioaktywnym [ 14 C]kwasem palmitynowym a następnie oznaczano poziom [ 14 C]fosfatydyloetanolu, produktu reakcji transfosfatydylacji, którą PLD prowadzi specyficznie w obecności etanolu. Stwierdzono, że ester forbolu (TPA) znany aktywator PKC, stymuluje aktywność PLD w glejaku C6. Efekt ten był całkowicie zniesiony przez GF109203X, specyficzny inhibitor PKC. GF109203X nie wpływał natomiast na poziom aktywacji PLD wywołanej przez sfingozynę, imipraminę i propranolol. Imipramina czy propranolol podane jednocześnie z TPA blokowały jego stymulujący efekt. Jednoczesne podanie TPA (w stałym stężeniu) i sfingozyny (w rosnącym) sumowały stymulującą aktywność PLD wywołaną przez te związki. W komórkach uprzepuszczalnionych digitoniną stymulujące działanie sfingozyny było nieznaczne. W tych warunkach doświadczalnych sfingozyna obniżała stymulujący wpływ TPA na aktywność enzymu. Otrzymane wyniki sugerują, że w glejaku C6 sfingozyna jest nie tylko związana z inną drogą aktywacji PLD niż aktywacja przez TPA, lecz także zachodzi w innym przedziale komórkowym. Przypuszczamy, że proces ten zachodzić może w wydzielonych mikrodomenach błony plazmatycznej szczególnie bogatych w cholesterol (kaweole?). Badania finansowane z grantu KBN nr 0995/P04/2000/18. P06-03 LIPIDY A PRZEKAZYWANIE SYGNAŁÓW W JĄDRZE KOMÓRKOWYM Anna Dygas A, Jolanta Barańska A: Instytut Biologii Dowiadczalnej im. M. Nenckiego, Zakład Neurobiologii Molekularnej i Komórkowej, Warszawa Ostatnio zidentyfikowano trzy geny odpowiedzialne za transport mrna z nukleoplazmy do cytoplazmy. Są to geny fosfolipazy C hydrolizującej PIP 2 do IP 3 i DAG i dwóch kinaz polifosfoinozytoli: Ipk2 fosforylującej IP 3 do IP 4 i

3 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 153 IP 5 oraz Ipk1 fosforylującej IP 5 do IP 6. Ipk2 wiąże sięz promotorami może zatem bezpośrednio regulować transkrypcjęgenów. Udział polifosfoinozytoli w procesach zachodzących w jądrze komórkowym jest więc faktem. DAG, drugi produkt hydrolizy PIP 2 w jądrze komórkowym razem z fosfatydyloseryną (PS) aktywuje PKC. Nasze badania wskazują, że zależna od Ca 2+ synteza PS zachodzi w wewnętrznej błonie otoczki jądrowej. W jądrze komórkowym znaleziono niemal wszystkie izoformy PKC, w tym i Ca 2+ -zależne. Potrzebny do ich aktywacji wapń zmagazynowany jest w przestrzeni otoczki jądrowej i uwalniany do matriks przez IP 3. Receptor IP 3 znajduje sięw wewnętrznej błonie tej otoczki. Za opóźnioną w czasie i przedłużoną aktywację PKC w jądrze komórkowym może odpowiadać DAG uwalniany z fosfatydylocholiny (PC). Fosfolipaza D (PLD), hydrolizując PC uwalnia kwas fosfatydowy (PA) a DAG powstaje w wyniku defosforylacji PA przez fosfohydrolazękwasu fosfatydowego. PC teoretycznie może być także bezpośrednio źródłem DAG. Syntaza sfingomieliny odłącza bowiem cząsteczkęfosfocholiny od PC produkując tym samym DAG. Wykazano, że i PC i sfingomielina (SM) związane są z chromatyną w izolowanych jądrach komórkowych. Obok pochodnych PI także udział pochodnych SM w przekazywaniu sygnałów w jądrze jest ostatnio badany bardzo intensywnie. P06-04 IZOLACJA GENÓW OKSYDAZY ALTERNATYWNEJ A. CASTELLANII I D. DISCOIDEUM Maciej Behrendt, Wiesława Jarmuszkiewicz, Lilla Hryniewiecka Zakład Bioenergetyki, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Poznań W mitochondriach ameby Acanthamoeba castellanii i śluzowca Dictiostelium discoideum, podobnie jak u roślin wyższych, stwierdzono występowanie alternatywnej oksydazy (AOX) niewrażliwej na cyjanek, katalizującej przeniesienie elektronów bezpośrednio z ubichinonu na tlen z pominięciem łańcucha cytochromowego. Celem pracy jest poznanie sekwencji aminokwasowej białka AOX A. castellanii i D. discoideum oraz porównanie ich ze znanymi sekwencjami białek roślinnych i mikroorganizmów. Za pomocą techniki PCR (polymerase chain reaction) zamplifikowano fragmenty genomów DNA ameby i śluzowca stosując różne primery, których sekwencje wybrano na podstawie konserwatywnych regionów białek i cdna dla AOX z różnych gatunków roślin, drożdży (Hansenula anomala, Candida albinicans) oraz Trypanosoma bruce. Analiza sekwencji aminokwasowej AOX ameby i śluzowca pomoże wyjaśnić odmienną regulacje aktywności tego białka u badanych pierwotniaków (brak regulacji poprzez zmiany stanu redukcji/utlenienia enzymu oraz inna regulacja allosteryczna poprzez mononukleotydy purynowe a nie przez pirogronian) w porównaniu z roślinami wyższymi. Praca częściowo finansowana przez KBN 6 P04A P06-05 WPŁYW ph NA AKTYWNOŚĆ ALTERNATYWNEJ OKSYDAZY W MITOCHONDRIACH A. CASTELLANII Wiesława Jarmuszkiewicz, Agnieszka Bińczak, Lilla Hryniewiecka Zakład Bioenergetyki, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Poznań Funkcjonowanie w mitochondriach Acanthamoeba castellanii odpornej na cyjanek oksydazy alternatywnej stanowi cechęwspólną z mitochondriami roślin wyższych. Oksydaza alternatywna ameby, przeciwnie do roślinnej, nie jest aktywowana przez kwasy organiczne czy przez stan utlenienia/redukcji białka, a przez mononukleozydy purynowe z których najefektywniejszym jest GMP. Celem badań było zbadanie czy ph płynu inkubacyjnego wpływa na aktywność oksydazy alternatywnej u ameby. Zastosowano trzy substraty oddechowe (jabłczan, bursztynian, NADH) różniące siędrogą wprowadzania elektronów na ubichinon. Niezależnie od rodzaju użytego substratu pomiary oddychania mitochondriów w obecności inhibitora drogi cytochromowej (KCN lub antymycyny) wskazują, że optimum aktywności oksydazy alternatywnej prawdopodobnie przypada na wartość ph 6,8. Przy tym ph stwierdzono także największy stopień aktywacji oksydazy alternatywnej przez GMP. Pomiary stopnia redukcji ubichinonu pozwolą potwierdzić powyższe obserwacje. Jednocześnie wykazano, że optimum aktywności drogi cytochromowej dla mitochondriów w fosforylującym stanie oddechowym (w obecności inhibitora oksydazy alternatywnej) oraz w stanie rozprzężonym (w obecności FCCP) przypada na wartość ph 7,4. Praca częściowo finansowana przez KBN 6 P04A

4 154 SESJA 6 PLAKATY P06-06 LOKALIZACJA AKTYWNOŚCI REDUKTAZY ŻELAZOWEJ W KOMÓRKACH AEROMONAS HYDROPHILA Andrzej Woźnica, Sylwia Łabużek, Danuta Mańka, Krzysztof Rakus, Janusz Dzirba, Joanna Burcoń Uniwersytet Śląski, Katedra Biochemii, Katowice Mayers i Mayers wykazali obecność reduktazy w błonie zewnętrznej bakterii hodowanych w warunkach anoksji. Stwierdzili ponadto niską aktywność tego enzymu w układach aerobowych. Gaspard i in. wykazali, że 80% aktywności komórkowej reduktazy żelazowej u Shewanella putrefaciens, jest zlokalizowane w zewnętrznej błonie komórkowej. Sellinger i in. izolowali z peryplazmy i błony zewnętrznej komórek Geobacter sulfurreducens, cytochrom c o maksymach absorpcji 419, 522 i 552 nm, który wykazywał aktywność reduktazy żelazowej. Celem pracy było opracowanie metod rozdziału komórek bakterii na frakcje takie jak cytoplazma, peryplazma i frakcje błonowe oraz lokalizacja aktywności reduktazy żelazowej w izolowanych frakcjach komórkowych szczepu Aeromonas hydrophila KB1. Do badań wykorzystano szczep Aeromonas hydrophila KB1. Biomasędo badań pozyskiwano z hodowli bakterii prowadzonych w warunkach anoksji. Aktywność reduktazy żelazowej wyznaczano poprzez pomiar stężenia zredukowanego żelaza(ii) metodą kolorymetryczną. Frakcję peryplazmatyczną, cytoplazmatyczną i frakcjębłonową uzyskiwano poprzez wirowanie różnicowe. Frakcje błonowe rozdzielano przez wirowanie w gradiencie sacharozy (30 55%). Uzyskiwano w ten sposób frakcje: błony wewnętrznej cytoplazmatycznej (CM), błony zewnętrznej (OM). Frakcję błony zewnętrznej identyfikowano poprzez pomiar zawartości KDO. W każdej z zebranych frakcji oznaczano gęstość metodą refraktometryczną, zawartość białka metodą Bradforda oraz aktywność reduktazy żelazowej. Zastosowany sposób postępowania pozwolił na skuteczne pozyskanie poszczególnych frakcji komórkowych. Uzyskane wyniki wskazują, że aktywność reduktazy zlokalizowana jest we frakcji błonowej i peryplazmatycznej. P06-07 ANALIZA RNA PARAMECIUM Z ZASTOSOWANIEM SOND Jolanta Wiejak, Liliana Surmacz, Elżbieta Wyroba -ADRENERGICZNYCH Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Zakład Biologii Komórki, Warszawa Poszukując molekularnych podstaw specyficznej odpowiedzi komórek Paramecium na ligandy adrenergiczne [Wyroba E. Cell. Biol. Int. Rep. 15, ] badano ekspresjęreceptora 2 -adrenergicznego ( -AR) stosując RT-PCR oraz hybrydyzacjęnorthern. W wyniku reakcji RT-PCR ze starterami zlokalizowanymi w 4 i 6 regionie transbłonowym (TM 4, TM 6) otrzymano dwa produkty: 360 p.z. i 320 p.z. Produkty te analizowano stosując technikęsouthern blot: tylko fragment 360 p.z. o przewidywanej wielkości hybrydyzował z sondą obejmującą region 3 pętli cytoplazmatycznej receptora, zlokalizowanej w obrębie amplifikowanego obszaru. W analizie Northern zastosowano 3 sondy specyficzne dla -AR: cdna dla ludzkiego receptora 2 -adrenergicznego, antysensowny oligonukleotyd (Nr 5) obejmujący Phe 290 istotną w wiązaniu agonistów [Strader et al., FASEB J. 9, 745.], antysensowny oligonukleotyd (Nr 9), użyty jako starter w reakcji RT-PCR (tzw. uniwersalny starter specyficzny dla -adrenoreceptora [Venta et al., Biochem. Genetics 34, 321.]). Czwarta sonda RNA dla -aktyny stanowiła kontrolęi ujawniła transkrypt o wielkości ~1.8 kb. Wszystkie zastosowane sondy były znakowane pochodnymi digoksygeniny, co umożliwiło nieradioaktywną, chemiluminescencyjną detekcjęz użyciem CDP-Star jako substratu. W wyniku hybrydyzacji całkowitego RNA z sondą cdna oraz sondą Nr 5 zaobserwowano pojedynczy prążek o wielkości ~2 kb. Transkrypt o tym samym ciężarze molekularnym został również wykryty po hybrydyzacji mrna z sondą Nr 9 [Płatek et al., Acta Biochim. Polon. 46, ]. Obecność mrna o m. cz. ~2 kb jest zgodna z wielkością transkryptów ssaczych receptorów 2 -AR, która wynosi kb.

