OCENA PODATNOŚCI BIAŁEK SERWATKOWYCH NA DZIAŁANIE ZEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH PROTEAZ DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA 1

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 12 (3) 2013, 5-18 ISSN X (print) ISSN (on-line) OCENA PODATNOŚCI BIAŁEK SERWATKOWYCH NA DZIAŁANIE ZEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH PROTEAZ DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA 1 Konrad Babij, Anna Dąbrowska, Marek Szołtysik, Marta Pokora, Agnieszka Szmyt, Aleksandra Zambrowicz, Józefa Chrzanowska Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. Celem podjętych w pracy badań była ocena podatności wybranych białek serwatkowych na działanie zewnątrzkomórkowych proteaz drożdży Yarrowia lipolytica i określenie ich potencjalnej przydatności technologicznej w procesie enzymatycznej hydrolizy. Do badań wykorzystano zarówno aktywną w środowisku kwaśnym proteazę aspartylową, a także działającą w środowisku alkalicznym proteazę serynową. Hydrolizie poddano α-laktoalbuminę, β-laktoglobulinę oraz dostępny w handlu koncentrat białek serwatkowych (WPC-80). Reakcję hydrolizy prowadzono w temperaturze 37 C, w ph 3,0 (dla proteazy aspartylowej) i w ph 8,0 (dla proteazy serynowej), wprowadzając enzym w dawce 10 U/mg białka substratowego. Postęp proteolizy analizowano ilościowo poprzez oznaczenie stopnia hydrolizy (DH%) i przyrost wolnych grup aminowych oraz jakościowo, tj. elektroforetycznie, a także wykonując rozdział frakcji białkowo-peptydowych przy wykorzystaniu wysoko sprawnej chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz (RP-HPLC). W puli wszystkich przetestowanych wariantów badawczych najwyższy poziom degradacji sięgający 39% uzyskano w roztworach β-laktoglobuliny trawionych drożdżową protezą serynową. Sława kluczowe: drożdże, Yarrowia lipolytica, proteazy, białka serwatkowe, hydroliza Badania zrealizowano w ramach projektu 2011/01/B/NZ9/04297 finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki. Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Anna Dąbrowska, Katedra Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. J. Chełmońskiego 37/41, Wrocław, anna.dabrowska@up.wroc.pl

2 6 K. Babij i in. WSTĘP Hydroliza enzymatyczna jest jedną z najczęściej stosowanych metod modyfikacji właściwości fizykochemicznych, funkcjonalnych i sensorycznych białek [Darewicz i in. 2000, Gastaldi i in. 2003, Liu, Chiang 2008, Tunçtürk, Zorba 2006]. W odróżnieniu od metod chemicznych, w których stosuje się nieorganiczne kwasy lub zasady, degradacja z wykorzystaniem enzymów nie powoduje zniszczenia form L-aminokwasów i powstawania ich izomerów D, a także tworzenia się niepożądanych pochodnych takich jak lizyno-alanina [Lahl, Gringstaff 1989]. Reakcje enzymatyczne prowadzone są najczęściej w łagodnych warunkach, a wysoka specyficzność wykorzystywanych do tego celu enzymów umożliwia precyzyjne kontrolowanie tych procesów, co pozwala na uzyskiwanie hydrolizatów o określonym stopniu degradacji i składzie peptydów. Zaletą procesów angażujących biokatalizatory jest również fakt, że kompozycja aminokwasów w enzymatycznych hydrolizatach białkowych jest bardzo zbliżona do tej, która występuje w degradowanym substracie [Clemente 2000]. W ostatnich latach znacznie wzrosło zainteresowanie wykorzystaniem naturalnych lub zhydrolizowanych białek serwatkowych w żywieniu człowieka. Spowodowane jest to postępem technologicznym, głównie w obszarze membranowych technik separacji, umożliwiających, przy stosunkowo niskich kosztach, uzyskiwanie białek o atrakcyjnych właściwościach żywieniowych i prozdrowotnych [Prieto i in. 2007]. Hydrolizaty białek serwatkowych wykazują wiele przydatnych w produkcji żywności właściwości funkcjonalnych takich jak: wodochłonność, zdolność do żelowania, tworzenia piany oraz emulgowania [Lieske, Konrad 1996, Caessens i in. 1999]. Zawarte w ich składzie peptydy o zróżnicowanej masie cząsteczkowej