Oznaczanie zawartości alkoholu etylowego w płynach ustrojowych człowieka metodą chromatografii gazowej head-space walidacja metody

Transkrypt

1 Iwona Ostaszewska Oznaczanie zawartości alkoholu etylowego w płynach ustrojowych człowieka metodą chromatografii gazowej head-space walidacja metody Wprowadzenie Badania oznaczania zawartoœci alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych cz³owieka przeprowadzane s¹ przez policyjnych ekspertów kryminalistyki od 1957 roku. Pierwsza pracownia, w której badano zarówno próbki krwi i moczu powsta³a w Zak³adzie Kryminalistyki KG MO. Próbki nadsy³ane by³y wówczas z obszaru ca³ej Polski, g³ównie jednak z terenu dzisiejszego województwa mazowieckiego. Od pocz¹tku 1995 roku stopniowo na terenie ca³ego kraju powstawa³y w laboratoriach kryminalistycznych komend wojewódzkich Policji kolejne pracownie badañ p³ynów ustrojowych cz³owieka na zawartoœæ alkoholu etylowego. W chwili obecnej jest ich 13, w których w sumie wykonywanych jest œrednio oko³o analiz rocznie. Liczba wydawanych w tym zakresie opinii w ci¹gu tych kilku lat utrzymuje siê stale na podobnym poziomie. W praktyce, zarówno w Polsce, jak i w wielu innych krajach, spoœród kilkudziesiêciu znanych i opracowanych metod oznaczania stê enia alkoholu etylowego w materiale biologicznym, przyjê³y siê i znalaz³y najszersze zastosowanie trzy metody: metoda Widmarka (chemiczna dwuchromianowa), enzymatyczna (ADH) oraz chromatografii gazowej z detekcj¹ p³omieniowo- -jonizacyjn¹ (GC/FID). Metody te, w myœl Rozporz¹dzenia Ministra Zdrowia i Opieki Spo³ecznej z dnia 6 maja 1983 roku w sprawie warunków i sposobu dokonywania badañ na zawartoœæ alkoholu w organizmie, by³y traktowane równorzêdnie pod wzglêdem wiarygodnoœci otrzymanego wyniku. Zgodnie z zatwierdzonymi przez Zarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Medycyny S¹dowej i Kryminologii w dniu 26 listopada 2004 roku zaleceniami opracowanymi przez Instytut Ekspertyz S¹dowych (IES) w Krakowie (opublikowanymi w Prokuraturze i Prawie, nr 4, kwiecieñ 2005 r.), stê enie alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych wyznacza siê metod¹ chromatografii gazowej oraz metod¹ enzymatyczn¹ ADH. Zgodnie z wymienionymi zaleceniami IES przy zastosowaniu metody chromatografii gazowej wskazane jest wykorzystanie techniki analizy fazy nadpowierzchniowej head-space. Jest to metoda standardowa, dobrze znana i opisana w literaturze fachowej i stosowana najczêœciej przez laboratoria wykonuj¹ce tego typu badania na potrzeby organów œcigania lub wymiaru sprawiedliwoœci. Wydzia³ Fizykochemii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP uznaje tê metodê i stosuje j¹, odnosz¹c siê do ww. zaleceñ. Oznaczanie jakoœciowe i iloœciowe alkoholu etylowego w materiale biologicznym wyznaczane jest metod¹ chromatografii gazowej head-space, zgodnie z Procedur¹ badawcz¹ nr HJ-60/Pb-IV/3/08 Oznaczanie zawartoœci alkoholu etylowego we krwi cz³owieka metod¹ chromatografii gazowej head-space (ryc. 1). Aby wynik oznaczania alkoholu etylowego w próbce materia³u biologicznego by³ wiarygodny i spe³nia³ kryteria dowodowe w procesie cywilnym lub karnym, wymagane jest, aby pomiar zosta³ dokonany za pomoc¹ dwóch metod. Zgodnie z obowi¹zuj¹cymi zaleceniami dopuszczalne jest, aby w razie zastosowania jedynie chromatografii gazowej head-space (tak jest w przypadku stosowanych procedur badawczych w policyjnych laboratoriach kryminalistycznych), badanie laboratoryjne zabezpieczonego materia³u by³o wykonane z dwóch oddzielnie pobranych do analizy próbek z materia³u badawczego oraz aby oznaczenie by³o wykonane przy zastosowaniu kolumn o odmiennych w³aœciwoœciach elucyjnych, np. takich kolumn, które ró ni¹ siê polarnoœci¹. Metoda chromatografii gazowej z wykorzystaniem techniki analizy fazy nadpowierzchniowej (head-space analysis) zastosowana przy oznaczeniu zawartoœci alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych cz³owieka jest metod¹ z wyboru, o najwy szym stopniu swoistoœci. O powszechnym zastosowaniu tej metody decyduj¹ jej g³ówne zalety, m.in.: ³atwoœæ przygotowania próbek do analizy, potrzeba niewielkiej iloœci materia³u przeznaczonego do badañ, szybka mo liwoœæ wykrycia i wykonania oznaczenia oczekiwanej substancji w trakcie jednego cyklu badawczego, mo liwoœæ wykona- PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ)

