WYKRYWANIE WIRUSÓW ZIEMNIACZANYCH BEZPOŚREDNIO W EKSTRAKTACH Z BULW PORÓWNANIE TESTU ELISA Z IMMUNO-CAPTURED RT-PCR

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (2) 2009 WYKRYWANIE WIRUSÓW ZIEMNIACZANYCH BEZPOŚREDNIO W EKSTRAKTACH Z BULW PORÓWNANIE TESTU ELISA Z IMMUNO-CAPTURED RT-PCR KRZYSZTOF TREDER 1, TOMASZ PILECKI 1, PAWEŁ ŁYCUŚ 1,2 1 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Biochemii Bonin 3 krzysztof.treder@wp.pl 2 Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt Judyma 2 26, Szczecin I. WSTĘP Próby oczkowe to wiarygodna i czuła metoda wykrywania wirusów w bulwach ziemniaka. Niestety są bardzo kosztowne z uwagi na konieczność utrzymywania roślin w szklarni w okresie jesienno-zimowym. Dlatego pożądana jest procedura alternatywna, pozwalająca na bezpośrednią ocenę zdrowotności bulw. Flegg i Clark (1979) opracowali czuły test koktajl-elisa do wykrywania wirusa chlorostyczna plamistości liści jabłoni (ACLSV). Jest on dziesięciokrotnie bardziej czuły niż DAS-ELISA w ocenie koncentracji cząstek wirusa liściozwoju ziemniaka (PLRV) w ekstraktach z liści (van den Heuvel i Peters 1989). Wykazano również jego przydatność do detekcji PLRV w ekstraktach z bulw (Treder i Lewosz 2000). Za jedyną alternatywę dla prób oczkowych uznawane są testy molekularne oparte o technikę PCR. Jednak z uwagi na wysoki koszt oraz pracochłonność izolacji RNA trudno adaptować je do diagnostyki masowej. Nolasco i wsp. (1993) opracowali test immuno-captured RT-PCR (IC-RT-PCR) eliminujący konieczność izolacji RNA. Polega on na związaniu cząstek wirusa za pomocą przeciwciał pokrywających ściany mikropłytki i wykonaniu reakcji odwrotnej transkrypcji a następnie PCR. W pracy porównano koktajl-elisa z DAS-ELISA pod względem czułości wykrywania cząstek PLRV, wirusa ziemniaka M (PVM) oraz wirusa ziemniaka Y (PVY) w ekstraktach z bulw. Dodatkowo testowano przydatność IC-RT-PCR do wykrywania PLRV.

2 Wykrywanie wirusów ziemniaczanych 741 II. MATERIAŁ I METODY Bulwy do badań uzyskano z roślin porażonych pierwotnie wirusami PLRV, PVM, PVY oraz z kontrolnych roślin wolnych od wirusów. Przystolonowy fragment bulw ucierano na tarce i odciskano ekstrakt, który natychmiast rozcieńczano pięciokrotnie buforem do prób (1 x PBS ph 7,4 zawierającym 2% PVP, 0,05% Tween 20, 1% żelatynę, 0,4% siarczyn sodu). Z tego rozcieńczenia przygotowywano kolejne w zakresie od 10 do razy. Porównanie czułości wykrywania wirusów PLRV, PVM, PVY w rozcieńczeniach soku z bulw wykonywano za pomocą DAS-ELISA oraz koktajl-elisa stosując przeciwciała i koniugaty własnej produkcji. DAS-ELISA. Soki rozcieńczone razy buforem do prób nanoszono do studzienek mikropłytki (200 µl/studzienkę) pokrytych przeciwciałami, inkubowano w 4 C do następnego dnia. Płytkę płukano buforem do płukania (1 x PBS z 0,05% Tween 20) i dodawano po 200 µl koniugatu przeciwciał z alkaliczną fosfatazą, rozcieńczonego razy w buforze do prób. Płytki inkubowano 3,5 h w 37 C, płukano i dodawano roztwór fosforanu p-nitrofenolu. Po 2 h rozwijania reakcji odczytywano absorbancję w 405 nm. Koktajl-ELISA. Do studzienek mikropłytki pokrytej przeciwciałami nakładano po 100 µl soków rozcieńczonych razy buforem do prób. Dodawano po 100 µl koniugatu przeciwciał z alkaliczną fosfatazą (rozcieńczonego 500 razy) i inkubowano w 4 C do następnego dnia. Płytkę płukano i dodawano roztwór fosforanu p-nitrofenolu. Po 2 h rozwijania reakcji odczytywano absorbancję w 405 nm. IC-RT-PCR. Do probówek (0,2 ml), powleczonych przeciwciałami specyficznymi wobec PLRV nakładano po 50 µl soków rozcieńczonych razy buforem do prób. Inkubowano 24 h, płukano buforem PBS zawierającym 0,05% Tween 20, następnie 3-krotnie wodą traktowaną 0,1% dwuetylopirokarbonianem (DEPC) i nakładano po 12 µl wody plus 1 µl mieszaniny przypadkowych heksamerów. Probówki ogrzewano 10 minut w 65 C po czym schładzano do 4 C. Dodawano 7 µl mieszaniny zawierającej bufor do odwrotnej transkrypcji, inhibitor rybonukleazy, mieszaninę trójfosforanów deoksynukleotydów oraz odwrotną transkryptazę (Roche). Syntezę cdna prowadzono przez 30 minut w 65 C. Następnie 5 µl nakładano w 4 C do probówek napełnionych 15 µl mieszaniny do reakcji PCR wraz z polimerazą oraz starterami: PLRVR (5 -GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3 ) i PLRVF (5 -CGCGCTAACAGAGTTT-3 ) wg Singh i wsp. (2002). Probówki wkładano do gorącego termocyklera i wykonywano reakcję PCR wg programu: 2 min w 94 C, 30 cykli: 92 C 30 s, 56 C 30 s, 72 C 45 s. Reakcję kończono przez 5 min w 72 C. Produkty reakcji rozdzielano elektroforetycznie w 1,5% agarozie. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Za pomocą testu koktajl-elisa wykryto cząstki badanych wirusów w sokach kilkukrotnie bardziej rozcieńczonych niż za pomocą DAS-ELISA (rys. 1A, B, C). Dla prób zawierających wiriony PLRV wartości absorbancji były zawsze wyższe w kok-