oraz wolne aminokwasy charakteryzują się wysoką wartością odżywczą i przyswajalnością, co przyczynia się do ich powszechnego wykorzystania w produkcji suplementów i oraz środków żywnościowych specjalnego przeznaczenia [Clemente 2000, Yujie i in. 2006]. Hydroliza enzymatyczna prowadzi również do wyeliminowania lub znacznego ograniczenie alergenności tych białek przy pełnym zachowaniu ich wartości odżywczej. Hydrolizaty białek serwatkowych są również źródłem, z którego można izolować peptydy o aktywności biologicznej. Liczne właściwości tych substancji, tj. działanie przeciwutleniające, bakteriobójcze, immunomodulacyjne, antytrombotyczne, obniżające ciśnienia tętnicze krwi czy glikemię poposiłkową, przyczyniają się do wykorzystania tych składników w produkcji żywności o charakterze nutraceutycznym [Haque, Chand 2008]. Dostępne w handlu hydrolizaty białek mleka otrzymywane są najczęściej przy zastosowaniu komercyjnych enzymów trawiennych (pepsyny, trypsyny i chymotrypsyny), roślinnych (papainy, ficyny, bromelainy), a także wielu preparatów pochodzenia bakteryjnego lub grzybowego. Degradacja białek serwatkowych za pomocą enzymów trawiennych może być jednak utrudniona ze względu na ich zwartą strukturę przestrzenną. Poszukiwanie biokatalizatorów zdolnych do wydajnego trawienia tych białek w ich formie natywnej może pozwolić na wyeliminowanie dodatkowych etapów ogrzewania substratu białkowego, powodującego jego denaturację. Istotną grupą enzymów zdolnych do degradowania białek mleka są niekomercyjne, zewnątrzkomórkowe proteazy wytwarzane przez drożdże Yarrowia lipolytica. Mikroorganizmy te mają uzdolnienia zarówno do syntezy proteazy serynowej, aktywnej w środowisku zasadowym, jak i aspartylowej, degradującej białka przy niskich wartościach ph Acta Sci. Pol.

3 Ocena przydatności białek serwatkowych... 7 [Ogrydziak 1993]. Wykorzystanie enzymów degradujących białka serwatkowe w różnych zakresach ph pozwala na ich szerokie zastosowanie i uzyskiwanie w ten sposób preparatów o zróżnicowanych właściwościach funkcjonalnych. Celem podjętych w pracy badań była ocena podatności wybranych białek serwatkowych na działanie zewnątrzkomórkowych proteaz drożdży Yarrowia lipolytica i określenie ich potencjalnej przydatności technologicznej w procesie enzymatycznej hydrolizy. MATERIAŁ I METODY Materiałem do badań były preparaty wybranych białek serwatkowych: β-laktoglobuliny (Sigma), α-laktoalbuminy (Sigma) i koncentratu białek serwatkowych WPC-80 (AMCO). Zastosowane do hydrolizy niekomercyjne proteazy pozyskano z drożdży Yarrowia lipolytica. Wykorzystany w pracy szczep został wyizolowany z sera z przerostem pleśni rokpol [Wojtatowicz i in. 2002] i zdeponowany w kolekcji drobnoustrojów Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wykorzystywane w pracy enzymy, tj: zewnątrzkomórkową proteazę aspartylową i serynową, otrzymywano z 48-godzinnych hodowli drożdży prowadzonych w bioreaktorze, w ph odpowiednio: 3,5 dla proteazy aspartylowej i 7,5 dla proteazy serynowej, na podłożu wzbogaconym w kazeinę i produkty odpadowe przemysłu tłuszczowego. Po zakończeniu hodowli biomasę drożdżową odwirowano. Uzyskane supernatanty, stanowiące surowe preparaty enzymatyczne, zagęszczano w dializatorze wyposażonym w asymetryczne membrany polisulfonowe, o nominalnym punkcie odcięcia 18 kda. W tak przygotowanych preparatach oznaczano poziom aktywności proteolitycznej wobec kazeiny lub hemoglobiny [Chrzanowska, Kołaczkowska 1998]. Metodyka badań Hydrolizę 1-procentowych roztworów białek serwatkowych prowadzono w temp. 37 C przez 5 godzin, w 0,1 M buforze Tris HCl ph 8,0 (w przypadku proteazy serynowej) oraz w 0,05 M buforze boraks-hcl, ph 3,0 (w przypadku proteazy aspartylowej). Do hydrolizy użyto enzymu w dawce 10 U/mg białka substratowego. Próby do analiz pobierano po 1-, 3-, 5- i 24-godzinnej inkubacji. Proces degradacji białka monitorowano ilościowo oznaczając stopień hydrolizy i przyrost wolnych grup