ISBN

Transkrypt

1

2 I N S T Y T U T O C H R O N Y R O Ś L I N PA Ń S T W O W Y I N S T Y T U T B A D AW C Z Y Dyrektor doc. dr hab. Marek MRÓWCZYŃSKI Z A K Ł A D U P O W S Z E C H N I A N I A, W Y D AW N I C T W I W S P Ó Ł P R A C Y Z Z A G R A N I C Ą Kierownik dr Stefan WOLNY ul. Władysława Węgorka 20, Poznań tel: , fax: upowszechnianie@ior.poznan.pl Redaktor wydawnictw upowszechnieniowych i wdrożeniowych: Dr Stefan Wolny Recenzent: Prof. dr hab. Marek Tomalak Autorzy opracowania: Dr Renata Dobosz Dr Aleksandra Obrępalska-Stęplowska Mgr Katarzyna Nowaczyk Prof. dr hab. Stefan Kornobis Autorzy fotografii: Dr Renata Dobosz Mgr Magdalena Gawlak Mgr Witold Karnkowski Program Wieloletni Określanie zakresu zmienności morfologicznej i molekularnej nicienipasożytów roślin w celu identyfikacji gatunków objętych regulacjami prawnymi ISBN Copyright by Instytyt Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Nakład: 150 egz. Opracowanie graficzne oraz projekt okładki: mgr inż. Dominik Krawczyk Druk: TOTEM, Świętokrzyska 53, Inowrocław, tel. (052) ,

3 SPIS TREŚCI 1. WYKRYWANIE IZOLACJA MATERIAŁU IDENTYFIKACJA GATUNKU...4 CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW LITERATURA WYKRYWANIE Gatunki z rodzaju Meloidogyne posiadające status organizmów kwarantannowych umieszczone na liście A2 EPPO: (guzak amerykański) M. chitwoodi Golden et al (guzak holenderski) M. fallax Karssen Rośliny żywicielskie Ze względu na zakres roślin żywicielskich gatunki rodzaju Meloidogyne dzieli się na trzy grupy: I) gatunki pasożytujące na roślinach dwuliściennych, II) gatunki mające żywicieli wśród roślin jednoliściennych III) oraz gatunki, których żywicielami są zarówno rośliny jedno- jak i dwuliścienne (Karssen, 1999 ). Ponieważ M. chitwoodi podobnie jak M. fallax reprezentują trzecią grupę troficzną mogą one, poza takimi roślinami jak np. ziemniak lub marchew, wystąpić również w uprawie zbóż czy kukurydzy. Pospolicie występujący w otwartym gruncie M. hapla (guzak północny) związany jest z roślinami dwuliściennymi, choć znane są sporadyczne przypadki jego wystąpienia na roślinach jednoliściennych z rodzajów: Allium sp. (Oostenbrink, 1960) i Hosta sp. (Brinkman i Goossens, 1994) Objawy Guzaki nie powodują specyficznych objawów na nadziemnych częściach roślin. Obserwowane więdnięcie czy żółknięcie liści może być też wywołane przez inne szkodniki, patogeny chorobotwórcze albo czynniki abiotyczne. Objawy typowe dla Meloidogyne zaobserwować można na podziemnych częściach roślin.

4 4 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi Są to charakterystyczne wyrośla na korzeniach, zwane również guzami, powstające w wyniku interakcji pasożyt-żywiciel. Wyrośla związane z pasożytowaniem M. chitwoodi. (fot. 1a) czy M. fallax (fot. 1b) są nieco mniejsze niż obserwowane na korzeniach roślin porażonych przez M. hapla, a wyrastające z nich korzenie boczne nie są tak liczne jak wyrastające z guzów powstałych na skutek porażenia przez guzaka północnego (fot. 1c). Zewnętrznym objawem porażenia bulw ziemniaka przez M. chitwoodi (fot. 2a) czy M. fallax (fot. 2b) jest szorstka skórka z charakterystycznymi naroślami, które u pewnych odmian ziemniaka nie występują mimo stwierdzonego silnego porażenia. Pod skórką można obserwować nekrotyczne fragmenty tkanki koloru brązowego oraz charakterystyczne małe, ciemne plamki (wyraźnie widoczne na tle mleczno-żółtej tkanki bulwy). (M. chitwoodi fot. 3a; M. fallax 3b). UWAGA: W niewybarwionych korzeniach, poza złożami jajowymi, stadia rozwojowe guzaków znajdujące się wewnątrz tkanek nie zawsze są dokładnie widoczne. Dlatego podczas obserwacji systemów korzeniowych zaleca się zwrócenie szczególnej uwagi nawet na niewielkie zgrubienia tkanek. 2. IZOLACJA MATERIAŁU Materiał biologiczny pozyskuje się z tkanek roślin (korzeni i bulw) oraz z gleby. Z wyroślami związane są wszystkie stadia rozwojowe. Wewnątrz tkanek znajdują się nieruchome stadia rozwojowe guzaków (samice) i larwy. Natomiast na zewnątrz można łatwo zaobserwować, zamknięte w galaretowatej osłonce, złoża jajowe (już przy powiększeniu 20x uzyskiwanym przy pracy z optycznym mikroskopem stereoskopowym). Izolując materiał biologiczny z tkanek uzyskuje się również larwy inwazyjne (J 2 ), które opuściły złoże jajowe a jeszcze nie wniknęły do korzeni oraz robakowate, ruchliwe samce. Z gleby izoluje się wyłącznie stadia ruchliwe: larwy inwazyjne (J 2 ) i samce. 3. IDENTYFIKACJA GATUNKU Identyfikacji gatunku guzaka dokonuje się na podstawie cech morfologicznych i morfometrycznych oraz w oparciu o badanie genetyczne Oznaczanie na podstawie cech morfologicznych i morfometrycznych Cechy diagnostyczne służące oznaczeniu gatunku to: wzór na płytce perinealnej 1 samicy, długość i kształt guzów sztyletu samicy i samca oraz długość ciała larw inwazyjnych (J 2 ), długość ich ogona długość części przezroczystej (hyalinowej). Zestawienie zakresów zmienności cech diagnostycznych guzaków zamieszczono w tabeli 1. 1 płytka perinealna konfiguracja powierzchni oskórka w postaci charakterystycznego dla poszczególnych gatunków Meloidogyne układu linii perinealnych okalających wulwy i odbyt

5 Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Meloidogyne 5 Fot. 1. Wyrośla powstałe na korzeniach w wyniku pasożytowania M. chitwoodi (a), M. fallax (b) oraz M. hapla (c) Fot. 2. Objawy porażenia widoczne na powierzchni bulwy ziemniaka wywołane przez M. chitwoodi (a) i M. fallax (b) Fot. 3. Objawy porażenia wewnętrznych tkanek bulwy ziemniaka wywołane przez M. chitwoodi (a) i M. fallax (b)

6 6 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi Tabela 1. Cechy diagnostyczne oraz zakresy zmienności cech wykorzystywanych w diagnostyce gatunków z rodzaju Meloidogyne Meloidogyne Stadium/Cecha* hapla chitwoodi fallax Samica Długość sztyletu (µm) Samiec Długość sztyletu (µm) Larwy inwazyjne (J 2 ) Długość ciała (µm) Larwy inwazyjne (J 2 ) Długość ogona (µm) Larwy inwazyjne (J 2 ) Długość części przezroczystej (hyalinowej) (µm) Kształt guzów sztyletu okrągłe nieregularne okrągłe *W tabeli podano zakresy zmienności cech (w nawiasach umieszczono wartości minimalne i maksymalne). Dane morfometryczne przygotowano w oparciu o dane literaturowe oraz badania własne.

7 CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW Guzak północny Meloidogyne hapla (Chitwood 1949) Ciało samic, mniej lub bardziej zaokrąglone w kształcie gruszki. W przedniej części występuje szyjka i część głowowa. Sztylet jest lekko wygięty z wyraźnymi, delikatnymi, zaokrąglonymi guzami. Fałdy oskórka delikatne. Na tylnej cześci ciała widoczna okrągła płytka perinealna. Niekiedy fałdy oskórka formują po bokach tzw. skrzydełka. W okolicy ogona widoczne punktowanie oskórka (fot. 4a). Samce: Głowa wysoka, oddzielona od reszty ciała, sztylet delikatny, guzy zaokrąglone wyraźnie widoczne. Pola boczne z 4 liniami. Larwy inwazyjne (J 2 ) smukłe, z delikatniejszym, w porównaniu do larw mątwików, szkieletem głowy (fot. 4b) oraz delikatnym sztyletem długości µm. Guzy sztyletu okrągłe, oddzielone od jego podstawy. Hemizonid 1 występuje przed otworkiem wydalniczym. Ogon stożkowaty, na zakończeniu zaokrąglony. Przezroczysta część ogona przyjmuje często nieregularny kształt (fot. 4c). Fot. 4. M. hapla: wzór płytki perinealnej (a); głowa larwy inwazyjnej (b), zakończenie ogona (c) 1 hemizonid część systemu nerwowego, widoczna jako soczewkowaty twór położony pod oskórkiem na brzusznej stronie ciała nicienia w pobliżu otworu wydalniczego

8 Guzak amerykański Meloidogyne chitwoodi (Golden et al. 1980) Samice mają ciało okrągłe lub lekko gruszkowate z krótką szyjką zakończoną częścią głowową. Sztylet delikatny, guzy sztyletu są wyraźnie oddzielone od jego podstawy, owalne lub nieregularne, lekko spłaszczone i delikatnie pochylone. Dolna część sztyletu lekko zakrzywiona po stronie grzbietowej. Wulwa umieszczona na niewielkim wzniesieniu. Płytka perinealna stosunkowo mała, okrągła lub owalna. Łuk grzbietowy przechodzący od niskiego i zaokrąglonego do stosunkowo wysokiego. (fot. 5a). Linie boczne słabowidoczne. Głowa samca nieoddzielona od reszty ciała, brak poprzecznej szczeliny, sztylet delikatny, guzy wyraźnie oddzielone od podstawy sztyletu, owalne lub nieregularne, lekko spłaszczone i delikatnie pochylone. Na polach bocznych 4 linie. Larwy inwazyjne (J 2 ). Ciało smukłe, sztylet delikatny 9,5 10 µm długi, guzy u samicy i samca podobne (fot. 5b). Hemizonid jest położony przed lub w bliskim sąsiedztwie otworu wydalniczego. Ogon stożkowaty, na końcu zaokrąglony (fot. 5c). Fot. 5. M. chitwoodi: wzór płytki perinealnej (a);głowa larwy inwazyjnej (b), zakończenie ogona (c)

9 Guzak holenderski Meloidogyne fallax (Karssen 1996) Ciało samicy okrągłe lub w kształcie gruszki z krótką szyjką. Sztylet delikatny, jego dolna część jest lekko zakrzywiona po stronie grzbietowej. Guzy sztyletu są wyraźne, okrągłe. Wulwa umieszczona na niewielkim wzniesieniu. Płytka perinealna owalna z grubymi liniami (fot. 6a). Głowa samca lekko oddzielona od reszty ciała. Sztylet delikatny, lekko wygięty w kierunku grzbietowym. Guzy sztyletu są wyraźne, okrągłe. Na polach bocznych widoczne 4 linie. Larwy inwazyjne (J 2 ) są smukłe z delikatnym sztyletem i wyraźnie widocznymi okrągłymi guzami (fot. 6b). Hemizonid występuje przed lub w pobliżu otworu wydalniczego. Ogon stożkowaty na końcu okrągły (fot. 6c). Fot. 6. M. fallax: wzór płytki perinealnej (a);głowa larwy inwazyjnej (b), zakończenie ogona (c)

10 10 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi 3.2. Oznaczanie w oparciu o metody biologii molekularnej Identyfikację gatunków przeprowadza się według następującego porządku: Izolacja DNA Tkanki larw lub osobników dorosłych należy rozgnieść tak, aby przynajmniej częściowo je zmacerować. Następnie stosuje się jedną z poniższych procedur: przy pomocy gotowych zestawów Najlepiej przeprowadzić izolację przy pomocy gotowych zestawów do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych, dostępnych komercyjnie (np. DNeasy Isolation Kit, Qiagen). W pierwszym etapie rozgniecione tkanki zalewa się niewielką ilością buforu lizującego (dokładna objętość, wg. instrukcji producenta) zawierającym proteinazę K. Etap ten należy wydłużyć do ok. 4 godzin, w celu dokładnej lizy tkanek. Później przemywa się materiał genetyczny związany na błonie kolumienek z zestawu, a procedurę kończy się wymyciem oczyszczonego DNA z błony i zawieszeniem w wodzie lub 10 mm roztworze TrisCl (ph 7.5). izolacja metodą ekstrakcji fenolowej Rozgniecione tkanki należy zmieszać z ok. 100 μl buforu do izolacji DNA (50 mm TrisCl ph 7,5; 50 mm NaCl; 5 mm EDTA; 0,5% SDS) z dodatkiem proteinazy K, o stężeniu 50 μg/ml i trawić przez noc w 37 C lub 56 C. Następnie dodać do próby równą objętość mieszaniny fenol/chloroform (1:1) i przeprowadzić kilkukrotnie ekstrakcję fenolową, aż do zaniku interfazy, po czym wykonać ekstrakcję chloroformem (1 raz). DNA z fazy wodnej wytrącać etanolem (2,5 objętości) w obecności octanu amonu (1/3 objętości, 7,5 M) w 80 C przez 20 min. Osad zbierać przez wirowanie przy rpm, 20 min. w 4 C, a następnie przemyć 70% etanolem, suszyć i rozpuścić w wodzie lub buforze 1xTE (10 mm TrisCl ph 7,5; 1 mm EDTA). UWAGA: Jakość wyizolowanego DNA sprawdzić w świetle UV po rozdziale elektroforetycznym w 0,8% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (stęż. 0,5 μg/ml). Stężenie uzyskanego DNA można ocenić spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 260 nm, natomiast czystość preparatu można ocenić na podstawie wartości A 260 / A 280 (wartość pomiędzy 1,7 1,9 świadczy o jego czystości). Wyizolowany DNA należy przechowywać w 20 C Identyfikacja gatunków metodą PCR Do celów wykrywania, a także różnicowania nicieni tego rodzaju, zwłaszcza gatunków kwarantannowych zostało opracowanych wiele metod opartych głównie na standardowej reakcji PCR, a także real-time PCR, w tym także protokoły rekomendowane przez EPPO. Należą do nich: metoda standardowej reakcji PCR opisana przez Petersena i Vraina (1996) do wykrywania gatunków: M. hapla, M. chitwoodi i M. fallax oparta na amplifikacji se-

11 Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Meloidogyne 11 kwencji IGS (ang. intergenic spacer) w sekwencji rdna, bez konieczności trawienia restrykcyjnego produktu, oraz metoda opisana przez Wisharta i wsp. (2002) również oparta na amplifikacji przy pomocy gatunkowo-specyficznych starterów przyłączających się w obrębie regionu ITS. Przynależność gatunkową badanych nicieni z rodzaju Meloidogyne określić można na podstawie różnic w długości produktów reakcji. Innym sposobem detekcji i różnicowania jest metoda opisana przez Zijlstra i wsp. (1997), która polega na amplifikacji sekwencji ITS metodą PCR, a następnie trawieniu enzymami restrykcyjnymi powstałych produktów reakcji. Przynależność gatunkową określa się na podstawie różnic w długości fragmentów restrykcyjnych. Ze względu na istniejące różnice w sekwencjach nukleotydowych we fragmentach ITS oraz IGS (wynikających ze zróżnicowania genetycznego populacji, w tym również tych, które nie zostały do tej pory opisane), do których przyłączają się startery oraz różnic w miejscach cięcia enzymami restrykcyjnymi, może niekiedy dojść do reakcji krzyżowych czy powstawania niespecyficznych produktów. Czasami uzyskane wyniki są trudne do interpretacji. Najbezpieczniejszą więc metodą, chociaż bardziej pracochłonną, jest sekwencjonowanie uzyskanych produktów reakcji. Autorzy proponują więc, aby oczyszczony produkt reakcji PCR poddać sekwencjonowaniu (w jednym z serwisów oferujących tego typu usługi) celem potwierdzenia otrzymanego wyniku. Metodą umożliwiającą uzyskanie produktów w standardowej reakcji PCR dla każdego z gatunków Meloidogyne (nie tylko trzech wyżej wymienionych) jest reakcja opisana ostatnio przez zespół Berry i wsp (2008), z zastosowanie startera uniwersalnych dla wielu rodzjów nicieni 18S, oraz startera Melo-R-long umożliwiającego amplifikację nicieni z rodzaju Meloidogyne. Detekcja PCR z zastosowaniem metody Berry i wsp. Reakcję przeprowadza się wykorzystując 25 μl mieszaniny reakcyjnej, która zawierać powinna: 5 U polimerazy Taq, 1x stężony bufor załączony do polimerazy zawierający zwykle: 10 mm Tris-HCl ph 8,8, 1,5 mm MgCl 2, 50 mm KCl, 0,1% Triton X-100, 2 μm każdego ze starterów: 18S (5 TTGATTACGTCCCTGCCCTTT3 ) i Melo-R-long (5 GGCCTCACTTAAGAGGCTCA 3 ), 200 μm dntp, 1 μl wyizolowanego DNA. Reakcję należy przeprowadzić stosując poniżej podany profil termiczny reakcji: wstępna denaturacja w 94 C przez 3 minuty, 30 cykli składających się z: denaturacji w 94 C przez 1 min.,

12 12 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi przyłączania starterów w 57 C przez 1 min, elongacji w 72 C przez 1 min. końcowej elongacji w 72 C przez 10 min. Długość produktu dla wszystkich nicieni z rodzaju Meloidogyne powinna wynieść ok. 380 nt. UWAGA: w każdej analizie powinny być nastawione trzy reakcje kontrolne pozytywna (zawierająca pewny materiał genetyczny pochodzący z gatunku, którego obecność próbujemy stwierdzić, np. DNA z M. hapla przy identyfikacji M. hapla) negatywna (zawierająca DNA izolowany z innego gatunku) kontrola odczynnikowa (czyli próba zawierająca wszystkie odczynniki użyte do w/w analiz, bez DNA). Próby b i c powinny dać wynik negatywny Analiza wyników Rozdział elektroforetyczny. Wyniki reakcji PCR sprawdza się poprzez rozdzielenie produktów amplifikacji w 2% żelu agarozowym. Przykładowy wynik uzyskany w amplifikacji nicieni M. hapla, M. chitwoodi, M. fallax przedstawia ryc. 1. Ryc. 1. Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji PCR nicieni metodą opisaną przez Berry i wsp. (2008): 1) M. hapla, 2) M. chitwoodi, 3) M. fallax, K próba odczynnikowa, M marker masy cząsteczkowej.

13 Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Meloidogyne 13 Sekwencjonowanie. Do sekwencjonowania, oprócz produktu, należy przesłać jeden ze starterów, dzięki któremu produkt ten otrzymano. Wyniki sekwencjonowania należy porównać z danymi zdeponowanymi w Banku Genów ( Genbank/index.html). 4. LITERATURA Berry SD, Fargette M, Spaull VW, Morand S, Cadet P (2008) Detection and quantification of root-knot nematode (Meloidogyne javanica), lesion nematode (Pratylenchus zeae) and dagger nematode (Xiphinema elongatum) parasites of sugarcane using real-time PCR. Mel and cell probes 22: Brinkman H., Goossens J., 1994) Het noordelijk worteklnobbelaaltje Meloidogyne hapla bij Hosta sorten. Gewasbescherming 25: Karssen G., Brzeski W. M Meloidogyne Göldi, ss: W: Nematodes of Tylenchina in Poland and temperate Europe. (M. W. Brzeski, eds). Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Warszawa. Karssen G The plant-parasitic nematode genus Meloidogyne Göldi, 1892 (Tylenchida) in Europe. Ph. D. Thesis, University of Gent, 161 ss. Kornobis S Diversity of Meloidogyne hapla Chitwood, 1949 population in Poland. Russian Journal of Nematology 12(1): Oostenbrink M. 1960) Enige bijzondere aaltjesaantastingen in T. Pl. Zietken 67: Petersen DJ, Vrain TC (1996) Rapid identification of Meloidogyne chitwoodi, M. hapla and M. fallax using PCR primers to amplify their ribosomal intergenic spacer. Fundamental and Applied Nematology 19 (6): Wishart J, Phillips MS & Blok VC (2002) Ribosomal intergenic spacer: a polymerase chain reaction diagnostic for Meloidogyne chitwoodi, M. fallax, and M. hapla. Phytopathology 92, Zijlstra C (1997) A reliable, precise method to differentiate species of root-knot nematodes in mixtures on the basis of ITS-RFLPs. Fundamental and Applied Nematology 20:

14