3 742 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (2) 2009 A. PLRV Rozcieńczenia soku z bulw Dilutions of tuber extract Rozcieńczenia soku z bulw Dilutions of tuber extract Rozcieńczenia soku z bulw Dilutions of tuber extract Rys. 1. Porównanie czułości wykrywania wirusów PLRV (A), PVM (B) i PVY (C) za pomocą koktajl-elisa ( ) i DAS-ELISA ( ) w rozcieńczeniach soku z bulw. Przedstawione wyniki uzyskano z uśrednienia dwóch powtórzeń i po odjęciu wartości progowych. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe Fig. 1. Comparison of cocktail-elisa ( ) and DAS-ELISA ( ) detection sensitivity for detection of PLRV (A), PVM (B) and PVY ( C) in dilutions of tuber extract. Presented results represents average values from duplicates with threshold values (background) subtracted. Error bars corresponds to standard deviation

4 Wykrywanie wirusów ziemniaczanych 743 tajl-elisa. Sok rozcieńczony 10-krotnie posiadał lekko hamujący wpływ na wykrywanie PLRV. Efekt ten zanikał po 20-krotnym rozcieńczeniu soku, które było optymalnedo wykrywania cząstek wirusa (rys. 1A). Znacznie silniejsze hamowanie stwierdzono dla PVM i PVY. Malało wraz z rozcieńczeniem soku by zaniknąć dla prób rozcieńczonych 100-krotnie w przypadku PVM i 50-krotnie dla PVY (rys. 1B, C). Na skutek hamującego wpływu soku na wykrywanie tych wirusów w mniej rozcieńczonych sokach wyższe wyniki uzyskano za pomocą DAS-ELISA. Jednak w DAS-ELISA obserwowano spadek wartości absorbancji wraz z rozcieńczeniem soku, podczas gdy w koktajl- ELISA wraz z rozcieńczeniem soku następował wzrost wartości absorbancji aż do optymalnego rozcieńczenia. Ta obserwacja jest istotna, gdyż stosując do porównania czułości obu testów niewłaściwie rozcieńczony sok można wnioskować, że dla PVM i PVY test DAS-ELISA jest bardziej czuły niż koktajl-elisa. Ponadto wskazuje, że dla polepszenia wykrywania PVM i PVY korzystne jest stosowanie bardziej rozcieńczonych soków niż w przypadku PLRV. Jednak z literatury wiadomo, że wpływ soku na wykrywanie wirusów może zależeć od takich czynników jak rodzaj odmiany ziemniaka czy stan fizjologiczny tkanki (Tamada i Harrisom 1980a, b; Gunn i Pares 1988). Może to być przyczyną zmienności wyników prowadzącej do ich błędnej interpretacji. Dla oceny przydatności IC-RT-PCR do wykrywania PLRV w ekstraktach z bulw porównano czułość tego testu z koktajl-elisa (tab. 1). Za pomocą koktajl-elisa wykryto obecność cząstek wirusa w sokach od 10 do 400 razy rozcieńczonych. Badając te same próby za pomocą IC-RT-PCR uzyskano specyficzny dla PLRV produkt o wielkości 336 pz dla wszystkich badanych rozcieńczeń. Intensywność produktu nie różniła się Tabela 1. Ocena czułości wykrywania PLRV za pomocą testów koktajl-elisa i IC-RT-PCR w ekstraktach z bulw ziemniaka Table 1. Estimation of cocktail-elisa and IC-RT-PCR sensitivity for PLRV detection in tuber extracts Rozcieńczenia soku z bulw Dilutions of tuber extract Kontrola 1 Control 1 0,009 0,103 0,113 0,077 0,219 SD * 0,007 0,096 0,092 0,025 0,041 PLRV 2 1,808 0,459 0,266 0,170 0,163 SD * 0,146 0,030 0,024 0,045 0,079 IC-RT-PCR średnie wartości absorbancji (405 nm) dla trzech powtórzeń rozcieńczeń soku z roślin wolnych od PLRV 2 wartości absorbancji (405 nm) dla trzech powtórzeń rozcieńczeń soku z roślin zainfekowanych PLRV * odchylenie standardowe obliczone dla 3 powtórzeń + obecność specyficznego dla PLRV produktu PCR o wielkości 336 par zasad 1 average absorbance values (405 nm) for triplicates of extract dilutions from PLRV free plants 2 average absorbance values (405 nm) for triplicates of extract dilutions from PLRV infected plants * standard deviation calculated for triplicates of extract dilutions + presence of PCR reaction product, specific for PLRV (336 bp long)