aminowych, a także jakościowo poprzez rozdział uzyskanych frakcji peptydowych metodą wysoko sprawnej chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz (RP-HPLC) oraz elektroforetycznie (SDS-PAGE). Metody analityczne Oznaczanie aktywności enzymatycznej według Chrzanowskiej J., Kołaczkowskiej [1998] Aktywność proteolityczną oznaczano wobec 2-procentowego roztworu kazeiny w 0,1 M buforze Tris-HCl o ph 8,6 w temperaturze 37 C. Po 10 minutach reakcję przerywano przez dodanie 5-procentowego kwasu trójchlorooctowego (TCA), a następnie wirowano 10 min, 5500 obr./min. W supernatantach dokonywano pomiaru absorbancji przy długości fali λ = 280 nm. Za jedną jednostkę aktywności enzymatycznej przyjęto taką ilość enzymu, która w warunkach testu daje przyrost ekstynkcji E = 0,1. Biotechnologia 12 (3) 2013

4 8 K. Babij i in. Oznaczenie stopnia hydrolizy (DH) według Spellman [2003] Do 1 ml hydrolizatu dodawano 1 ml 10-procentowego TCA i pozostawiano na 15 minut w celu wytrącenia z roztworu niezhydrolizowanego białka. Po tym czasie próby wirowano przy 5500 g przez 10 minut, a w uzyskanych supernatantach określano zawartość białka metodą spektrofotometryczną poprzez pomiar absorbancji przy długości fali λ = 280 nm. Stopień hydrolizy określano jako procent produktów białkowych rozpuszczalnych w 5-procentowym TCA po hydrolizie, w odniesieniu do białka znajdującego się w wyjściowym roztworze. Zawartość wolnych grup aminowych oznaczono, stosując zmodyfikowaną metodę Kuchroo i in. [1983] Oznaczenie zawartości wolnych grup aminowych wykonano przy użyciu kwasu 2,4,6-trójnitrobenzanosulfonowego (TNBS), według zmodyfikowanej przez Chrzanowską metody Snydera i Sobocińskiego [1975] oraz Kuchroo i in. [1983]. Do odpowiednio rozcieńczonego hydrolizatu w 0,1 M boraksie, dodawano 50 μl 0,03 M wodnego roztworu TNBS, a następnie pozostawiono w zaciemnieniu przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej, po czym wprowadzano 2 ml 0,1 M NaH 2 PO 4, zawierającego 1,5 mm Na 2 SO 3, w litrze roztworu, a następnie wykonywano pomiar absorbancji przy długości fali λ = 420 nm, wobec próby ślepej. Ilość wolnych grup aminowych odczytywano z krzywej wzorcowej sporządzonej dla mianowanego roztworu glicyny. Chromatografia cieczowa w układzie odwróconych faz (RP-HPLC) według Christensena i in. [1989] Profile peptydowe hydrolizatów enzymatycznych preparatów białek mleka wyznaczano metodą RP-HPLC. Rozdziału dokonano z wykorzystaniem kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent Technologies (4,5 250 mm). Kolumnę równoważono 0,1% TFA, po czym nanoszono 100 μl hydrolizatu zawieszonego w fazie A: 0,1% TFA w H 2 O. Rozdział prowadzono w gradiencie faz: 0,1% TFA w H 2 O i 0,1% TFA w acetonitrylu o przyrastającym w czasie stężeniu 10%/min. Elucję peptydów monitorowano przy długości fali 230 nm. Elektroforeza w warunkach denaturujących według Schaggera i von Jagowa [1987] Rozdział elektroforetyczny białek prowadzono w dwuwarstwowym żelu poliakryloamidowym z SDS, w skład którego wchodziły 4-procentowy żel zagęszczający i 16-procentowy rozdzielający. Analizowane próby oraz marker mas zostały przygotowane w identyczny sposób jak podczas wykonywania rozdziału białkowo-peptydowego. Elektroforezę prowadzono przy stałym natężeniu prądu i zmieniającym się w zależności od żelu napięciu: 50 V dla żelu zagęszczającego i 80 V dla rozdzielającego. Po zakończonym rozdziale żele zanurzano w roztworze zawierającym 50% metanolu i 10% kwasu octowego. Do wybarwiania żelu użyto roztworu: 0,1 M NaOH i NH 4 OH z 20% AgNO 3 [Mc Veight i in. 1988]. OMÓWIENIE I DYSKUSJA Hydrolizę badanych w pracy białek serwatkowych, tj. α-laktoalbuminy, β-laktoglobuliny oraz koncentratu WPC-80 z udziałem pochodzących z drożdży Y. lipolytica proteinaz: aspartylowej i serynowej, prowadzono odpowiednio w ph: 3,0 i 8,0. Proces degradacji białka analizowano ilościowo poprzez wyznaczenie stopnia hydrolizy (DH), a także w re- Acta Sci. Pol.