2 Procedura oznaczenia alkoholu metod¹ chromatografii gazowej head-space Ryc. 1. Schemat analizy iloœciowej alkoholu etylowego we krwi metod¹ chromatografii head-space Fig. 1. Flowchart of quantitative analysis of ethyl alcohol in blood by means of head-space chromatography Ÿród³o (ryc. 1 4): autorka nia du ej liczby prób w krótkim czasie, a tak e czu³oœæ pomiaru oraz du a selektywnoœæ w stosunku do etanolu. Metoda ta jest ³atwa do automatyzacji, a odtwarzalnoœæ i powtarzalnoœæ wyniku jest zazwyczaj lepsza ni przy bezpoœrednim, rêcznym nastrzyku. Do analizy stosuje siê specjalnie do tego przeznaczone naczynia szklane (naczynka chromatograficzne), szczelnie zamykane membran¹ z gumy i aluminiowym kapslem. Proces izolacji alkoholu etylowego polega na czêœciowym odparowaniu w podwy szonej temperaturze lotnych zwi¹zków z próby materia³u biologicznego do przestrzeni naczynia nad analizowanym materia³em. W technice tej analizie poddawana nie jest bezpoœrednio próbka krwi, lecz faza gazowa znajduj¹ca siê nad próbk¹ umieszczon¹ w zamkniêtym naczyniu. Izolowanie prowadzone jest do momentu osi¹gniêcia stanu równo- 34 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ) 2009

3 wagi pomiêdzy stê eniem zwi¹zku w materiale biologicznym oraz w fazie gazowej, która nastêpnie jest pobierana poprzez membranê do analizy chromatograficznej gazoszczeln¹ strzykawk¹. W zamkniêtym uk³adzie i ustalonej temperaturze stosunek stê eñ alkoholu we krwi do jego stê enia w powietrzu nad krwi¹ ma zgodnie z prawem Henr ego-daltona wartoœæ sta³¹. Do naczynka chromatograficznego o pojemnoœci 22 ml wprowadzany jest 1 ml roztworu tert-butanolu (2-metylo-2-propanol) o stê eniu objêtoœciowym 0,05, który pe³ni rolê wzorca wewnêtrznego, a nastêpnie dodawane jest 0,1 ml próbki krwi. Naczynko chromatograficzne jest kapslowane i umieszczane w autosamplerze chromatografu gazowego. Poniewa w oznaczeniach stosowany jest detektor p³omieniowo- -jonizacyjny (FID), to wielkoœæ sygna³u analitycznego, tj. pole powierzchni pod pikiem lub jego wysokoœæ, jest proporcjonalna do stê enia alkoholu w próbce. Ze wzglêdu na fakt, e chromatografia gazowa nie jest metod¹ absolutn¹, to aby wyznaczyæ stê enie alkoholu w badanej próbce, nale y wykonaæ kalibracjê, stosuj¹c okreœlon¹ iloœæ próbek kontrolnych (roztworów wzorcowych), sporz¹dzonych z certyfikowanych materia³ów odniesienia. Procedura przygotowania i analizy próbek kontrolnych jest analogiczna do przygotowania i analizy próbek krwi. Organ procesowy d¹ y do dok³adnego okreœlenia stê enia alkoholu etylowego we krwi badanego. Wynik takiego badania stanowi obiektywny materia³ dowodowy w procesie karnym i czêsto ma rozstrzygaj¹ce znaczenie dla rozpatrywanych przez s¹d spraw. Wynik oznaczenia stê enia alkoholu etylowego we krwi jest podstaw¹ do niepodwa alnego ustalenia stanu trzeÿwoœci badanego w chwili zdarzenia. Zgodnie z polskim prawodawstwem stan po u yciu alkoholu zachodzi, gdy zawartoœæ alkoholu w organizmie wynosi lub prowadzi do stê enia we krwi, od 0,2 do 0,5 alkoholu, co odpowiada obecnoœci od 0,1 do 0,25 mg alkoholu w 1 dm 3 wydychanego powietrza, a stan, w którym zawartoœæ alkoholu w organizmie wynosi lub prowadzi do stê enia we krwi powy- ej 0,5 alkoholu lub obecnoœci powy ej 0,25 mg alkoholu w 1 dm 3 wydychanego powietrza, okreœlany jest stanem nietrzeÿwoœci. Rzetelny, pewny i obarczony jak najmniejszym b³êdem wynik wykonywanych badañ jest wa nym elementem dowodowym w procesie karnym. Mimo szczegó³owego opisu wymagañ, procedur oraz instrukcji dotycz¹cych m.in. systematycznej kalibracji aparatury analitycznej, a tak e sprzêtu pomocniczego, pobierania próbek do badañ, analizy próbek, zapewnienia jakoœci i kontroli jakoœci badañ, wieloletniego uczestnictwa w programach miêdzylaboratoryjnych badañ bieg³oœci, organizowanych przez uznane miêdzynarodowe instytucje specjalistyczne oraz sporz¹dzania dokumentacji z badañ oraz wydawanej opinii, z punktu widzenia analityka œcis³a realizacja tego celu nie zawsze siê udaje. Z teorii pomiaru potwierdzonej codzienn¹ praktyk¹ analityczn¹ wiadomo, e wynik ka dego pomiaru mo e byæ obarczony b³êdem. Miêdzynarodowa Organizacja Standaryzacyjna (International Standards Organization) w normie PN-EN ISO/IEC 17025:2005 obliguje laboratoria do przeprowadzenia walidacji metod badawczych oraz oszacowania niepewnoœci pomiaru. Dziêki przeprowadzonej