Potencjał rozwojowy i terapeutyczny komórek T regulatorowych. w modelowym reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów

Transkrypt

1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej Isaura Felcenloben Potencjał rozwojowy i terapeutyczny komórek T regulatorowych w modelowym reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów Developmental and therapeutic potential of regulatory T cells in a model of rheumatoid arthritis in rats Praca doktorska wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Anny Chełmońskiej-Soyta Wrocław 2014

2 Żródła finansowania pracy 1) Grant KBN nr N N ; Udział komórek regulatorowych w reumatoidalnym zapaleniu stawów u psów ; kierownik projektu: prof.dr hab. Kornel Ratajczak. 2) Grant PRELUDIUM III (NCN) nr UMO-2012/05/N/NZ5/00873; Podłoże molekularne ekspansji poliklonalnej komórek T regulatorowych stymulowanych kwasem retinowym w warunkach in vitro, kierownik projektu: mgr inż. Isaura Felcenloben 3) Działalność Celowa dla Młodych Naukowców 2011 nr 13/DD/2011. Optymalizacja warunków wydajnej hodowli in vitro komórek T regulatorowych ; kierownik projektu: mgr inż. Isaura Felcenloben. 4) Działalność Celowa dla Młodych Naukowców 2012 nr Mwet/272/2012/S.C.; Detekcja stężeń cytokin IL-1,IL-6,IL-10 I IL-17, na poziomach mrna i białak, u szczurów Wistar w trakcie rozwoju CIA, kierownik projektu: mgr inż. Isaura Felcenloben. 5) Grant Plus nr DG-G/4191/13; Potencjał rozwojowy i terapeutyczny komórek T regulatorowych w modelowym reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów, kierownik projektu: mgr inż. Isaura Felcenloben Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w Ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. 4

3 STRESZCZENIE Komórki T regulatorowe (Tregs z ang. regulatory T cells) pełnią supresyjną funkcję w wyciszaniu ognisk autoimmunologicznych w organizmach żywych tym samym Tregs mogą pełnić istotną rolę immunomodulacyjnego narzędzia w terapiach bazujących na transferze adaptywnym. Dlatego nadrzędnym celem pracy było opracowanie, przetestowanie oraz ocena skuteczności terapii bazującej na transferze adaptywnym komórek T regulatorowych u szczurów z CIA (zwierzęcy model reumatoidalnego zapalenia stawów). Ponadto cele szczegółowe zakładały poznanie dynamiki, wybranych, komórkowych i molekularnych zmian zachodzących w trakcie rozwoju CIA oraz porównanie potencjału komórek CD4+CD25-, izolowanych od szczurów z CIA lub od zdrowych, do różnicowania się do fenotypu komórek T regulatorowych w obecności kwasu all-trans retinowego w celu poznania zarówno mechanizmów aktywacji jak i potencjału terapeutycznego komórek T regulatorowych. Badania wykonywano w ramach 3 niezależnych eksperymentów, których przedmiot badań stanowiły: 1. Dynamika molekularnych zmian w trakcie rozwoju CIA. W tej części badań obserwowano dynamikę zmian w rozwoju CIA, u 6-cio tygodniowych samic szczurów Wistar przez 28 dni od pierwszej immunizacji bydlęcym kolagenem typu II-go (CII): objawów klinicznych (objawy makroskopowe, zmiany w obrazie rentgenograficznym i histologicznym), odpowiedzi humoralnej przeciwciał klasy IgG anty-cii, frekwencję komórek T regulatorowych CD4+CD25+FOXP3+, poziom transkryptomów foxp3 i erα oraz il-10 i il Dostawowy transfer adaptywny itregs szczurom z CIA. W ramach tego obszaru badawczego przeprowadzono hodowlę itregs w obecności 17-β-estradiolu, w celu zweryfikowania jego przydatności jako induktora proliferacji komórek CD4+CD25+ i ich różnicowania w itregs przeznaczonych do terapii immunomodulującej bazującej na transferze adaptywnym. Ponadto przeprowadzono transfer adaptywny komórek itregs u 6-cio tygodniowych samic szczurów Wistar, które podzielono na 3 grupy: szczury zdrowe, szczury z wczesnym stadium rozwoju CIA, szczury z pełnoobjawowym CIA. Oceniano 11