5 Ocena przydatności białek serwatkowych... 9 akcji barwnej z kwasem trinitrobenzenosulfonowym (TNBS) pozwalającej wyznaczyć stężenie wolnych grup aminowych, tworzących się w wyniku rozpadu wiązań peptydowych. Uzyskane wyniki przedstawiono na rys. 1 i AAL BLG WPC DH [%] 8 4 A Czas hydrolizy [godz.] Time of hydrolysis [h] 40 AAL BLG WPC 30 DH [%] B Czas hydrolizy [godz.] Time of hydrolysis [h] Rys. 1. Stopień hydrolizy DH białek serwatkowych: AAL: α-laktoalbuminy, BLG: β-laktoglobuliny, WPC: koncentratu białek serwatkowych WPC-80, otrzymanych przy zastosowaniu proteazy asparylowej (A) i serynowej (B) z drożdży Yarrowia lipolytica, w dawce 10 U/mg Fig. 1. The DH of whey protein hydrolysates: AAL: α-lactoalbumin, BLG: β-lactoglobulin, WPC: whey protein concentrate WPC-80, obtained with the use of aspartyl (A) and serine (B) protease isolated from Yarrowia lipolytica yeast, in the dose of 10 U/mg Wszystkie wykorzystane w pracy substraty białek serwatkowych były podatne na działanie proteazy serynowej z drożdży Yarrowia lipolytica. Potwierdza to obecność produktów ich degradacji, identyfikowanych już w pierwszych godzinach prowadzenia reakcji hydrolizy, jak również kilkukrotny wzrost ich stężenia po 24 godzinach. W wyniku przeprowadzonych badań wykazano duże zróżnicowanie w podatności dwóch głównych frakcji białek serwatkowych na działanie proteazy drożdżowej aktywnej w środowisku zasadowym. Największą aktywność enzym ten wykazywał wobec Biotechnologia 12 (3) 2013

6 10 K. Babij i in. β-laktoglobuliny. Po godzinie prowadzenia reakcji stopień hydrolizy tego białka przekroczył 13%, a po 24 godzinach wzrósł ponad trzykrotnie. Uzyskane wyniki potwierdzono również podczas oznaczenia stężenia wolnych grup aminowych, których ilość w pierwszej godzinie prowadzenia reakcji hydrolizy wynosiła 1198 μm Gly/g, natomiast po 24 godzinach osiągała poziom 3641 μm Gly/g. Wysoki stopień hydrolizy β-laktoglobuliny zaobserwowali również w swoich badaniach Vasquez-Lara i in. [2003], którzy po zastosowaniu proteazy roślinnej (preparatu Actinidin) w dwugodzinnej reakcji prowadzonej w temp. 41,6 C uzyskali poziom hydrolizy wynoszący 43% AAL BLG WPC M Gly/g A Czas hydrolizy [godz.] Time of hydrolysis [h] AAL BLG WPC μm Gly/g B Czas hydrolizy [godz.] Time of hydrolysis [h] Rys. 2. Zawartość wolnych grup aminowych w hydrolizatach białek serwatkowych: AAL: α-laktoalbuminy, BLG: β-laktoglobuliny, WPC: koncentratu białek serwatkowych WPC- 80, otrzymanych przy zastosowaniu proteazy asparylowej (A) i serynowej (B) z drożdży Yarrowia lipolytica, w dawce 10 U/mg Fig. 2. Free amino groups content in whey protein hydrolysates: AAL: α-lactoalbumin, BLG: β-lactoglobulin, WPC: whey protein concentrate WPC-80, obtained with the use of aspartyl (A) and serine (B) protease isolated from Yarrowia lipolytica yeast, in the dose of 10 U/mg Acta Sci. Pol.