5 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 155 P06-08 LOKALIZACJA SELENU AKUMULOWANEGO W KOMÓRKACH DROŻDŻY SACCHAROMYCES FRAGILIS Jerzy Chmielowski, Anna Tyflewska, Grzegorz Dziubanek Uniwersytet Śląski, Katedra Biochemii, Katowice Celem podjętych badań była lokalizacja selenu akumulowanego w komórkach i izolowanych protoplastach drożdży S. fragilis. Interesujące wydawało sięrównież poznanie przemian, którym podlega selen. W tym celu obserwowano wewnątrzkomórkową redukcjęseleninu do selenu pierwiastkowego. Do badań wybrano szczep, Saccharomyces fragilis IS fr/1, który charakteryzował siępodwyższoną zdolnością bioakumulacji selenu. Hodowlę drożdży prowadzono w temperaturze 30 C napowietrzając przez wytrząsanie. Selen wprowadzano do hodowli drożdży w postaci seleninu sodu znakowanego 75 Se, umożliwiało detekcjęselenu w biomasie i frakcjach subkomórkowych drożdży. Izolacjęprotoplastów drożdży przeprowadzano metodą enzymatyczną. Frakcje subkomórkowe drożdży izolowano z protoplastów po trzygodzinnej inkubacji z seleninem sodu podanym w stężeniu 500 mm. Izolacjęfrakcji subkomórkowych drożdży przeprowadzono wykorzystując metodęultrawirowania i rozdziałów gradientowych. Stwierdzono najwyższy około 40% poziom akumulacji selenu w frakcji cytoplazmatycznej, pozostałe frakcje komórkowe (uwzględniając błąd metodyczny) wiązały odpowiednio: frakcja błonowa 33%, mikrosomalna 26%, mitochondrialna 23% i jądrowa około 20%. Przypuszcza się, że selen był wiązany przez białka cytoplazmatyczne i jądrowe. Ziarna selenu pierwiastkowego występujące w cytoplazmie obserwowano w mikroskopie świetlnym i elektronowym. P06-09 TRANSPORT FLUORESCEINY I JEJ POCHODNYCH PRZEZ BŁONĘ KRWINKI CZERWONEJ CZŁOWIEKA Błażej Rychlik, Grzegorz Bartosz Uniwersytet Łódzki, Katedra Biofizyki Molekularnej, Łódź Znaczniki fluorescencyjne na ogół traktuje sięjako związki inertne, mało toksyczne, słabo reaktywne metabolicznie. Liczne obserwacje wskazują jednak (np. Homolya L. et al.,[1993], J.Biol.Chem. 268), że przynajmniej niektóre z nich są usuwane przez komórki na drodze transportu aktywnego. Postuluje sięudział w tym procesie białek z rodziny transporterów ABC: białek grupy MRP. Białka te cechuje dość niska specyficzność ich substratami są na ogół duże aniony organiczne o amfipatycznej strukturze. Celem prezentowanej pracy było określenie potencjalnych różnic w transporcie fluoresceiny (F), 5/6-karboksyfluoresceiny (CF), 2,7 -bis-(2-karboksyetylo)-5/6-karboksyfluoresceiny (BCECF), 2,7 -bis-(2-karboksypropylo)-5/6-karboksyfluoresceiny (BCPCF) oraz kalceiny (CAL) w układzie modelowym krwinkach czerwonych człowieka. W erytrocytach ekspresji ulega bowiem białko MRP1 i inny, nie rozpoznany jeszcze transporter aktywny o zbliżonej specyficzności substratowej-(inny członek grupy?). Wyznaczano szybkość wypływu znaczników fluorescencyjnych z nienaruszonych krwinek oraz wpływ głodzenia metabolicznego oraz wybranych inhibitorów (jonów wanadanowych, fluorkowych, werapamilu, benzobromaronu, probenecidu) na ten proces, a także szybkość akumulacji znaczników we wnętrzu pęcherzyków o odwróconej orientacji uzyskiwanych z błon erytrocytarnych oraz sposób inhibicji tej akumulacji przez 2,4-dinitrofenylo-S-glutation modelowy substrat obu wspomnianych transporterów, benzobromaron, werapamil i probenecid. Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić istnienie różnic w charakterze transportu różnych znaczników, przy czym transport F ma charakter bierny, zaś transport BCECF i BCPCF zdecydowanie aktywny, prawdopodobnie angażujący białka MRP. P06-10 WPŁYW HISTAMINY NA POZIOMY CYKLICZNEGO AMP W GRUCZOŁACH Jacek Danowski, Bogumił Kmieć Akademia Medyczna, Katedra Histologii i Embriologii, Samodzielna Pracownia Cytofizjologii, Łódź Użyto 60 dojrzałych płciowo samców świnek morskich, podzielonych na 6 grup. GrupęI stanowiły zwierzęta, którym nie podano histaminy. W pozostałych grupach podano histaminęw dawce 0,75 mg/kg. Na 30 minut

