A = log (I o /I) = ε c d

Transkrypt

1 Fotometryczne oznaczanie zawartości białka Zajęcia 3 godzinne część A, zajęcia 4 godzinne część A i B. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie zasad, na których oparte są najczęściej stosowane metody oznaczania białka związane z cechami jego budowy. Celem równoległym jest zapoznanie się, na przykładzie metody Lowry ego i współpracowników oraz metody spektrofotometrycznej z często wykonywaną fotometryczną analizą ilościową białka w badaniach biochemicznych. Wprowadzenie Metody oznaczania zawartości białka oparte są na charakterystycznych cechach jego budowy. Najczęściej wykorzystywane są następujące cechy białek: 1. obecność reszt aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu) w składzie aminokwasowym, 2. występowanie wiązań peptydowych, 3. występowanie reszt aminokwasów zasadowych (argininy, lizyny, histydyny) Metody fotometryczne oznaczania białka. W metodach fotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego przez różne substancje. Pomiar absorpcji światła przy określonej częstotliwości drgań (długości fali) może być miarą ilości substancji pochłaniającej promieniowanie i jest podstawą fotometrycznej analizy ilościowej. Do oznaczeń wykorzystuje się widmo określonych związków lub barwnych produktów powstałych w wyniku reakcji chemicznych, które można mierzyć metodami spektrofotometrycznymi i kolorymetrycznymi. Zdolność pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego określonej częstotliwości przez daną substancję zależy od jej struktury, a zwłaszcza od występowania i rozmieszczenia wiązań nienasyconych (głównie podwójnych). Substancje barwne pochłaniają fale świetlne w zakresie widma widzialnego ( nm) o barwie dopełniającej do tej, która jest dostrzegana przez oko ludzkie, np. barwa czerwona jest dopełniająca do niebieskiej, fioletowa do żółtej, a zielona do pomarańczowej. Stopień pochłaniania światła (wygaszenie), którego miarą jest absorbancja jest proporcjonalny do stężenia substancji pochłaniającej, a zależność ta jest tym bardziej ścisła, im mniejsza jest rozpiętość długości fali w wiązce światła padającego (światło monochromatyczne). Do uzyskania wiązki światła monochromatycznego używa się pryzmaty kwarcowe lub siatki dyfrakcyjne. Ilościowe metody fotometryczne oparte są na prawie Lamberta-Beera, zgodnie z którym absorbancja (A) zależy od logarytmu dziesiętnego ilorazu natężenia światła spolaryzowanego, które pada na badany roztwór (I o ) do natężenia światła które po przejściu przez roztwór nie zostało pochłonięte (I). Wyrażając to w inny sposób absorbancja zależy od stężenia molowego mierzonej substancji (c), grubości warstwy roztworu przez który przechodzi wiązka światła (d) i od molowego współczynnika absorpcji (ε). A = log (I o /I) = ε c d Grubość warstwy roztworu (d) wynosi zazwyczaj 1 cm, a pomiary dokonywane są w kuwetach z kwarcu, szkła lub tworzywa sztucznego. Kuwety różnią się przepuszczalnością 1