7 Ocena przydatności białek serwatkowych Najbardziej opornym substratem na działanie drożdżowej proteazy serynowej była α-laktoalbumina. Po godzinnej degradacji jej stopień hydrolizy wynosił zaledwie 7,6% i rósł proporcjonalnie w czasie, osiągając ostatecznie 18,2%. Poziom wolnych grup aminowych w tych próbach po 24 godzinach wynosił natomiast 1923 μm Gly/g. Wykorzystanie jako substratu przemysłowego koncentratu białek serwatkowych WPC-80 przyczyniło się do uzyskania po 24 godzinach stopnia hydrolizy sięgającego blisko 23%. Uzyskany w badaniach wysoki stopień degradacji β-laktoglobuliny jest interesujący, gdyż białko to charakteryzuje się niską podatnością na proteolizę enzymatyczną [Lovegrove i in. 1993, Lacroix, Li-Chan 2013]. Wykorzystanie testowanego w pracy enzymu stwarza zatem możliwości prowadzenia głębokiej proteolizy z pominięciem wstępnych zabiegów technologicznych, takich jak obróbka termiczna czy presuryzacja. Poziom proteolizy wybranych białek serwatkowych, jaki uzyskano po zastosowaniu zewnątrzkomórkowej proteazy serynowej z Yarrowia lipolytica do degradacji, pozwala na wykorzystanie tego enzymu do otrzymywania szerokiej gamy funkcjonalnych hydrolizatów zarówno o niskim, jak i wysokim stopniu hydrolizy. Preparaty o DH < 10% stosowane są najczęściej do modyfikacji właściwości funkcjonalnych produktów żywnościowych. Hydrolizaty należące do drugiej grupy (DH > 10%) są ważnym komponentem wykorzystywanym w produkcji suplementów diety i żywności specjalnego przeznaczenia [Pedroche i in. 2003, Asia i in. 2011]. Zastosowanie do hydrolizy drugiego z analizowanych w pracy enzymów drożdżowych (proteazy aspartylowej) przyczyniło się do uzyskania kilkakrotnie niższego stopnia degradacji badanych białek w porównaniu z ich hydrolizatami otrzymanymi przy użyciu proteazy serynowej. Analizowane substraty okazały się oporne na proteolizę proteazą aspartylową, a w ich 24-godzinnych hydrolizatach wyznaczony stopień hydrolizy wynosił ok. 13% (12,3 13,3%), natomiast oznaczone wartości wolnych grup aminowych mieściły się w zakresie od 1135 do 1418 μm Gly/g. Białka serwatkowe uważane są za substraty mało podatne na degradację enzymatyczną [Lovegrove i in. 1993, Lacroix, Li-Chan 2013]. Zastosowanie do ich proteolizy komercyjnych preparatów enzymatycznych takich jak alkalaza, wprowadzana zarówno pojedynczo [Spellman i in. 2003, Ou i in. 2010], jak i w układach sekwencyjnych, np. z pepsyną [Wróblewska, Troszyńska 2005], czy też neutrazy z Bacillus amyloliquefaciens pozwoliło na uzyskanie maksymalnego stopnia ich degradacji na poziomie nieprzekraczającym 15%. Otrzymane w analizach ilościowych wyniki znalazły potwierdzenie w wykonanych rozdziałach chromatograficznych (RP-HPLC) (rys. 3, 4), jak i w analizie elektroforetycznej (SDS PAGE, rys. 5). We wszystkich obrazach, jakie uzyskano po 24 godzinach prowadzenia reakcji hydrolizy, wykazano obecność drobnocząsteczkowych frakcji, które zwalniane były z kolumny wcześniej niż białko niezhydrolizowane. Podobnie jak we wcześniejszych oznaczeniach najmniej podatnym na degradację