walidacji z du ym prawdopodobieñstwem mo na powiedzieæ, e proces analizy przebiega w sposób prawid³owy oraz e daje precyzyjne i wiarygodne wyniki. Pracownia badañ p³ynów ustrojowych na zawartoœæ alkoholu etylowego Wydzia³u Fizykochemii CLK KGP d¹ y do wykonywania badañ na optymalnym poziomie jakoœciowym, tak aby uzyskiwane wyniki badañ by³y miarodajne, obiektywne i jak najbardziej rzetelne. Pracownia, w której oznaczany jest alkohol etylowy w p³ynach ustrojowych cz³owieka, podlega kontroli auditorów wewnêtrznych, a okresowo tak e auditorów zewnêtrznych. W lutym 2009 roku auditorzy z Polskiego Centrum Akredytacji (PCA) ocenili m.in.: a) obs³ugê i kontrolê pracy aparatury badawczej, b) kontrolê kalibracji i sprawdzeñ wyposa enia pomiarowego, c) dokumentacjê stosowanej metody analizy oznaczania zawartoœci alkoholu etylowego we krwi cz³owieka, d) dokumentacjê uczestnictwa w programach miêdzylaboratoryjnych badañ bieg³oœci organizowanych przez uznane miêdzynarodowe instytucje specjalistyczne, e) sposób zapisywania i kontroli raportowanych wyników analizy, f) sposób i przebieg przeprowadzenia walidacji stosowanej metody, g) raport z przeprowadzonej walidacji, h) sposób dokumentowania przebiegu badañ oraz sporz¹dzane opinie. Dnia 22 maja 2009 roku Wydzia³ Fizykochemii CLK KGP uzyska³ Certyfikat Akredytacyjny na zg³oszon¹ metodê oznaczania jakoœciowego i iloœciowego alkoholu etylowego we krwi cz³owieka metod¹ chromatografii gazowej head-space. Wa ne jest, aby oprócz podania samego wyniku badania mieæ œwiadomoœæ stopnia dok³adnoœci uzyskanych oznaczeñ oraz mieæ oszacowan¹ niepewnoœæ zastosowanej metody. W tym celu przeprowadzono ocenê ca³ego postêpowania analitycznego, dziêki której przedstawiono dowody, e wprowadzona do badañ metoda oznaczania alkoholu etylowego we krwi cz³owieka metod¹ PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ)

4 chromatografii gazowej head-space zgodnie z Procedur¹ badawcz¹ nr HJ-60/Pb-IV/3/08 jest stosowana w³aœciwie. Ponadto udowodniono, e w procesie przeprowadzanych analiz, który przebiega w sposób rzetelny i prawid³owy, otrzymuje siê wyniki badañ na oczekiwanym poziomie jakoœciowym, obarczone niepewnoœci¹ nie wiêksz¹, ni za³o ono. W tym celu zosta³y wyznaczone i ocenione nastêpuj¹ce parametry walidacyjne: wyznaczenie zakresu i liniowoœci metody wyznaczenie granic wykrywalnoœci i oznaczalnoœci okreœlenie powtarzalnoœci wyznaczenie dok³adnoœci okreœlenie odtwarzalnoœci wyznaczenie niepewnoœci metody badawczej. Aparatura badawcza Badania przeprowadzono z u yciem chromatografu gazowego Clarus 500 (model dwukana³owy kana³y synchroniczne), wyposa onego w automatyczny podajnik próbek (autosampler) TurboMatrix HS-40 firmy Perkin-Elmer oraz sterownik komputerowy z odpowiednim oprogramowaniem (ryc. 2). Rozdzia³ dokonywany jest na dwóch kolumnach kapilarnych, ró ni¹cych siê polarnoœci¹: 1. Bac 2 o d³ugoœci 10 m, œrednicy wewnêtrznej 0,18 mm i gruboœci filmu 0,63 μm. 2. Bac 3 o d³ugoœci 10 m, œrednicy wewnêtrznej 0,18 mm i gruboœci filmu 0,30 μm, w temperaturze 35 o C. Do wykrycia obecnoœci alkoholu etylowego w strumieniu gazu noœnego (helu) wykorzystywane s¹ detektory p³omieniowo-jonizacyjne (FID). Wyposa enie pomiarowe (ryc. 3): pipeta pó³automatyczna, o numerze fabrycznym , pozwalaj¹ca na odmierzenie 0,1 ml; o wartoœci niepewnoœci max. 0,21%, pipeta pó³automatyczna, o numerze fabrycznym , pozwalaj¹ca na odmierzenie 1,0 ml; o wartoœci niepewnoœci max. 0,27%, dozownik pó³automatyczny o numerze fabrycznym , pozwalaj¹cy na odmierzenie 1,0 ml, o wartoœci niepewnoœci max. 0,27%, jednorazowe koñcówki do pipet lub do dozownika (zgodnie ze specyfikacj¹ techniczn¹ u ywanego wyposa enia pomiarowego), termohigrometr posiadaj¹cy aktualne œwiadectwo wzorcowania, naczynka chromatograficzne, zgodne z wymaganiami specyfikacji technicznej u ytkowanego chro- Ryc. 2. Chromatograf gazowy Clarus 500 z autosamplerem Turbo Matrix HS-40 Fig. 2. Clarus 500 gas chromatograph with Turbo Matrix HS-40 autosampler 36 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ) 2009