2 dla światła monochromatycznego o różnej długości fali, np. kuwety kwarcowe należy używać w zakresie długości fali nm. Molowy współczynnik absorpcji ε jest charakterystyczny dla mierzonej substancji, w sposób doświadczalny wyznaczany jest dla 1 molowego stężenia substancji, przy grubości warstwy roztworu d = 1cm. Współczynnik ten zależy od budowy analizowanej substancji (obecność pierścieni aromatycznych, pierścieni heterocyklicznych, wiązań podwójnych itp.), można go wykorzystywać do pomiaru stężeń mierzonych substancji, gdy mamy do czynienia homogennymi roztworami analizowanej substancji. Częściej zamiast stosowania molowego współczynnika absorpcji wygodniej jest wykreślić tzw. krzywą wzorcową dla oznaczanej substancji. Sporządza się ją odkładając na osi rzędnych wartość absorbancji kilku różnych znanych stężeń badanego związku, z kolei na osi odciętych odpowiednie wartości stężeń mierzonej substancji. Ilości analizowanej substancji powinny być tak dobrane, aby wykres zależności absorbancji od stężenia substancji był linią prostą, dodatkowo wykres powinien przechodzić przez początek układu współrzędnych (rys. 1). A. Kolorymetryczne metody oznaczania zawartości białka. Metoda Lowry ego i współpracowników. Bardzo popularnym sposobem oznaczania ilości białka jest metoda Lowry'ego i współpracowników (1951), która stanowi temat ćwiczenia. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność aminokwasów aromatycznych. Metoda ta składa się z 2 etapów, w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i Cu 2+ oraz redukcja jonów miedzi Cu 2+ do Cu + w środowisku zasadowym). W drugim etapie metody jony miedzi Cu + katalizują reakcję utlenienia przebiegającą głównie z udziałem tyrozyny i tryptofanu redukując odczynnik Folina-Ciocalteu, czyli kwasy: fosforomolibdenowy i fosforowolframowy do odpowiednich niebieskich tlenków. Stężenie barwnego kompleksu można mierzyć przy długości fali w zakresie od 500 do 750 nm. Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się najczęściej z krzywej wzorcowej. Przy tym dla uzyskania właściwych wyników niezmiernie ważny jest dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce zbliżone ilości tyrozyny i tryptofanu w stosunku do badanego białka. Zaletą metody jest jej znaczna czułość. Można stosować ją bowiem do oznaczenia ilość białka już od 10 μg w próbie, a zależność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu, a stężeniem białka obserwuje się nawet przy większych stężeniach do 1000 μg. Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w odniesieniu do białka oznaczanego (np. trypsyna daje 3 razy większe natężenie barwy niż żelatyna, przy tych samych stężeniach wagowych). Inną wadą metody Lowry ego jest zawyżanie wyników oznaczania w wyciągach niedializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu przez wolne aminokwasy, niewielkie peptydy, fenole, nitrofenole, w mniejszym stopniu przez puryny i pirymidyny, kwas moczowy, związki zawierające mostki disiarczkowe oraz niektóre detergenty. Z kolei związki takie jak: Zn 2+, Mg 2+, (NH 4 ) 2 SO 4, CCl 3 COOH, HClO 4, aceton, etanol, węglowodany, zależnie od stężenia obniżają intensywność barwy kompleksu. Odczynniki. 1. Odczynnik miedziowy. 2. Odczynnik Folina. 3. Wzorcowy roztwór albuminy wołowej (BSA) o stężeniu 200 μg/ml. 4. Rozcieńczony roztwór albuminy wołowej (BSA) jako zadanie kontrolne. 2

3 Wykonanie. Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczenia zawartości białka metodą Lowry ego i wsp. Do probówek odmierzyć w 2 powtórzeniach odpowiednio po 0,1 ml (20 μg białka), 0,2 ml (40 μg białka), 0,3 ml (60 μg białka), 0,4 ml (80 μg białka), 0,5 ml (100 μg białka) z roztworu wzorcowego albuminy wołowej (BSA) o stężeniu 200 μg/ml (3), a do próby odczynnikowej (ślepej) zamiast białka odmierzyć 0,5 ml wody. Wszystkie przygotowane ilości białka uzupełnić woda destylowaną do objętości 0,5 ml. Następnie do wszystkich probówek zawierających białko lub wodę destylowaną dodać po 2,5 ml odczynnika miedziowego (1), wymieszać i po 10 min dodać po 0,25 ml odczynnika Folina (2), całość natychmiast wymieszać używając mikrowytrząsarki do probówek. Po 30 min (jednak nie dłużej niż po 60 minutach) zmierzyć intensywność zabarwienia w fotometrze (przy 750 nm) nastawiając przyrząd na zero wobec próby odczynnikowej (ślepej). Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji (A) wykreślić krzywą zależności absorbancji od ilości białka w próbie. absorbancja Rys. 1 Przykładowa krzywa wzorcowa opisująca zależność absorbancji od ilości białka. Oznaczanie zawartości białka w badanym roztworze metodą Lowry ego i wsp. Roztwór białka otrzymany w kolbce miarowej na 10 ml należy dopełnić do kreski wodą destylowaną i dokładnie wymieszać. Do 2 probówek odmierzyć po 0,5 ml roztworu z kolbki, do trzeciej próbówki odmierzyć 0,5 ml H 2 O destylowanej (próba odczynnikowa) i dalej postępować jak przy sporządzaniu krzywej wzorcowej. Przykładowe obliczenia. ilo ść białka [ μg] Absorbancja Absorbancja Średnia ilość białka w µg odczytana z krzywej 1 2 absorbancja wzorcowej dla średniej absorbancji 0,406 0,414 0, Średnia absorbancja: 0,410 Ilość białka w 0,5 ml badanego roztworu białka wynosiła 70 µg, W 10 ml, (w kolbce) jest odpowiednio 1400 µg białka (20 x 70µg), Do kolbki, przed dopełnieniem jej wodą do objętości 10 ml wlano np. 3 ml analizowanego roztworu albuminy technicznej (wartość tą poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu absorbancji średniej dla wydanego zadania kontrolnego). 3