6 156 SESJA 6 PLAKATY przed podaniem histaminy w grupie III podano dootrzewnie mepyraminę, w grupie IV ranitydynę, w grupie V ranitydynę i mepyraminę, zaś w grupie VI ipratropium. Wszystkie zwierzęta w grupach II i IV oraz większość świnek grupy VI zginęły we wstrząsie histaminowym. Do badań pobrano tarczyce, nadnercza, ślinianki przyuszne i trzustki. W homogenatach każdego z tych narządów oznaczano poziom camp, poza tym w tarczycy oznaczono poziom tyroksyny i trójjodotyroniny, w homogenatach nadnerczy poziom adrenaliny, zaś zawartość -amylazy w homogenatach ślinianek i trzustek.w badaniach nie stwierdzono istotnych zmian stężenia camp w homogenatach tarczycy i nadnerczy w żadnej z grup doświadczalnych w porównaniu z grupą I. Aktywność -amylazy w homogenatach ślinianek i trzustek była znamiennie niższa w grupach II, III i VI, natomiast poziomy camp były w tych grupach podwyższone. Uzyskane wyniki wskazują, że: 1. wydzielanie trójjodotyroniny i tyroksyny pod wpływem histaminy jest wydzielaniem niewybiórczym i zachodzi poprzez pobudzenie receptora H1 (bez pobudzenia receptora muskarynowego); 2. wydzielanie adrenaliny w rdzeniu nadnerczy jest wybiórcze i zachodzi poprzez pobudzenie receptora H1 (bez pobudzenia receptora muskarynowego); 3. wydzielanie -amylazy przez śliniankęprzyuszną i przez trzustkęjest procesem wybiórczym i zachodzi poprzez pobudzenie receptora H2 (bez pobudzenia receptora muskarynowego). P06-11 MECHANIZM UWALNIANIA ATP Z IZOLOWANYCH KŁĘBUSZKÓW NERKOWYCH I HODOWANYCH PODOCYTÓW Ludmiła Martyniec, Gabriela Dzierżko, Stefan Angielski Placówka Nefrologii Komórkowej i Molekularnej PAN, Akademia Medyczna, Gdańsk Zarówno komórki podocytarne jak i mezangialne posiadają bogaty aparat kurczliwy i przeto są zdolne do regulacji wielkości powierzchni kapilar kłębuszka, dostępnej dla procesu filtracji. Uprzednio wykazaliśmy, że ATP i adenozyna wywołują zmiany wielkości objętości izolowanych kłębuszków nerkowych. Jednak dotychczas nie badano uwalniania ATP z kłębuszków lub wchodzących w ich skład podocytów. Celem tej pracy było zbadanie mechanizmu uwalniania ATP z kłębuszków nerkowych i hodowanych podocytów. Kłębuszki nerkowe izolowano metodą przesiewową z kory nerek szczura. Podocyty hodowane otrzymywano z kłębuszków nerkowych samic szczurzych. Uwalnianie ATP mierzono lucyferazowo/lucyferynową. ATP uwalnia sięzarówno z kłębuszków (3,5+0.8 nm) jak i z hodowanych podocytów (19,8+6.0 nm) w stanie stacjonarnym. Hipotonia (10%) zwiększa uwalnianie ATP z podocytów prawie 2-krotnie. Zmniejszenie osmolalności środowiska zewnętrznego o 30% powoduje prawie 3-krotny wzrost uwalniania ATP przez kłębuszki nerkowe i 4-krotny przez podocyty. Insulina (100 nm) zmniejsza uwalnianie ATP przez podocyty w stanie stacjonarnym. Podobnie działa chlorek gadolinu (50 M), inhibitor mechanowrażliwych kanałów jonowych, hamując w ok. 70% zarówno stacjonarne jak i indukowane hipotonią uwalnianie ATP z podocytów. ARL, inhibitor ekto-atp-azy, zwiększa wielokrotnie zewnątrzkomórkowe stężenie ATP w zawiesinie kłębuszków i hodowli podocytów do wartości 72,0 nm i 11,5 nm, odpowiednio. Przedstawione wyniki sugerują, że kłębuszki nerkowe jak i hodowane podocyty uwalniają ATP do środowiska zewnętrznego w stężeniu, wystarczającym do pobudzenia receptorów purynergicznych typu P2, co z kolei może mieć wpływ na dynamikę kłębuszka, warunkującą sprawność procesu filtracji kłębuszkowej. P06-12 WPŁYW RECEPTORÓW ADRENERGICZNYCH NA TRANSPORT JONÓW NA MODELU IZOLOWANEJ SKÓRY ŻABY Danuta Kosik-Bogacka A, Bolesław Banach B, Tomasz Tyrakowski C A: Katedra i Zakład Biologii i Parazytologii Medycznej, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin B: Katedra i Zakład Fizjologii, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin C: Katedra i Zakład Elektrofizjologii Tkanki Nabłonkowej i Skóry, Akademia Medyczna im. Ludwika Rydygiera, Bydgoszcz Za pomocą metod elektrofizjologicznych przystosowanych do oceny prądów jonowych określono wpływ bodźców mechanicznych i chemicznych na prądy jonowe w izolowanej skórze żaby. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń zanalizowano mechanizmy regulacyjne, które oddziaływały na stały potencjał elektryczny skóry określony jako PD oraz na odwracalne zmiany tego potencjału w czasie stymulacji mechanicznej oznaczone jako dpd. Sprawdzono doświadczalnie przypuszczenie, że pobudzenie lub blokowanie receptorów adrenergicznych może wpływać na transport jonów w skórze żaby i tym samym powodować zmiany dpd. Materiał doświadczalny stanowiły 43 fragmenty skóry pochodzące z 23 żab Rana esculenta L. Doświadczenia polegały na pomiarze różni-

7 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 157 cy przeznabłonkowego potencjału elektrycznego (PD w mv) izolowanej skóry żaby umieszczonej w aparacie Ussinga. Doświadczenia wykonywano w warunkach kontrolnych, w czasie stymulacji oraz po modyfikacjach farmakologicznych. Adrenalina dodawana do płynu stymulującego wywoływała reakcjęhiperpolaryzacji o wartości takiej samej jak stymulacja kontrolna. Antagonista receptorów -adrenergicznych (benekstramina) zmniejszał wielkość reakcji hiperpolaryzacji. Tymolol (bloker receptorów -adrenergicznych) podawany w grupie kontrolnej wywoływał dwa rodzaje reakcji: obniżał wartość reakcji hiperpolaryzacji (18 preparatów) lub wywoływał reakcję depolaryzacji (8 preparatów). Podawany na skórężaby inkubowaną w amilorydzie nie wpłynął na zahamowaną przez amiloryd reakcjęhiperpolaryzacji, natomiast podany po inkubacji z bumetanidem obniżał wartość dpd. Wykazano, że blokowanie oddziaływań adrenergicznych zmniejsza stymulowany transport jonów i na tej podstawie można przypuszczać, że pobudzenie receptorów adrenergicznych zwiększa reakcje obronne skóry żaby zależne od transportu jonów. P06-13 FUNCTION OF SODIUM CHANNELS OF TRACHEAL EPITHELIUM MODULATED BY AMBROXOL B. Banach A, D. Kosik-Bogacka B, A. Porębska C, I. Poziomkowska A, S. Słuczanowska-Głąbowska A A: Katedra i Zakład Fizjologii, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin B: Katedra i Zakład Biologii i Parazytologii Medycznej, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin The purpose of this paper was to examine the electrical potential of isolated tracheal wall after inhibition of chloride transport and\or sodium transport in the basic conditions and after mechanical stimulation. This paper also aimed to examine how ambroxol, the drug augmenting airway clerance, affects the sodium channel. The experiments were carried out in Ussing apparatus where mechanical stimulus affected segments of isolated tracheal wall incubated in the presence of amiloride, bumetanide and both inhibitors simultaneously. It was shown that hiperpolarization dependent on opening of sodium channels can be achieved in two experiment conditions: during mechanical stimulation combined with amiloride rinsing from Ussing apparatus (dpd=-0.8 mv) with blocking effect of ambroxol (dpd=-0.3 mv) and in mechanical stimulation during chloride transport inhibition with bumetanide (dpd=-0.6 mv). The use of bumetanide and ambroxol in stimulating fluid opens sodium channels (dpd=-1.1 mv) so far closed. These sodium channels are sensitive to amiloride, modulated by ambroxol. P06-14 UDZIAŁ KINAZY BIAŁKOWEJ C W REGULACJI AKTYWACJI STAT-1 INDUKOWANEJ IFN Khalid Al.-Nedawi, Maria Świątkowska, Kamila Błędzka, Zofia Pawłowska, Czesław Cierniewski Zakład Biofizyki Akademii Medycznej, Łódź Wcześniejsze nasze badania wykazały obecność na powierzchni komórek śródbłonka ludzkiego kinaz białkowych, które fosforylują białka korzystając z zewnątrzkomórkowego ATP. Aktywność tych enzymów, zwanych ektokinazami, wykryto zarówno w komórkach śródbłonka (HUVEC), jak i w linii komórkowej śródbłonka EA.hy 926. Ich aktywność oceniono na podstawie poziomu fosforylacji endogennych białek błony komórkowej w obecności [ - 32 P]ATP. Ektokinazy odpowiedzialne za powierzchniową fosforylacjębiałek scharakteryzowano na podstawie reakcji, w których zastosowano selektywne substraty oraz inhibitory białkowej kinazy C, kinazy białkowej A oraz kazeinowej kinazy II. Stymulacja komórek śródbłonka za pomocą interferonu (IFN ) prowadziła do znacznego obniżenia poziomu zewnątrzkomórkowej fosforylacji białek błony komórkowej, sięgającego od 20 do 80%. IFN związany z błoną ulegał szybkiej fosforylacji, która była w pełni hamowana za pomocą inhibitorów PKC. Doświadczenia nasze wykazały, że ektokinaza fosforylująca IFN wykazuje specyfyczność białkowej kinazy C. W tej pracy zbadaliśmy wpływ inhibitorów ektokinazy na wewnątrzkomórkowy szlak przekazywania sygnału indukowanego przez IFN. Białka rodziny STAT pełnią rolęmediatorów w szlaku JAK-STAT przekazywania sygnałów indukowanym przez IFN. STAT-1 funkcjonuje również jako czynnik transkrypcyjny pełniący podstawową rolęw ekspresji niektórych genów. Poziom aktywacji czynnika STAT-1 po stymulacji IFN określany był przy zastosowaniu metod immunoprecypitacji i Western Blotting z użyciem przeciwciał skierowanych przeciw STAT-1. Aktywacja STAT-1 indukowana przez tęcytokinębyła silnie hamowana w obecności inhibitorów ektokinazy K-252b oraz [Ala113]MBP. Zablokowanie aktywacji czynnika STAT-1, indukowanej interferonem, przez te inhibitory wskazuje na udział ektokinazy mającej specyficzność kinazy białkowej C w uruchamianym przez tęcytokinęszlaku przekazywania sygnału do wnętrza komórki.