proteazą aspartylową białkiem była α-laktoalbumina. W jej 24-godzinnym hydrolizacie na chromatogramie wyraźnie widoczny jest pik pochodzący od niezhydrolizowanego substratu, czego nie zaobserwowano w innych próbach, zarówno tych trawionych proteazą aspartylową, jak i serynową. Analiza obrazów elektroforetycznych hydrolizatów uzyskanych z zastosowaniem proteazy aspartylowej potwierdziła również, że we wszystkich badanych preparatach proces ten przebiegał w sposób ograniczony. W miarę postępu proteolizy można zauważyć pojawianie się pojedynczych pasm peptydowych, o niższych masach cząsteczkowych Biotechnologia 12 (3) 2013

8 12 K. Babij i in. i wzrastającej intensywności, ale we wszystkich analizowanych próbach po 24-godzinnej hydrolizie wciąż widoczne były wyraźne pasma niezhydrolizowanych białek. Uzyskane w tej analizie wyniki potwierdzają wcześniejsze obserwacje dotyczące niskiej podatności białek serwatkowych na działanie proteazy drożdżowej aktywnej w środowisku kwaśnym. KA A KB B KC C Rys. 3. Profile białkowo-peptydowe hydrolizatów białek serwatkowych otrzymane po 24-go- Profile białkowo-peptydowe hydrolizatów białek serwatkowych otrzymane po 24-godzinnej hydrolizie proteazą aspartylową, w dawce 10 U/mg: A: α-laktoalbumina, B: β-laktoglobulina, C; WPC-80, K: 1-procentowe roztwory kontrolne A, B, C bez dodatku enzymu Fig. 3. RP-HPLC profiles of whey protein hydrolysates obtained after 24-hour hydrolysis with aspartyl protease isolated from Yarrowia lipolytica yeast, introduced at the dose of 10 U/mg. A: α-lactalbumin, B: β-lactoglobulin, C: WPC-80, K: undigested 1% protein solution A, B, C was used as a control Acta Sci. Pol.

9 Ocena przydatności białek serwatkowych KA A KB B KC C Rys. 4. Profile białkowo-peptydowe hydrolizatów białek serwatkowych otrzymane po 24-go- Profile białkowo-peptydowe hydrolizatów białek serwatkowych otrzymane po 24-godzinnej hydrolizie proteazą serynową, w dawce 10 U/mg: A: α-laktoalbumina, B: β-laktoglobulina, C: WPC-80, K: 1-procentowe roztwory kontrolne A, B, C bez dodatku enzymu Fig. 4. RP-HPLC profiles of whey protein hydrolysates obtained after 24-hour hydrolysis with serine protease isolated from Yarrowia lipolytica yeast, introduced at the dose of 10 U/mg. A: α-lactalbumin, B: β-lactoglobulin, C: WPC-80, K: undigested 1% protein solution A, B, C was used as a control Biotechnologia 12 (3) 2013

10 14 K. Babij i in. A α-laktoalbumina B β-laktoglobulina C WPC-80 [godz.] K K K A α-laktoalbumina B β-laktoglobulina C WPC-80 K K K Rys. 5. Rozdział elektroforetyczny frakcji białkowo-peptydowych hydrolizatów: A: α-laktoalbuminy, B: β-laktoglobuliny, C: WPC-80, uzyskanych z zastosowaniem proteazy aspartylowej, w dawce 10 U/mg, po 1, 3, 5, 24 godzinach prowadzenia reakcji. K: roztwór białka nie poddany hydrolizie Fig. 5. Electrophoretic separation of peptide fractions in whey protein hydrolysates: A: α-lactalbumin, B: β-lactoglobulin, C: WPC-80, with aspartyl protease introduced at the dose of 10 U/mg after 1, 3, 5, 24 h of reaction. K: unhydrolyzed protein Acta Sci. Pol.