4 w 3 ml roztworu albuminy technicznej było 1400 µg białka, zatem w 1000 ml: 1400 µg białka x 1000/3 = µg białka, czyli 466,7 mg albuminy, co odpowiada obliczonej zawartości białka w roztworze albuminy technicznej na podstawie uzyskanych wyników pomiaru absorbancji. W 1000 ml rozpuszczono 500 mg albuminy technicznej, zatem 500 mg 100% 466,7 mg x% Obliczona czystość albuminy, w jej preparacie handlowym wynosi 93,3% czystego białka. Inne kolorymetryczne metody oznaczania zawartości białka. Metoda z zastosowaniem kwasu bicynchoninowego (BCA). Podobnie jak i w metodzie Lowry ego i wsp., również i w tym przypadku jony Cu 2+ ulegają redukcji w środowisku zasadowym do jonów Cu +. Odpowiadają za to wiązania peptydowe w białku, reszty cysteiny, cystyny, tryptofanu oraz tyrozyny, następnie powstałe jony Cu + reagują z BCA, tworząc barwny kompleks (Smith i współautorzy, 1985). Czułość tej metody jest podobna do metody Lowry ego i wsp.. Zaletą jest to, że przebiega jednoetapowo, a produkt reakcji przyjmuje intensywne czerwone zabarwienie, które można mierzyć przy długości fali 562 nm. Istotne dla tej metody jest przeprowadzenie reakcji w temperaturze 37ºC lub 60ºC, co powoduje zwiększenie czułości metody w porównaniu do reakcji prowadzonej w temperaturze pokojowej. Metodę tę można z powodzeniem stosować w obecności detergentów, mocznika, chlorku guanidyny, które przeszkadzają w metodzie Lowry ego i wsp.. Wadą tej metody jest to, że duże stężenie cukrów redukujących utrudnia prawidłowe oznaczenie stężenia białka. Metoda Bradford, z zastosowaniem błękitu Coomassie. Jest to prostsza, czulsza (od 1 μg białka w próbie) i szybsza metoda niż metoda Lowry ego i wsp.. Polega na reakcji reszt aminokwasowych argininy, lizyny oraz w mniejszym stopniu histydyny i aminokwasów aromatycznych (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina) w białkach z formą anionową błękitu Coomassie G-250 (Bradford 1976). Intensywność zabarwienia kompleksu białko barwnik mierzy się przy długości fali 595 nm bezpośrednio po wykonaniu reakcji. W warunkach standardowych w tej metodzie barwnik nie wiąże się z wolnymi aminokwasami (argininą i lizyną) oraz z peptydami o masie cząsteczkowej niższej niż 3000 Da. Wadą tej metody jest duża zmienność absorbancji (A 595 ) dla różnych rodzajów białek, przy identycznych stężeniach wagowych tych białek. Wynika to z niejednakowego składu aminokwasowego białek, co ma wpływ na intensywność barwnego kompleksu powstającego w tej reakcji. Inną wadą jest zawyżanie wyników przez detergenty, polifenole, amfolity, oraz zasady obecne w środowisku reakcji. Z kolei związki takie jak chlorowodorek guanidyny, askorbinian sodu, konkurując z barwnikiem o białko obniżają intensywność barwy kompleksu. B. Spektrofotometryczna metoda oznaczania białka. W tej metodzie wykorzystuje się spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV o długości 280 nm oraz 260 nm przechodzących przez badany roztwór białka (Layne 1957). Do pomiarów należy używać odpowiednich kuwet (kwarcowych lub z tworzywa sztucznego przepuszczającego promieniowanie UV). Większość związków aromatycznych ma zdolność pochłaniania światła nadfioletowego o długości fali 280 nm. W składzie aminokwasowym białek występują 3 aminokwasy aromatyczne: tyrozyna i tryptofan, które pochłaniają światło głównie przy długości fali 280 nm, oraz fenyloalanina, która najsilniej absorbuje światło przy 260 nm. Wadą tej metody jest duża zmienność absorbancji dla różnych rodzajów białek, 4