8 158 SESJA 6 PLAKATY P06-15 UDZIAŁ KASKADY MAPK W AKTYWACJI GENU PAI-1 PRZEZ REAKTYWNE FORMY TLENU M. Świątkowska A, J. Szemraj B, Z. Pawłowska A, M. Nawrot A, C.S. Cierniewski A A: Zakład Biofizyki, Zakład Biochemii B: Instytut Fizjologii i Biochemii, Akademia Medyczna w Łodzi Dwa źródła reaktywnych form tlenu (RTF): zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe mogą pełnić rolęregulującą funkcje komórki. Tarczą ich działania są kinazy tyrozynowe i treoninowe oraz czynniki transkrypcyjne. Dla niskiego poziomu RTF, aktywność fosfataz dominuje nad aktywnością kinazową, skutecznie ją blokując. Na skutek stymulacji komórek przez ligand, wzrasta poziom RTF w komórce, które inaktywują aktywność fosfataz, a w konsekwencji wzrasta aktywność kinaz białkowych. Mechanizm taki może występować w przypadku działania czynników wzrostu czy cytokin, które powodują wybuch aktywności kinazowej. Ekspozycja komórek na cytokiny czy czynniki wzrostu powoduje wzrost RTF, zaś sygnały przez nie generowane są z powodzeniem hamowane przez antyutleniacze. RTF produkowane są w dużych ilościach przez komórki systemu immunologicznego, a inne typy komórek np: fibroblasty, komórki mięśni gładkich, czy śródbłonek produkują znacznie mniejsze ilości anionorodnika ponadtlenkowego czy też nadtlenku wodoru. Taka mała produkcja RTF wydaje siępełnić rolęw transdukcji sygnału, w aktywacji MAPK, JNK, czy czynników transkrypcyjnych (NF B). Celem naszych badań było sprawdzenie roli RTF w regulacji ekspresji PAI-1. Ten najważniejszy inhibitor aktywacji plazminogenu wykazuje swoją aktywność w regulacji procesów proteolitycznych w macierzy zewnątrzkomórkowej, w migracji komórek, stanowi ważny czynnik w procesie powstawania i funkcji naczyń krwionośnych, a jego poziom znacznie wzrasta w różnorodnych stanach patologicznych i stanowi poważny czynnik ryzyka w miażdżycy naczyń, zawałach serca czy cukrzycy. Poznanie mechanizmów kontrolujących jego syntezęstanowi ważny element w zrozumienu regulacji naczyniowej fibrynolizy. Cytokiny stanowią ważny czynnik regulujący ekspresjępai-1. W naszych badaniach wykazaliśmy, że TNF- aktywując komórki środbłonka powoduje znaczny wzrost ekspresji PAI-1, a ten efekt hamowany jest przez N-acetylocysteinę(NAC). Aktywacja kaskady MAPK przez TNF- wydaje sięzasadniczym elementem w przekazywaniu sygnału prowadzącym do aktywacji genu PAI-1. Inhibitor kinazy MAP, PD98059, hamuje ekspresjępai-1 w komórkach aktywowanych przez TNF-. Bezpośrednimi aktywatorami kinazy MAP w komórkach aktywowanych TNF- są RTF, gdyż obserwujemy znaczne zahamowanie jej aktywności w obecności NAC. Nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) aktywuje także gen PAI-1 i obserwujemy znaczny wzrost ekspresji PAI-1, ale również potęguje efekt TNF- powodując wręcz dramatyczny wzrost ekspresji PAI-1. H 2 O 2 wpływa na aktywacjęgenu PAI-1 poprzez aktywacjękaskady MAP, a jego efekt na tękinazęjest hamowany przez NAC. W aktywacji genu PAI-1 indukowanej przez RTF, zaangażowany jest czynnik transkrypcyjny NF B. Inhibitor proteosomu 26S hamuje wzrost ekspresji PAI-1 w komórkach aktywowanych TNF- czy poddanych działaniu RTF. Reaktywne formy tlenu stanowią ważny element regulujący ekspresję PAI-1. Generowane wewnętrznie przez cytokiny oraz jako zewnętrzne źródło, aktywują gen PAI-1 poprzez kaskadę MAPK. P06-16 ZMIANY STRUKTURALNYCH I DYNAMICZNYCH WŁAŚCIWOŚCI DWUWARSTWOWYCH MEMBRAN LIPIDOWYCH INDUKOWANE PRZEZ -TOKOFEROL I 6-O- -(D-GLUKOPIRANOZYLO)D- -TOKOFEROL Stanisława Koronkiewicz A, Krzysztof Bryl A, Stanisław Witkowski B, Piotr Wałejko B A: Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, Katedra Fizyki i Biofizyki, Olsztyn B: Uniwersytet, Instytut Chemii, Białystok Terapeutyczne zastosowanie witaminy E jest ograniczone koniecznością jej doustnego podawania i słabą wchłanialnością. W celu zwiększenia rozpuszczalności tokoferolu w wodzie, co umożliwiłoby dożylne jego podawanie w formie proleku, zsyntezowano 6-O- -(D-glukopiranozylo)d- -tokoferol. Celem badań było sprawdzenie w jaki sposób -tokoferol i glukozydowa pochodna tokoferolu wpływają na dynamiczne i strukturalne właściwości błon biologicznych. Badania prowadzono w układzie modelowym, którym były płaskie dwuwarstwowe błony lipidowe (BLM) formowane metodą Mueller-Rudin. Zawartość -tokoferolu i jego pochodnej wynosiła od 2.5 do 10 % (w/w) w stosunku do całkowitego stężenia lipidów. W celu obserwacji dynamicznych właściwości BLM badano w warunkach woltametrycznych i chronopotencjometrycznych zjawisko elektroporacji. Wyniki wskazują, że elektroporacja następuje łatwiej w przypadku błon o zwiększonej w stosunku do naturalnej zawartości tokoferoli. Błony stawały sięmniej stabilne, łatwiej ulegały zniszczeniu. Ponadto -tokoferol, a zwłaszcza jego pochodna, utrudniały proces zamykania sięporów w błonach znajdujących siępod wpływem zewnętrznego pola elektrycznego. Efekt ten był mniej widoczny w przypadku gdy potencjał transmembranowy wynosił zero. Wynik

9 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 159 ten sugeruje, że pole elektryczne może wpływać w znaczący sposób na fizjologiczne funkcje witaminy E. Destrukcyjny wpływ -tokoferolu i jego pochodnej na błony uwidaczniający sięprzy stosunkowo wysokich stężeniach tych związków w błonach należałoby uwzględnić w toku dalszych badań nad medycznym zastosowaniem glukozydowej pochodnej tokoferolu. P06-17 UDZIAŁ APARATU IMPORTU BIAŁKA W TRANSPORCIE METABOLITÓW DO MITOCHONDRIÓW DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE Nina Antos, Małgorzata Budzińska, Hanna Kmita Zakład Bioenergetyki, Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii, Poznań Przez wiele lat uważano, iż transport metabolitów przez zewnętrzną błonę mitochondrialną prowadzi jedynie poryna mitochondrialna nazywana również kanałem VDAC (z ang. voltage dependent anion selective channel). Jednakże istnienie funkcjonalnych mitochondriów w bezporynowych mutantach drożdży S. cerevisiae dowiodło, iż w procesie tym uczestniczyć mogą także inne białka zewnętrznej błony mitochondrialnej. Do tej pory w błonie zewnętrznej mitochondriów S. cerevisiae stwierdzono obecność tylko jednego kanału odrębnego od VDAC. Jest to kanał w obrębie kompleksu TOM, który to kompleks stanowi część aparatu importu białka zlokalizowaną w błonie zewnętrznej. Głównym składnikiem kanału w kompleksie TOM jest białko Tom40. Stwierdziliśmy, iż zablokowanie kanału kompleksu TOM przez chemiczne ilości białka chimerowego pb 2 -DHFR hamuje dostęp metabolitów do mitochondriów mutanta pozbawionego kanału VDAC (aktualnie YVDAC1), jak i podwójnego mutanta pozbawionego nie tylko kanału VDAC ale także białka homologicznego pozbawionego aktywności kanałowej (YVDAC2). Jednakże w przypadku mitochondriów podwójnego mutanta dla uzyskania efektu porównywalnego z otrzymanym dla mitochondriów pojedynczego mutanta niezbędne było zastosowanie wyższych stężeń białka chimerowego. Ponadto w mitochondriach obu mutantów stwierdziliśmy zwiększony poziom ekspresji białka Tom40 w porównaniu z mitochondriami wyjściowego szczepu dzikiego, przy czym poziom ekspresji białka Tom40 w mitochondriach podwójnego mutanta był wyższy. Uzyskane wyniki pozwalają wnioskować, iż kompleks TOM odgrywa istotną rolęw transporcie metabolitów przy braku kanału VDAC, przy czym rola ta wydaje się wzrastać przy równoczesnym usunięciu białka YVDAC2. P06-18 MECHANIZM NADPH-ZALEŻNEJ PEROKSYDACJI LIPIDÓW W MIKROSOMACH ŁOŻYSKA LUDZKIEGO Ryszard Milczarek, Jerzy Klimek, Leon Żelewski Katedra i Zakład Biochemii Farmaceutycznej Akademii Medycznej w Gdańsku We krwi kobiet w stanie przedrzucawkowym obserwowano znaczne podwyższenie poziomu nadtlenków lipidowych, w porównaniu z ich poziomem u kobiet w ciąży prawidłowej. Ich głównym źródłem jest peroksydacja lipidów błonowych w łożysku. Stąd, celem niniejszej pracy było wykazanie obecności i wyjaśnienie mechanizmu NADPH-zależnej peroksydacji w mikrosomalnej frakcji łożyska ludzkiego. Stwierdzono, że jony żelazawe w nieznacznym stopniu wpływają na syntezęmda. Dopiero dodanie układu regenerującego NADPH prowadzi do bardzo silnej stymulacji peroksydacji lipidów w obecności Fe 2+. Obecność NADPH jest konieczna do enzymatycznej redukcji powstałego w wyniku autooksydacji Fe 3+ do Fe 2+. W procesie inicjacji mikrosomalnej peroksydacji lipidów mogą uczestniczyć wolne rodniki tlenowe oraz inne aktywne formy tlenu. Mannitol, bardzo efektywny inhibitor peroksydacji lipidów inicjowanej przez rodniki hydroksylowe, jest bez wpływu na syntezęmda. Dysmutaza ponadtlenkowa usuwająca O 2 - (anionorodnik ponadtlenkowy) bardzo silnie hamuje NADPH-zależną peroksydacjęlipidów. Wyniki tych doświadczeń wskazują, że w inicjacji mikrosomalnej NADPH-zależnej peroksydacji lipidów istotną rolęodgrywa O 2 -. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że cytochrom P-450 dostarczając O 2 - odgrywa istotną rolęw NADPH-zależnej peroksydacji lipidów w mitochondriach łożyska ludzkiego. Na tej podstawie można przypuszczać, że również w mikrosomach łożyska ludzkiego źródłem O 2 - jest cytochrom P-450. Przebadano wpływ inhibitorów cytochromu P-450 na syntezęmda. Ketoconazol (5 M), SKF 525A (150 M) oraz aminoglutetimid (300 M) całkowicie hamują syntezęmda potwierdzając udział cytochromu P-450 w mikrosomalnej NADPH-zależnej peroksydacji lipidów. Reasumując otrzymane wyniki można wyciągnąć wniosek, że O 2 - uwalniany przez cytochrom P-450, redukując Fe 3+ do Fe 2+ prowadzi do wytworzenia optymalnego stosunku Fe 3+ /Fe 2+ wymaganego do inicjacji peroksydacji lipidów w mikrosomach łożyska ludzkiego. Praca finansowana z badań własnych W-48 AM w Gdańsku.

