ZASTOSOWANIE 16 MARKERÓW Y-STR W POPULACJI POLSKI CENTRALNEJ* THE UTILITY OF THE 16 Y-STRS MARKERS IN THE CENTRAL POLAND POPULATION*

Transkrypt

1 ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS ROCZNIKI POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE 2007, 53, SUPPL. 2, RENATA JACEWICZ, MACIEJ JĘDRZEJCZYK, KATARZYNA BĄBOL-POKORA, JAROSŁAW PIĄTEK 1, ANDRZEJ OSSOWSKI 1, JAROSŁAW BERENT ZASTOSOWANIE 16 MARKERÓW Y-STR W POPULACJI POLSKI CENTRALNEJ* THE UTILITY OF THE 16 Y-STRS MARKERS IN THE CENTRAL POLAND POPULATION* 1 Pracownia Genetyki Sądowej Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi ul. Sędziowska 18 a, Łódź Kierownik: dr hab. n. med. Jarosław Berent Pracownia Hemogenetyki Zakładu Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, Szczecin Kierownik: dr hab. n. med. Mirosław Parafiniuk Summary Haplotype and allele frequencies for the panel of 16 Y chromosome STR loci, namely 19, 385, 389I, 389II, 390, 391, 392, 393, 437, 438, 439, 448, 456, 458, 635 and Y GATA-H4 were determined in a population sample of 250 unrelated males from the central region of Poland. The 238 different haplotypes were identified, of which 227 haplotypes were unique, 10 were duplicated and one haplotype was shared between three unrelated men. The average gene diversity was , combined gene diversity was and probability that two randomly chosen haplotypes are different in the population was Interpopulation comparisons revealed that Polish population is homogeneous within the three compared samples, while it differs statistically significantly from other population samples apart from Spanish population. This seems to be the first report showing the analysis of the molecular genetic distance between the population of Poland and other European and world populations for the panel of 16 Y-chromosome STR loci. The analyzed set of Y-STR markers is very useful in forensic casework to identify males and trace paternal lineages. K e y w o r d s: Y-STRs population genetics central Poland. Streszczenie Nierekombinacyjne markery typu STR zlokalizowane na chromosomie Y znalazły szerokie zastosowanie w genetyce sądowej. Są szczególnie przydatne w analizie śladów z przestępstw na tle seksualnym oraz do uzyskania niepowtarzalnych profili rodowodowych w badaniach pokrewieństwa. Uzyskiwana wartość siły dyskryminacji, a tym samym wartość dowodowa analizy, jest zależna od zakresu zastosowanych markerów, a do jej oceny konieczna jest znajomość częstości alleli w odnośnej populacji. Celem opracowania była analiza polimorfizmu w obrębie 16 markerów chromosomu Y przeprowadzona w grupie 250 niespokrewnionych mężczyzn z regionu Polski centralnej, uczestniczących w badaniach spornego ojcostwa. Matrycowe DNA amplifikowano z wykorzystaniem zestawu PCR AmpFlSTR Y-filer, a detekcję produktów amplifikacji przeprowadzano w sekwenatorze ABI Prism 377. Statystyczna i graficzna analiza wyników, obejmująca obliczenia częstości występowania poszczególnych alleli w populacji, ocenę zróżnicowania w obrębie układów i genotypów oraz analizę molekularnego dystansu (AMOVA) pomiędzy populacjami, została wykonana z zastosowaniem oprogramowania: Arlequin, GDA oraz Treeview. Dla badanego zestawu 16 markerów Y-STR uzyskano średnią wartość zmienności genowej 0,5995, łączną wartość * Praca sfinansowana z grantu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Nr * This work was supported by the grant of Medical University in Łódź.

2 96 RENATA JACEWICZ, MACIEJ JĘDRZEJCZYK, KATARZYNA BĄBOL-POKORA i wsp. zmienności genowej 0,9998 oraz wartość odsetka unikalnych haplotypów 0,908. Prawdopodobieństwo przypadkowego powtórzenia się 16 locusowego haplotypu w badanej populacji Polski centralnej wynosi zaledwie 0,0004. Ujawnione wysokie wskaźniki dyskryminacji, jak i męska specyficzność badanego zestawu markerów warunkują ich wysoką przydatność w analizach z zakresu genetyki sądowej. Uzyskane dane populacyjne posłużą do opracowania bazy danych do obliczeń wartości dowodowej ekspertyz. Porównanie przeprowadzone w oparciu o AMOVA wykazało homogenność w obrębie 3 polskich populacji i zobrazowało rosnący dystans genetyczny dzielący badaną populację Polski centralnej od populacji serbskiej, hiszpańskiej, portugalskiej, brazylijskiej i japońskiej. H a s ł a: Y-STRs genetyka populacyjna Polska centralna. Wstęp Nierekombinacyjne markery typu STR zlokalizowane na chromosomie Y znalazły szerokie zastosowanie w genetyce sądowej. Są szczególnie przydatne w badaniach przestępstw na tle seksualnym, ponieważ umożliwiają detekcję i identyfikację męskiego DNA w mieszaninach. Pozwalają też na wyodrębnienie śladowych ilości męskiego DNA w materiale pochodzącym od kobiety, a także ujawnienie więcej niż jednego sprawcy gwałtu [1]. W sytuacji, gdy domniemany ojciec nie żyje lub jest niedostępny do badań, markery Y-STRs ujawniają przynależność do określonej męskiej linii rodowej [2]. Zastosowanie ich do praktyki sądowo-medycznej wymaga opracowania baz danych populacyjnych zawierających częstości alleli oraz obliczeń parametrów statystycznych oceniających przydatność do analiz [3]. Uzyskane dane stanowią punkt wyjścia do opracowania baz danych populacyjnych w rejonie Polski centralnej oraz oceny wartości dowodowej ekspertyzy w przypadku zgodności profili. Jest to pierwsza praca przedstawiająca analizę molekularnego dystansu genetycznego dzielącego populację Polski od innych populacji Europy i świata w oparciu o zakres 16 badanych loci Y-STR. Materiał i metody Materiał do badań stanowiła krew obwodowa bądź wymazy nabłonka pobrane od 250 niespokrewnionych mężczyzn pochodzących z regionu Polski centralnej, zgłaszających się na badanie w sprawach ustalenia ojcostwa. DNA wyizolowano przy użyciu zestawu Sherlock AX (A&A Biotechnology). Matrycowe DNA amplifikowano z wykorzystaniem zestawu PCR AmpFlSTR Y-filer zgodnie z oryginalnymi zaleceniami technicznymi producenta (Applied Biosystems). Detekcję produktów amplifikacji przeprowadzano w sekwenatorze ABI Prism 377 wobec standardu wielkości GeneScan-500, stosując oprogramowanie GeneScan 3.7 NT (Applied Biosystems). Statystyczna analiza wyników, obejmująca obliczenia częstości występowania poszczególnych alleli w populacji, analizę molekularnego dystansu (AMOVA) oraz ocenę dystansu genetycznego pomiędzy populacjami w oparciu o obliczenia współczynnika R st, została wykonana z zastosowaniem oprogramowania Arlequin 2.0 [4]. Filogenetyczne drzewo obrazujące genetyczny dystans Slatkina [5] między populacjami zostało skonstruowane przy użyciu programu GDA [6] i uwidocznione z wykorzystaniem programu Treeview [7]. Zróżnicowanie w obrębie układów (GD) i haplotypów (HD) zostało obliczone z zastosowaniem formuły Nei [8]. Wyniki Badany zakres 16 