5 matografu oraz gumowe korki i aluminiowe kapsle w niezbêdnej iloœci. Do wyznaczenia precyzji objêtoœci pipet wykorzystano dane zawarte w za³¹czonych certyfikatach jakoœci, dostarczonych wraz z pipetami przez ich producenta, firmê Eppendorf (Niemcy): Odczynniki standard wewnêtrzny w niezbêdnej iloœci 0,05 wodny roztwór tert-butanolu, certyfikowany materia³ odniesienia roztwór wodny alkoholu etylowego o okreœlonych stê eniach zawartych w granicach od 0,1 do 5,0, œrodki dezynfekuj¹ce o w³aœciwoœciach bakteriobójczych, grzybobójczych i wirusobójczych w niezbêdnej iloœci. Dla wyznaczenia powtarzalnoœci pomiarów za pomoc¹ aparatu wykorzystano dane z kilkudziesiêciu pomiarów dla tego samego stê enia roztworu wzorcowego, sporz¹dzonego z certyfikowanego materia³u odniesienia. B³¹d stê enia alkoholu w roztworach wzorcowych odczytano ze œwiadectw certyfikowanych materia³ów odniesienia, wystawionych dla ka dego poziomu stê enia roztworu wzorcowego przez producenta, firmê Cerilliant, dostarczonych przez dostawcê, firmê Ryc. 3. Wyposa enie stanowiska przeznaczonego do przygotowania próbek do analizy metod¹ chromatografii head-space Fig. 3. Workstation for preparation of samples to head-space chromatography analysis próbki krwi zawieraj¹ce alkohol etylowy, gazy: hel, powietrze, wodór, o czystoœci minimum 99,9% Wyposa enie pomocnicze statyw z otworami do umieszczenia odpowiedniej liczby naczynek chromatograficznych na stanowisku przygotowania próbek, przyrz¹d s³u ¹cy do zamykania naczynek chromatograficznych kapslownica oraz do ich otwierania dekapslownica, œrodki ochrony osobistej (m.in. fartuchy ochronne, rêkawiczki jednorazowe, przy³bice stomatologiczne), LGC Standards (USA) oraz Merck KgaA (Darmstadt, Niemcy) i przedstawiono w tabeli 4, w rozdziale dotycz¹cym oszacowania niepewnoœci. Przebieg badań Wyznaczenie zakresu pomiarowego od 0,10 do 5,0 i liniowości metody Liniowoœæ jest to przedzia³ zawartoœci analitu, dla którego sygna³ wyjœciowy urz¹dzenia pomiarowego jest proporcjonalny do tej zawartoœci w okreœlonym za- PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ)

6 kresie, zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym: y = ax + b gdzie: y zmienna zale na (sygna³ wyjœciowy urz¹dzenia pomiarowego), x zmienna niezale na (zawartoœæ oznaczanego analitu), b wyraz wolny (oznacza punkt przeciêcia siê krzywej ze wspó³rzêdn¹ y), a wspó³czynnik kierunkowej prostej (mówi o nachyleniu prostej wzglêdem wspó³rzêdnych x i y). Zakres liniowy najczêœciej jest wyznaczany z u yciem krzywej kalibracyjnej urz¹dzenia pomiarowego. W tym celu przeprowadzono pomiary dla roztworów wzorcowych ró ni¹cych siê miêdzy sob¹ stê eniem analitu na piêciu poziomach stê eñ, tj. 0,10 ; 0,20 ; 0,50 ; 2,0 i 5,0. Wykonano po trzy niezale ne oznaczenia i na tej podstawie z piêciu punktów kalibracji zosta³a wykreœlona dla ka dej kolumny krzywa kalibracji. Parametry krzywych kalibracji: kolumna A: y = 0,6088x-0,0288; r 2 = 0, kolumna B: y = 0,5898x-0,0398; r 2 = 0, Zale noœæ miêdzy zmiennymi charakteryzuje wspó³czynnik korelacji r. Je eli jego wartoœæ jest równa co najmniej 0,99, mo na mówiæ o liniowoœci metody (w zakresie stê eñ, dla których sporz¹dzono roztwory wzorcowe w celu wyznaczenia krzywej kalibracyjnej). Uzyskane wysokie wartoœci wspó³czynnika r œwiadcz¹ o prawid³owym skorelowaniu wielkoœci, a tak e o liniowoœci wskazañ detektora FID w badanym zakresie stê eñ dla obu kolumn. Zakres pomiarowy jest to przedzia³ stê eñ analizowanej substancji (pomiêdzy najni szym i najwy szym stê eniem), w którym mo na osi¹gn¹æ akceptowaln¹ dok³adnoœæ i precyzjê. W badaniach wykorzystano certyfikowany materia³ odniesienia (roztwory wodne etanolu firmy Merck oraz Cerilliant w zakresie stê eñ od 0,1 do 5,0 ). Granica wykrywalności i oznaczalności Granica wykrywalnoœci (limit of detection LOD) jest to najmniejsza iloœæ lub najmniejsze stê enie substancji chemicznej, mo liwe do wykrycia za pomoc¹ danej metody analitycznej z okreœlonym prawdopodobieñstwem. Wartoœæ granicy wykrywalnoœci jest œciœle zwi¹zana z poziomem szumów stosowanego urz¹dzenia analitycznego, przyjmuje siê, e wartoœæ LOD to trzykrotnoœæ poziomu szumów. Mo na j¹ równie wyznaczyæ na podstawie odchylenia standardowego zbioru sygna³ów i wspó³czynnika nachylenia krzywej kalibracyjnej, korzystaj¹c z zale - noœci: gdzie: a wspó³czynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej, s odchylenie standardowe. Granica oznaczalnoœci (limit of quantification LOQ) jest to najmniejsza iloœæ lub najmniejsze stê enie substancji, mo liwe do iloœciowego oznaczenia za pomoc¹ danej metody analitycznej z za³o on¹ dok³adnoœci¹ i precyzj¹. Jej wartoœæ jest zawsze wielokrotnoœci¹ wyznaczonej wartoœci granicy wykrywalnoœci (LOD). Zazwyczaj przyjmuje siê zale noœæ: Powtarzalność 3,3* s LOD = a LOQ = 3 x LOD Powtarzalnoœæ jest parametrem wyra aj¹cym precyzjê oznaczeñ wykonanych w krótkim odstêpie czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warunkach. Powtarzalnoœæ zosta³a wyznaczona poprzez obliczenie odchylenia standardowego dla ka dego poziomu stê enia alkoholu etylowego w zakresie kalibracji od 0,10 do 5,0 w oparciu o wyniki 55 nastêpuj¹cych po sobie pomiarów wykonanych w krótkich przedzia³ach czasu, za pomoc¹ instrumentu chromatograf gazowy head-space Clarus 500 firmy Perkin-Elmer, oddzielnie dla ka dej z kolumn A i B, jako wartoœci wzglêdnego odchylenia standardowego dla nastêpuj¹cych szeœciu poziomów stê eñ: 0,10 ; 0,20 ; 0,50 ; 1,0 ; 2,0 i 5,0 ; Uzyskane wyniki pomiarów jak i obliczone wartoœci œrednie (x œr ) dla ka dej serii, wartoœci odchyleñ standardowych (S), wartoœci wzglêdnych odchyleñ standardowych (RSD) oraz odchylenia standardowe œredniej ( s ) przedstawiono w tabelach 1 i 2. Odtwarzalnoœæ sprawdzono poprzez analizê próbek kontrolnych o stê eniach 0,2 oraz 0,5 w 30 seriach w ró ne dni. Uzyskane wyniki pomiarów jak i obliczone wartoœci œrednie (x œr ) dla ka dego stê enia, wartoœci odchyleñ standardowych (S), wartoœci wzglêdnych odchyleñ standardowych (RSD) oraz odchylenia standardowe œredniej ( s ) przedstawiono w tabeli 3. Dok³adnoœæ i poprawnoœæ jest definiowana jako zgodnoœæ pomiêdzy uzyskanym wynikiem (pojedynczego) pomiaru z wartoœci¹ rzeczywist¹ (oczekiwan¹). 38 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ) 2009

7 Wartoœci uzyskane dla stê eñ wzorców od 0,10 do 0,50 (kolumna A i B) Values obtained for standard concentrations from 0,10% to 0,50% (columns A and B) Tabela 1 Ÿród³o (tab. 1 8): opracowanie w³asne Wartoœci uzyskane dla stê eñ wzorców od 1,0 do 5,0 kolumna A i B) Values obtained for standard concentrations from 1,0 % to 5,0% (columns A and B) Tabela 2 Poprawnoœæ to stopieñ zgodnoœci wyniku oznaczenia (jako œredniej obliczonej na podstawie serii pomiarów) z wartoœci¹ oczekiwan¹. Zatem poprawnoœæ jest parametrem okreœlaj¹cym zgodnoœæ wyników uzyskiwanych za pomoc¹ danej metodyki analitycznej z wynikami rzeczywistymi (oczekiwanymi). Dok³adnoœæ stanowi po³¹czenie poprawnoœci i precyzji, poniewa im bardziej poprawne i precyzyjne bêd¹ wyniki otrzymane z zastosowaniem danej metodyki analitycznej, tym bardziej dok³adny bêdzie wynik pojedynczego oznaczenia. Dok³adnoœæ zosta³a okreœlona tymi samymi 30 seriami, jakimi obliczona zosta³a odtwarzalnoœæ: Dla stê enia 0,2 Wartoœæ rzeczywista (znana wartoœæ sk³adnika w próbce standardu I-rzêdowego): 0,200 Odchylenie wartoœci rzeczywistej (œrednia wartoœæ minus wartoœæ rzeczywista): 0,001 Dok³adnoœæ (100 x œrednia/rzeczywista wartoœæ): 100% Dla stê enia 0,5 Wartoœæ rzeczywista (znana wartoœæ sk³adnika w próbce standardu I-rzêdowego): 0,500 Tabela 3 Wartoœci uzyskane dla stê eñ wzorców od 0,20 do 0,50 (kolumna A i B) Values obtained for standard concentrations from 0,20% to 0,50% (columns A and B) Odchylenie wartoœci rzeczywistej (œrednia wartoœæ minus wartoœæ rzeczywista): 0,001 Dok³adnoœæ (100 x œrednia/rzeczywista wartoœæ): 100% Ślepa próba Na 10 chromatogramach wykonanych z próbek wody na kolumnie A oraz kolumnie B nie stwierdzono obecnoœci pików chromatograficznych przy czasach retencji odpowiadaj¹cych alkoholowi etylowemu i standardowi wewnêtrznemu. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ)

8 Oszacowanie niepewności pomiaru Niepewnoœæ jest podstawow¹ w³aœciwoœci¹ ka dego pomiaru. Wyznaczaj¹c niepewnoœæ pomiaru, zwiêkszamy jego miarodajnoœæ. Na podstawie oszacowanej wartoœci niepewnoœci mo na okreœliæ przydatnoœæ danej metody analitycznej. Okreœlenie rozszerzonej niepewnoœci badanej metody analitycznej pozwala mówiæ o jakoœci wyników osi¹ganych za pomoc¹ danej metody. Niepewnoœæ jest parametrem zwi¹zanym z wynikiem pomiaru, który okreœla przedzia³ wokó³ wartoœci œredniej, w którym mo e znaleÿæ siê wartoœæ oczekiwana. Niepewnoœæ pomiaru jest sk³adow¹ niepewnoœci wszystkich pojedynczych etapów postêpowania analitycznego. Źród³em niepewnoœci w trakcie badania próbki krwi za pomoc¹ niniejszej procedury s¹ m.in.: a) niepewnoœæ zwi¹zana z etapem kalibracji chromatografu gazowego (u kal ), na któr¹ sk³adaj¹ siê: powtarzalnoœæ odczytu wartoœci sygna³u R i zarówno dla próbek wzorcowych na podstawie których wykreœlono krzyw¹ kalibracyjn¹, jak i badanych próbek krwi (u krz ), sposób przygotowania próbek wzorcowych (u przstd ), niepewnoœæ zwi¹zana z wyznaczeniem wartoœci odniesienia dla próbek wzorcowych (u STD ) z danych producenta certyfikowanych materia³ów odniesienia, b) standardowa niepewnoœæ zwi¹zana z przygotowaniem próbek krwi (u pr ). Wp³yw poszczególnych Ÿróde³ niepewnoœci przedstawiono, stosuj¹c diagram Ishikawy (ryc. 4). Pominiêto niepewnoœæ wyznaczenia sta³ej Henry ego dla alkoholu oraz niepewnoœæ wyznaczenia objêtoœci naczynek chromatograficznych, ze wzglêdu na niewielki ich wk³ad w sumaryczny bud et niepewnoœci. Bior¹c pod uwagê wszystkie sk³adowe przedstawione w diagramie Ishikawy, wzglêdn¹ niepewnoœæ wyznaczenia stê enia alkoholu w próbce krwi mo na zapisaæ nastêpuj¹co: U przstd Ryc. 4. Wp³yw poszczególnych parametrów na wartoœæ niepewnoœci oznaczenia alkoholu etylowego we krwi cz³owieka przedstawiono, stosuj¹c diagram Ishikawy Fig. 4. Effect of specific parameters on value of uncertainty in determination of ethyl alcohol in human blood are presented on Ishikawa diagram 40 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ) 2009

9 2 kal u = u + u C0 kal pr 2 przstd i u = u + u + u 2 krz 2 STD Na niepewnoœæ metody wyznaczenia stê enia alkoholu metod¹ chromatografii gazowej head-space wp³ywaj¹ przedstawione poni ej zmienne. Aby oszacowaæ niepewnoœæ wyznaczenia stê enia alkoholu metod¹ chromatografii gazowej, nale y przedstawiæ funkcjê wi¹ ¹c¹ zmienne ze stê eniem alkoholu w próbce krwi: c 0 STD STD c 0 = f ( RS, RSTD, Ri, ci, VSTD, VIS, V0, V0 STD ) V STD objêtoœæ dodawanego i-tego wzorca alkoholu etylowego na etapie kalibracji, zawsze 100 μl, V IS STD objêtoœæ dodawanego standardu wewnêtrznego na etapie kalibracji, zawsze 1000 μl, R i stosunek powierzchni wzorca alkoholu etylowego do powierzchni piku standardu wewnêtrznego, V 0 objêtoœæ krwi pobrana do badañ zawsze 100 μl, V 0 STD objêtoœæ standardu wewnêtrznego dodawana do próbki krwi, zawsze 1000 μl, a nastêpnie obliczyæ zgodnie z prawem propagacji b³êdu wartoœæ rozszerzonej niepewnoœci wed³ug wzoru: n δc 0 U = c kc0 δx 0 i 1 δx i 2 i gdzie: c 0 stê enie alkoholu etylowego w próbce krwi odczytane z krzywej kalibracyjnej [ ], R s pole powierzchni piku etanolu w nieznanej próbce, R STD pole powierzchni piku standardu wewnêtrznego t-butanolu w nieznanej próbce, c i STD stê enie i-tego wzorca alkoholu, gdzie: X i kolejne zmienne, c 0 stê enie alkoholu uzyskane z badañ, k wspó³czynnik rozszerzenia. Do wyznaczenia niepewnoœci objêtoœci V STD, V IS STD, V 0, V 0 STD uwzglêdniono dane zawarte w cer- Tabela 4 Zestawienie danych zawartych w certyfikatach CRM oraz obliczonych na podstawie danych z certyfikatów CRM Comparison of data comprised in CRM certificates and calculated basing on data from CRM certificates *W przypadku firmy Merck nie podano na jakim poziomie ufnoœci zosta³a oznaczona wartoœæ stê enia, wiêc niepewnoœæ standardow¹ obliczono ze wzoru: u c STD 4 2,03-1,99 = = 0, dla pozosta³ych wzorców poziom ufnoœci wynosi³ 95%. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ)

10 tyfikatach jakoœci, do³¹czonych przez producenta pipet, firmê Eppendorf (Niemcy) (tab. 4). W obliczeniach uwzglêdniono iloœæ odmierzeñ przeprowadzanych ka d¹ z pipet. W celu wyznaczenia niepewnoœci etapu kalibracji sporz¹dzono krzyw¹ kalibracyjn¹ dla stê eñ 0,10, 0,20, 0,50, 2,0 i 5,0. Dla ka dego ze stê eñ zarejestrowano po cztery serie wyników dla ka dej z kolumn. Przygotowano próbkê krwi o stê eniu oczekiwanym alkoholu etylowego na poziomie oko³o 0,5, dla której zarejestrowano po piêæ wyników na ka dej z kolumn A i B. Niepewnoœæ standardow¹ zwi¹zan¹ z przeprowadzeniem kalibracji i zastosowaniem metody regresji liniowej obliczono z poni szego wzoru: u krz s = a CR 1 1 ( c pr c + + p n Q gdzie: s CR resztkowe odchylenie standardowe, p liczba pomiarów (powtórzeñ) wykonanych dla badanej próbki krwi, (p = 5), n liczba punktów kalibracyjnych, c pr œrednie stê enie alkoholu w próbce wzorcowej odczytane za pomoc¹ wyznaczonej krzywej kalibracyjnej, c œr œrednia ze wszystkich wartoœci stê eñ roztworów wzorcowych, dla których wykonano pomiar w celu sporz¹dzenia krzywej wzorcowej, n 2 Q CR wartoœæ opisana wzorem: ( c i c œr ), a wspó³czynnik nachylenia wyznaczonej krzywej kalibracji, b wartoœæ odciêtej z wyznaczonej krzywej kalibracji. Tabela 5 Wyniki cz¹stkowe do obliczeñ u krz dla kolumn A i B Partial results for calculation of U krz for columns A and B i= 1 CR œr ) 2 Otrzymane wyniki cz¹stkowe zestawiono w tabeli 5. Wspó³czynnik kierunkowy oraz odciêt¹ krzywej kalibracyjnej obliczono, stosuj¹c metodê najmniejszych kwadratów. B³¹d stê enia alkoholu w jego roztworach wzorcowych odczytano ze œwiadectw certyfikowanych materia- ³ów odniesienia, wystawionych przez producenta, firmê Cerilliant, dostarczanych przez dostawcê, firmê LGC Standards (USA) oraz œwiadectw CRM, wystawionych przez firmê Merck KgaA (Darmstadt, Niemcy). Œrednie stê enie oraz œredni¹ niepewnoœæ standardow¹ dla wyników z kolumny A i B uzyskano, posi³kuj¹c siê poni - szymi wzorami i otrzymano nastêpuj¹ce wyniki: c c pra * + c * 2 prb 2 u u krza krzb = = 0, u u u krz krza Zbiorcze wyniki przedstawiono w tabelach 6 i 7. Nastêpnie porównano obliczon¹ wartoœæ niepewnoœci z odchyleniem standardowym, uzyskanym dla œredniej z próbek kontrolnych o stê eniu 0,50 alkoholu etylowego. Do obliczeñ œredniej brano pod uwagê wyniki pomiêdzy kolejnymi kalibracjami wykonanymi po badaniach walidacyjnych (wyniki zestawiono w tabeli 8). Omówienie wyników krzb 1 = = 0, u krza u krzb 1. Dla próbki o stê eniu 0,5 alkoholu etylowego niepewnoœæ standardowa wynosi 0,02, niepewnoœæ rozszerzona (przy wspó³czynniku rozszerzenia k = 2) wynosi 0, Najwiêkszy wk³ad do bud etu niepewnoœci (86%) wnosi wyznaczenie krzywej kalibracyjnej i odczytanie z niej wartoœci stê enia oraz czystoœæ certyfikowanego materia³u odniesienia (13%). Wk³ad obu tych czynników jest zrozumia³y, gdy zawartoœæ alkoholu w badanych próbkach, a tak e we wzorcach jest niewielka. Wk³ad pozosta³ych czynników: przygotowania roztworów wzorcowych oraz próbek krwi jest równy 1%. 3. Certyfikowany materia³ odniesienia c 4 STD (firmy Merck) o stê eniu 2,0 odbiega zdecydowanie 42 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ) 2009

11 Tabela 6 Zmienne wp³ywaj¹ce na niepewnoœæ wyznaczenia stê enia alkoholu etylowego metod¹ chromatografii gazowej head-space Variables influencing uncertainty of determining ethyl alcohol concentrations by means of head-space gas chromatography Tabela 7 Udzia³ % Ÿróde³ niepewnoœci wchodz¹cych w sk³ad bud etu niepewnoœci Percentages of sources of uncertainty comprised in uncertainty budget 5. Proces walidacji wraz z oszacowaniem bud etu niepewnoœci przedstawionej procedury analitycznej w pe³ni potwierdzi³ jej przydatnoœæ do zamierzonego zastosowania. 6. Wykonywanie badañ na optymalnym poziomie jakoœciowym, tak aby uzyskiwane wyniki badañ by- ³y jak najbardziej rzetelne, wiarygodne oraz obarczone jak najmniejsz¹ niepewnoœci¹, a tak e stale rosn¹ce wymagania odnoœnie do wysokich standardów pracy laboratorium, powoduj¹, e walidacja jest niezwykle wa nym i nieuniknionym elementem potwierdzaj¹cym prawid³owe funkcjonowanie ka dej pracowni, w której przeprowadzane s¹ badania p³ynów ustrojowych na zawartoœæ alkoholu etylowego. Porównanie wartoœci niepewnoœci uzyskanej w wyniku oszacowania z wynikami rzeczywistymi Comparison of estimated uncertainty obtained from estimation with real results Tabela 8 jakoœci¹ od pozosta³ych (firmy Cerilliant), gdy jego wk³ad w u STD jest najwiêkszy. 4. Odchylenie standardowe obliczone na podstawie próbek kontrolnych pozostaje w zgodzie z niepewnoœci¹ obliczon¹ na podstawie bud etu niepewnoœci. BIBLIOGRAFIA 1. EA-04/16 Wytyczne EA dotycz¹ce wyra ania niepewnoœci w badaniach iloœciowych, grudzieñ 2003 r. 2. EURACHEM CITAC Guide Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement QUAM:2000.P1. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ)