10 160 SESJA 6 PLAKATY P06-19 ZNACZENIE DEGRADACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEGO ATP W PROCESIE STYMULACJI GLUKONEOGENEZY W KANALIKACH KORY NERKI KRÓLIKA Adam Jagielski, Dagmara Wohner, Jadwiga Bryła Zakład Regulacji Metabolizmu Instytutu Biochemii Uniwersytetu Warszawskiego Badano wpływ agonów receptorów purynergicznych oraz produktów ich rozkładu przez enzymy zewnątrzkomórkowe na szybkość procesu glukoneogenezy w kanalikach kory nerki królika inkubowanych z różnymi substratami. Wykazano, że agony receptorów purynergicznych (ATP, datp, Ap3A oraz -S-ATP) są szybko degradowane przez zewnątrzkomórkowe nukleotydazy oraz deaminazęadenozynową z wytworzeniem ADP, AMP, adenozyny, inozyny oraz hipoksantyny, które osiągają stężenia od 30 do 100 M w mieszaninie inkubacyjnej. Zarówno agony jak i produkty ich rozkładu w stężeniu 200 M stymulują produkcjęglukozy w kanalikach nerkowych inkubowanych w obecności pirogronianu, asparaginianu+glicerol lub alaniny+glicerol+kaprylan. Stymulacji glukoneogenezy w obecności aminokwasów przez badane agony towarzyszy wzrost szybkości wytwarzania glutaminy na skutek uwalniania jonów amonowych z degradowanych agonów purynergicznych. Ponieważ MSO, inhibitor syntetazy glutaminowej, stymuluje produkcjęglukozy w obecności aminokwasów, wydaje się, że proces syntezy glutaminy współzawodniczy ze szlakiem glukoneogenezy o szkielet węglowy aminokwasów. W przeciwieństwie do agonów receptorów purynergicznych jony amonowe hamują glukoneogenezęw obecności aminokwasów oraz zwiększają produkcję glutaminy. Uzyskane wyniki wskazują, że ATP, datp, Ap3A oraz -S-ATP zwiększają wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia, natomiast stymulacji glukoneogenezy przez AMP, inozynęi hipoksantynęnie towarzyszy wzrost poziomu tych jonów. Oznacza to, że w przeciwieństwie do dotychczas powszechnie akceptowanej hipotezy, dla stymulacji glukoneogenezy nie jest niezbędny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia. P06-20 WŁAŚCIWOŚCI MONOWARSTW ORAZ DWUWARSTW LIPIDOWYCH UTWORZONYCH Z POLIPRENOLU I FOSFATYDYLOCHOLINY Teresa Janas A, Krzysztof Nowotarski B, Wiesław I. Gruszecki C, Tadeusz Janas B A: Zakład Fizyki, Politechnika Zielonogórska, Zielona Góra B: Zakład Biofizyki, Wyższa Szkoła Pedagogiczna, Zielona Góra C: Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Lublin Poliprenole są naturalnymi produktami pochodzenia roślinnego, są one utworzone z reszt prenylowych (C5). Cząsteczka długołańcuchowego poliprenolu-heksadekaprenolu (C80) składa sięz 16 reszt prenylowych o strukturze: omega-t2-c12- -OH, gdzie omega jest końcową resztą izoprenową, T jest resztą trans-izoprenową, C jest resztą cis-izoprenową, jest grupą izoprenową połączoną z grupą OH. Wykonano pomiary właściwości monowarstw oraz dwuwarstw lipidowych utworzonych z poliprenolu (heksadekaprenolu) i fosfatydylcholiny (DOPC). Zostały zmierzone izotermy ciśnienie powierzchniowe-obszar na cząsteczkę, zależności prądowo-napięciowe i zależność przewodności od temperatury. Obliczono przewodność elektryczną, energięaktywacji i współczynnik przepuszczalności dwuwarstwy dla jonów chloru oraz izobary, powierzchnięcząsteczki, energia swobodna mieszania, wartości ciśnienia i powierzchni dla kolapsu w przypadku monowarstw lipidowych. Heksadekaprenol zmniejsza energięaktywacji i zwiększa przewodność błon modelowych. Zarówno energia swobodna mieszania jak i powierzchnia cząsteczki poliprenolu zależą od względnego stężenia poliprenolu w monowarstwie. Wyniki badań wskazują, że heksadekaprenol zmienia własności transportowe błon lipidowych i modyfikuje ich organizację molekularną.

11 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 161 P06-21 WPŁYW MIAŻDŻYCY NACZYŃ KRWIONOŚNYCH I NIEKTÓRYCH CHORÓB NEURODEGRADACYJNYCH NA ZMIANY ILOŚCIOWE I JAKOŚCIOWE PURYN WE KRWI I W PŁYNIE MÓZGOWO-RDZENIOWYM CZŁOWIEKA M. Romanowska A, I. Pijarowska A, J. Łęcka B, M. Komoszyński A A: Zakład Biochemii, UMK, Toruń B: Katedra i Zakład Biochemii, AM, Bydgoszcz Ekto(E)-puryny są cząsteczkami sygnałowymi, które współdziałając z purynoreceptorami regulują proces hemostazy i ciśnienie krwi w układzie krwionośnym (UK), modulują aktywność metaboliczną ośrodkowego układu nerwowego (CNS) i aktywują receptory bólowe. Powyższe fakty pozwalają sądzić, że etiologia miażdżycy, zawału serca i mózgu, padaczki, ischemii i migreny może być związana ze zmianami w metabolizmie E-puryn. Do ilościowej i jakościowej analizy puryn we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym (pmr) człowieka użyto techniki HPLC RP stosując rozdział izokratyczny. W osoczu osób po zawale mięśnia sercowego (n=10) ilość puryn (Ino+Ado+AMP+ADP+ATP) wynosiła 6,1 M, natomiast w grupie kontrolnej (n=19) tylko 3,8 M. Stężenie ADP u osób chorych było 2x wyższe niż w grupie kontrolnej. Pomiędzy osoczami osób zdrowych i chorych stwierdzono istotne statystycznie różnice w stężeniu puryn tylko w przypadku Ado, AMP i ATP. Wyniki te wskazują na związek obserwowanych zmian w metabolizmie E-puryn z miażdżycą. Ilość puryn (IMP+Ino+Ado+AMP+ADP+ATP) w pmr chorych na migrenę(n=32) była 2x, w ischemii (n=33) 1,6x, po zawale mózgu (n=43) 2,6x wyższa, natomiast pmr chorych na padaczkę(n=37) zawierał 1,6x mniej puryn w stosunku do wartości fizjologicznej. Potwierdza to związek między zmianami w metabolizmie E-puryn a opisanymi wyżej jednostkami chorobowymi i wskazuje na możliwość zastosowania tych badań do diagnostyki schorzeń CNS. P06-22 ENZYMATYCZNA REGULACJA EKTO-PURYN W NACZYNIACH KRWIONOŚNYCH CZŁOWIEKA J. Łęcka A, M. Komoszyński B A: Katedra i Zakład Biochemii, AM, Bydgoszcz B: Zakład Biochemii, UMK, Toruń W naczyniach krwionośnych (NK) ATP, ADP i Ado współdziałając z purynoreceptorami modulują ciśnienie krwi i hemostazę. Stężenie ekto(e)-puryn we krwi, a więc i ich funkcje sygnałowe, kontrolowane są przez następujące E-enzymy: apirazę, ATPazę, 5 -nukleotydazę (5 -N), deaminazę adenozyny (ADA) oraz miokinazę. Szybkość degradacji ATP i powstawanie kolejnych produktów (E-puryn) w reakcjach katalizowanych przez te enzymy zależy od dostępności substratów, ich powinowactwa do enzymów, a także od wpływu wszystkich metabolitów na kolejne enzymy uczestniczące w łańcuchu przemian E-puryn. Założeniem tych badań jest twierdzenie, iż wiązanie E-puryn do receptorów zależy od ich stężenia we krwi. Badania wykonano na pooperacyjnych fragmentach NK, stosując do ilościowych i jakościowych oznaczeń puryn technikęhplc RP. Badania wykazały, iż najniższą Km (3, mola/l) posiada E-apiraza względem ADP. Pozostałe E-enzymy mają niższe powinowactwo do substratów (od jednego do dwóch tysięcy). Wartości Km pozwalają uszeregować badane E-enzymy NK w następujący sposób: apiraza-adp>apiraza-atp>ada ATPaza>ADP-miokinaza>5 -N. Uzyskane wyniki wskazują, iż ADP jest puryną, której stężenie w NK jest utrzymywane na niskim poziomie i regulowane przez dwa enzymy: E-apirazę i E-miokinazę. Tolerowana przez układ ilość ATP jest zdecydowanie wyższa niż ADP, chociaż i w tym wypadku poziom nukleotydu jest kontrolowany przez dwa enzymy: E-ATPazęi E-apirazę. Zdecydowanie najniższe powinowactwo E-5 -N do AMP i wysokie E-ADA do Ado sugeruje, iż E-5 -N jest odpowiedzialna za regulacjętransdukcji sygnału z udziałem Ado i receptorów P1. P06-23 METABOLIZM EKTOPURYN W WYBRANYCH STRUKTURACH MÓZGU WIEPRZOWEGO A. Wenderski, M. Romanowska, F. Kukulski, M. Komoszyński Z. Biochemii, Uniwersytet M. Kopernika, Toruń Celem prezentowanych badań było porównanie metabolizmu ekto(e)-puryn (pełniących w wielu tkankach funkcjęneurotransmiterów) w synaptosomach izolowanych z czterech różnych struktur mózgu: kory mózgowej