11 Ocena przydatności białek serwatkowych W przypadku hydrolizatów uzyskanych przy zastosowaniu proteazy serynowej wykonana analiza elektroforetyczna potwierdziła znacznie wyższą podatność testowanych substratów na działanie tego enzymu. W analizowanym doświadczeniu w okresie hydrolizy (1, 3, 5 i 24 godz.) postępująca degradacja skutkowała zanikiem pasm pochodzących od badanych substratów i pojawianiem się sygnałów wskazujących na obecność frakcji niskocząsteczkowych. Analiza rozdziałów elektroforetycznych hydrolizatów już w 3. godzinie reakcji wskazywała na całkowity zanik pasm charakterystycznych dla natywnej β-laktoglobuliny, natomiast pasmo pochodzące od niezhydrolizowanej α-laktoalbuminy było nadal w końcowym okresie proteolizy. Także Ena i in. [1995], którzy do hydrolizy białek serwatkowych wykorzystali peptydazę z Aspergillus sp. (Corolase 7092 TM), już po 85 min reakcji odnotowali wyraźny zanik pasm charakterystycznych dla głównych białek serwatkowych. Podobnie jak w przypadku zewnątrzkomórkowej proteazy serynowej Yarrowia lipolytica autorzy tej pracy zaobserwowali, że proteoliza α-laktoalbuminy zachodziła w mniejszym stopniu niż β-laktoglobuliny. WNIOSKI 1. Wszystkie analizowane w pracy białka serwatkowe były podatne na działanie zewnątrzkomórkowych proteaz drożdży Y. lipolytica. 2. Wykorzystanie do trawienia analizowanych w pracy białek aktywnej w środowisku zasadowym proteazy serynowej przebiegało wydajniej niż wykorzystanie do tego celu proteazy aspartylowej, działającej przy niskich wartościach ph. 3. W puli wszystkich przetestowanych wariantów badawczych najwyższy poziom degradacji sięgający 39% uzyskano w roztworach β-laktoglobuliny trawionych drożdżową protezą serynową. 4. Zewnątrzkomórkowe proteazy drożdży Y. lipolytica mogą być wykorzystywane do degradowania białek serwatkowych i uzyskiwania tą drogą szerokiej gamy funkcjonalnych hydrolizatów zarówno o niskim, jak i wysokim stopniu hydrolizy. PIŚMIENNICTWO Asia B.F. Ahmed, Elfadil Babiker E., Nonuhiro Mori, Islam Mohamed Ahmed A., Hydrolysis of Ovine and Caprine Caseins by Enzymatic Extract from Solanum dubium Seeds. Australian J. Basic App. Sci., 5, Caessens P., Visser S., Gruppen H., Voragen A.G.J., β-lactoglobulin hydrolysis. Peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin, and Staphilococcus aureus V8 protease. J. Agric. Food Chem., 47, Chrzanowska J., Kołaczkowska M., Production of extracellular proteolytic enzymes by Beauveria bassiana. Acta Mycol., 33, Christensen T.M.I.E., Kristiansen K.R., Madsen J.S., Proteolysis in cheese investigated by high-performance liquid chromatography. J. Dairy Res. 56, Clemente A., Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. Trends Food Sci. Technol., 11(7), Darewicz M., Dziuba J., Caessens P.W.J.R., Effect of enzymatic hydrolysis on the emulsifying and foaming properties of milk proteins a review. Pol. J. Food Nutr. Sci., 9(1), 3 8. Biotechnologia 12 (3) 2013

12 16 K. Babij i in. Ena J.M., Van Beresteijn E.C.H., Robben A.J.P.M., Schmidt D.G., Whey Protein Antigenicity Reduction by Fungal Proteinases and a Pepsin/Pancreatin Combination. J. Food Sci., 60, Gastaldi E., Trial N., Guillaume C., Bourret E., Gontard N., Cuq J.L., Effect of Controlled κ-casein Hydrolysis on Rheological Properties of Acid Milk Gels. J. Dairy Sci., 86(3), Haque E., Chand R., Antihypertensive and antimicrobial bioactive peptides from milk proteins. Eur Food Res. Technol. 227, Kuchroo C.N., Rahilly J., Fox P.F., Assesment of proteolysis in cheese by reaction with trinitrobenzene sulphonic acid. Irish J. Food Sci. Technol., 7, Lacroix I.M.E., Li-Chan E.C.Y., Dipeptidyl peptidase-iv inhibitory peptides generated by tryptic hydrolysis of a whey protein concentrate rich in β-lactoglobulin. J. Agric. Food Chem., 61, Lahl J.W., Gringstaff D.A., Materiały 6 th SIFS Symposuim of Food Ingredients Applications, Status and Safety, Singapore, kwietnia 1989, Lieske B., Konrad G., A new method to estimate caseinomacropeptide and glycomacropeptide from trichloro-acetic acid filtrates. Milchwissenschaft. 51, Liu B.L., Chiang P.S., Production of Hydrolysate with Antioxidative Activity and Functional Properties by Enzymatic Hydrolysis of Defatted Sesame (Sesamum indicum L.). Int. J. Appl. Sci. Eng. 6, Lovegrove J.A., Osman D.L., Morgan J.B., Hampton S.M., Transfer of cow s milk β-lactoglobulin to human serum after a milk load: a pilot study. Gut., 34, McVeight T., Coffrey P., Owen P., Silver stainibg of oproteins and lipopoliasccharides in SDS-poliacrylamide gels [in:] Immunochemical and molecular genetics analysis of bacterial pathogens. (Ed. by P. Owen and T.J. Foster). Elseveir Science Publishers. Ogrydziak D.M., 1993, Yeast extracellular protease. Critic. Rev. Biotechnol. 13, Ou K., Liu Y., Zhang L., Yang X., Huang Z., Nout M.J.R., Liang J., Effect of neutrase, alcalase and papain hydrolysis of whey protein concentrates on iron uptake by Caco-2 cells. J. Agric. Food Chem., 58, Pedroche J., Yust M., Girón-Calle J., Vioque J., Alaiz M., Millán F., Plant protein hydrolysates and tailor-made foods. Electronic Journal of Environ. Agric. Food Chem., 2, Prieto C. A., Guadix A., Gonzalez-Tello P., Guadix E. M., A Cyclic Batch Membrane Reactor for the Hydrolysis of Whey Protein, J. Food Eng.,78, Schagger H, von Jagow G., Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kda. Anal Biochem 166 (2), Snyder, S.L., Sobociński P.Z., An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for the determination of amines. Anal. Biochem., 64, Spellman D., McEvoy E., O Cuinn G., FitzGerald R.J., Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: comparison of the TNBS, OPA and ph stat methods for quantification of degree of hydrolysis. Int. Dairy J., 13(6), Tunçtürk Y., Zorba Ö., The effects of enzymatic hydrolysis of casein on apparent yield stress and some emulsion properties. Food Hydrocoll., 20(4), Vasquez-Lara L., Tello-Solis S. R., Gomez-Ruiz L., Garcia-Garibay M., Rodriguez-Serrano G.M., Degradation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin by Actinidin. Food Biotech. 17, Wojtatowicz M., Chrzanowska J., Juszczyk P., Skiba A., Gdula A., Identification and biochemical characteristics of yeast microflora of Rokpol cheese. Int. J. Food Microbiol. 69, Acta Sci. Pol.

13 Ocena przydatności białek serwatkowych Wróblewska B., Troszyńska A., Enzymatic hydrolysis of cow s whey milk protein in aspect of utility in production of hypoallergenic formulas. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 14/55, 4, Yujie C., Bo T., Bo S., Mingruo G., Enzymatic hydrolysis conditions for egg white proteins. Bull. Facul. Agric. Niigata Unive., 58(2), THE EVALUATION OF WHEY PROTEINS SUSCEPTIBILITY TO DEGRADATION WITH EXTRACELLULAR PROTEASES ISOLATED FROM YARROWIA LIPOLYTICA Abstract. The aim of the study was the evaluation of selected whey proteins susceptability to degradation with proteolytic enzymes isolated from Yarrowia lipolytica yeast. In the research the aspartyl and serine proteases were used for hydrolysis of α-lactoalbumin, β-lactoglobulin and whey protein concentrate (WPC-80). The reaction was carried out at ph 3.0 and ph 8.0 respectively, at 37 C, with the enzyme applied in a dose of 10 U/mg of the protein. The progress of proteolysis was monitored quantitatively by the determination of the hydrolysis degree (DH), free amino groups content and qualitatively by the SDS PAGE electrophoresis and by RP-HPLC. All tested substrates were characterized by low susceptibility to degradation with aspartyl protease, while the application of serine protease caused the intensive degradation mainly β-lactoglobulin. Key words: yeast, Yarrowia lipolytica, proteases, whey proteins, hydrolysis Zaakceptowano do druku Accepted for print: Do cytowania For citation: Babij K., Dąbrowska A., Szołtysik M., Pokora M., Szmyt A., Zambrowicz A., Chrzanowska J., Ocena podatności białek serwatkowych na działanie zewnątrzkomórkowych proteaz drożdży Yarrowia Lipolytica. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 12 (3), Biotechnologia 12 (3) 2013