12 3. Guba³a W.: Toksykologia alkoholu wybrane zagadnienia, Wyd. IES, Kraków Materia³y z warsztatów Metrologia chemiczna, zorganizowanych w ramach targów EuroLab XI Miêdzynarodowe Targi Analityki i Technik Pomiarowych r. 5. Metodyka oznaczania jakoœciowego i iloœciowego alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych cz³owieka metod¹ chromatografii gazowej head-space, nr HJ/W-60/IV/08, wyd r. 6. Niepewnoœæ pomiaru raz jeszcze. Ró ne podejœcia do szacowania niepewnoœci Raport techniczny nr 1/2007 EUROLAB, marzec Norma PN-EN ISO/IEC 17025: Ap1:2007 Ogólne wymagania dotycz¹ce kompetencji laboratoriów badawczych. 8. Ocena i kontrola jakoœci wyników pomiarów analitycznych, P. Konieczka i J. Namieœnik [red.], Wyd. WNiT, Warszawa Podrêcznik obliczania niepewnoœci pomiaru w laboratoriach œrodowiskowych, Biuletyn Informacyjny Klubu POLLAB 2/51/2008, wersja 3, styczeñ 2008 r. 10. Rozporz¹dzenie Ministra Zdrowia i Opieki Spo³ecznej z dnia 6 maja 1983 roku w sprawie warunków i sposobu dokonywania badañ na zawartoœæ alkoholu w organizmie, DzU z 1983 roku, nr 25, poz Rödel W., Wölm G.: Chromatografia gazowa, Wydaw. Nauk. PWN, Warszawa Taylor J.R.: Wstêp do analizy b³êdu pomiarowego, Wydaw. Nauk. PWN, Warszawa Ustawa z dnia 26 paÿdziernika 1982 roku o wychowaniu w trzeÿwoœci i przeciwdzia³aniu alkoholizmowi, tekst jedn. DzU z 2002 roku, nr 147, poz z póÿn. zm. 14. Ustawa z dnia 20 czerwca 1997 roku Prawo o ruchu drogowym, tekst jedn. DzU z 2003 roku, nr 58, poz. 515 z póÿn. zm. 15. Zasady przeprowadzania pomiarów stê enia alkoholu oraz opiniowania w sprawach trzeÿwoœci. Zalecenia opracowane przez Instytut Ekspertyz S¹dowych zatwierdzone przez Zarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Medycyny S¹dowej i Kryminologii w dniu 26 listopada 2004 roku, Prokuratura i Prawo 2005, nr Zuba D.: Niepewnoœæ pomiarowa wyznaczania stê enia alkoholu we krwi, Z Zagadnieñ Nauk S¹dowych 2003, nr LIV. Streszczenie: Oznaczanie jakoœciowe i iloœciowe alkoholu etylowego w materiale biologicznym wyznaczane jest metod¹ chromatografii gazowej head-space w Wydziale Fizykochemii CLK KGP, zgodnie z Procedur¹ badawcz¹ nr HJ-60/Pb-IV/3/08 Oznaczanie zawartoœci alkoholu etylowego we krwi cz³owieka metod¹ chromatografii gazowej head-space. Ww. metoda jest metod¹ z wyboru, o najwy szym stopniu swoistoœci. O szerokim zastosowaniu tej metody decyduj¹ jej g³ówne zalety, m.in.: ³atwoœæ przygotowania próbek do analizy, potrzeba niewielkiej iloœci materia³u przeznaczonego do badañ, szybka mo liwoœæ wykrycia i wykonania oznaczenia oczekiwanej substancji w trakcie jednego cyklu badawczego, mo liwoœæ wykonania du ej liczby prób w krótkim czasie, a tak e czu³oœæ pomiaru oraz du a selektywnoœæ w stosunku do etanolu. Pracownia badañ p³ynów ustrojowych na zawartoœæ alkoholu etylowego Wydzia³u Fizykochemii CLK KGP d¹ y do przeprowadzania badañ na optymalnym poziomie jakoœciowym, tak aby uzyskiwane wyniki badañ by³y miarodajne, obiektywne i jak najbardziej rzetelne. Dziêki przeprowadzonej walidacji z du ym prawdopodobieñstwem mo na powiedzieæ, e proces analizy przebiega w sposób prawid³owy oraz e daje precyzyjne i wiarygodne wyniki. S³owa kluczowe: metoda chromatografii gazowej head-space, walidacja, liniowoœæ, granica wykrywalnoœci i oznaczalnoœci, powtarzalnoœæ, odtwarzalnoœæ, niepewnoœæ pomiaru, bud et niepewnoœci. Summary Qualitative and quantitative determination of ethyl alcohol in body fluids is performed by means of head-space gas chromatography in Physics and Chemistry Department of the Central Forensic Laboratory of Polish Police in conformity to Analytical procedure no. HJ-60/Pb-IV/3/08 Determination of ethyl alcohol in human blood by means of head-space gas chromatography. The aforementioned method was deliberately selected for its highest specificity. The widespread use of this method is conditioned by its main advantages, such as: easy preparation of samples for analysis, small quantities of test material required, detection and determination can be completed within one analytical cycle, large number of tests can be completed in a short time, measurements of high sensitivity and selectivity to ethanol. The team of alcohol in blood determination in the Physics and Chemistry Department of the Central Forensic Laboratory of Polish Police is aiming at achieving an optimal qualitative level of analyses, so that the results were relevant, impartial and reliable. Upon the completion of the validation one might state with a greater certainty that the process of analysis is performed correctly and provides accurate and reliable results. Keywords: head-space gas chromatography method, validation, linearity, detection and determinability limit, repeatability, reproducibility, measurement uncertainty, uncertainty budget. Autorka sk³ada podziêkowania p. Wiktorowi Dmitrukowi za okazan¹ pomoc i cenne wskazówki w trakcie przeprowadzania badañ walidacyjnych. 44 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 265 (lipiec wrzesieñ) 2009