12 162 SESJA 6 PLAKATY (KM), hipokampu (H), móżdżku (M) i rdzenia przedłużonego (R). Aktywność enzymów metabolizujących E-puryny oznaczano na podstawie nukleotydowych produktów reakcji enzymatycznych, stosując HPLC RP. W pęcherzykach synaptosomalnych wszystkich przebadanych struktur mózgu stwierdziliśmy obecność E-ATPazy, E-apirazy, E-5 -nukleotydazy (E-5 N) oraz deaminazy E-adenozyny (E-ADA). Końcowym produktem przemian ATP z udziałem tych enzymów jest inozyna. Stwierdziliśmy, że aktywność ATPazy, apirazy i E-5 N w synaptosomach izolowanych z KM była podobna do aktywności tych enzymów w synaptosomach izolowanych z H. Obie struktury różniły sięwyraźnie aktywnością E-ADA, która w KM wynosiła 3,3 M Ino/min/mg i była przeszło pięciokrotnie wyższa niż w H. Fakt ten jest szczególnie interesujący bowiem wielu badaczy kwestionuje obecność tego enzymu w KM. Enzymem najbardziej aktywnym w M była E-ATPaza, której aktywność (183 M ADP/min/mg) była przeszło trzykrotnie wyższa w porównaniu z aktywnością apirazy. Aktywność wszystkich czterech E-enzymów w R była od 2 do 3 razy niższa od aktywności w innych przebadanych przez nas strukturach mózgu i wynosiła dla: ATPazy 60 M ADP/min/mg, apirazy 24 M AMP/min/mg, E-5 N 4 M Ado/min/mg i E-ADA 1 M Ino/min/mg. Wysoka aktywność enzymów degradujących E-puryny w H i KM potwierdza wcześniejsze sugestie o udziale E-puryn w procesach uczenia się i pamięci. P06-24 WPŁYW ANGIOTENSYNY II NA AKTYWNOŚĆ ANP-ZALEŻNEJ CYKLAZY GUANYLANOWEJ W HODOWLACH PODOCYTÓW KŁĘBKÓW NERKOWYCH MYSZY Barbara Lewko, Agnieszka Olszewska, Jan Stępiński Zakład Immunopatologii, Akademia Medyczna w Gdańsku Komórki podocytarne odgrywają kluczową rolęw regulacji filtracji kłębuszkowej w nerkach, a ich funkcja jest kontrolowana przez hormony wazoaktywne. Na komórkach tych znajdują sięreceptory dla czynników wazorelaksacyjnych jak ANP, jak i obkurczających jak Angiotensyna II. Celem tej pracy było zbadanie wzajemnych oddziaływań obu systemów i sprawdzenie w jakim stopniu AngII może modulować zdolność ANP do generowania cgmp w hodowlach podocytów. Mysie podocyty z nieśmiertelnej linii komórkowej (Dr P.Mundel, Heidelberg) hodowano na 24 dołkowych płytkach w środowisku RPMI z 10% FCS przez dni. Komórki preinkubowano w środowisku RPMI z 2% BSA w 37 C w obecności lub bez 1 M AngII. Po 0 60 minutach lub 24 godzinach w odpłukanych komórkach oznaczono aktywność błonowej GC w obecności 0,1 M ANP i 1 M IBMX. Aktywność określono w pmolach wytwarzanego cgmp (metodą RIA) w czasie 15 minut w przeliczeniu na mg białka. W porównaniu do ANP dodana równocześnie lub 5 minut przed dodaniem ANP AngII znacznie ograniczała syntezę cgmp (416±29 vs 640±32 pmol/mg białka, P<0.0005). Efekt ten odwracała 10 M saralazyna (559±25 pmol/mg białka). Przedłużenie czasu preinkubacji z Ang II do 60 minut stopniowo znosiło hamujący efekt tego mediatora na indukowaną przez ANP syntezęcgmp. 24 godzinna ekspozycja na AngII nie zmieniała odpowiedzi podocytów na ANP (589±79 pmol/mg białka). Wniosek: w podocytach AngII działając przypuszczalnie bezpośrednio przez swoje receptory hamuje aktywność cyklazy guanylanowej zależnej od ANP. Praca finansowana przez Grant KBN 4 P05A P06-25 KANAŁY JONOWE AKTYWOWANE PRZEZ cgmp W KOMÓRKACH STENTOR COERULEUS Mirosława Walerczyk, Bożenna Groszyńska, Stanisław Fabczak Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Zakład Biologii Komórki, Warszawa Stentor coeruleus jest orzęskiem wrażliwym na działanie światła. Wzrost intensywności oświetlenia w otoczeniu wywołuje odpowiedź ruchową komórek, zwaną reakcją fotofobową. Płynące do przodu komórki, poddane takiej stymulacji, zatrzymują sięz pewnym opóźnieniem, następnie przez pewien czas płyną do tyłu w wyniku rewersji ruchu rzęskowego, po czym ponawiają ruch do przodu. Rewersja ruchu rzęskowego jest związana z generacją potencjału czynnościowego, który z kolei jest wywołany powstaniem potencjału fotoreceptorowego w odpowiedzi na działanie bodźca. Badania behawioralne i biochemiczne wykazały, że cgmp, jako wtórny przekaźnik, może być włączony w proces przetwarzania bodźca świetlnego w badanym orzęsku. Przy użyciu przeciwciał przeciw cgmp stwierdzona została również obecność we frakcji korteksowej orzęsków białka o masie 63 kda, homologicznego do alfa podjednostki kanału jonowego aktywowanego przez cgmp w komórkach fotoreceptorowych kręgowców. Badania techniką patch-clamp wykazały w liposomach z wbudowaną frakcją korteksową występowanie kanałów jonowych, których aktywność jest regulowana przez cgmp. Przewodność takiego kanału wynosi około 30 ps i jest redukowana przez l-cis-diltiazem, specyficzny bloker kanałów zależnych od

13 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 163 cgmp. Występowanie kanałów jonowych aktywowanych przez cgmp zostało także potwierdzone w błonach natywnych badanego orzęska. Wyniki powyższych badań sugerują, że cgmp oraz kanały jonowe zależne od cgmp mogą uczestniczyć w procesie przekazywania bodźców świetlnych i reakcji fotofobowej u orzęsków Stentor. P06-26 MODULACJA REAKCJI FOTOFOBOWEJ U ORZĘSKA BLEPHARISMA JAPONICUM PRZEZ PROCESY FOSFORYLACJI I DEFOSFORYLACJI SERYNY Hanna Fabczak, Bożena Groszyńska, Anna Mirgos, Stanisław Fabczak Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Zakład Biologii Komórki, Warszawa Orzęski Blepharisma japonicum reagują na wzrost natężenia światła krótkotrwałą rewersją ruchu rzęskowego (reakcja fotofobowa). Zjawisku temu towarzyszą zmiany elektryczne na błonie komórkowej (potencjał fotoreceptorowy i potencjał czynnościowy). Wstępne badania behawioralne wykazały, że BIM (inhibitor białkowej kinazy A, PKA i białkowej kinazy C, PKC) oraz estry forbolu, (aktywator PKC) w znacznym stopniu modyfikują reakcjęfotofobową. W obecności inhibitora tych kinaz wzrasta wrażliwość komórek na działanie światła. Skróceniu ulega opóźninie z jakim występuje reakcja fotofobowa oraz większa liczba komórek reaguje na bodziec. Odwrotny efekt obserwowany jest w obecności estrów forbolu. Wyniki tych doświadczeń nasuwają przypuszczenie, że w proces przetwarzania bodźca świetlnego u tych orzęsków włączone są procesy fosforylacji i defosforylacji białek. Zastosowanie specyficznych przeciwciał na fosfoserynęumożliwiło porównanie poziomu fosforylacji tego aminokwasu w poszczególnych białkach lizatu komórkowego po stymulacji światłem Blepharisma, w obecności BIM i KCl (czynnika depolaryzującego błonękomórkową). Analiza tych doświadczeń pozwoliła zlokalizować przynajmniej trzy polipeptydy w specyficzny sposób ulegające fosforylacji. P06-27 ZABURZENIA METABOLIZMU WAPNIOWEGO W CHOROBACH MITOCHONDRIALNYCH Magdalena Waśniewska A, Elżbieta Karczmarewicz B, Katarzyna Mroczek C, Dorota Abramczuk B, Ewa Bartnik C, Ewa Pronicka B, Ewa Popowska B, Jerzy Duszyński A A: Instytut Biologii Doświadczalnej PAN, Warszawa B: Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa Międzylesie C: Zakład Genetyki UW, Warszawa W komórkach niepobudliwych elektrycznie opróżnienie wewnątrzkomórkowych magazynów wapniowych siateczki śródplazmatycznej (ER) powoduje aktywacjękanałów wapniowych SOCs (store operated channels) w błonie plazmatycznej i w konsekwencji napływ Ca 2+ do cytosolu. Zniesienie potencjału mitochondrialnego hamuje ten napływ. Badania prowadzono na fibroblastach pobranych od osób zdrowych i pacjentów z zaburzeniami funkcjonowania łańcucha oddechowego, spowodowanymi: (1) mutacją T8993C w mtdna w genie kodującym podjednostkę a mitochondrialnej ATP-azy F o F 1. Zawartość zmutowanego mtdna wahała sięod 50% do 95%, (2) mutacją w jądrowym genie SURF1, kodującym białko surf1p, odpowiedzialne za składanie IV kompleksu łańcucha oddechowego. Badano zaburzenia homeostazy jonów wapniowych w komórkach pochodzących zarówno od osób zdrowych, jak i chorych. We wszystkich przypadkach, w komórkach spoczynkowych stężenie Ca 2+ w cytosolu było podobne. Natomiast napływ Ca 2+ ze środowiska zewnętrznego do komórki indukowany opróżnieniem magazynów wapniowych, był znacznie zahamowany w komórkach pochodzących od pacjentów, w porównaniu z kontrolą. Zniesienie potencjału mitochondrialnego w wyniku dodania CCCP do komórek pochodzących od pacjentów nie wpływało na napływ Ca 2+ ze środowiska zewnętrznego do komórki, w przeciwieństwie do komórek kontrolnych. Wstępne wyniki pomiarów potencjału mitochondrialnego wskazują na znaczne jego obniżenie w komórkach pochodzących od pacjentów.