5 744 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (2) 2009 Rys. 2. Produkty IC-RT-PCR ze starterami specyficznymi dla PLRV Sok z liści rośliny porażonej PLRV (kontrola pozytywna) rozcieńczony 100 razy 1 Sok z bulw porażonych PLRV rozcieńczony 20, 50, 200, 400 oraz 800 razy 2 6 Marker M Sok z bulwy wolnej od PLRV rozcieńczony 100 razy B Sok z liści rośliny wolnej od PLRV rozcieńczony 100 razy L Fig. 2. Products of IC-RT-PCR with PLRV-specific primers Sap from leaves of PLRV infected plant (positive control) diluted 100 fold 1 Sap from tubers of PLRV infected plant diluted 20, 50, 200, 400 and 800 fold 2 6 Marker M Sap from PLRV-free tuber diluted 100-fold B Sap from PLRV-free leaf diluted 100-fold L znacząco pomiędzy rozcieńczeniami, co świadczy o tym, że nie osiągnięty został limit detekcji testu (rys. 2). Wynik potwierdza wyższą czułość IC-RT-PCR od testów immunoenzymatycznych. Świadczy jednak również o tym, że koktajl-elisa jest metodą, której czułość jest na tyle wysoka by warto było podjąć próbę adaptacji tej metody do oceny stanu zdrowotnego bulw ziemniaka. IV. LITERATURA Flegg C.L., Clark M.F The detection of apple chlorotic leafspot virus by a modified procedure of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ann. Appl. Biol. 91: Gunn L.V., Pares R.D Effect of potato physiology on the interpretation of ELISA results for potato leafroll virus. Plant Pathol. 37: Nolasco G., de Blas C., Torres V., Ponz F A method combining immunocapture and PCR amplification in a microtiter plate for the detection of plant viruses and subviral pathogens. J. Virol. Methods 45:

6 Wykrywanie wirusów ziemniaczanych 745 Singh R.P., Nie X., Singh M., Coffin R., Duplessis P Sodium sulphite inhibition of potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J. Virol. Methods 99: Tamada T., Harrison B.D. 1980a. Factors affecting the detection of potato leafroll virus in potato foliage by enzyme-linked immunosorbent assay. Ann. Appl. Biol. 95: Tamada T., Harrison B.D. 1980b. Aplication of enzyme-linked immunosorbent assay to the detection of potato leafroll virus in potato tubers. Ann. Appl. Biol. 96: Treder K., Lewosz J Zastosowanie metod molekularnych do wykrywania wirusa liściozwoju ziemniaka (PLRV). Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 40 (1): van den Heuvel J.F.J.M., Peters D Improved detection of potato leafroll virus in plant material and in aphids. Phytopathology 79: KRZYSZTOF TREDER, TOMASZ PILECKI, PAWEŁ ŁYCUŚ DETECTION OF POTATO VIRUSES DIRECTLY IN TUBER EXTRACTS COMPARISON OF ELISA AND IMMUNO-CAPTURED RT-PCR SUMMARY The application of the cocktail-elisa procedure allowed for the detection of PLRV, PVM and PVY in samples 10-fold more diluted than by DAS-ELISA. Dilutions of extracts obtained from PLRV-infected tuber were also tested by IC-RT-PCR and PLRV-specific PCR product was observed even for the most diluted samples. Key words: potato virus, ELISA, IC-RT-PCR