(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/45 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. G01N 33/68 ( ) C07K 14/47 ( ) C07K 16/18 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Wysoko specyficzny test immunologiczny i zestaw do oznaczania peptydów i białek o znaczeniu biologicznym (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/19 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/04 (73) Uprawniony z patentu: Araclon Biotech, S.L., Zaragoza, ES (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 J MANUEL SARASA BARRIO, Zaragoza, ES (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS Rzecznicy Patentowi WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 [0001] Wynalazek dotyczy dziedziny analiz immunologicznych, umożliwiających wykrywanie peptydów i białek w próbkach, i zapewniających wyższą czułość niż testy znane ze stanu techniki. Wynalazek dotyczy także zestawów, które dostarczają składniki potrzebne do przeprowadzenia wspomnianych analiz immunologicznych. TŁO WYNALAZKU [0002] Choroba Alzheimera (AD) jest progresywną chorobą degeneracyjną centralnego układu nerwowego, która chrakteryzuje się postępującą i nasilającą się utratą pamięci, a następnie utratą kontroli nad funkcjami kończyn i ciała i ewentualną śmiercią. Jest zdecydowanie najczęstszą przyczyną występowania demencji, dotykającą 1 do 6% osób w wieku powyżej 65 lat i od 10 do 20% z grupy osób w wieku ponad 80 lat. [0003] AD jest odróżniana od innych rodzajów demencji na podstawie kilku charakterystycznych objawów chorobowych, w tym stopniowego pojawiania się w mózgu pacjentów płytek starczych, w przestrzeni pozakomórkowej między neuronami. Płytki posiadają centralny rdzeń złogów amyloidowych, utworzony głównie przez włókna składające się z peptydu o aminokwasach, odnoszącego się do peptydu β amyloidu (Aβ), otoczonego przez zdegenerowane komórki nerwowe i glejowe. Peptyd ten powstaje z proteolitycznie zmodyfikowanego białka prekursorowego, zwanego białkiem prekursorowym amyloidu β (βapp). βapp występuje w organizmie w postaci różnych izoform pochodzących z alternatywnego składania pierwotnego transkryptu genu kodującego βapp. Izoformy te stanowią głównie βapp-695, βapp-751 i βapp-770, przy czym dane odnoszą się do liczby aminokwasów. Gen βapp występuje u ludzi w chromosomie 21, którego trisomia (zespół Downa) powoduje nadekspresję białka i wczesne pojawienie się złogów amyloidowych w mózgu pacjenta (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, ). βapp jest białkiem transmembranowym, które może być przetwarzane przez różne enzymy proteolityczne (sekretazy), co powoduje powstawanie różnych produktów. Zazwyczaj, βapp ulega cięciu przez sekretazę alfa w jego obszarze pozakomórkowym, co generuje słabo rozpuszczalny, wydzielany fragment i krótszy zakotwiczony w błonie fragment o nazwie C83, który jest następnie cięty przez γ- sekretazę do peptydu p3 (p3 40 lub p3 42 ) oraz peptydu 57 lub 59, które są następnie degradowane przez inne proteazy. W wyniku trawienia βapp przez β-sekretazę powstaje rozpuszczalny, wydzielany fragment (sβapp-β) i fragment C99, które mogą być cięte przez γ-sekretazy, co daje peptyd amyloidowy Aβ i peptyd 57 lub 59 aminokwasowy zakotwiczony w błonie (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, ). [0004] AD może być klasyfikowana na podstawie wieku, w którym wystąpiła, jako wcześnie pojawiająca się (w wieku poniżej 60 lat) i późno pojawiająca się (w wieku powyżej 60 lat), na podstawie wystąpienia autosomalnego dziedziczenia dominującego, jako postać rodzinna AD lub sporadyczna AD. Wczesny początek postaci rodzinnej AD może być związany ze znaną mutacją w genach kodujących

3 2 βapp, presenilinę 1 i presenilinę 2 (znajdujących się odpowiednio na chromosomach 21, 14 i 1). Wspomniane klasyfikacje nie wykluczają się wzajemnie. Najczęstsze postaci są późno pojawiającymi się postaciami sporadycznymi. [0005] W praktyce klinicznej, rozpoznanie choroby przeprowadza się przy użyciu kryteriów klinicznych, opartych na występowaniu typowych objawów klinicznych a wykluczenie innych rodzajów demencji przy użyciu technik neuroobrazowania i analizy krwi. Stosując te kryteria diagnostyczne, wiarygodność diagnostyczna jest akceptowalna, choć według badań przeprowadzonych z wykonaniem autopsji mózgu, grupa 10-20% pacjentów z rozpoznaną AD cierpiało na inne choroby. Ponadto, obecnie stosowane metody diagnostyczne mogą być wykonywane tylko wtedy, gdy proces neurodegeneracyjny jest tak zaawansowany, że pacjent cierpi na demencję a uszkodzenie mózgu jest tak rozległe, że ogranicza to ilość środków terapeutycznych. Ostateczna diagnoza wymaga badania patologicznego wykonywanego post-mortem na tkance mózgowej. [0006] Dlatego, istnieje potrzeba identyfikacji biomarkerów do wczesnego rozpoznania AD, które są czułe i specyficzne, i które umożliwiają rozróżnienie zaburzenia funkcji poznawczych związanych z wiekiem od zaburzeń związanych z wczesnymi objawami tego procesu, jak również na odróżnienie zmian wynikających z AD i z powodu innych chorób degeneracyjnych. Zgodnie z Growdon et al. (Neurobiol. Aging, 1998, 19: ), idealny marker dla AD powinien spełniać następujące wymagania: Powinien wykrywać podstawową cechę neuropatologii Powinien być zatwierdzony w neuropatologicznie potwierdzonych przypadkach choroby Powinien wykazywać czułość na poziomie co najmniej 80% w wykrywaniu AD Powinien przejawiać specyficzność na poziomie co najmniej 80% w rozróżnianiu AD od innych rodzajów demencji oraz Powinien być wiarygodny i powtarzalny, nieinwazyjny, prosty do wykonania i niedrogi. [0007] W stanie techniki znane są metody diagnozowania AD poprzez wykrywanie poziomu biomarkerów obecnych w mózgu lub w CSF (płynie mózgowo-rdzeniowym) pacjentów. Scharakteryzowano różne biomarkery, które oznaczane są w CSF. CSF odzwierciedla bezpośrednio skład przestrzeni zewnątrzkomórkowej centralnego układu nerwowego, a tym samym zapewnia wyższe stężenia biomarkerów. Jednak, CSF może być pobierany jedynie za pomocą punkcji lędźwiowej, która nie jest rutynową metodą diagnostyczną łatwo akceptowaną przez pacjentów cierpiących na demencję, nie mówiąc już u pacjentach z zaburzeniami pamięci. Istnieje więc potrzeba zapewnienia biomarkerów AD, które mogą być wykryte w próbkach, które można nieinwazyjnie pobierać z ciała pacjenta. [0008] Odpowiednie biomarkery AD opisane w stanie techniki i możliwe do wykrycia w osoczu obejmują (i) markery pochodzące z płytki amyloidu, (ii) autoprzeciwciała przeciwko Aβ lub βapp, (iii) markery zapalne, takie jak IL-6, jego receptor lub gp130, białko C-reaktywne lub białko stresu oksydacyjnego (izoprostany), (iv) markery metabolizmu lipidowego (apoe, oksysterole) oraz (v) markery choroby naczyń