14 164 SESJA 6 PLAKATY P06-28 RECEPTOR FC II ASOCJUJE Z DOMENAMI BŁONY KOMÓRKOWEJ BOGATYMI W CHOLESTEROL I SFINGOLIPIDY, GDZIE JEST FOSFORYLOWANY PRZEZ KINAZĘ TYROZYNOWĄ Lyn Marek Korzeniowski, Katarzyna Kwiatkowska, Andrzej Sobota Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Warszawa Fosforylacja receptora Fc II (Fc II) przez kinazy tyrozynowe z rodziny Src zapoczątkowuje przekazywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych w czasie aktywacji receptora. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że fosforylacja receptora zachodzi w trakcie jego agregacji w płaszczyźnie błony komórkowej. Z uwagi na fakt, że kinazy z rodziny Src skupione są w obrębie domen błony komórkowej bogatych w cholesterol i sfingolipidy założyliśmy, że domeny te mogą być miejscem interakcji zagregowanego receptora FcII z kinazami. Stosując technikęchromatografii i wirowania w gradiencie gęstości wyizolowaliśmy z monocytów linii U937 wysokocząsteczkowy kompleks, który zawierał zagregowany receptor FcII. W kompleksie tym stwierdziliśmy również obecność kinazy Lyn, jednej z kinaz z rodziny Src. Tylko receptor FcII wchodzący w skład wysokocząsteczkowego kompleksu ulegał fosforylacji. Badania przy użyciu metody immunoprecypitacji i obserwacje ultrastrukturalne wykazały, że zagregowany receptor FcII i kinaza Lyn współwystępują w obrębie nm fragmentów błony komórkowej nierozpuszczalnych w detergentach niejonowych. Kompleks receptora FcII i kinazy Lyn otrzymywano w zakresie stężeń detergentu od 1,5% do 0,05%. Wraz ze zmniejszającym się stężeniem detergentu ilość kinazy Lyn współwystępującej z receptorem FcII wzrastała. Około 50% wyizolowanego kompleksu zawierającego receptor FcII i kinazęlyn wykazywało niską gęstością właściwą: 1,060 1,110 g/ml, charakterystyczną dla domen błony komórkowej bogatych w cholesterol i sfingolipidy. Nasze dane wskazują, że w czasie aktywacji receptor FcII ulega agregacji asocjując z cholestrolowo-sfingolipidowymi domenami błony komórkowej, gdzie jest fosforylowany przez kinazę Lyn. P06-29 CZYNNIKI MODYFIKUJĄCE ZALEŻNĄ OD PKC DROGĘ PRZEKAZYWANIA SYGNAŁU W LUDZKICH ERYTROCYTACH Maria Rybczyńska, Krzysztof Książek Zakład Chemii Klinicznej, Katedra Biochemii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego, Poznań PKC należy do grupy serynowo-treoninowych kinaz białkowych i odgrywa znaczącą rolęw procesach przekazywania sygnału, proliferacji i różnicowania komórek nowotworowych [Boorne A.J., Donelly N., Schrey M.P.,1998, Breast Cancer Res.Treat., 48, ]. Heksadecylofosfocholina (HePC) modyfikuje działanie PKC poprzez hamowanie aktywności fosfolipazy C [Grunicke H.H, Maly K., Tinhofer I., Giselbrecht S., Ûberall F.,1998, Drugs of Tooday, 34, 3 14.], lub w wyniku konkurencji o miejsce wiążące w cząsteczce PKC z fosfatydyloseryną [Ûberall F., Oberhuber H., Maly K., Zuknun J., Demuth L., Grunicke H.H.,1991, Cancer Res ]. Drugim modulatorem, którego wpływ analizowano jest promieniowanie (IR). Celem pracy było wykazanie wpływu HePC w zakresie stężeń nie wywołujących hemolizy 0,5 M -5,0 M oraz IR w dawkach 25Gy i 50Gy na stymulowane PMA przemieszczanie izoformy PKC z cytosolu do błony komórkowej erytrocytu oraz określenie wpływu obu tych czynników na wyjściową zawartość PKC w błonie komórkowej. Obecność PKC wykazano metodą elektroforezy na 7,5% PAG-SDS, transferu na błonę Immobilon P oraz dzięki zastosowaniu przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko PKC. Stwierdzono, że HePC hamuje stymulowane PMA przemieszczanie PKC do błony erytrocytu w stopniu zależnym od stężenia, a promieniowanie w stopniu zależnym od dawki. Ponadto HePC w stężeniu 5 M oraz IR w dawce 50 Gy zmniejszają wyjściową zawartość PKC w błonie co wskazuje na synergistyczne działanie tych czynników.

15 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 165 P06-30 REGULACJA METABOLIZMU ENERGETYCZNEGO RAKA PĘCHERZA (T[24]) WYWOŁANA ZMIANĄ ELASTYCZNOŚCI KOMÓRKI POD WPŁYWEM MIKROKRYSTALICZNEGO CHITOZANU Jan Ignacak A, Małgorzata Lekka B, Henryk Struszczyk C, Iwona Pałka A, Maryla Łabędź A, Piotr Laidler A A: Instytut Biochemii Lekarskiej CM UJ, Kraków B: Instytut Fizyki Jądrowej, Kraków C: Instytut Włókien Chemicznych, Łódź Wykazano ostatnio, że mikrokrystaliczny chitozan (poli-[2-dezoksy-2-aminoglukoza], produkt depolimeryzacji i deacetylacji chityny) hamuje aktywność glikolityczną komórek nowotworowych. Prowadzone badania na komórkach raka pęcherza (T 24 ) z użyciem chitozanu o różnym stopniu deacetylacji, wykazały hamowanie aktywności glikolitycznej co wyrażało sięobniżeniem poziomu ATP i produkcji mleczanu. Efektu tego nie obserwowano w komórkach prawidłowych nabłonka moczowodu (HCV). Elastyczność komórek nowotworowych (wyrażana wartością modułu Young a) zbadana za pomocą skaningowego mikroskopu sił (SFM) okazała siędużo niższa niż elastyczność referencyjnych komórek prawidłowych. W obecności mikrokrystalicznego chitozanu o najwyższym stopniu deacetylacji (97%) obserwowano największy spadek elastyczności, a wartości modułu Young a były porównywalne z wartościami dla komórek prawidłowych. Zmniejszenie elastyczności komórek nowotworowych dobrze korelowało z obniżeniem poziomu ATP (wsp. korelacji 0,9504) i zahamowaniem produkcji mleczanu (wsp. korelacji 0,9963).Błony komórek nowotworowych posiadają ujemny ładunek powierzchniowy niższy niż błony komórek prawidłowych. Zwiększony charakter anionowy błon nowotworów powoduje osłabienie adhezji międzykomórkowej, brak hamowania wzrostu i ruchu oraz zmiany organizacji cytoszkieletu komórki. Wyraża się to między innymi różną elastycznością komórek nowotworowych i prawidłowych. Zmiana elastyczności komórek nowotworowych pod wpływem mikrokrystalicznego chitozanu, powoduje prawdopodobnie reorganizację cytoszkieletu co może mieć wpływ na obniżenie aktywności izoenzymu M 2 kinazy pirogronianowej, bezpośrednio odpowiedzialnego za syntezę ATP. P06-31 MITOCHONDRIALNY RECEPTOR BENZODIAZEPINOWY PROTISTA M. Słocińska, O. Stobienia, L. Hryniewiecka Zakład Bioenergetyki, Instytut Biologii Molekularnej I Biotechnologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Poznań Mitochondrialny receptor benzodiazepinowy (mbzr) został zidentyfikowany po raz pierwszy w komórkach ssaków. W jego skład wchodzą: kanał VDAC, translokaza nukleotydów adeninowych i białko o masie 18 kda. Obiektem badań były mitochondria izolowane z komórek ameby Acanthamoeba castellanii i drożdży Saccharomyces cerevisiae. Uzyskane wyniki wykazały, że ligandy mbzr (diazepam i Ro5-4864) w stężeniach 1 5 M obniżają przewodnictwo kanału VDAC do 2 ns. W tym stanie kanał jest nieprzepuszczalny dla nukleotydów adeninowych. Nie zauważono jednak wpływu ligandów na aktywność kinazy adenylanowej, która to spełnia funkcje równoważnika nukleotydów adeninowych w przestrzeni międzybłonowej a w warunkach beztlenowych pracuje w kierunku formowania ADP z ATP i AMP. Oddziaływanie benzodiazepin na oddychanie i sprzężenie mitochondriów było dużo mniej wyraźne niż opisane dla mitochondriów ssaków. Dopiero 30 mm stężenie Ro powodowało wyraźne obniżenie zużycia tlenu w stanie fosforylacyjnym i spadek kontroli oddechowej w mitochondriach ameby. W szczepie dzikim i bezporynowym mutancie drożdży efekt Ro był widoczny odpowiednio przy stężeniach 10 i 30 M. Diazepam powodował we wszystkich analizowanych typach mitochondriów spadek kontroli oddechowej przy wysokim, 30 M stężeniu. Wykazano, że powinowactwo i specyfika działania ligandów mitochondrialnego receptora benzodiazepinowego, diazepamu i Ro są dużo mniejsze niż w mitochondriach ssaków.

16 166 SESJA 6 PLAKATY P06-32 WPŁYW KWASU TANINOWEGO I PROTOKATECHOWEGO NA POZIOM IZOENZYMÓW S-TRANSFERAZY GLUTATIONU W WĄTROBIE I NERKACH SZCZURA Violetta Krajka-Kuźniak, Jerzy Gnojkowski, Wanda Baer-Dubowska Katedra Biochemii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego, Poznań Powszechnie występujące w jadalnych owocach i warzywach fenolokwasy wykazują zdolność modulacji procesu kancerogenezy i należą do potencjalnych czynników chemoprewencyjnych mogących mieć zastosowanie w profilaktyce onkologicznej. Prosty kwas fenolowy, kwas protokatechowy oraz kwas taninowy, ester glukozy i kwasu galusowego wykazują zdolność modulacji procesu kancerogenezy poprzez m.in. indukcjęenzymów II fazy. Celem prezentowanej pracy była ocena wpływu kwasu protokatechowego i taninowego oraz 3-metylocholantrenu na aktywność S-transferazy glutationu i jej izoenzymy. Badania przeprowadzono na szczurach samcach szczepu Wistar. Badane związki podawano ip. w dawce 50 mg/kg masy ciała 2 razy w tygodniu przez okres 14 dni. Izoenzymy oznaczano we frakcji cytoplazmatycznej wątroby i nerkach szczura. Rozdział przeprowadzono na drodze HPLC. Stwierdzono zróżnicowany wpływ kwasu protokatechowego i taninowego na aktywność GST zależny od badanego narządu. Dootrzewnowe podanie kwasu protokatechowego zwiększało aktywność GST w wątrobie szczura pozostając bez wpływu na aktywność w nerkach. Kwas protokatechowy obniżał indukujące działanie 3-metylocholantrenu w obu narządach. W wątrobie kwas protokatechowy podwyższał poziom izoenzymu klasy mi z jednoczesnym obniżeniem izoenzymu z klasy. W nerkach obniżał znacznie jedynie izoenzymy z klasy. Łączne podanie kwasu protokatechowego i 3-metylocholantrenu obniżało indukujące działanie 3-MC wobec podjednostek klasy i. Statystycznie znamienne podwyższenie stwierdzono dla podjednostek z klasy i w nerkach szczurów, którym łącznie podawano kwas protokatechowy i 3-metylocholantren. Kwas taninowy nie zmieniał statystycznie znamiennie aktywności GST w obu narządach. Nieznaczny wzrost aktywności GST w nerkach, charakteryzował siępodwyższeniem izoenzymów z wszystkich klas. Łączne podanie 3-metylocholantrenu i kwasu taninowego podwyższało całkowitą aktywność GST w wątrobie, a obniżało w nerkach w stosunku do 3-metylocholantrenu. U szczurów traktowanych łącznie 3-metylocholantrenem i kwasem taninowym zaobserwowano wzrost klasy i przy nieznacznym spadku podjednostek klasy. Z kolei w wątrobie dla tej samej grupy zwierząt kwas taninowy obniżał poziomy izoenzymów z klasy, a podwyższał z klasy. Uzyskane wyniki sugerują, że chociaż wpływ obu kwasów na aktywność GST jest umiarkowany to oddziaływanie na poszczególne klasy izoenzymów GST może odgrywać ważną rolęw chemoprewencyjnym działaniu kwasu protokatechowego i taninowego. P06-33 WPŁYW ROŚLINNYCH ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH NA ROZMIESZCZENIE IZOENZYMÓW KINAZY BIAŁKOWEJ C W NASKÓRKU MYSZY PODDANYM DZIAŁANIU ESTRU FORBOLU Hanna Szaefer, Jolanta Kaczmarek, Maria Rybczyńska, Wanda Baer-Dubowska Katedra Biochemii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego, Poznań Kwas taninowy, roślinny polifenol hamuje etap promocji wywołany działaniem octanu 12 O-tetradekanoiloforbolu (TPA) w modelu skórnej kancerogenezy u myszy. Efekt promocyjny TPA jest wynikiem między innymi jego wiązania do komórkowego receptora kinazy białkowej C (PKC). PKC jest specyficzną kinazą serynowo-treoninową, która wpływa na kilka docelowych białek, modulując ich funkcjębiologiczną i uczestnicząc w przekazywaniu sygnału w komórce. PKC reprezentuje rodzinęprzynajmniej 11 izoenzymów, które mogą być podzielone na 3 główne grupy: zależne od wapnia lub klasyczne PKC (,, ), niezależne od wapnia lub nowe PKC (, ) oraz atypowe PKC ( ). Liczne badania wykazały, że nałożenie TPA na skóręmyszy powoduje znaczące przemieszczenie izoenzymów PKC z frakcji cytoplazmatycznej do błonowej. Celem prezentowanej pracy było stwierdzenie, czy kwas taninowy oraz proste kwasy fenolowe: protokatechowy i chlorogenowy mogą oddziaływać na wywołaną TPA translokacjęizoenzymów PKC:, 1, 2 i z frakcji cytoplazmatycznej do błonowej. Oznaczanie zawartości izoenzymów PKC przeprowadzono na drodze immunoblotingu i skanowania densytometrycznego po zastosowaniu odpowiednich przeciwciał. W celu oceny optymalnego czasu oddziaływania TPA na translokacjępkc zastosowano początkowo dwa czasy ekspozycji 15 minut i 48 godzin. Wyraźniejsze przemieszczenie PKC w stosunku do grupy kontrolnej zaobserwowano po 48 godzinach od nałożenia promotora. Nakładanie na 15 minut przed 48 godzinną ekspozycją na TPA roślinnych fenoli w zróżnicowany sposób wpływało na rozmieszczenie izoenzymów PKC. Wszystkie badane związki hamowały przemieszczenie izoenzymu z cytoplazmy do błon. Najskuteczniejszym inhibitorem translokacji PKC okazał siękwas chlorogenowy. Związek ten nieznacznie podwyższał poziom izoenzymów, 1 i 2 we frakcji cytoplazmatycznej, wyraźnie zmniejszając ich zawartość w błonach.

17 BŁONY KOMÓRKOWE: SYGNALIZACJA I BIOENERGETYKA 167 Po nałożeniu kwasu protokatechowego zaobserwowano natomiast inhibicjętranslokacji izoenzymu. Uzyskane wyniki sugerują, że modyfikacja rozmieszczenia izoenzymów PKC pod wpływem badanych roślinnych fenoli może być związana z antypromocyjnym działaniem tych związków. P06-34 MODULACJA AKTYWNOŚCI S-TRANSFERAZ GLUTATIONU PRZEZ PRZECIWUTLENIACZE FENOLOWE Jerzy Gnojkowski, Violetta Krajka-Kuźniak, Wanda Baer-Dubowska Katedra Biochemii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego, Poznań S-transferazy glutationu (GST, E.C ) są multigenową rodziną enzymów uczestniczących w ochronie komórek przed cytotoksycznym, mutagennym i kancerogennym działaniem różnych elektrofilowych substancji. Dotychczas zidentyfikowano następujące główne klasy GST,,,, i. Uważa się, że różnice w indukcji i ekspresji specyficznych izoform GST mogą być ważną determinantą docelowego narządu oraz wrażliwości gatunkowej. Wykazanie zdolności wielu naturalnie występujących produktów roślinnych do indukowania GST zwróciło uwagęna rolędiety w indukcji GST jako mechanizmu wyjaśniającego antykancerogenne efekty owoców i warzyw. Istnieją poważne dowody pochodzące z eksperymentów na zwierzętach wskazujące, że indukcja GST może zmniejszać skuteczność i siłęrozmaitych kancerogenów chemicznych. Wśród wielu substancji, które w warunkach laboratoryjnych chronią przed rakiem, ważną grupęstanowią roślinne związki fenolowe. W pracy zbadano wpływ dootrzewnowego podania szczurom dwóch polifenoli roślinnych, kwasu protokatechowego i kwasu taninowego oraz syntetycznych estrów kwasu galusowego stosowanych w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym w celu ochrony wielonienasyconych kwasów tłuszczowych przed oksydacyjnym rozkładem, na aktywność GST frakcji cytoplazmatycznej wątroby i nerek. Pożyteczną i praktyczną metodą wpływu różnych czynników na skład izoenzymowy S-transferaz glutationu może być pomiar specyficznej substratowo aktywności charakterystycznej dla poszczególnych izoform. W pracy do badania aktywności GST stosowano następujące substraty: 1-chloro-2,4-dinitrobenzen, CDNB; 1,2-dichloro-4-nitrobenzen, DCNB; chlorek 4-nitrobezylowy, CNB oraz kwas etakrynowy, KE. Uzyskane wyniki sugerują, że obserwowane zmiany aktywności pod wpływem badanych związków fenolowych mogą być rezultatem modyfikacji profilu izoenzymowego S-transferaz glutationu. Zmiany te charakteryzują sięspecyficznością narządową. W wątrobie nastąpił wzrost aktywności GST klasy pod wpływem estrów kwasu galusowego i GST oraz pod wpływem kwasu protokatechowego, natomiast galusan dodecylu obniżał aktywność GST klas pi i. Nie obserwowano zmian po podaniu kwasu taninowego. W nerkach kwas protokatechowy zwiększał a kwas taninowy obniżał aktywność GST klas i. Galusany zwiększały aktywność izoenzymów należących do klas i. Przedstawione wyniki wskazują na możliwość oddziaływania związków fenolowych na skład izoenzymowy S-transferaz glutationu. Rezultatem tej modyfikacji mogą być zmiany w poziomie reaktywnych metabolitów, co w konsekwencji prowadzić będzie do różnic w toksycznej odpowiedzi osób eksponowanych na naturalne i syntetyczne związki chemiczne w miejscu pracy, diecie i środowisku.