4 skuteczność transferu komórek w kontekście migracji podawanych dostawowo itregs i redukcji objawów klinicznych w zależnośći od stopnia rozwoju modelowego CIA. 3. Podłoże molekularne ekspansji poliklonalnej komórek T regulatorowych stymulowanych kwasem retinowym w warunkach in vitro. Ostatnia część prowadzonych badań dotyczyła: określania statusu klinicznego szczurów zdrowych i szczurów z CIA na podstawie obserwacji makroskopowych, analizy rentgenograficznej, analizy histologicznej oraz obecności przeciwciał anty-cii. Określono fenotyp i frekwencję komórek T regulatorowych uzyskanych z wysortowanych komórek CD4+CD25- oraz po ich hodowli w obecności ATRA. Ponadto określono zdolność wydzielania IL-10 przez komórki CD4+FOXP3+ uzyskanych z wysortowanych komórek CD4+CD25- oraz po ich po hodowli w obecności ATRA. Zbadano ekspresję genów foxp3, rarα, rarβ, rxrβ, ppar β/δ w komórkach CD4+CD25-, po stymulacji ATRA oraz ekspresję białek Rarα; Rarβ, Rxrβ. Eksperyment ten miał na celu porównanie potencjału komórek CD4+CD25- izolowanych od szczurów z CIA lub od zdrowych, do różnicowania się w kierunku fenotypu komórek T regulatorowych w obecności kwasu all-trans retinowego w celu poznania zarówno mechanizmów aktywacji jak i potencjału terapeutycznego komórek T regulatorowych. W ramach zrealizowanej pracy doktorskiej wykazano, że: najwyższa frekwencja Tregs na obwodzie jest obserwowana w 7. dniu po pierwszej immunizacji CII i stanowi optymalny moment izolacji komórek CD4+CD25+ od zwierząt z CIA przeznaczonych do propagacji w warunkach in vitro oraz zastosowania ich w immunomodulacyjnej terapii leczenia modelowego RZS bazującej na transferze adaptywnym, z uwagi na wczesną aktywację mechanizmów regulacyjnych w kompartmencie obwodowym u szczurów w przebiegu indukowanego kolagenem zapalenia stawów ingerencja terapeutyczna polegająca na wsparciu mechanizmów regulacyjnych powinna odbywać się w bardzo wczesnych etapach rozwoju RZS, 17-β-estradiol jest dobrym induktorem proliferacji komórek CD4+CD25+ i ich różnicowania w itregs. Hodowli komórek CD4+CD25+ z 17-β-estradiolu jest odpowiednim rozwiązaniem dla uzyskania itregs dla transferu adaptywnego, 12

5 efektywność przeprowadzonego transferu adaptywnego itregs zależy od momentu podania komórek w trakcie rozwoju CIA, ale odpowiedź na takie leczenie jest wysoko zindywidualizowana oraz jest zależna od stadium choroby, migracja podawanych na drodze transferu adaptywnego itregs podobnie jak frekwencja obwodowych, fizjologicznie obecnych w organizmie Tregs są różne u zwierząt zdrowych, z rozwijającym się CIA a w pełni rozwiniętym CIA, komórki CD4+CD25- izolowane od zwierząt z CIA i od zwierzat zdrowych charakteryzują się różnym potencjałem róznicowania w kierunku komórek CD4+CD25+CD44+FOXP3+, co wskazuje na konieczność badania fenotypu i potencjału komórek izolowanych od osobników, u których miałaby zostać zastosowana terapia immunomodulacyjne bazująca na transferze adaptywnym komórek podawanych ex vivo, receptor kwasu retinowego Rxrβ jest obecny w komórkach CD4+CD25- izolowanych od zwierząt z CIA, co wskazuje, że może on być celem terapeutycznej interwencji z uwagi na jego szerokie oddziaływania z kluczowymi w wielu schorzeniach receptorami LXR czy PPARγ. 13