4 3 (homocysteina, lipoproteina b Clq) (Scheuner D et al. (1996) Nature Med 2, ). [0009] Jednakże, w świetle faktu, że Aβ ulega kumulacji w mózgu pacjentów z AD i stanowi centralny element patogenezy AD, białko to zostało uznane za najbardziej odpowiedniego kandydata na biomarkera AD. Jednak, korzystanie z Aβ w funkcji biomarkera AD w osoczu stwarza problem wynikający z tego, że stężenia peptydów Aβ (Aβ (1-40) oraz Aβ (1-42)) w surowicy są niezwykle niskie, tak że nie ma dostępnych testów, które są wystarczająco czułe, aby umożliwić detekcję wymienionych rodzajów peptydu. [0010] Scheuner et al (Nature Med., 1996, 2: ) przeprowadził wstępne badania mające na celu wykrycie, czy pozakomórkowe stężenia preseniliny 1, preseniliny 2 lub βapp były podwyższone u pacjentów z rodzin przenoszących mutacje związane z postacią rodzinną AD. Mimo że podwyższony poziom Aβ 1-42 (43) stwierdzono w osoczu pochodzącym od osób z FAD-związanymi mutacjami PS1 (P <0,0001), PS2 N1411 (P = 0,009), APP K670N. M671L (P <0,0001) i APP V7171 (jeden pacjent), badania te nie zostały zatwierdzone do analizy sporadycznej postaci AD, w której stężenie peptydów Aβ w surowicy jest znacznie niższe. Zestaw do oznaczania stosowany w opisanych tym dokumencie badaniach był testem immunoenzymatycznym podwójnego wiązania ( kanapkowym ) ELISA, wcześniej opisanym przez Suzuki,N. et al. (Science, 1994, 264: ), w którym wykorzystuje się przeciwciało wychwytujące i przeciwciało do detekcji sprzężone z peroksydazą. [0011] Przypuszcza się, że nie ma korelacji między poziomem Aβ a sporadyczną postacią AD. W związku z tym, Tamaoka A et al. (J Neurol Sci., 1996, 141, 65-68) dokonali pomiaru poziomu Aβ w osoczu pochodzącym od 28 pacjentów ze sporadyczną postacią AD, 40 pacjentów cierpiących na inne procesy neurologiczne związane z demencją i 40 osób zdrowych. Autorzy stwierdzili, że stężenia Aβ40 i Aβ42 są podobne w grupie kontrolnej i u chorych na postać sporadyczną AD. Podobne wyniki zostały uzyskane przez Kosaka et al. (Neurology, (1997) 48, ). Test wykorzystany przez Tamaoka i współpracowników został ponadto scharakteryzowany w WO , w odniesieniu do pomiaru Aβ1-40 w osoczu. Test ten jest testem podwójnego wiązania ELISA, w którym peptydy Aβ40 i Aβ42 są wychwytywane na stałym nośniku, przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 1A10 (mab) i wykrywane za pomocą 14F1 mab sprzężonego z peroksydazą. Test ten zapewnia poziom czułości w zakresie wartości jednocyfrowych stężenia pg/ml. [0012] Vanderstichele H et al. (Amyloid, 2000, 7, ) określili poziom Aβ(1-42) w CSF, osoczu i moczu dla 12 zdrowych osobników kontrolnych, 39 pacjentów chorych na AD oraz 6 pacjentów cierpiących na otępienie z ciałami Lewy'ego, 10 pacjentów z innymi rodzajami demencji oraz 9 pacjentów z innymi patologiami neurologicznymi niewykazującymi objawów demencji, jednak nie odnotowano żadnej korelacji pomiędzy poziomem Aβ(1-42) a wynikami diagnozy, płcią lub wynikami MMSE. We wspomnianych badaniach zastosowano test INNOTEST β-amyloidu (1-42), oparty na teście podwójnego wiązania ELISA, w którym Aβ(1-42) jest wychwytywane na stałym nośniku za pomocą 21F12 mab rozpoznającego N- końcowy region Aβ(1-42) i przeprowadza się wykrywane z użyciem biotynylowanego

5 4 3D6 mab, które rozpoznaje C-końcowy region Aβ(42) oraz streptawidyny sprzężonej z HRP. [0013] Fukomoto et al. (Arch. Neurol. 2003, 60, ) przeprowadził badania nad korelacją poziomu Aβ40 i Aβ42 w osoczu względem różnych klinicznych, demograficznych i genetycznych zmiennych u 146 pacjentów z AD, 37 pacjentów z łagodnymi zaburzeniami poznawczymi i 96 pacjentów z chorobą Parkinsona. Wyniki pokazały, że istnieje znaczący wzrost poziomu skorelowany z wiekiem, ale nie ma różnic w odniesieniu do rozpoznania, historii choroby rodziny, genotypu ApoE lub leczenia za pomocą różnych leków, takich jak inhibitor acetylocholinesterazy lub statyny. Pomiary wykonano przy użyciu testu podwójnego wiązania ELISA, przy zastosowaniu mab, które rozpoznaje sekwencję aminokwasową od 11 do 28 z Aβ (BNT77) oraz mab sprzężonych z HRP, które specyficznie rozpoznają Aβ40 i Aβ42 (BA27 oraz BC05 mab). [0014] Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, ) dokonali pomiaru poziomu Aβ40 i Aβ42 w osoczu i w CSF u 78 pacjentów z AD oraz u 61 zdrowych osób stanowiących grupę kontrolną i odnotowali, że poziom Aβ40 w osoczu jest wyższy u pacjentów z AD, którzy posiadają allele ApoE4, niż w grupie kontrolnej nie posiadającej wspomnianych alleli, oraz że poziom Aβ42 jest zbliżony u pacjentów z AD i grupy kontrolnej, przy czym nie odnotowali żadnych różnic wynikających z płci lub stanu psychicznego ocenianego za pomocą testu krótkiej skali oceny stanu psychicznego (MMSE). Pomiary przeprowadzono stosując immunoenzymatyczny test podwójnego wiązania ELISA, w którym wykorzystano jako przeciwciało wychwytujące przeciw-aβ mab 6E10 oraz biotynylowane przeciwciało z surowicy odpornościowej skierowane przeciwko peptydom i specyficzne wobec Aβ42 i Aβ40. [0015] Mayeux, R. et al. (Ann Neurol. 1999, 46, ) dokonali pomiaru poziomu Aβ40 i Aβ42 w osoczu w badanej grupie (530) i 18 miesięcy później (307 pacjentów) stosując ten sam test immunoenzymatyczny ELISA, jak Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, ). Odnotowano, że pacjenci, u których rozwinęła się AD posiadali wyższy poziom Aβ42 niż osoby, u których podczas badania nie rozwinęła się AD. Poziom Aβ42 ulegał obniżeniu po 3 latach od ustalenia diagnozy AD. Nie zaobserwowano żadnych różnic pod względem fenotypu AD. [0016] Lanz, T.A i Schacthter, J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157:71-81) opisali kolorymetryczny i fluorescencyjny test podwójnego wiązania ELISA do wykrywania całkowitej zawartości peptydów Aβ albo ilości poszczególnych peptydów Aβ40 i Aβ42. Do wykrywania całkowitej zawartości peptydów Aβ zastosowano 6E10 mab, wykorzystane do wychwytywania peptydów Aβ, a następnie detekcję prowadzono z użyciem biotynylowanego 4G8 i albo sprzężonej z europem streptawidyny albo HRP-streptawidyny. Do wykrywania ilości peptydów Aβ40 i Aβ42, zastosowano 6E10 mab jako przeciwciało wychwytujące i biotynylowane królicze poliklonalne przeciwciała specyficzne wobec wspomnianych fragmentów, po czym użyto sprzężoną z europem streptawidynę albo HRP-streptawidynę. Jednakże, metoda ta pozwoliła na uzyskanie najniższego limitu detekcji na poziomie 10 pg/ml i była używana jedynie do pomiaru Aβ w ekstrakcie z mózgu.

6 5 [0017] W WO opisano analizę immunologiczną do wykrywania postaci multimerycznych Aβ42, które uczestniczą w wychwytywaniu pochodnych peptydów Aβ42, z użyciem przeciwciał poliklonalnych specyficznych wobec wspomnianych postaci multimerycznych i oznaczanie ilości związanych peptydów za pomocą mab i HRP-sprzężonego, przeciw-mysiego IgG. Jednak, powyższa analiza zapewnia poziom detekcji rzędu pm, co odpowiada 4000 pg/ml. [0018] W WO przedstawiono test podwójnego wiązania ELISA do oznaczania Aβ, w którym wykorzystano przeciwciało 3D6 mab przeciw-n-końcowe jako przeciwciało wychwytujące i do detekcji, mab, które rozpoznawało aminokwasy 15 do 24 dojrzałego Aβ, ale powyższy test stosowano jedynie do pomiaru wartości stężenia Aβ w zakresie 100 do 200 pg/ml. [0019] W WO ujawniono test ELISA do pomiaru Aβ40 i Aβ42 w osoczu, w którym wykorzystano przeciwciało rozpoznające aminokwasy 13 do 28 dojrzałych peptydów Aβ, ale test ten daje możliwość wykrycia stężeń wspomnianych peptydów jedynie w zakresie pg/ml a zatem jest odpowiedni tylko do oznaczania poziomu Aβ w osoczu w przypadku postaci rodzinnej AD. [0020] W WO opisano test podwójnego wiązania ELISA do pomiaru wszytkich rodzajów Aβ (Aβ40 i Aβ42) w homogenacie uzyskanym z mózgu, w którym to teście zastosowano jako przeciwciało wychwytujące specyficzne mab dla aminokwasów 13 do 28 z Aβ42 oraz biotynylowane 3D6 mab specyficzne dla N- końcowego regionu peptydu Aβ42, po czym użyto streptawidyny sprzężonej z peroksydazą. W dokumencie tym opisano ponadto test podwójnego wiązania ELISA specyficzny wobec Aβ42, w którym wykorzystano jako przeciwciało wychwytujące mab 21F12 specyficzne wobec aminokwasów z Aβ42 oraz biotynylowane 3D6 mab jako przeciwciało do detekcji. Jednakże, powyższe testy pozwalały na uzyskanie niższych poziomów czułości rzędu 50 ng/ml w analizie pomiaru całkowitego Aβ i 125 mg/ml w teście pomiaru ukierunkowanym na Aβ42, co czyni testy te nieużyteczne do oznaczania Aβ lub Aβ42 w osoczu lub w surowicy. [0021] W W przedstawiono test podwójnego wiązania ELISA do pomiaru β-amyloidu(1-42) w ekstraktach z mózgu w kwasie mrówkowym oraz w CSF z wykorzystaniem mab 3D6 jako przeciwciała do detekcji oraz przeciwciał poliklonalnych specyficznych wobec różnych regionów dojrzałych peptydów Aβ, zastosowanych jako przeciwciało wychwytujące. [0022] Jednakże, wszystkie dotychczasowe testy oparte na analizie ELISA posiadają niski poziom detekcji, mieszczący się w większości przypadków w zakresie wartości jednocyfrowych pg/ml, który jest wystarczający do oznaczenia Aβ40 i Aβ42 w CSF, jak również do wykrycia wspomnianych cząsteczek w osoczu u pacjentów cierpiących na postać rodzinną AD, ale nie jest odpowiedni do wykrywania Aβ42 w osoczu u pacjentów cierpiących na postać sporadyczną AD, w przypadku której stężenia Aβ42 w osoczu są dużo niższe. W szczególności, test INNOTEST β amyloidu (1-42) wykazuje niski poziom detekcji 20 pg/ml, który pozwala na oznaczenie Aβ42 w CSF, jak również na wykrycie wspomnianych cząsteczek w osoczu u pacjentów cierpiących na postać rodzinną AD, ale nie jest odpowiedni do wykrywania Aβ42 w osoczu u pacjentów cierpiących na postać sporadyczną AD, w

7 6 przypadku której stężenia Aβ42 w osoczu są dużo niższe. Użycie tego zestawu polecane jest jedynie do oznaczania poziomu peptydu Aβ w CSF. Zalecenie to zostało następnie sprawdzone w ostatnich badaniach z wykorzystaniem INNOTEST testu β-amyloidu(1-42), w których wykazano, że poziom peptydu w CSF mieści się w zakresie pomiędzy 100 a 1000 razy wyższym, niż w osoczu (Lewczuk, P et al. (2004) Neurobiol. Aging 25, ). [0023] Innymi, handlowo dostępnymi zestawami są Biosource test β amyloidu (1-40) oraz test β amyloidu (1-42). Zestawy te umożliwiają przeprowadzenie testu podwójnego wiązania ELISA, w którym peptydy są wychwytywane na nośniku za pomocą mab skierowanego przeciwko regionowi końca aminowego dojrzałego peptydu i wykrywane przy zastosowaniu króliczego przeciwciała poliklonalnego, które reaguje z regionem C-końcowym dojrzałych β-peptydów i peroksydazą sprzężoną z przeciw-króliczą IgG. Zestaw ten wykazuje czułość według danych producenta na poziomie niższym niż 10 pg/ml, ale jest używany do wykrywania stężenia Aβ o wartości pomiędzy 15,6 a 1000 pg/ml. Zestawy Biosource są zalecane przez producentów do wykrywania peptydów Aβ w surowicy, CSF oraz kulturach komórkowych. Jednak, średni poziom Aβ40 i Aβ42 w surowicy pochodzącej od pacjentów z postacią sporadyczną AD leży poniżej dolnej granicy czułości testu, zatem nie wydaje się możliwe, by można było wykorzystać je do pomiarów próbek surowicy. [0024] W kanadyjskim zgłoszeniu patentowym (CA ), odpowiadającym międzynarodowemu zgloszeniu patentowemu WO , opisano jedynie analizę peptydu Aβ, pozwalającą na uzyskanie niższego poziomu detekcji 0.5 pg/ml. Analiza przedstawiona w tym dokumencie jest analizą opartą na elektrochemiluminiscenyjnym (ECL) teście podwójnego wiązania, w którym mab 21F12 (które rozpoznaje aminokwasy z Aβ42) jest sprzężone z kuleczkami magnetycznymi, stosowanymi do wyłapywania peptydu Aβ42 w próbce zawierającej Aβ42, a następnie kontaktowane z 3D6 mab sprzężonym z kompleksem rutenu. Ilość związanego przeciwciała 3D6 jest następnie wykrywana za pomocą luminescencji emitowanej przez kompleks rutenu, po przyłożeniu energii elektrycznej. Wykorzystując powyższą analizę, twórcy byli w stanie wykryć tak niski jak 0.5 pg/ml poziom standardu Aβ42. Jednakże, gdy zastosowano taką samą analizę do porównania poziomu Aβ42 w próbkach osocza pochodzących od pacjentów AD i od zdrowych osób z grupy kontrolnej, nie zaobserwowano żadnych znaczących różnic pomiędzy dwiema grupami badanych, co sprawiło, że twórcy stwierdzili, że ilość nienaruszonej Aβ42 w surowicy jest bardzo niska na skutek degradacji i przeszli do stosowania kompetytywnej analizy ELISA z użyciem 21F12 mab, zapeniającej niższe poziomy czułości w zakresie ng/ml. [0025] W EP ujawniono: zestaw do detekcji docelowego polipeptydu wybranego z grupy obejmującej A42 (Aβ42), A40 (Aβ40) i ich mieszaninę, zawierający: (i) pierwsze przeciwciało (przeciwciało wychwytujące) lub kombinację przeciwciał rozpoznających docelowy polipeptyd (substancje wiążące, które są przeciwcialami),

8 7 (ii) drugie przeciwciało (przeciwciało reporterowe) lub kombinację przeciwciał rozpoznających inny obszar docelowego polipeptydu niż obszar rozpoznawany przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał (substancje wiążące, które są przeciwciałami), (iii) odczynnik (taki jak, np. "inne przeciwciało (np. królicze przeciwciało)") wykazujący powinowactwo do drugiego przeciwciała, przy czym odczynnik ten jest sprzężony z pierwszym elementem pary wiążącej (przeciwciała skierowane przeciwko króliczym, rozpoznające królicze przeciwciało) oraz (iv) drugi element pary wiążącej, taki jak wykrywalny znacznik lub enzym (fosfataza). W EP ujawniono ponadto, że układ ten może także obejmować substrat dla znacznika enzymatycznego. [0026] Zatem, w dziedzinie istnieje potrzeba wprowadzenia udoskonalonej analizy immunologicznej i zestawów do wykrywania peptydów Aβ-pochodnych, które pozwolą na przezwyciężenie problemów związanych ze znanymi w stanie techniki metodami i zestawami, w szczególności, które wykazują czułość wystarczającą do wiarygodnego wykrycia peptydów Aβ w osoczu pacjentów cierpiących na postać sporadyczną AD. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0027] W pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu do wykrywania docelowego polipeptydu, wybranego z grupy obejmującej Aβ42, Aβ40 oraz ich mieszaninę, zawierającego (i) pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał rozpoznających wspomniany docelowy polipeptyd przy czym pierwsze przeciwciało skierowane jest przeciwko epitopowi znajdującemu się w obszarze aminowasów 1 do 16 Aβ40 oraz Aβ42, i pierwsze przeciwciało jest uprzednio związane ze stałym nośnikiem, (ii) drugie przeciwciało lub kombinację przeciwciał rozpoznających inny obszar docelowego polipeptydu, niż obszar rozpoznawany przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał, (iii) odczynnik wykazujący powinowactwo względem drugiego przeciwciała, przy czym wspomniany odczynnik jest sprzężony z pierwszym elementem pary wiążącej oraz (iv) drugi element pary wiążącej sprzężony ze znacznikiem fluorescencyjnym, luminescencyjnym lub enzymatycznym, w którym para wiążąca wybrana jest z grupy składającej się z: haptenu i przeciwciała;

9 8 antygenu i przeciwciała; biotyny i awidyny; biotyny i streptawidyny; analogu biotyny i awidyny; analogu biotyny i streptawidyny; cukru i lektyny; enzymu i kofaktora; kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego oraz analogu kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego. [0028] W drugim aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu według wynalazku do oznaczania lub wykrywania docelowego polipeptydu w próbce, jak również służącego do diagnozy choroby neurodegeneracyjnej u pacjenta. [0029] W trzecim aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oznaczania lub wykrywania ilości docelowego polipeptydu wybranego z grupy zawierającej Aβ42, Aβ40 i ich mieszaninę, w próbce, obejmujący następujące etapy (i) wychwytywanie docelowego polipeptydu obecnego w próbce za pomocą pierwszego przeciwciała lub kombinacji przeciwciał wiążących specyficznie wspomniany docelowy polipeptyd, przy czym pierwsze przeciwciało skierowane jest przeciwko epitopowi położonemu w obszarze aminokwasów 1 do 16 w Aβ40 oraz Aβ42, i pierwsze przeciwciało jest uprzednio immobilizowane na stałym nośniku, (ii) kontaktowanie kompleksu immunologicznego utworzonego w etapie (i) z drugim przeciwciałem lub kombinacją przeciwciał rozpoznających obszar docelowego polipeptydu, który jest różny od obszaru rozpoznawanego przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał, (iii) kontaktowanie kompleksu utworzonego w etapie (ii) z odczynnikiem wykazującym powinowactwo względem drugiego przeciwciała i sprzężonego z pierwszym elementem pary wiążącej, (iv) kontaktowanie kompleksu utworzonego w etapie (iii) z drugim elementem pary wiążącej sprzężonym ze znacznikiem fluorescencyjnym, luminescencyjnym lub enzymatycznym oraz (v) wykrycie lub określenie aktywności lub ilości znacznika przyłączonego do drugiego elementu pary wiążącej,

10 9 przy czym para wiążąca wybrana jest z grupy składającej się z: haptenu i przeciwciała; antygenu i przeciwciała; biotyny i awidyny; biotyny i streptawidyny; analogu biotyny i awidyny; analogu biotyny i streptawidyny; cukru i lektyny; enzymu i kofaktora; kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego oraz analogu kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego. [0030] W czwartym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania choroby degeneracyjnej u pacjenta, obejmującego określenie ilości Aβ40 lub Aβ42 w próbce od pacjenta z wykorzystaniem sposobu według wynalazku i skorelowanie wartości stężenia wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce od wspomnianego pacjenta w odniesieniu do stężenia wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce pochodzącej od zdrowego osobnika, z pojawieniem się choroby degeneracyjnej. KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU [0031] Na Figurze 1 przedstawiono krzywą standardową miareczkowania dla testu podwójnego wiązania ELISA, w którym wartość absorbancji przy 450 nm przedstawiono w funkcji znanych wartości stężenia standardowych preparatów Aβ40 (w pg/ml). [0032] Na Figurze 2 przedstawiono krzywą standardową miareczkowania dla testu podwójnego wiązania ELISA, w którym wartość absorbancji przy 450 nm przedstawiono w funkcji znanych wartości stężenia standardowych preparatów Aβ42 (w pg/ml). SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0033] Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że zaskakująco, dzięki zastosowaniu zestawu zawierającego składniki określone w zastrz. 1, możliwe jest określenie poziomu Aβ40 i Aβ42 przy niskim poziomie detekcji, niższym niż 0.1

11 10 pg/ml. Zestaw ten pozwala na wiarygodne ilościowe oznaczenie wspomnianych cząsteczek w każdej próbce od każdego osobnika, w szczególności, w osoczu pobranym od osób, u których podejrzewa się występowanie postaci sporadycznej AD, przy czym stężenie w osoczu jest tak niskie, że dotychczas nie było możliwe dokonanie wiarygodnego pomiaru. [0034] Zgodnie z powyższym, w pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu do wykrywania docelowego polipeptydu, wybranego z grupy obejmującej Aβ42, Aβ40 oraz ich mieszaninę, zawierającego (i) pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał rozpoznających wspomniany docelowy polipeptyd przy czym pierwsze przeciwciało skierowane jest przeciwko epitopowi znajdującemu się w obszarze aminowasów 1 do 16 Aβ40 oraz Aβ42, i pierwsze przeciwciało jest uprzednio związane ze stałym nośnikiem, (ii) drugie przeciwciało lub kombinację przeciwciał rozpoznających inny obszar docelowego polipeptydu, niż obszar rozpoznawany przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał, (iii) odczynnik wykazujący powinowactwo względem drugiego przeciwciała, przy czym wspomniany odczynnik jest sprzężony z pierwszym elementem pary wiążącej oraz (iv) drugi element pary wiążącej sprzężony ze znacznikiem fluorescencyjnym, luminescencyjnym lub enzymatycznym, w którym para wiążąca wybrana jest z grupy składającej się z: haptenu i przeciwciała; antygenu i przeciwciała; biotyny i awidyny; biotyny i streptawidyny; analogu biotyny i awidyny; analogu biotyny i streptawidyny; cukru i lektyny; enzymu i kofaktora; kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego oraz analogu kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego.