5 wynikająca z niejednakowej procentowej zawartości aminokwasów. Inną wadą metody spektrofotometrycznej jest możliwość zawyżenia odczytu przez kwasy nukleinowe obecne w próbie, w szczególności w homogenatach po dezintegracji komórek. Stosując tę metodę można oznaczyć zawartość białka od 10 μg. Zaletą metody jest jej prostota i szybkość pomiaru, co ma szczególne znaczenie w preparatyce enzymatycznej, często wykonuje się pomiar tylko przy jednej długości fali. Do wyliczenia przybliżonego stężenia białka w analizowanej próbie można użyć prostego równania: Białko (mg/ml) = 1,55 x A 280 0,76 x A 260 W pomiarach bardziej dokładnych oraz do oznaczeń stężeń białka w homogenatach należy stosować metody kolorymetryczne opisane powyżej w zależności od rodzaju materiału biologicznego i dostępności białka wzorcowego, a nie metodę spektrofotometryczną, która jest wprawdzie metodą szybką, ale i obarczoną dużym błędem pomiaru. Odczynniki. Rozcieńczony roztwór albuminy wołowej (BSA) jako zadanie kontrolne. Wykonanie. Oznaczanie zawartości białka w badanym roztworze. Do odpowiedniej kuwety (kwarcowej lub z tworzywa sztucznego przepuszczającej promieniowanie UV) odmierzyć najpierw wody destylowanej, wyzerować spektrofotometr przy długości fali 280 nm, następnie zmierzyć absorbancję dla otrzymanego roztworu białka. Pomiar powtórzyć po wyzerowaniu spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Zmierzone absorbancje nie powinny przekroczyć wartości 1,000. W przeciwnym wypadku konieczne jest odpowiednie rozcieńczenie mierzonego roztworu białka wodą. Otrzymany wynik wstawić do odpowiedniego równania, wyliczyć stężenie białka w mg/ml, a uwzględniając schemat rozcieńczeń obliczyć zawartość białka w otrzymanym do analizy roztworze. Przykładowe obliczenia. Absorbancja przy 280 nm Absorbancja przy 260 nm 0,120 0,091 Białko (mg/ml) = 1,55 x 0,120 0,76 x 0,091 = 0,186 0,069 = 0,117 W 1 ml próby znajduje się 117 µg białka W 10 ml, (w kolbce) 1170 µg białka Do kolbki, przed dopełnieniem jej wodą do objętości 10 ml wlano np. 3 ml analizowanego roztworu albuminy technicznej (wartość tą poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu absorbancji średniej dla zadania kontrolnego). w 3 ml roztworu albuminy technicznej było 1170 µg białka, zatem w 1000 ml: 1170 µg białka x 1000/3 = µg białka, czyli 390,0 mg albuminy, co odpowiada obliczonej zawartości białka w roztworze albuminy technicznej na podstawie uzyskanych wyników pomiaru absorbancji. W 1000 ml rozpuszczono 500 mg albuminy technicznej, zatem 500 mg 100% 390,0 mg x% 5

6 Obliczony procent czystości albuminy, w jej preparacie handlowym wynosi 78,0% czystego białka. Opracowanie wyników. Studenci wykonują krzywą wzorcową na papierze milimetrowym lub korzystając z programu komputerowego, nanosząc na wykres średnią z 2 pomiarów dla każdego stężenia białka. Niezależnie w sprawozdaniu należy podać odczyty absorbancji obu powtórzeń dla badanego roztworu białka oraz wyliczoną wartość średnią. Przy oznaczaniu zawartości białka należy z wartości absorbancji odczytać na krzywej wzorcowej stężenie białka, a następnie na podstawie proporcji w całej próbie obliczyć procentową zawartość białka w badanym materiale. Sposób przygotowania roztworu z tego materiału podany będzie przez prowadzącego ćwiczenia. Po wykonaniu ćwiczeń A i B należy porównać uzyskane wyniki pomiarów metodami Lowry ego i wsp. oraz spektrofotometryczną, a jeśli wystąpiły różnice, uzasadnić ich przyczynę. Pytania: 1. Wymienić cechy budowy białek, które są wykorzystywane przy ich ilościowym oznaczaniu. 2. Scharakteryzować zasady, na których opierają się poszczególne metody oznaczania zawartości białka. 3. Określić przydatność poszczególnych metod w ilościowym oznaczaniu białek. 4. Dlaczego przy oznaczaniu białka metodą spektrofotometryczną lub kolorymetryczną konieczne jest podanie rodzaju białka użytego do wyznaczania współczynników przeliczeniowych lub sporządzenia krzywej wzorcowej? 5. Obliczyć, jakiemu stężeniu związku odpowiada wartość absorbancji (A) = 0,1, jeżeli molowy współczynnik absorbancji wynosi Dlaczego w metodach fotometrycznych dokładność oznaczenia zależy między innymi od czystości padającej wiązki światła, jak się tę czystość osiąga? 7. Omów zasadę poznanej na ćwiczeniach metody ilościowego oznaczania zawartości białka. Jaką zależność przedstawiała sporządzona na ćwiczeniach krzywa wzorcowa? Literatura: 1. Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, Layne, E. (1957). Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Methods in Enzymology 3: Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: