(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 5/077 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/12 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Komórki macierzyste uzyskane z miazgi zębów mlecznych lub stałych i zawiązków zębów, zdolne do tworzenia ludzkiej tkanki kostnej (30) Pierwszeństwo: IT NA (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/16 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/08 (73) Uprawniony z patentu: Teslab S.r.l., Napoli, IT (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FRANCESCO CARINCI, Bologna, IT RICCARDO D'AQUINO, Napoli, IT ALFREDO DE ROSA, Napoli, IT ANTONIO GRAZIANO, Napoli, IT GREGORIO LAINO, Torre del Greco, IT GIANPAOLO PAPACCIO, Napoli, IT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 3 17/P28066PL00 EP B1 Opis Stan techniki [0001] W ostatnich dekadach rehabilitacja estetyczna, morfologiczna i czynnościowa okolicy ustno-szczękowotwarzowej osiągnęła wysokie standardy, ze względu na postęp we wszystkich dyscyplinach związanych ze stomatologią, takich jak anestezjologia, mikrochirurgia i farmakologia. [0002] Nadal jednak ograniczeniem w dążeniu do osiągnięcia odpowiedniej rehabilitacji jest zmniejszenie ilości tkanki kostnej. Zmniejszenie ilości tkanki kostnej można klasyfikować w odniesieniu do lokalizacji (to znaczy jako objaw związany z tkankami okołozębowymi, szczękami i żuchwą, okolicą czaszkowoszczękowo-twarzową itd.), jakości, pochodzenia embriologicznego, właściwości mechanicznych tkanki kostnej (związanych z wytrzymałością kości gąbczastej; Trisi P. i Rao W. Bone classification: clinicalhistomorphometric comparison. Clin. Oral Implants Res. 1999, 10:1-7) i ilości (które można zdefiniować jako całkowitą objętość utraconej tkanki kostnej). [0003] Utracona tkanka kostna może obejmować okolicę ozębnej, szczęki, żuchwę, kości twarzoczaszki i inne miejsca w różnych częściach ciała. Zjawisko zmniejszania ilości tkanki kostnej może mieć kilka przyczyn: 1 - Ubytek struktur anatomicznych mocujących zęby do szczęk i żuchwy. Zęby są umocowane w kości wyrostka zębodołowego poprzez tkanki okołozębowe, a mianowicie dziąsła, cement (kostniwo), ozębną (więzadło przyzębne)

3 4 i kość wyrostka zębodołowego. Choroby tkanki okołozębowej jest to wiele chorób wywoływanych przez czynniki genetyczne i środowiskowe. Ich objawem klinicznym jest resorpcja kości wyrostka zębodołowego i osłabienie umocowania zębów. Stopień nasilenia procesu chorobowego ocenia się ilościowo jako zmniejszenie ilości tkanki kostnej w pionie i liczbę zajętych ścian kości wyrostka zębodołowego. Jako że maksymalna długość korzenia zęba wynosi około 20 mm, maksymalny ubytek tkanki kostnej w pionie, gdy zęby nadal pozostają na miejscu, nie może być większy (Lindhe J., Parodontologia, Edi-Ermes, Mediolan, 1991). Choroby tkanek okołozębowych stanowią epidemię. W niektórych obszarach geograficznych u ponad 10% populacji obecne są kieszonki okołozębowe, których głębokość (mierzona sondą) wynosi powyżej 5 mm (Orozco A.H. i wsp., Periodontal treatment needs in a native island community in Columbia. Int. Dent. J. 2004, 54: 73-76). Wszyscy ci pacjenci wymagają swoistej terapii w celu przywrócenia utraconej tkanki kostnej wyrostka zębodołowego. 2 - Ubytek kości w szczęce i żuchwie. Ubytki te mogą mieć kilka przyczyn, takich jak częściowe lub całkowite bezzębie (powodujące resorpcję kości wyrostka zębodołowego), urazy i guzy. Z guzów najczęstszą chorobą złośliwą w obrębie jamy ustnej jest rak płaskokomórkowy jamy ustnej; w Stanach Zjednoczonych stwierdza się rocznie około nowych przypadków tej choroby i 8000 zgonów nią spowodowanych (Greenlee R. i wsp. Cancer statistic. Cancer J. Clin. 2001, 51: 15-36). Jeżeli chodzi o urazy twarzy, nadal nie jest

4 5 dostępny ogólnokrajowy raport na temat ich występowania, liczba leczonych pacjentów jest jednak bardzo wysoka, jeżeli weźmie się pod uwagę, że jeden ośrodek może operować ponad 1000 pacjentów rocznie (Gassner R. i wsp. Cranio-maxillo-facial trauma: a 10 year review of 9,543 cases with 21,067 injuries. J Craniomaxillofacial Surg. 2003, 31: 51-61). 3 - Ubytek kości w okolicy czaszkowo-twarzowej Zmniejszenie ilości tkanki kostnej jest determinowane kilkoma przyczynami. Należą do nich powikłania pourazowe, resekcje w okolicy czaszkowo-twarzowej celem usunięcia guza oraz malformacje. Przykładami malformacji wrodzonych, wymagających autologicznych przeszczepów kości, są rozszczep wargi i podniebienia (w tym przypadku autologiczny przeszczep kości wprowadza się do rozszczepu w wyrostku zębodołowym) oraz zespół Treachera Collinsa (w tym przypadku usuwa się żebro celem odtworzenia żuchwy). 4 - Ubytek tkanki kostnej poza okolicą głowy Istnieje kilka przyczyn determinujących zmniejszenie ilości tkanki kostnej. Należą do nich powikłania pourazowe, resekcja kości celem usunięcia guza oraz malformacje. We wszystkich tych przypadkach ograniczeniem, które ortopedzi muszą pokonywać w swej codziennej praktyce, jest kwestia dostępności autologicznej tkanki kostnej do odtworzenia ubytku. [0004] Jak podano powyżej, ubytek kości można zaklasyfikować jako niewielki (jak w chorobach tkanek okołozębowych), jeżeli objętość ubytku tkanki kostnej wynosi mniej więcej kilka milimetrów po każdej stronie,

5 6 lub jako znaczny, jeżeli zmniejszenie ilości tkanki kostnej jest większe. [0005] Obecnie do korygowania ubytków tkanki kostnej dostępnych jest kilka biomateriałów i różne techniki chirurgiczne. Wszystkie one mają wady i zalety. [0006] W niewielkich ubytkach kości można zastosować jedną z kilku znanych procedur medycznych i chirurgicznych do zapobiegania chorobom tkanki okołozębowej lub do odwracania skutków tych chorób. Gdy jednak nasilenie choroby tkanki okołozębowej jest znaczne, konieczne jest odtworzenie ubytku kości. Można to osiągnąć z zastosowaniem materiału alloplastycznego lub przeszczepu heterogenicznego/ksenogenicznego. Oba te typy materiałów mogą powodować osteoindukcję i(lub) osteokondukcję. W tych samych przypadkach dentysta może zastosować błony, determinujące fizyczne rozdzielenie między nabłonkiem a leżącą poniżej tkanką kostną. [0007] W znacznych ubytkach kości istnieją trzy możliwości terapeutyczne: 1) zastosowanie materiału alloplastycznego (takiego jak siatka do rekonstrukcji żuchwy lub do protezy kości biodrowej), 2) zastosowanie autologicznego przeszczepu kości (na przykład przeszczepienie tkanki kostnej z grzebienia biodrowego celem odbudowy łuku żuchwowego lub wolnych płatów pobranych ze strzałki, przedramienia, grzebienia biodrowego itd.), 3) osteogeneza dystrakcyjna. [0008] W każdym przypadku optymalne jest zastosowanie autologicznej tkanki kostnej. Zastosowanie przeszczepu heterogenicznego lub ksenogenicznego możne prowadzić do reakcji przeciwko obcym tkankom, jak również do przeniesienia nieznanych chorób, natomiast użycie

6 7 materiałów alloplastycznych nie umożliwia odtworzenia ubytku, ponadto może powodować zakażenia oraz reakcje na ciało obce. Obecnie jest kilka ograniczeń powszechnego stosowania autologicznych przeszczepów kości: 1) spowodowanie uszkodzenia w miejscu donorowym (to znaczy w obrębie strzałki, przedramienia, grzebienia biodrowego itd.) nie zawsze jest ogólnie dopuszczalne, jeżeli weźmie się pod uwagę, że czasami przeszczep kończy się niepowodzeniem; 2) strategia chirurgiczna wiąże się ze znacznymi kosztami z powodu konieczności zastosowania narzędzi i przeszkolenia zespołu; 3) pobranie przeszczepu z miejsca donorowego wydłuża czas operacji; 4) nie jest możliwe pobranie dużej ilości tkanki kostnej z miejsca donorowego, ponieważ mogłoby to wywołać powikłania w tym miejscu. [0009] Po uwzględnieniu wszystkiego, co powiedziano powyżej, można wyciągnąć następujące wnioski: 1) ubytek kości stanowi ograniczenie w zabiegach rekonstrukcji stomatologicznej, szczękowo-twarzowej i ortopedycznej; 2) złotym standardem jest zastosowanie kości autologicznej; 3) pobranie kości autologicznej z różnych miejsc u tego samego pacjenta wiąże się z dodatkowym ryzykiem dla samego pacjenta, wymaga specjalistycznego przeszkolenia personelu i generuje koszty biologiczne i ekonomiczne. [0010] Potencjalnym rozwiązaniem tych problemów jest użycie kości autologicznej wytworzonej in vitro z zastosowaniem swoistych cytotypów. Z tego punktu widzenia zastosowanie komórek macierzystych (zdolnych do różnicowania do osteoblastów produkujących kość in vitro) może być odpowiednią strategią.

7 8 [0011] Komórki macierzyste są to komórki charakteryzujące się: 1) samoodnową (to znaczy nie mają one ograniczeń co do potencjalnej liczby podziałów komórek); 2) przyczynianiem się do powstawania/ różnicowaniem w kierunku różnych linii komórkowych. W piśmiennictwie donoszono, że komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego są w stanie różnicować się do osteoblastów (Kuznetsov S.A. i wsp. Singlecolony derived strains of human marrow fibroblasts from bone after transplantation in vivo. J. Bone Min. Res. 1997; 12, ; Pittenger M.F. i wsp. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284, ), lecz nie opisano wydajności tych komórek (określanych mianem komórek macierzystych zrębu szpiku kostnego ang. Bone Marrow Stromal Stem Cells - BMSSC) w zakresie wytwarzania kości w strukturze trójwymiarowej in vitro. Ostatnio opisano izolowanie i określanie właściwości komórek macierzystych, pochodzących z ludzkiej miazgi zębów (Gronthos S. i wsp., PNAS 2000, 97, ; Gronthos S. i wsp., JDR 2002, 81, ; Batouli S. i wsp., JDR 2003, 82, ; US n wydany na nazwisko Shi i wsp. Shi S i wsp., J. Bone Min, Res., 2003, 18, ). Bardziej szczegółowo, linia komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) jest prekursorem osteoblastów i cechuje się: 1) obecnością swoistej sialoproteiny zębiny; 2) nieobecnością wytwarzania kości in vitro; 3) wytwarzaniem struktur zębinopodobnych in vivo po przeszczepieniu komórek myszom z upośledzeniem odporności.

8 9 [0012] Miura M i wsp. (PNAS 2003; 100, ) opisują dodatkową klasę komórek macierzystych uzyskiwaną z miazgi zębów mlecznych, zwaną komórkami macierzystymi z ludzkich wypadniętych zębów mlecznych (ang. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth - SHED). Komórki SHED mogą różnicować się do osteoblastów in vitro, lecz wymaga to dodania do pożywki BMP-4. Ponadto komórki SHED nie różnicują się do osteoblastów po przeszczepieniu myszom z upośledzeniem odporności. Zarówno komórki SHED, jak i DPSC nie są zdolne do wytwarzania tkanki kostnej in vitro. [0013] Dodatkowo, zarówno SHED, jak i DPSC wymagają wektora ceramicznego, żeby przeszczepić je zwierzęciu i uzyskać trójwymiarową tkankę. [0014] Dodatkowe patenty, związane ze stanem techniki w dziedzinie niniejszego wynalazku, to US n (na nazwisko Yelic i wsp.) i US n (na nazwisko Sramek i wsp.). W US nr opisano sposób wytwarzania zawiązka zęba w modelu zwierzęcym. Te zawiązki zębów można potencjalnie wprowadzać do dziąseł człowieka w celu zastąpienia utraconych zębów. W US nr opisano sposób i swoiste narzędzie do pobierania miazgi zęba. Krótki opis wynalazku [0015] Wynalazek opisuje: 1) sposób izolowania dwóch linii komórek macierzystych pochodzenia mezenchymalnego, lecz nie krwiotwórczego, pochodzących z ludzkiej miazgi zębowej. Te linie komórkowe, gdy pochodzą z miazgi zębowej zębów stałych lub zawiązków zębów, określa się nazwą mezenchymalnych

9 10 komórek wytwarzających tkankę kostną pochodzących z komórek macierzystych miazgi zębowej (ang. Mesenchymal Bone Producing cells derived from Dental Pulp Stem Cells - MBP-DPSC), natomiast gdy pochodzą z miazgi zębów mlecznych - nazwą mezenchymalnych komórek wytwarzających tkankę kostną pochodzących z komórek macierzystych ludzkich wypadniętych zębów mlecznych (ang. Mesenchymal Bone Producing cells derived from Stem cell of Human Exfoliated Deciduous Teeth MBP- SHED). Można je uzyskać z zastosowaniem cytofluorymetru z sorterem i swoistych markerów CD34, STRO-1 i c-kit; 2) hodowlę, ekspansję i różnicowanie obu linii komórek macierzystych do osteoblastów zdolnych do wytwarzania tkanki kostnej. Ten nowy rodzaj żywego materiału biologicznego określa się nazwą żywej autologicznej tkanki kostnej (ang. Living Autologous Bone - LAB). Jest to kość splotowata, nie zaś blaszkowata, zawierająca żywe osteoblasty pochodzące z MBP-DPSC i MBP-SHED. Komórki te należą do miazgi ludzkich zębów mlecznych i stałych oraz zawiązków zębów. Obie linie MBP są zdolne do różnicowania się do osteoblastów bez dodawania do pożywki żadnych leków osteogennych; wytworzone osteoblasty produkują tkankę kostną in vitro i in vivo; 3) sposób zastosowania klinicznego LAB w postępowaniu praktycznym w stomatologii, chirurgii szczękowotwarzowej i ortopedii; 4) sposób intensywnej produkcji LAB. Opis wynalazku [0016] Niniejszy wynalazek dotyczy biologicznego, żywego materiału, który można wykorzystywać do

10 11 autologicznych przeszczepów kości, oraz sposobu jego wytwarzania z komórek macierzystych, pochodzących z miazgi ludzkich zębów mlecznych i stałych oraz zawiązków zębów, zdolnych do różnicowania się do osteoblastów, wytwarzających in vitro tkankę kostną splotowatą. Tę żywą tkankę można przeszczepiać jako materiał autologiczny pacjentom będącym jednocześnie dawcami, celem naprawy ubytków kostnych. Bardziej szczegółowo, wynalazek opisuje sposób: 1) izolowania komórek macierzystych, pochodzących z ludzkiej miazgi zębów mlecznych i stałych oraz zawiązków zębów, określanych odpowiednio nazwami MBP- SHED i MBP-DPSC; 2) ich ekspansji (to znaczy zwiększenia liczby klonów); 3) ich różnicowania do osteoblastów; 4) wytwarzania in vitro tkanki kostnej splotowatej przez te osteoblasty; tkanka ta określana jest nazwą żywej autologicznej tkanki kostnej (LAB); 5) przechowywania LAB w odpowiednich warunkach zapewniających dużą żywotność komórek. [0017] Niniejszy wynalazek wykazuje następujące korzyści w stosunku do stanu techniki, w którym stosuje się osteoblasty pochodzące z komórek macierzystych szpiku kostnego (Kuznetsov SA i wsp., Single colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts from bone after transplantation in vivo. J. Bone Min. Res. 1997, 12, ; Pittenger M.F. i wsp., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999, 284, ): 1) zmniejszoną inwazyjność: w istocie można uniknąć ekstrakcji zębów przez przeprowadzenie wycięcia miazgi zęba; 2) duże bezpieczeństwo, ponieważ próbkę pobiera się z zęba,

11 12 zamiast używać, jak dotychczas, komórek macierzystych ze szpiku kostnego z grzebienia biodrowego; 3) hodowle pierwotne charakteryzują się dużą liczbą kolonii, ponieważ próbki nie zawierają komórek krwiotwórczych; 4) trójwymiarową organizacją LAB bez dodawania jakiegokolwiek leku osteogennego ani rusztowania: nie można tego osiągnąć przy zastosowaniu osteoblastów pochodzących z komórek macierzystych szpiku. [0018] Ponadto niniejszy wynalazek wykazuje pewne inne korzyści w stosunku do stanu techniki, związane ze znanymi uprzednio komórkami DPSC (Gronthos S. i wsp., PNAS 2000, 97, ; Gronthos S. i wsp., JDR 2002, 81, ; Batouli S. i wsp., JDR 2003, 82, ; US n na nazwisko Shi i wsp.) i komórkami SHED (Miura M i wsp., PNAS 2003, 100, ) izolowanymi z ludzkiej miazgi zębowej. Opisywane MBP-DPSC pochodzą z mezechymy, a nie z tkanki krwiotwórczej (jak w przypadku DPSC opisywanych uprzednio). Ponadto MBP-DPSC różnicują się do osteoblastów zdolnych do wytwarzania tkanki kostnej in vitro, DPSC zaś - nie. DPSC mogą tworzyć struktury podobne do tkanki kostnej tylko wtedy, gdy przeszczepi się je myszom z upośledzeniem odporności. [0019] Komórka MBP-SHED różni się od komórki SHED, ponieważ komórki SHED: 1) wymagają dodatku BMP-4 do pożywki, żeby różnicować się do osteoblastów in vitro; 2) nie są zdolne do wytwarzania tkanki podobnej do tkanki kostnej in vitro; 3) po przeszczepieniu myszom z upośledzeniem odporności nie są zdolne do różnicowania się do osteoblastów, lecz indukują tworzenie się tkanki zębinopodobnej.

12 13 [0020] Dodatkowa różnica między niniejszym wynalazkiem a stanem techniki związana jest z metodą stosowaną do izolowania komórek macierzystych z ludzkiej miazgi zębów mlecznych i stałych oraz zawiązków zębów (to znaczy z zastosowaniem sortera FAC). [0021] Ponadto DPSC i komórki SHED wymagają zastosowania wektora ceramicznego do wszczepienia w modelu zwierzęcym, natomiast LAB można wszczepiać same. [0022] Podobnie, istnieje wiele różnic między niniejszym wynalazkiem a US n na nazwisko Yelic i wsp. oraz patentem US n na nazwisko Sramek i wsp. W US nr opisano sposób wytwarzania zawiązka zęba w modelu zwierzęcym. Te zawiązki zęba można potencjalnie przeszczepiać do dziąseł człowieka w celu zastąpienia utraconych zębów. W US nr opisano sposób i specjalne narzędzie do pobierania miazgi zęba i izolowania komórek uznawanych za komórki macierzyste, które są zupełnie różne od opisywanych w niniejszym wynalazku. Opis sposobu wytwarzania MBP-SHED i MBP-DPSC z ludzkiej miazgi zębów mlecznych i stałych oraz zawiązków zębów. [0023] Komórki macierzyste izolowane z ludzkiej miazgi zęba pochodzą z komórek mezenchymalnych wytwarzanych przez grzebienie nerwowe. [0024] W celu izolowania komórek macierzystych z ludzkiej miazgi zębowej konieczne jest, żeby zęby były zdrowe i bez żadnego połączenia między miazgą a jamą ustną. U pacjenta należy przeprowadzić profesjonalny zabieg higieny jamy ustnej na tydzień przez ekstrakcją zęba (lub wycięciem miazgi zęba) i rozpocząć profilaktykę przeciwbakteryjną pod postacią płukania

13 14 jamy ustnej 0,12% roztworem chlorheksydyny dwa razy dziennie. Jeżeli chodzi o przygotowanie zębów tuż przed pobraniem próbki, dostępne są różne metody. Koronę pokrywa się 0,2% żelem chlorheksydynowym na kilka minut. Następnie ząb delikatnie usuwa się jałowymi kleszczami i, trzymając ząb kleszczami, usuwa się miazgę kiretą Graceya. Miazgę od razu umieszcza się w roztworze trawiącym (zob. poniżej). [0025] Jeżeli ma być wykorzystany ząb stały, do wyboru są dwie metody. Pierwszą metodą jest ekstrakcja zęba. Koronę pokrywa się 0,2% żelem chlorheksydynowym na kilka minut, po czym ząb delikatnie usuwa się jałowymi kleszczami, umieszcza na jałowej serwecie, płucze 0,12% roztworem chlorheksydyny i przecina na pół dłutem lub wiertłem z płukaniem wodą. Kiretą Graceya pobiera się miazgę. Zaraz potem miazgę umieszcza się w roztworze trawiącym (zob. poniżej). [0026] Drugą metodą jest wycięcie miazgi zęba z pozostawieniem zęba na miejscu. Przy tej procedurze nie należy używać wiertła do odsłaniania komory miazgi zęba, ponieważ mogłoby to doprowadzić do uszkodzenia miazgi. Miazgę pobiera się kiretą Graceya. Następnie miazgę umieszcza się w roztworze trawiącym (zob. poniżej). [0027] Jeżeli chodzi o pobieranie miazgi z zawiązków zębów, metoda jest podobna do metody opisywanej w odniesieniu do ekstrakcji zębów stałych. [0028] W każdym razie miazgę zęba umieszcza się w roztworze trawiącym, zawierającym: 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny, 500 µg/ml 0,1M klarytromycyny w 4 ml PBS, ph 7,4, z dodatkiem 3 mg/ml kolagenazy typu

14 15 I, 4 mg/ml dyspazy. Objętość roztworu zależy od objętości miazgi poddawanej trawieniu i wynosi od 2 do 4 ml w przypadku zębów mlecznych i od 2 do 5 ml w przypadku zębów stałych lub zawiązków zębów. Miazgę utrzymuje się w roztworze trawiącym przez 1 h w temperaturze 37 C, delikatnie wytrząsając w celu ułatwienia rozpuszczania się tkanki. Po strawieniu roztwór zanurza się w 10-krotnej objętości pożywki hodowlanej α-mem z dodatkiem 20% FBS, 100 µm dwufosforanu kwasu askorbinowego, 2 mm L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny (Invitrogen, Mediolan, Włochy). Następnie zawiesinę komórek odwirowuje się (10 min przy 140 g), zawartość dna probówki ponownie zawiesza się w 12 ml tej samej pożywki hodowlanej, filtruje na 70-µm filtrach Falcon (Becton & Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). Po filtracji komórki umieszcza się w 25-cm 2 kolbach. Kolby inkubuje się w temperaturze 37 C w 5% CO 2, zmieniając pożywkę dwa razy w tygodniu. [0029] Obserwacje mikroskopowe wykazały, że do dnia pierwszego hodowli można było zaobserwować dwa cytotypy: a) drobne, zaokrąglone komórki, tworzące agregaty liczące po komórek (drobne kolonie); b) komórki gwiaździste, wydłużone i przylegające, tworzące agregaty liczące od 30 do 80 komórek (większe kolonie). Przez czas do 5 dnia hodowli komórki nie wykazują istotnej proliferacji, a obecny materiał martwiczy ulega eliminacji w czasie wymian pożywki. Po dniach hodowli, gdy w każdej miazdze obserwowano do 40 klonów, prowadzi się następujące operacje: z kolby usuwa się pożywkę, komórki dwukrotnie płucze się

15 16 jałowym 0,1M PBS, komórki oddziela się od kolby, stosując 0,3 ml 0,1M trypsyny przez 1 min w temperaturze 37 C, komórki zawiesza się w 3 ml pożywki hodowlanej (uprzednio opisanej); 1,5 ml tej zawiesiny przenosi się do drugiej kolby i do obu kolb dodaje się pożywkę hodowlaną do ostatecznej objętości 6 ml. Ten ostatni etap ma duże znaczenie dla stymulacji proliferacji komórek. [0030] W dniu 20-21, gdy całkowita liczba komórek jest wystarczająca do przeprowadzenia sortowania FAC komórki osadza się (10 min przy 140 g), płucze się je w 0,1% BSA w 0,1M PBS w temperaturze 4 C i inkubuje przez 10 min w temperaturze 4 C celem ekspozycji na przeciwciało w roztworze zawierającym 1 µl roztworu macierzystego przeciwciała i 9 µl 0,1% BSA w PBS. Roztwór macierzysty przeciwciała sporządza się z 200 µg przeciwciała w 1 ml 0,1M PBS. Po inkubacji komórki płucze się 0,1% BSA w PBS celem usunięcia przeciwciał, które nie reagują lub reagują nieswoiście, i analizuje pod kątem dodatniości względem następujących przeciwciał monoklonalnych (wyznakowanych FITC, PE i Cychrome) przeciwko: c-kit, CD34, STRO-1, CD45 (Santa Cruz). Komórki wykazywały 11% dodatniość pod względem c-kit, 8% dodatniość pod względem CD34 i 30% dodatniość pod względem STRO-1. W szczególności, komórki, które były dodatnie pod względem c-kit były również dodatnie pod względem CD34 i STRO-1, natomiast były one zawsze ujemne pod względem CD45. Twórcy wynalazku mogą zatem podkreślić pochodzenie tych komórek z linii innych niż linie krwiotwórcze. Zebrali oni tylko te komórki dodatnie pod względem c-kit CD34 i STRO-1 celem uzyskania

16 17 różnicowania osteogennego. c-kit jest to błonowa kinaza tyrozynowa, która wybiórczo rozpoznaje czynnik komórek macierzystych (SCF). Dokonuje się tego celem izolowania komórek macierzystych z miazgi zębów mlecznych i stałych oraz zawiązków zębów, z tą jedynie różnicą, że komórki macierzyste uzyskiwane z zębów mlecznych i zawiązków zębów uzyskuje się w sposób ciągły i w dość dużej ilości, natomiast komórki pochodzące z zębów stałych dostępne są w mniejszej, choć wystarczającej, ilości, lecz nie w sposób ciągły. Komórki te, określane jako MBP-SHED i MBP-DPSC, są subpopulacją komórek macierzystych zębów mlecznych (SHED) i stałych (DPSC), zarówno wyrżniętych, jak i w fazie zawiązków. MBP-SHED i MBP-DPSC różnicują się, w swoistych warunkach hodowli, do progenitorów osteogennych i następnie do osteoblastów, w następujący sposób: KOMÓRKI MACIERZYSTE (zidentyfikowane jako komórki dodatnie pod względem c- Kit, CD34 i STRO-1) KOMÓRKI PROGENITOROWE/PREKURSOROWE (zidentyfikowane jako komórki dodatnie pod względem RUNX-2) KOMÓRKI OSTATECZNIE ZRÓŻNICOWANE (zidentyfikowane jako komórki dodatnie pod względem osteokalcyny i CD44). To różnicowanie opisano poniżej. [0031] Komórki macierzyste dodatnie pod względem c-kit, CD34 i STRO-1 wysiewa się na płytki. Proliferują one w poszczególnych kolbach. Do dnia 30 od wyizolowania komórki zaczynają wytwarzać macierz organiczną pozakomórkową, która do dnia 40, w kolbach, wytwarza tkankę kostną splotowatą (LAB), w której obserwuje się te same komórki, które są odpowiedzialne za jej tworzenie.

17 18 [0032] Wytwarzanie LAB cechuje się występowaniem następujących etapów: 1) początkowo grupy komórek tworzą okrągłe obszary centralne, w których wydzielają kryształy nieorganiczne, włókna kolagenowe i glikoproteiny; 2) następnie ta struktura nabywa organizację trójwymiarową poprzez przyłączanie się nowo powstającej macierzy; 3) do dnia 40 macierz staje się trójwymiarową, zmineralizowaną tkanką: tkanką kostną splotowatą (nie zaś tkanką kostną blaszkowatą); 4) do dnia 50 w kolbach obserwuje się małe sześciany tkanki kostnej, których wymiary zależą od wysokości podłoża. Ta metoda umożliwia otrzymywanie małych sześcianów tkanki kostnej splotowatej o grubości 1 cm i objętości do 1 cm 3, nadających się do wszczepów chirurgicznych, również dlatego, że są one bogate w żywe osteoblasty, wykazują aktywność syntezy i umożliwiają tworzenie się złogów tkanki kostnej. [0033] Gdy komórki zaczynają wykazywać wzrost zlewny, ich proliferacja ustaje, jeżeli jednak część z nich usunie się i przeniesie do innej kolby, ponownie zaczynają proliferować i wytwarzać LAB. Opracowany system pozwala zatem na wytworzenie reaktora biologicznego umożliwiającego nieograniczone wytwarzanie LAB. Następnie, po różnicowaniu komórek, do dnia 35 od ich wyizolowania, przeprowadza się ocenę charakterystyki komórek, stosując przeciwciała monoklonalne: HLA-1, CD14, CD44, CD45, CD54, SSEA-1, RUNX-2, CD34, osteokalcynę (OC) i flkl. Komórki wytwarzane według niniejszego wynalazku wykazują 100% dodatniość pod względem HLA-1 i CD44, 70% dodatniość pod względem RUNX-2 i 30% dodatniość pod względem OC,

18 19 CD54 i flk-1, przy całkowitej ujemności pod względem innych stosowanych przeciwciał. RUNX-2 jest czynnikiem transkrypcyjnym, identyfikującym cytotyp preosteoblastyczny, natomiast OC identyfikuje osteoblasty. Komórki macierzyste, które w czasie procesu różnicowania wykazują ekspresję flk-1 (receptor VEGF lub naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu), są odpowiedzialne za angiogenezę, do której może dochodzić w środkowej części LAB. W istocie, komórki znajdujące się w obrębie nowo powstałej LAB nie degenerują i przez nieograniczony czas wytwarzają tkankę kostną splotowatą, którą można wykorzystywać do przeszczepień autologicznych. LAB utrzymuje swą charakterystykę i żywotność po przechowywaniu w temperaturze +4 C przez wiele dni. Ponadto LAB można poddawać kriokonserwacji i przechowywać w temperaturze <0 C przez długi czas, utrzymując jej zdolność do wytwarzania tkanki kostnej, z zastosowaniem konwencjonalnych technik kriokonserwacji komórek i tkanek. [0034] Podsumowując można stwierdzić, że procedura wytwarzania LAB jest następująca: 1) ekstrakcja, w warunkach jałowych, miazgi z zębów mlecznych i stałych lub zawiązków zębów, trawienie i hodowla; 2) trypsynizacja i powielenie hodowli pierwotnych; 3) sortowanie FAC i ponowne rozpoczęcie hodowli; 4) różnicowanie komórek z tworzeniem się tkanki i ich zastosowanie do zwiększenia tworzenia się tkanki poprzez rozsianie do kilku kolb z użyciem nowej pożywki hodowlanej.

19 20 [0035] W poniższej tabeli podano punkty czasowe całego procesu, umożliwiającego ciągłe wytwarzanie LAB (zależnie od leczenia pacjenta): Faza Dzień Ekstrakcja zęba 0 Pobranie miazgi z zęba mlecznego, 0 stałego lub zawiązka zęba Trawienie miazgi 0 Moment rozpoczęcia hodowli 0 Proliferacja komórek 1-15(21) Sortowanie Różnicowanie osteogenne do 35 Określanie charakterystyki (RUNX-2 i 35 OC) Wytwarzanie LAB 40-do skutku Przeszczepienie LAB Po 50 Gojenie ubytku kostnego W ciągu 60 dni od przeszczepienia Określanie charakterystyki LAB [0036] Uzyskiwana in vitro zmineralizowana, żywa, autologiczna tkanka kostna splotowata (LAB) wykazuje charakterystykę podobną, jak ludzka tkanka kostna w czasie mineralizacji; w istocie, obrazy idealnie nakładają się na obrazy ludzkiej tkanki kostnej przy kostnieniu bezpośrednim lub błoniastym. [0037] Charakterystyka wytwarzania LAB: 1) uzyskuje się komórki o charakterystyce i ekspresji swoistej dla komórek macierzystych z wykorzystaniem określonej w zastrzeżeniach procedury z miazgi ludzkich zębów mlecznych lub stałych albo zawiązków zębów. W przypadku

20 21 zębów stałych komórki macierzyste uzyskiwano także od osób niebędących w młodym wieku; 2) komórki macierzyste, dzięki poddaniu odpowiedniej obróbce, różnicują się do cytotypu osteogennego, który zaczyna wytwarzać zmineralizowaną macierz i następnie autologiczną, zmineralizowaną, żywą tkankę kostną, wykazującą charakterystykę taką samą, jak ludzka tkanka kostna w czasie kostnienia; 3) dane z obserwacji histologicznej, histochemicznej (barwienie barwnikami Alizarin Red S, ALP, Schmorla, hematoksyliną i eozyną), immunofluorescencyjnej (dodatniość pod względem kalceiny i przeciwciał skierowanych przeciwko osteonektynie, osteopontynie, fibronektynie, kolagenowi typu III i kostnej fosfatazie alkalicznej) i badań dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego wyraźnie dowodzą podobieństwa między LAB a ludzką tkanką kostną w czasie mineralizacji; 4) komórki obecne w LAB rosną i wytwarzają tkankę kostną bez modyfikacji cytologicznych; 5) żywą tkankę kostną uzyskaną in vitro (LAB) można łatwo przenosić do innych kolb, gdzie kontynuuje ona wzrost w pożywce hodowlanej; 6) po trypsynizacji, uzyskane komórki tkanki kostnej są zdolne do wytwarzania tkanki kostnej w kolbie do hodowli drugorzędowej; 7) LAB i znajdujące się w niej komórki pozostają żywe przy utrzymywaniu w temperaturze +4 C przez godzin; 8) LAB i znajdujące się w niej komórki można poddawać kriokonserwacji w temperaturze <80 C przez wiele lat, wykorzystując konwencjonalne techniki kriokonserwacji materiału komórkowego. [0038] Wniosek jest taki, że niniejszy wynalazek różni się od stanu techniki, w szczególności od metodologii

21 22 opisywanej przez Miura i Gronthos, w następujących aspektach: 1) technika ekstrakcji miazgi z zębów, zarówno stałych, jak i mlecznych, jest różna; 2) zastosowanie miazgi zawiązków zębów do izolowania komórek macierzystych; 3) selekcja typów komórkowych na bazie urządzenia FACsorter; 4) izolowana populacja komórek macierzystych jest dodatnia pod względem c-kit, CD34 i STRO-1, lecz zawsze i ciągle ujemna pod względem CD45, co wskazuje, że nie są to komórki krwiotwórcze, w odróżnieniu od metod opisywanych przez Gronthos i Miura; 5) odsetek dodatniości i liczba komórek, które można uzyskać, są wyższe w stosunku do znanych ze stanu techniki; 6) izolowane komórki wytwarzają in vitro żywą, autologiczną, zmineralizowaną tkankę kostną (LAB), podczas gdy w pracach Miura i Gronthos nie opisano tej właściwości, lecz jedynie to, że izolowane komórki, po wstrzyknięciu szczurom z upośledzeniem odporności, stymulują wytwarzanie splotowatego materiału, przypominającego zębinę; 7) komórki izolowane według Gronthos i Miura są populacją heterogenną, natomiast metodologia opisana w niniejszym wynalazku pozwala na selekcję homogennej populacji komórkowej; 8) w odróżnieniu od doniesień Gronthos, sposoby umożliwiają izolowanie komórek macierzystych w wystarczającej ilości także w przypadku zębów stałych u osób w wieku powyżej 32 lat; 9) LAB rośnie bez ograniczeń, poza ograniczeniami związanymi z dostępnością powierzchni i pożywki hodowlanej; 10) opisywane komórki wykazują dużą stabilność i wytwarzają tkankę kostną, która nakłada się na tkankę obserwowaną u człowieka w trakcie mineralizacji, nie stanowi zaś

22 23 zwykłych kryształów, jak opisano u Gronthos i Miura; 11) komórki są osteoblastami, a nie komórkami przypominającymi odontoblasty, jak opisywali Gronthos i Miura. Elektronowa mikroskopia transmisyjna MBP-SHED i MBP-DPSC ukazuje widoczny ruch w obrębie pęcherzyków, z komórki i ku komórce; obserwowano ponadto liczne swoiste cechy ultrastrukturalne na poziomie struktur jądrowych. Częsta jest w istocie obecność komórek wielojądrzastych; w niektórych przypadkach jądra są nieregularne i mają więcej niż jedno jąderko. Częstą cechą wszystkich jąder jest obecność filamentu lub przedłużenia, być może do płata jądra. Te cechy są typowe dla niezróżnicowanych komórek macierzystych. Analiza TEM zróżnicowanych osteoblastów i uzyskanej tkanki kostnej splotowatej wykazała, że cytoplazma komórek jest bogata w pęcherzyki, co jest typowe dla ludzkich osteoblastów, szczególnie obfita w RER, jądro z jąderkiem, wykazuje wszystkie cechy aktywnej syntezy białek. Macierz pozakomórkowa jest, jak się wydaje, bogata we włókna i proteoglikany oraz pęcherzyki ezoitotyczne. Cechy te są typowe dla zróżnicowanych komórek wydzielających macierz, i są podobne do cech charakterystycznych obserwowanych w ludzkiej tkance kostnej w okresie tworzenia się. [0039] W celu lepszego określenia kształtu nowo powstającej tkanki kostnej splotowatej w trzech wymiarach, komórki hoduje się na ulegającym resorpcji kopolimerze kwasu mlekowego i glikolowego (85:15 p/p). Tę macierz polimerową wybrano do badania ze względu na łatwość manipulacji i czas resorpcji, zapewniających morfologiczny wygląd tkanki kostnej splotowatej, lecz

23 24 jednocześnie niehamujących wzrostu. Po modelowaniu polimer ten wykazuje, techniką CAD/CAM, obecność na powierzchni porów o średnicy µm, do których penetrują komórki, i porów o średnicy około 15 µm, z którymi doskonale łączą się MBP-SHED lub MBP-DPSC, co zapewnia całkowitą adhezję między komórkami a polimerem. [0040] Zachowanie MBP-SHED lub MBP-DPSC jest analogiczne, gdy te komórki hoduje się na wytrawionych powierzchniach tytanowych. [0041] Efektywność interakcji komórka-polimer lub komórka-tytan wykazano w badaniach histologicznych, histochemicznych (z użyciem barwienia barwnikiem Alizarin Red S, ALP, Schmorla, hematoksyliną i eozyną), immunofluorescencyjnych (dodatniość pod względem kalceiny, pod względem przeciwciał skierowanych przeciwko osteonektynie, osteopontynie, fibronektynie, kolagenowi typu III i fosfatazie alkalicznej kości), badaniach dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i badaniach mikroskopowych (mikroskop współogniskowy, TEM i SEM). PRZYKŁAD 1 Wytwarzanie LAB z zębów mlecznych a) Faza chirurgiczna [0042] 1) Dobór pacjentów wszystkie osoby badane były zdrowe w odniesieniu do chorób ogólnoustrojowych i chorób jamy ustnej. Uzyskano wytwarzanie LAB z zębów mlecznych trzech pacjentów płci męskiej w wieku 2, 6 i 8 lat. 2) Przygotowanie pacjenta do badania trzech pacjentów, na tydzień przed ekstrakcją, poddawano

24 25 profesjonalnemu zabiegowi higienicznemu i leczeniu 0,12% chlorheksydyną. Jeżeli chodzi o potraktowanie zęba w momencie usuwania, koronę kliniczną pokrywano 0,2% żelem chlorheksydynowym na kilka minut przed wywołaniem wypadnięcia. 3) Procedury ekstrakcji miazgi celem uzyskania ekstrakcji zęba mlecznego zastosowano delikatne pociąganie jałowymi kleszczami do ekstrakcji zębów. Trzymając ząb między ramionami kleszczy, poza jamą ustną, ząb oczyszczano 0,12% roztworem chlorheksydyny, po czym powodowano jego wypadnięcie. Następnie odsłaniano miazgę i ekstrahowano ją kiretą Graceya, po czym miazgę umieszczano w probówce z 5 ml roztworu trawiącego PBS, zawierającego 3 mg/ml kolagenazy typu I, 4 mg/ml dyspazy, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 500 mg/ml klarytromycyny. Miazgę zanurzano w roztworze i utrzymywano przez 1 godzinę w temperaturze 37 C, umiarkowanie wytrząsając w celu ułatwienia rozdrobnienia miazgi. Na koniec strawioną mieszaninę 10-krotnie rozcieńczano pożywką hodowlaną (typ α-mem, z dodatkiem 20% płodowej surowicy bydlęcej, 100 mm dwufosforanu kwasu askorbinowego, 2 mm L- glutaminy, 100 U/l penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny) i odwirowywano przez 10 min przy 140 g. Po odwirowaniu z dna probówki pobierano 12 ml zawiesiny i przefiltrowywano za pomocą 70-µm filtru Falcon. b) Faza laboratoryjna [0043] 1) Przygotowanie hodowli pierwotnych - przefiltrowany roztwór umieszczano w kolbie i wkładano do inkubatora

25 26 (37 C i 5% CO 2 ), po czym wymieniano pożywkę dwa razy w tygodniu. 2) Ekspansja hodowli - powodowano proliferację komórek w kolbie, utrzymując je w hodowli przez co najmniej 15 dni. 3) Określanie charakterystyki różnych klonów gdy uznawano, że liczba komórek jest wystarczająca (około komórek), komórki selekcjonowano poprzez sortowanie FAC, stosując markery komórek macierzystych, w tym CD34, STRO-1 i c-kit. 4) Izolowanie swoistych komórek określanych jako MBP- SHED - z hodowli selekcjonowano komórki dodatnie pod względem CD34, STRO-1 i c-kit, i stosowano je do późniejszej ekspansji i różnicowania. 5) Ekspansja swoistych klonów MBP-SHED in vitro Komórki pozostawiano do wzrostu w pożywce hodowlanej, opisanej uprzednio w punkcie a3). 6) Wytwarzanie LAB po kilku pasażach uzyskano żywą, autologiczną tkankę kostną splotowatą, kolonizowaną z osteoblastów (LAB). Faza ta trwała około 40 dni do uzyskania całkowitego różnicowania komórek macierzystych do osteoblastów. 7) Ekspansja LAB rozpoczynając od MBP-SHED, wytwarzanie LAB wymaga od 10 do 15 pasaży w 25-ml kolbach, zawierających po 6 ml pożywki; takie pasaże prowadzono przez około 8 tygodni, uzyskując około 2 cm 3 kości. 8) Zastosowanie LAB do badań histologicznych

26 27 PRZYKŁAD 2 Wytwarzanie LAB z zębów stałych a) Faza chirurgiczna [0044] 1) Dobór pacjentów doboru pacjentów dokonano z uwzględnieniem parametrów klinicznych i procesu patologicznego. Wszystkie osoby badane były zdrowe w odniesieniu do chorób ogólnoustrojowych i chorób jamy ustnej. Uzyskano wytwarzanie LAB z zębów stałych pięciu pacjentów płci męskiej w wieku 30, 32, 34, 35 i 37 lat. W tej fazie zidentyfikowano zębowe miejsca donorowe: we wszystkich przypadkach trzecie zęby trzonowe, dwa górne i trzy dolne. 2) Przygotowanie pacjenta do badania na tydzień przed ekstrakcją zębów pacjentów poddawano profesjonalnemu zabiegowi higienicznemu i płukaniu 0,12% roztworem chlorheksydyny dwa razy dziennie przez cały tydzień poprzedzający ekstrakcję. 3) Procedury ekstrakcji miazgi - po znieczuleniu miejscowym przeprowadzono ekstrakcję zęba dźwignią i(lub) kleszczami. W przypadku zębów dolnych procedura ta była poprzedzona uzyskaniem dostępu chirurgicznego przez wykonanie płata śluzówkowo-okostnowego. Trzymając usunięty element między ramionami kleszczy, poza jamą ustną, element zębowy umieszczano na jałowej serwecie chirurgicznej i oczyszczano 0,12% roztworem chlorheksydyny. Eksponowano komorę miazgi zęba przez oddzielenie między koroną a korzeniem anatomicznym za pomocą noża osadzonego z zachowaniem jałowości na chirurgicznym mikrosilniku, z płukaniem jałową wodą. Miazgę pobiera się kiretą Graceya i(lub) narzędziami

27 28 endodontycznymi, takimi jak ręczne narzędzia endodontyczne, i zanurza się w 5 ml 1M roztworu trawiącego (w 4 ml PBS), zawierającego 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny, 500 µg/ml klarytromycyny, 3 mg/ml kolagenazy typu I, 4 mg/ml dyspazy przez 1 h w temperaturze 37 C. W czasie trawienia miazgę powoli wytrząsano, żeby ułatwić rozdrabnianie tkanki. Na koniec trawienia dodawano pożywkę hodowlaną (pożywka hodowlana α-mem z dodatkiem 20% FCS, 100 µm dwufosforanu kwasu askorbinowego, 2 mm L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny) do objętości 50 ml i próbki odwirowywano przez 10 min przy 140g. Następnie z dna probówki zbierano 12 ml roztworu i przefiltrowywano na filtrze 70µ. b) Faza laboratoryjna [0045] 1) Przygotowanie hodowli pierwotnych - przefiltrowany roztwór umieszczano w kolbie i inkubowano w temperaturze 37 C i 5% CO 2 ; 2) Proliferacja hodowli komórkowej - pożywkę hodowlaną zmieniano dwa razy w tygodniu przez co najmniej 15 dni; 3) Określanie charakterystyki komórek gdy liczba komórek wynosiła około , wykonywano sortowanie FAC, stosując markery komórek macierzystych CD34, STRO- 1 i c-kit. 4) Izolowanie MBP-DPSC po sortowaniu FAC zbierano i hodowano komórki dodatnie. 5) Proliferacja MBP-DPSC in vitro komórki hodowano w poprzedniej pożywce hodowlanej.

28 29 6) Wytwarzanie LAB przeprowadzono kilka pasaży z komórek macierzystych do zróżnicowanych osteoblastów produkujących LAB. Ta faza doświadczenia trwała około 40 dni. 7) Ekspansja LAB po pasażach zróżnicowanych osteoblastów, w celu uzyskania dostatecznej liczby komórek otrzymywano LAB poprzez wysiewanie próbek po komórek do 25-ml kolb z 6 ml pożywki hodowlanej. Tę fazę prowadzono przez około 8 tygodni do momentu uzyskania w każdej kolbie wióru kostnego. Wióry kostne osiągają objętość około 1 cm 3. 8) Zbieranie LAB z kolb do analiz histologicznych. PRZYKŁAD 3 Wytwarzanie LAB z zawiązków zębów a) Faza chirurgiczna [0046] 1) Dobór pacjentów doboru pacjentów dokonano z uwzględnieniem parametrów klinicznych i procesu patologicznego. Wszystkie osoby badane były zdrowe w odniesieniu do chorób ogólnoustrojowych i chorób jamy ustnej. Uzyskano wytwarzanie LAB z zawiązków zębów ośmiorga pacjentów płci męskiej i żeńskiej w wieku 15, 16, 17, 17, 18, 20, 20 i 22 lat. W tej fazie zidentyfikowano zębowe miejsca donorowe (we wszystkich przypadkach jeszcze niewyrżnięte zawiązki zębów): we wszystkich przypadkach były to trzecie zęby trzonowe: trzy górne i pięć dolnych. 2) Przygotowanie pacjenta na tydzień przed ekstrakcją zębów pacjentów poddawano profesjonalnemu zabiegowi higienicznemu i płukaniu 0,12% roztworem chlorheksydyny

29 30 dwa razy dziennie przez cały tydzień poprzedzający ekstrakcję. 3) Procedury ekstrakcji miazgi - po znieczuleniu miejscowym przeprowadzono ekstrakcję zęba dźwignią i(lub) kleszczami. W przypadku zębów dolnych procedura ta była poprzedzona uzyskaniem dostępu chirurgicznego przez wykonanie płata śluzówkowo-okostnowego. Trzymając usunięty element między ramionami kleszczy, poza jamą ustną, element zębowy umieszczano na jałowej serwecie chirurgicznej i oczyszczano 0,12% roztworem chlorheksydyny. Następnie eksponowano komorę miazgi zęba przez oddzielenie między koroną a korzeniem anatomicznym za pomocą noża osadzonego z zachowaniem jałowości na chirurgicznym mikrosilniku, z płukaniem jałową wodą. Miazgę pobiera się kiretą Graceya i(lub) narzędziami endodontycznymi, takimi jak ręczne narzędzia endodontyczne, i zanurza się w 5 ml 1M roztworu trawiącego (zawierającego w 4 ml PBS 100 U/ml, 100 µg/ml streptomycyny, 500 µg/ml klarytromycyny, 4 ml PBS 1M z dodatkiem 3 mg/ml kolagenazy typu I, 4 mg/ml dyspazy) przez 1 h w temperaturze 37 C. W czasie trawienia miazgę powoli wytrząsano, żeby ułatwić rozdrabnianie tkanki. Na koniec trawienia dodawano pożywkę hodowlaną (pożywka hodowlana α-mem z dodatkiem 20% FCS, 100 µm dwufosforanu kwasu askorbinowego, 2 mm L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny) do objętości 50 ml i próbki odwirowywano przez 10 min przy 140g. Następnie z dna probówki zbierano 12 ml roztworu i przefiltrowywano na 70- mikronowym filtrze.

30 31 b) Faza doświadczalna [0047] 1) Przygotowanie pierwotnych hodowli komórek - przefiltrowany roztwór umieszczano w kolbie i inkubowano w temperaturze 37 C i 5% CO 2 ; 2) Proliferacja hodowli komórkowej - pożywkę hodowlaną zmieniano dwa razy w tygodniu przez co najmniej 15 dni. 3) Określanie charakterystyki komórek - gdy liczba komórek wynosiła około , wykonywano sortowanie FAC, stosując markery komórek macierzystych CD 34, STRO-1 i c-kit. 4) Izolowanie MBP-DPSC - po sortowaniu FAC zbierano i hodowano komórki dodatnie. 5) Proliferacja MBP-DPSC in vitro - komórki hodowano w poprzedniej pożywce hodowlanej. 6) Wytwarzanie LAB przeprowadzono kilka pasaży z komórek macierzystych do zróżnicowanych osteoblastów produkujących LAB. Ta faza doświadczenia trwała około 40 dni. 7) Ekspansja LAB po pasażach zróżnicowanych osteoblastów, w celu uzyskania dostatecznej liczby komórek otrzymywano LAB poprzez wysiewanie próbek po komórek do 25-ml kolb z 6 ml pożywki hodowlanej. Tę fazę prowadzono przez około 8 tygodni do momentu uzyskania w każdej kolbie wióru kostnego. Wióry kostne osiągają objętość około 1 cm 3. 8) Zbieranie LAB z kolb do analiz histologicznych.

31 32 PRZYKŁAD 4 Określanie charakterystyki LAB [0048] Próbki LAB uzyskane w przykładach 1-3 poddano następującym analizom: 1) Określanie liczby LAB oceniano tworzenie się żywej, autologicznej tkanki kostnej. Określano liczbę zwapnionych guzków na kolbę i porównywano pacjentów w młodym i starszym wieku. Dane podano jako średnią ± SD. 2) Badania histologiczne, histochemiczne i immunofluorescencyjne zróżnicowane komórki i zwapniałą macierz usuwano z kolb stosując roztwór 50/50 1M trypsyny i 0,5% EDTA, po czym utrwalano w 4% formaldehydzie w 0,1 M PBS przez 48 h w temperaturze 4 C, ph 7,4, płukano w 0,1M PBS, ph 7,4, w temperaturze 4 C, po czym odwadniano, zatapiano w parafinie i cięto na skrawki (o grubości 5 µm). Szkiełka barwiono hematoksyliną i eozyną, czerwienią alizarynową, metodą Schmorla, azotanem srebra. Komórki do badań histochemicznych i immunofluorescencyjnych płukano w 0,1M PBS i utrwalano w 4% formaldehydzie w 0,1 M PBS, stosując 0,2% Triton X100, przez 30 min w temperaturze 4 C, po czym płukano dwukrotnie w 0,1% BSA w 0,1M PBS w temperaturze pokojowej, za każdym razem przez 10 min. Komórki pokrywano standardowym roztworem fosfatazy alkalicznej (ALP), inkubowano w ciemności przez 8 h. Oznaczenie aktywności ALP przeprowadzano z użyciem próbek po komórek, oderwanych od podłoża z użyciem 0,02% PBS/EDTA i odwirowywanych przez 10 min przy 140g. Osad inkubowano z 1 ml roztworu BMPurple (Roche, Segrate, Mediolan, Włochy) przez 8 godzin w ciemności. Nadsącz

32 33 odczytywano w spektrofotometrze przy długości fali 615 nm. Jako kontrolę zastosowano komórki c-kit - /CD34 -. Wartości wyrażono jako stosunek między próbką a roztworem macierzystym BMPurple. Jako roztwór do próby ślepej zastosowano rozpuszczalnik BMPurple. Komórki do badań immunofluorescencyjnych płukano dwukrotnie w 0,1M PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min, utrwalano w 4% formaldehydzie w 0,1 M PBS przez 48 h w temperaturze 4 C, ph 7,4, płukano w 0,1M PBS o ph 7,4 w temperaturze 4 C, po czym inkubowano przez noc w temperaturze 4 C z przeciwciałami. Próbki LAB zatapiano w TBS (podłoże do mrożenia tkanek, Triangle Biomedical Sciences, Durham, N.C., USA) i cięto na skrawki w warunkach zamrożenia (Kriostat 1720 Digital MGW Lauda, Leika, Niemcy), utrwalano w 100% etanolu przez 30 min w temperaturze 4 C, płukano w PBS 0,1M, po czym pozostawiono na 60 min w 6% PBS/mleku i inkubowano z przeciwciałami w temperaturze 4 C przez noc. Przeciwciała do komórek lub LAB były następujące: przeciwko osteonektynie, fibronektynie (Novo Castra, Newcastle, Wielka Brytania), BSP (sialoproteina kostna) (BIODESIGN International, USA), BAP (fosfataza alkaliczna kości) (US Biological, USA) wszystkie były przeciwciałami mysimi skierowanymi przeciwko antygenom ludzkim; przeciwko osteokalcynie i kolagenowi III (Santa Cruz, CA, USA) były natomiast przeciwciałami kozimi skierowanymi przeciwko antygenom ludzkim. Przeciwciałami drugorzędowymi były przeciwciała kozie skierowane przeciwko antygenom mysim (FITC) i przeciwciałami mysimi skierowanymi przeciwko antygenom kozim (sprzężone z PE) (Santa Cruz, CA, USA). Komórki i

33 34 LAB obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym (mikroskop fluorescencyjny Axiovert 100, Zeiss, Niemcy). 3) Analiza reakcji odwrotnej transkryptazy w łańcuchowej reakcji polimerazy z około komórek ekstrahowano RNA całkowity w różnych punktach czasowych (dzień 22 w przypadku komórek niezróżnicowanych, dzień 40 i dzień 60 w przypadku komórek zróżnicowanych), przez homogenizację w odczynniku TRI (SIGMA, Mediolan, Włochy), zgodnie z instrukcjami producenta, i przechowywano je w temperaturze -70 C do czasu wykonania testów. Przeprowadzono syntezę cdna z RNA całkowitego, stosując odwrotną transkryptazę Superscript II (Invitrogen Celbio Włochy, San Giuliano Milanese, Mediolan, Włochy), z wykorzystaniem oligo (dt) i odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya (10 U/µl) w 20 µl w temperaturze 42 C przez 50 min. [0049] Analizy PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach, stosując termocykler TC-312 (Techne, Burlington, NJ, USA), w którym próbki poddawano 2- minutowemu etapowi denaturacji w 94 C, następnie 35 cyklom w temperaturze 94 C przez 30 s, 54 C przez 45 s, 72 C przez 1 min i etapowi ostatecznego wydłużania w temperaturze 72C przez 4 min. Mieszanina PCR zawierała 0,2 mm każdego z dntp, 1,5 M MgCl 2, 0,2 µm każdego startera. Sekwencje starterowe były następujące: lewa RUNX-2 5'-CAC TCA CTA CCA CAC CTA CC-3'; prawa RUNX-2 5'- TTC CAT CAG CGT CAA CAC C-3'; lewa β-aktyna 5 -TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G-3'; prawa β-aktyna 5 -TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3'. Produkty powielenia

34 35 rozdzielano na 2% żelu agarozowym w buforze (octan Tris - TAE). PCR przeprowadzono na próbkach RT-ujemnych w celu wykluczenia zanieczyszczenia DNA. [0050] W analizie immunofluorescencyjnej LAB była w znacznej mierze dodatnia pod względem markerów tkanki kostnej włóknistej, takich jak fibronektyna, kolagen I i III, BSP (sialoproteina kości) i BAP, osteonektyna i osteokalcyna: w szczególności, osteoblasty tworzące pojedynczą warstwę, otaczającą nowo wytworzone beleczki LAB, były intensywnie dodatnie pod względem osteokalcyny, co jest kolejnym potwierdzeniem tego, że komórki te są to osteoblasty zaangażowane w proces kostnienia. Wyniki wykazały, że sortowane i hodowane komórki do dnia 50, choć nie były już dodatnie pod względem markerów komórek macierzystych, były dodatnie pod względem CD44 (100%), RUNX-2 (68,65% ± 2,0) i osteokalcyny (28,45% ± 1,7). Analiza RT-PCR RUNX-2 wykazała, że transkrypty mrna tego czynnika transkrypcujnego były obecne w zróżnicowanych komórkach w dniach 40 i 60, lecz nie w komórkach sortowanych, a jeszcze niezróżnicowanych, w dniu 22. PRZYKŁAD 5 Tworzenie i rozwój LAB na polimerze tworzącym rusztowanie [0051] Próbki komórek z przykładów 1-3 umieszcza się wewnątrz cylindrycznego pojemnika, do którego wprowadza się uprzednio uformowany fragment 85:15 p/p kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (w praktyce klinicznej wybrany kształt będzie odpowiadał ubytkowi kości, tak, żeby uzyskać korektę danego dawcy). Kolonizację komórkową w trzech wymiarach na uformowanym wstępnie