12 11 [0035] Nie wiążąc się z żadną konkretną teorią, uważa się, że zwiększona czułość wynika z zastosowania odczynnika (iii), który umożliwia wzmocnienie sygnału wytworzonego przez przeciwciało do detekcji. [0036] Stosowane w niniejszym opisie określenie "Aβ42", dotyczy 42- aminokwasowego peptydu, odpowiadającego aminowasom 672 do 713 (SEQ ID NO:4), który powstaje w wyniku późniejszego cięcia proteolitycznego białka prekursorowego amyloidu (SEQ ID NO:6) przeprowadzanego przez β- i γ-sekretazy. [0037] Stosowane w niniejszym opisie określenie "Aβ40", dotyczy 40- aminokwasowego peptydu, odpowiadającego aminowasom 672 do 711 (SEQ ID NO:5), który powstaje w wyniku późniejszego cięcia proteolitycznego białka prekursorowego amyloidu (SEQ ID NO:6) przeprowadzanego przez β- i γ-sekretazy. [0038] W kontekście niniejszego wynalazku, pierwsze przeciwciało odnosi się do "przeciwciała wychwytującego", co oznacza, że przeciwciało jest stosowane do odnajdywania w próbce wszelkich molekularnych cząstek, z którymi specyficznie wiąże się przeciwciało. Nie ma praktycznie żadnych ograniczeń co do rodzaju przeciwciała, które może być stosowane jako przeciwciało wychwytujące, pod warunkiem, że zawiera ono co najmniej jedno miejsce wiążące antygen specyficzne dla Aβ40 i/lub Aβ42. Dlatego cząsteczki przeciwciał odpowiednie do stosowania jako przeciwciała wychwytujące obejmują Przeciwciała "nienaruszone", zawierające zmienny region wiążący antygen, jak również domenę stałą łańcucha lekkiego (CL) oraz domeny stałe łańcucha ciężkiego, CH1, CH2 i CH3, Fragmenty "Fab" otrzymane w wyniku trawienia papainą nienaruszonego przeciwciała, zawierające miejsce wiążące pojedynczy antygen CL oraz region CH1, Fragmenty "F(ab') 2 " uzyskane w wyniku trawienia pepsyną nienaruszonego przeciwciała, zawierające dwa miejsca wiążące antygen, Fragmenty "Fab'" zawierające domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego, posiadającą tylko jedno miejsce wiążące antygen. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab kilkoma resztami na końcu karboksylowym łańcucha ciężkiego domeny CH 1, obejmującymi jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała, "Fv" jest najmniejszym fragmentem przeciwciała, zawierającym pełne miejsce rozpoznające i wiążące antygen. Region ten zawiera dimer jednego łańcucha ciężkiego oraz jedną domenę zmienną łańcucha lekkiego w ścisłym, niekowalencyjnym wiązaniu. Posiada on konfigurację, w której trzy hiperzmienne regiony (CDR) każdej domeny zmiennej oddziaływają, by określić miejsce wiążące antygen na powierzchni dimeru VH - VL. Łącznie, sześć hiperzmiennych regionów nadaje specyficzność wiązaniu antygenu z przeciwciałem. Jednkże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv zawierająca tylko trzy hiperzmienne regiony specyficzne wobec antygenu) posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, mimo że z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiążące.

13 12 Pojedynczołańcuchowe FV lub "scfv" fragmenty przeciwciała zawierają VL oraz VH, domeny przeciwciała, przy czym domeny te występują w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, regiony VL i VH połączone są poprzez łącznik polipeptydowy, który sprawia, że scfv może przyjmować pożadaną strukturę dla wiązania antygenu. "Diprzeciwciała" zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) na tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL), połączonym za pomocą łącznika peptydowego, który jest zbyt krótki by umożliwić utworzenie par pomiędzy dwiema domenami na tym samym łańcuchu. Wymusza to powstawanie par z komplementarnymi domenami innego łańcucha i sprzyja tworzeniu kostruktu dimerycznej cząsteczki o dwóch funkcjonalnych miejscach wiążących antygen. "Przeciwciała bispecyficzne" (BAb) są pojedynczymi, diwalentnymi przeciwciałami (lub ich immunoterapeutycznie skutecznymi fragmentami), które posiadają dwa odmiennie wiążące, specyficzne miejsca antygenowe. Dwa miejsca antygenowe mogą być sprzężone razem chemicznie lub za pomocą znanych w stanie techniki metod inżynierii genetycznej. [0039] Wszystkie powyższe fragmenty przeciwciał mogą być następnie modyfikowane za pomocą konwencjonalnych technik znanych w dziedzinie, na przykład, poprzez aminokwasowe delecj(ę)e, insercję(e), podstawienie(a), dodanie (a) i/lub rekombinację (i/lub dowolne inną(e) modyfikację(e) (np. modyfikacje posttranslacyjne i chemiczne, takie jak glikozylacja i fosforylacja) stosowane w dziedzinie pojedynczo lub w kombinacji. Metody wprowadzania takich modyfikacji do sekwencji DNA będącej podstawą sekwencji aminokwasowej łańcucha immunoglobuliny są dobrze znane specjaliście w dziedzinie; patrz, np., Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, wydanie 2-gie 1989 oraz wydanie 3-cie [0040] Przeciwciała odpowiednie do zastosowania jako przeciwciała wychwytujące obejmują zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne. W celu wytworzenia przeciwciał poliklonalnych różne organizmy gospodarza, włączając kozy, króliki, szczury, myszy, wielbłądy, dromadery, lamy, ludzi, ptaki i inne, mogą być immunizowane poprzez zaszczepienie peptydem odpowiadającym fragmentowi Aβ40 lub Aβ42, posiadającym właściwości immunogenne. Zależnie od gatunku gospodarza, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej mogą być zastosowane różne adiuwanty. Takie adiuwanty obejmują, ale bez ograniczeń, adiuwant Freunda, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, oraz substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, KLH oraz dinitrofenol. Spośród adiuwantów stosowanych u ludzi szczególnie korzystne są BCG (Bacilli Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum. Jeżeli antygen jest peptydem, może być korzystne sprzężenie go z białkiem, które jest immunogenne w gatunkach poddawanych immunizacji. Na przykład, antygen może być sprzężony z hemocyjaniną morskiego mięczaka (Keyhole Limpet Hemocyanin KLH), błękitnym nośnikiem Blue Carrier (hemocyjaniną wyizolowaną z Concholepas concholepas), tyroglobuliną wołową lub inhibitorem trypsyny sojowej, za pomocą czynnika bifunkcjonalnego lub tworzącego pochodne, np., ester maleimidobenzylowy sulfoimidu kwasu bursztynowego (konjugacja poprzez reszty cysteiny), N-

14 13 hydroksyimid kwasu bursztynowego (poprzez reszty lizyny), glutaraldehyd, bezwodnik bursztynianowy lub SOCl 2. [0041] Do produkcji przeciwciał monoklonalnych mogą być zastosowane techniki konwencjonalne. Na przykład, przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymane dzięki zastosowaniu metody hybrydoma, opisanej po raz pierwszy przez Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), za pomocą procedury opisanej szczegółowo w rozdziale 11.4 do Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; wydanie zbindowane, 2003). Alternatywnie, przeciwciała monoklonalne mogą zostać wyizolowane z użyciem procedur rekombinowanego DNA z fagowej biblioteki przeciwciał utworzonej za pomocą technik opisanych w McCafferty et al., Nature, 348: (1990). Clacksoii et al., Nature, 352: (1991) oraz Marks et al., J. Mol. Biol., 222: (1991) opisali izolację, odpowiednio, mysich i ludzkich przeciwciał przy zastosowaniu bibliotek fagowych. W kolejnych publikacjach opisano strategie otrzymywania bardzo dużych bibliotek fagowych poprzez produkcję ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (rzędu nm) metodą tasowania łańcuchów (Marks et al., Bio/Technology, 10: (1992)), jak również za pomocą infekcji kombinatorycznej i rekombinacji in vivo (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21: (1993)). Zatem, techniki te są możliwymi alternatywami tradycyjnych technik z wykorzystaniem hybrydoma przeciwciał monoklonalnych do izolacji przeciwciał monoklonalnych. [0042] Przeciwciała poliklonalne mogą być stosowane bezpośrednio jako surowica odpornościowa uzyskana od immunizowanych gospodarzy po pobraniu krwi i usunięciu skrzepu fibrynowego. Przeciwciała monoklonalne można stosować bezpośrednio jako supernatant z kultury hybrydoma lub płynu wodobrzusza po implantacji hybrydoma w jamie otrzewnej odpowiedniego gospodarza. Alternatywnie, cząsteczki immunoglobulin, poliklonalne albo monoklonalne, mogą być oczyszczane przed ich użyciem za pomocą konwencjonalnych środków, takich jak oczyszczanie z wykorzystaniem powinowactwa z zastosowaniem peptydów pochodzących z Aβ40 lub Aβ42, oczyszczanie w żelu w warunkach niedenaturujących, HPLC lub RP- HPLC, sączenie molekularne, oczyszczanie na kolumnie z białkiem A, lub dowolna kombinacja tych technik. [0043] W korzystnej realizacji, przeciwciała wychwytujące rozpoznają obszar wspólny dla Aβ40 i Aβ42, co umożliwia jednoczesne wychwycenie obu rodzajów za pomocą jednego typu przeciwciał. W zasadzie, dowolne przeciwciało swoiste wobec obszaru wspólnego dla sekwencji zarówno Aβ40, jak i Aβ42 może być zastosowane jako przeciwciało wychwytujące. Korzystne epitopy, które mogą celem przeciwciał wychwytujących obejmują epitopy zlokalizowane w obszarze aminokwasów od 1 do 16, 1 do 17, 13 do 28, 15 do 24, 1 do 5 i 1 do 11 z Aβ40 lub Aβ42. W bardziej korzystnej realizacji, przeciwciało wychwytujące jest skierowane przeciwko obszarowi w Aβ40 lub Aβ42, który różni się od regionu C-końcowego. W wariancie jeszcze bardziej korzystnym, przeciwciało wychwytujące jest skierowane przeciwko obszarowi epitopowi w regionie N-końcowym peptydów Aβ40 i Aβ42. W jeszcze bardziej korzystnej realizacji, przeciwciało wychwytujące jest przeciwciałem monoklonalnym. W wariancie jeszcze bardziej korzystnym, przeciwciało wychwytujące rozpoznaje region odpowiadający aminokwasom 1-16 peptydów Aβ. W jeszcze bardziej korzystnej realizacji, przeciwciałem monoklonalnym stosowanym

15 14 jako przeciwciało wychwytujące jest 6E10 mab, jak opisano w Kim, K.S. (Neuroscience Res. Comm. 1988, 2: ). [0044] Drugi element zestawu według wynalazku odpowiada przeciwciału lub kombinacji przeciwciał, które rozpoznają inny region docelowego polipeptydu, niż region rozpoznawany przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał. W kontekście niniejszego wynalazku, drugie przeciwciało będzie dalej nazywane "przeciwciałem do detekcji", ponieważ przeciwciało to będzie wykorzystywane do wykrywania ilości antygenu, który został zatrzymany przez przeciwciało wychwytujące. [0045] Podobnie jak w przypadku przeciwciała wychwytującego, praktycznie nie ma ograniczeń co do rodzaju przeciwciała, które może być stosowane jako przeciwciało do detekcji. Jednak, dla specjalisty w dziedzinie jest wiadome, że przeciwciało do detekcji (i) musi wiązać z regionem antygenu, który nie jest objęty przez przeciwciało wychwytujące oraz (ii) musi zawierać nie tylko miejsce wiązania antygenu, ale również dodatkowy region lub regiony, które mogą być specyficznie wykryte przez odczynnik wykazujący wysokie powinowactwo wiązania względem wspomnianego przeciwciała, tak aby umożliwić wykrycie przeciwciała, które jest związane z antygenem wychwyconym przez przeciwciało wychwytujące. Korzystnie, wspomniane dodatkowe regiony, które mogą być specyficznie wiązane przez wspomniany odczynnik odpowiadają regionowi stałemu cząsteczki immunoglobuliny. [0046] Odpowiednie przeciwciała do detekcji obejmują nienaruszone przeciwciała, fragmenty Fab, F(ab') 2, Fab' oraz Fv, pojedynczołańcuchowe przeciwciała FV, diprzeciwciała, podwójnie swoiste przeciwciała i tym podobne, przy czym związki te odpowiadają uprzednio przedstawionym definicjom. Podobnie jak w przypadku przeciwciała wychwytującego, przeciwciało do detekcji może być poliklonalne lub monoklonalne, natywne lub zmodyfikowane posttranslacyjnie i czyste lub wzbogacone w cząsteczki wiążące antygen, przy zastosowaniu tych samych procedur, jak opisane dla przeciwciał wychwytujących. Dla specjalisty w dziedzinie jest wiadome, że w celu użycia przeciwciała do detekcji, należy je rozcieńczyć do odpowiedniego poziomu stężenia roboczego i wspomniane rozcieńczenie może być rutynowo ustalone dla każdej partii przeciwciał. Ponadto, będzie to oczywiste, że odpowiednie rozcieńczenie robocze będzie różne w zależności od tego czy użyta jest surowica odpornościowa czy raczej oczyszczona frakcja IgG. Typowe rozcieńczenia wynoszą 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000, 1/10000 i tym podobne. [0047] W korzystnej realizacji, przeciwciała do detekcji obejmują dowolne przeciwciało poliklonalne wybrane z grupy zawierającej (i) przeciwciało poliklonalne uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu C-końcowemu regionowi peptydu Aβ42, które wiąże się specyficznie z Aβ42, bez zajścia żadnej istotnej reakcji krzyżowej z Aβ40 lub Aβ43 (ii) przeciwciało poliklonalne uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu C-końcowemu regionowi peptydu Aβ40, które wiąże się specyficznie z Aβ40

16 15 bez zajścia żadnej istotnej reakcji krzyżowej z Aβ42, Aβ39, Aβ38, Aβ41 lub Aβ43 (iii) przeciwciało, które rozpoznaje jednocześnie C-końcowy region obu Aβ40 i Aβ42 lub (iv) kombinacja przeciwciał wymienionych w punkcie (i) oraz (ii). [0048] W jeszcze bardziej korzystnej realizacji, peptyd odpowiadający C- końcowemu regionowi peptydu Aβ42 użyty do otrzymania przeciwciała swoistego wobec Aβ42 jest peptydem zdefiniowanym w SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:2. W innej, korzystnej realizacji, peptyd odpowiadający C-końcowemu regionowi peptydu Aβ40 użyty do otrzymania przeciwciała swoistego wobec Aβ40 jest peptydem zdefiniowanym w SEQ ID NO:3. Przeciwciała swoiste względem Aβ40 i Aβ42 oraz spsosoby ich otrzymywania zostały szczegółowo opisane w WO oraz WO , włączonych tytułem referencji. [0049] Dla specjalisty w dziedzinie będzie zrozumiałe, że metoda może być użyta do wykrywania Aβ40 i Aβ42 lub obu tych rodzajów jednocześnie, w zależności od zastosowanych w metodzie rodzajów przeciwciał wychwytujących i przeciwciał do detekcji. [0050] W celu wykrycia lub specyficznego określenia Aβ40, przeciwciało wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje N-końcowy region Aβ40 (a także Aβ42, gdyż oba peptydy mają identyczne regiony N-końcowe) oraz przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ42. Alternatywnie, Aβ40 może zostać specyficznie wykryte za pomocą przeciwciała wychwytującego, które rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ42 i przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które rozpoznaje region Aβ40, który jest wspólny dla obu Aβ40 i Aβ42, korzystnie region N-końcowy Aβ42/Aβ40. [0051] W celu wykrycia lub specyficznego określenia Aβ42, przeciwciało wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje N-końcowy region Aβ42 (a także Aβ40, gdyż oba peptydy mają identyczne regiony N-końcowe) oraz przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ42, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ40. Alternatywnie, Aβ42 może zostać specyficznie wykryte za pomocą przeciwciała wychwytującego, które rozpoznaje region C-końcowy Aβ42 i przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które rozpoznaje region Aβ42, który jest wspólny dla obu Aβ42 i Aβ40. [0052] W celu wykrycia lub jednoczesnego określenia Aβ42 i Aβ40, przeciwciało wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje N-końcowy region wspólny dla Aβ42 i Aβ40 a przeciwciało do detekcji może stanowić kombinację przynajmniej dwóch przeciwciał, przy czym pierwsze przeciwciało specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ42, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ40 a drugie przeciwciało

17 16 specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ42. Alternatywnie, przeciwciało wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje region N-końcowy wspólny dla Aβ42 i Aβ40 a przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które rozpoznaje region C- końcowy obu Aβ40 i Aβ42. Alternatywnie, Aβ42 i Aβ40 mogą zostać jednocześnie wykryte z użyciem jako przeciwciała wychwytującego mieszaniny co najmniej dwóch przeciwciał obejmującej pierwsze przeciwciało, specyficznie rozpoznające region C- końcowy Aβ42, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ40 i drugie przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ42 oraz przeciwciała do detekcji, które rozpoznaje region N-końcowy wspólny dla obu Aβ42 i Aβ40. Alternatywnie, Aβ42 i Aβ40 mogą zostać jednocześnie wykryte z użyciem jako przeciwciała wychwytującego przeciwciała, które rozpoznaje region C-końcowy obu i Aβ42 a przeciwciało do detekcji rozpoznaje region N- koncowy wspólny dla obu Aβ42 i Aβ40. [0053] W korzystnej realizacji, pierwsze i/lub drugie przeciwciało lub kombinacja przeciwciał jest oczyszczana poprzez powinowactwo z użyciem polipeptydu zawierającego sekwencję polipeptydu zastosowanego do ich otrzymywania. [0054] Trzeci element zestawu odpowiada odczynnikowi, który wykazuje powinowactwo względem przeciwciała do detekcji i który jest sprzężony z pierwszym elementem pary wiążącej. Odczynnik wiążący przeciwciało może niekowalencyjnie wiązać się z określonym typem (-ami), szczególną(-ymi) klasą (-ami) i/lub określoną (-ymi) podklasą(-ami) przeciwciała lub fragmentów przeciwciała. Alternatywnie, odczynnik wiążący przeciwciało może niekowalencyjnie wiązać się z przeciwciałem swoistym dla określonego antygenu. W pewnych realizacjach, odczynnik wiążący przeciwciało wiąże się niekowalencyjnie z regionem Fc lub regionem F(ab) przeciwciała do detekcji. Korzystne odczynniki wiążące przeciwciało obejmują białko A, białko G, białko V, białko L, przeciwciało przeciwko Fc lub fragment wiążący przeciwciało i receptor Fc (FcR) lub jego fragment wiążący przeciwciało. Nieograniczające przykłady przeciwciał, które mogą być związane niekowalencyjnie z przeciwciałem do detekcji obejmują przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne, przeciwciała ludzkie, humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała, przeciwciała o pojedynczej domenie, przeciwciała pojedyńczołańcuchowe Fv (scfv), fragmenty Fab, fragmenty F(ab'), połączone wiązaniem disiarczkowym Fv (sdfv), przeciwciała wewnątrzkomórkowe i antyidiotypowe (anty-id) oraz fragmenty wiążące epitop któregokolwiek z powyższych. Nieograniczające przykłady receptorów Fc obejmują FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIAα, FcγRIIIB, FcεRIα, FcεRIξ oraz FcγRIIIAξ. [0055] Czwarty element zestawu według wynalazku odpowiada drugiemu elementowi pary wiążącej, sprzężonemu ze znacznikiem fluorescencyjnym, luminescencyjnym lub enzymatycznym, przy czym para wiążąca wybrana jest z grupy składającej się z: haptenu i przeciwciała; antygenu i przeciwciała;

18 17 biotyny i awidyny; biotyny i streptawidyny; analogu biotyny i awidyny; analogu biotyny i streptawidyny; cukru i lektyny; enzymu i kofaktora; kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego oraz analogu kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego. [0056] Należy rozumieć, że określenie "pierwszy" i "drugi" element pary wiążącej jest względne i że każdy z powyższych elementów może być postrzegany jako pierwszy lub drugi element pary wiążącej. W korzystnej realizacji, pierwszym elementem pary wiążącej jest biotyna lub jej funkcjonalnie równoważny wariant a drugim elementem pary wiążącej jest awidyna, streptawidyna lub jej funkcjonalnie równoważny wariant. [0057] W korzystnej realizacji, drugim elementem pary wiążącej jest streptawidyna. [0058] Odpowiednie wykrywalne znaczniki obejmują, bez ograniczenia, jednostki fluorescencyjne (np., fluoresceinę, rodaminę, fikoerytrynę, kumarynę, oksazynę, rezorufinę, cyjaninę i ich pochodne), jednostki luminescencyjne (np., nanocząstki Qdot dostarczane przez Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA). W przypadku, gdy wykrywalny znacznik jest enzymem, enzym ten musi posiadać zdolność wytwarzania wykrywalnego sygnału, na przykład, po dodaniu aktywatora, substratu, czynnika amplifikującego i tym podobnych. Enzymy odpowiednie do zastosowania jako wykrywalne znaczniki w niniejszym wynalazku i odpowiadające im substraty obejmują: Alkaliczną fosfatazę: Peroksydazy: Substraty chromogenne: substraty oparte na fosforanie p-nitrofenylu (p-npp), fosforanie 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/nitroblue tetrazolium (BCIP/NPT), Fast-Red/fosforan naftol-as-ts Substraty fluorogenne: fosforan 4-metyloumbeliferylu (4-MUP), 2-(5'- chloro-2'-fosforyloksyfenylo)-6-chloro-4-(3h)-chinazolinonu (CPPCQ), difosforan 3,6-fluoresceiny (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR, lub sole diazoniowe Fast Red Violet LB

19 18 Glikozydazy: Substraty chromogenne oparte na kwasie 2,2-azynobis(3- etylobenzotiazolino-6-sulfonowym) (ABTS), o-fenylenodiaminie (OPT), 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynie (TMB), o-dianizydynie, kwasie 5- aminosalicylowym, kwasie 3-dimetyloaminobenzoesowym (DMAB) oraz 3-metylo-2-benzotiazolinohydrazonie (MBTH), 3-amino-9- etylokarbazolu (AEC)- i tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Substraty fluorogenne: kwas 4-hydroksy-3-metoksyfenylooctowy, zredukowane fenoksazyny oraz zredukowane benzotiazyny, włączając czerwony odczynnik Amplex, Amplex UltraRed oraz zredukowane dihydroksanteny. Substraty chromogenne: o-nitrofenylo-β-d-galaktozyd (o-npg), p- nitrofenylo-β-d-galaktozyd oraz 4- metyloumbelifenylo-β-d-galaktozyd (MUG) dla β-d-galaktozydazy. Substraty fluorogenne: β-d-galaktopiranozyd rezorufiny, digalaktozyd fluoresceiny (FDG), diglukuronid fluoresceiny, β-d-galaktopiranozyd 4- metyloumbeliferylu, β-d-galaktopiranozyd karboksyumbeliferylu oraz fluorowane β-d-galaktopiranozydy kumaryny. Oksydoreduktazy (lucyferaza): Substraty luminiscencyjne: lucyferyna. [0059] W korzystnej realizacji, wykrywalnym znacznikiem jest peroksydaza chrzanowa a odczynnikiem do detekcji jest TMB. [0060] W korzystnej realizacji, zestaw zawiera ponadto stały nośnik. Stosowany w niniejszym opisie termin "nośnik" lub "powierzchnia" odnosi się do fazy stałej, która jest porowata lub gładka, materiałem nierozpuszczalnym w wodzie, o dowolnym z wielu możliwych kształtów, takich jak pasek, pręt, cząstka, w tym cząstki lateksowe, cząstki magnetyczne, mikrocząstki, koraliki, membrany, płytki ze studzienkami do mikromiareczkowania i probówki plastikowe. W zasadzie, każdy materiał jest odpowiedni do zastosowania jako stały nośnik pod warunkiem, że jest w stanie związać wystarczającą ilość przeciwciała wychwytującego. Tak więc, wyboru materiału fazy stałej dokonuje się w oparciu o pożądane cechy przeprowadzanej analizy. Materiały odpowiednie do zastosowania jako stały nośnik obejmują materiały polimerowe, szczególnie materiały celulozowe i materiały pochodzące z celulozy, takie jak papier zawierający włókna papieru, np. filtr papierowy, bibuła chromatograficzna, papier z włókna szklanego itp., syntetyczne lub zmodyfikowane naturalnie występujące polimery, takie jak nitroceluloza, octan celulozy, chlorek poliwinylu, poliakryloamid, usieciowany dekstran, agaroza, poliakrylan, polietylen, polipropylen, poli(4-metylobuten), polistyren, polimetakrylan, poli(tereftalan etylenu), nylon, maślan winylu), itp.; albo używany pojedynczo albo w połączeniu z innymi

20 19 materiałami; szkło, takie jak np, szkło dostępne jako szkło biologiczne, ceramika, metale, i tym podobne. Korzystne są nieusieciowane polimery styrenu i karboksylowany styren lub styren funkcjonalizowany innymi aktywnymi grupami, takimi jak grupa aminowa, hydroksylowa, halogenowa i tym podobne. W niektórych przypadkach będą zastosowane kopolimery styrenów podstawionych dienami, takie jak butadien. [0061] Stały nośnik i przeciwciało wychwytujące może być dostarczone oddzielnie w zestawie lub, alternatywnie, nośnik może być dostarczony w postaci już wstępnie pokrytej warstwą przeciwciała wychwytującego. W tym przypadku, po związaniu przeciwciała wychwytującego, nośnik może być potraktowany roztworem blokującym. Jeżeli nośnik jest wstępnie pokryty, korzystne jest, by nośnik został potraktowany stężonym roztworem trehalozy i pozostawiony do wyschnięcia, w tym przypadku sucha trehaloza tworzy halo na nośniku. Wspomniane nośniki zawierające suchą trehalozę są wyjątkowo stabilne i mogą być przechowywane przez okres do dwóch lat, gdy są przechowywane w temp. 4 C, w ciemności. [0062] Dodatkowe składniki zestawu mogą obejmować: Środki do pobrania od pacjenta próbki do analizy. Bufory i roztwory konieczne do przygotowania krzywych standardowych dla peptydów docelowych. Bufory i roztwory do przemywania i blokowania nośnika stałego podczas analizy Bufory i roztwory do pokrywania nośnika stałego przeciwciałem pokrywającym Odczynniki do rozwijania koloru lub sygnału fluorogennego dla wykrywalnego znacznika. Odczynniki do zatrzymywania powstawania barwnego lub fluorogennego produktu dla wykrywalnego znacznika (np. 1N H 2 SO 4 ) Środki do utrzymywania peptydu w postaci rozfałdowanej (np. stężony chlorowodorek guanidyny). Próbka zawierająca roztwór wyjściowy peptydów Aβ40 lub Aβ42 lub ich kombinację. [0063] W korzystnej realizacji, przeciwciało wychwytujące jest immobilizowane na stałym nośniku. Immobilizacja może mieć miejsce przed związaniem docelowego peptydu, który ma być wykryty lub po tym jak peptyd/białko jest związane przez przeciwciało wychwytujące. W każdym przypadku, gdy stosuje się stały nośnik, korzystne jest zablokowanie nadmiaru miejsc wiążących białka na nośniku przed dodaniem próbki zawierającej docelowy polipeptyd, który będzie oznaczany. Korzystnie, blokowanie lub gaszenie miejsc wiążących peptyd na nośniku przeprowadza się stosując ten sam bufor, który używany jest do przemywania kompleksów powstałych po każdej reakcji wiązania (np. 50 mm Tris-HCl, ph 8, PBS lub TBS opcjonalnie, zawierający Tween 20) uzupełniony związkiem makrocząsteczkowym (np. albuminą surowicy wołowej, odtłuszczonym mlekiem w proszku, odczynnikiem blokującym w technice Western, kazeiną, laktoalbuminą, owoalbuminą), w stężeniach od około 0,05% do 10%, korzystnie 1 do 5%, bardziej korzystnie około 3%. Jeżeli nośnik zawierający unieruchomione przeciwciało wychwytujące musi być przechowywany przez pewien czas, korzystne jest, by nośnik