6 ABSTRACT Regulatory T cells (Tregs) play an important suppressive role in amelioration of autoimmune response in mammals and so Tregs can fulfill an important role as a tool in the immunomodulatory therapies based on the adoptive transfer. Therefore, the major objective of the study was to develop, test and evaluate the effectiveness of therapy based on the adoptive transfer of regulatory T cells in rats with CIA (animal model of rheumatoid arthritis). The specific objectives assumed learning of cellular dynamics and molecular changes that occur during the development of CIA and comparing the potential of CD4+CD25- cells, isolated from CIA or normal rats, to differentiate into itregs phenotype in the presence of all-trans retinoic acid. The aim of this was to investigate both activation mechanisms and therapeutic potential of regulatory T cells. The study was performed within three independent experiements devoted to assessment of: 1. The dynamics of molecular changes during the development of the CIA. In this part of the study the dynamics of changes in the development of CIA were observed in 6-week old female Wistar rats for 28 days after the first immunization with bovine collagen type II (CII). Observation included: clinical symptoms (signs of macroscopic changes in the X-ray and histological analysis), the humoral response anti-cii in IgG class, frequency of regulatory T cells (CD4+CD25+FOXP3+), gene expression of foxp3, erα, il-10 and il Intra-articular adaptive transfer of itregs into rats with CIA. Within this area of research, itregs were cultured in the presence of 17-β-estradiol as an inducer of both cell proliferation of CD4+CD25+ cells and differentiation in itregs for immunomodulatory therapy based on adoptive transfer. In addition, an adoptive transfer of itregs cells was conducted in 6-week old Wistar rats which were divided into three groups: healthy rats, rats with early stage of CIA, and rats with fully developed CIA. The aim was to test the immunomodulatory therapy based on the adoptive transfer in a rat model of CIA to assess it`s 14

7 effectiveness in the context of migration of itregs administered intra-articularly and reduce characteristic clinical signs of the CIA. 3. The molecular basis of polyclonal expansion of regulatory T cells stimulated in vitro by retinoic acid. The last part of the study focused on determining the clinical status of both healthy rats and rats with the CIA on the basis of observations of symptoms, X-ray analysis, histological analysis and a level of anti CII response. Also, during this part of research frequency of regulatory T cells and their ability to secretion of IL-10 by CD4+ FOXP3+ was examined in sorted CD4+ CD25-, which was cultured in vitro in the presence of ATRA or in control conditions. Next step was examination of the foxp3, rarα, rarβ, rxrβ, ppar β/δ genes expression in cells after stimulation with ATRA and tests of the Rarα, Rarβ and Rxrβ protein expression. The aim of this last area of research was to compare the potential of CD4+CD25- cells, isolated from both healthy rats and rats with CIA, for differentiating into regulatory T cells in the presence of alltrans retinoic acid in order to learn more about activation mechanisms and therapeutic potential of regulatory T cells. Results of the dissertation indicated that: the highest frequency of Tregs at the periphery is observed on 7 th day after the first CII immunization, and it s an optimal point of time for the isolation of CD4+CD25+ cells dedicated for propagation in vitro for the immunomodulatory therapies of model RA based on adoptive transfer, due to the early activation of regulatory mechanisms in the peripheral compartment in rats during the course of collagen-induced arthritis, the therapeutic intervention aiming to support regulatory mechanisms should take place in the very early stages of RA, 17-β-estradiol is a good inducer of both proliferation of CD4+CD25+ and differentiating them into itregs. Culturing in vitro of CD4+CD25+ with 17-β-estradiol is a good solution to provide itregs for the adoptive transfer, 15

8 efficiency of adoptive transfer of itregs depends on the moment of administration of cells during development of CIA, however the response to such treatment is highly individualized, and dependent on the stage of the disease, migration of adoptive transferred itregs, similarly like the frequency of peripheral, physiologically present Tregs in the body, is different in healthy rats and in rats with fully developed CIA, CD4+CD25- cells isolated from healthy animals or from animals with CIA are characterized by different potential of the differentiation into CD4+CD25+CD44+FOXP3+ cells. What indicates a necessity to study the phenotype and potential of cells isolated from individuals for the immunomodulatory therapies based on the adoptive transfer of cells administered ex vivo, retinoic acid receptor Rxrβ is present in the CD4+CD25- cells isolated from rats with CIA - what, in the context of literature, confirms the possible therapeutic potential of this protein due to its widespread interaction with PPARγ or LXR receptors which are key factors in pathogenesis of several inflammatory diseases 16