układów STR chromosomu Y, wraz z oznaczeniem GenBank ( oraz strukturą motywu powtórzeniowego, w obrębie którego oznaczenia alleli stosowano zgodnie z nomenklaturą rekomendowaną przez Komisję DNA Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej [3], zawarto w tabeli 1. Zaobserwowano łącznie 238 haplotypów, z których 227 było unikalnych, 10 powtórzyło się w populacji 2 krotnie, a 1 pojawił się w populacji 3 razy. W tabelach 2, 3 i 4 przedstawiono charakterystykę uzyskanych rozkładów alleli i zestawienie ich częstości oraz liczebności, a także wartości GD w obrębie poszczególnych loci Y-STR. Wartość ta mieści się w zakresie od 0,3536 (393) do 0,8296 (), a średnia zmienność tych markerów w badanej populacji wynosi 0,5995. Zestawienie zmienności w obrębie minimalnego haplotypu (zakres 8 układów) ze zmiennością w obrębie haplotypu w pełnym zakresie 16 badanych układów przyniosło wzrost wartości GD z 0,9905 do 0,9998, jak i wzrost odsetka unikalnych haplotypów z 176 (0,704) do 227 (0,908). Ujawniona zmienność w obrębie haplotypów, wynosząca 0,9996, świadczy o tym, że prawdopodobieństwo, iż 2 niespokrewnionych mężczyzn będzie miało ten sam 16 locusowy haplotyp wynosi 0,0004. Najczęstszy haplotyp, który powtórzył się w badanej populacji 3 krotnie /15 odnotowano w populacji z częstością 0,012. Porównanie badanej populacji z populacją z innego z regionu Polski centralnej [9] oraz Polski północno-zachodniej, a także badanej populacji z innymi populacjami Europy i świata: serbską, hiszpańską, portugalską, brazylijską i japońską [10, 11, 12, 13, 14], przeprowadzone w oparciu o analizę AMOVA, przedstawiono odpowiednio w tabelach 5 i 6 oraz na rycinie 1. Dyskusja Uzyskane wartości wskaźnika dyskryminacji w obrębie układów i haplotypów są zbliżone do wartości uzyskiwa-

3 ZASTOSOWANIE 16 MARKERÓW Y-STR W POPULACJI POLSKI CENTRALNEJ 97 T a b e l a 1. Charakterystyka i oznaczenia obejmujące zakres badanych markerów zgodne z wytycznymi Komisji DNA Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej [3] T a b l e 1. Characteristics and designations of the range of investigated markers according to the recommendations of the DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics [3] Locus Motyw powtórzeniowy / Repeat motif Oznaczenie GenBank Accession 19 (TAGA) 3 tagg(taga) n AC I (TCTG) 3 (TCTA) n AC II (TCTG) n (TCTA) n N 28 (TCTG) 3 (TCTA) n AC (tcta) 2 (TCTG) n (TCTA) n (TCTG) n (TCTA) n tca(tcta) 2 AC (tctg) 3 (TCTA) n AC (TAT) n AC (AGAT) n AC (TCTA) n (TCTG) 1 3 (TCTA) 4 AC (TTTTC) 1 (TTTTA) 0 1 (TTTTC) n AC (GATA) n AC (AGAGAT) n N 42 (AGAGAT) n AC (AGAT) n AC (GAAA) n AC (TCTA) 4 (TGTA) 2 (TCTA) 2 (TGTA) 2 (TCTA) 2 (TGTA) 0,2 (TCTA) n AC GATAH4 (AGAT) 4 CTAT(AGAT) 2 (AGGT) 3 (AGAT) n N 24 (ATAG) 4 (ATAC) 1 (ATAG) 2 AC (aagg) 6 7 (GAAA) n AC T a b e l a 2. Zakres wielkości alleli i wartość zmienności genowej (GD) wyszczególniona dla każdego z 16 loci Y-STR w badanej populacji z rejonu Polski centralnej T a b l e 2. The allele range and gene diversity values (GD) detailed for each from the 16 Y-STR loci in the investigated population from the central region of Poland Locus Zakres alleli Zakres wielkości (pz) e range Size range (bp) GD ,76 207,09 0, I ,28 164,81 0, II ,38 289,93 0, ,85 223,84 0, ,67 176,03 0, ,38 317,12 0, ,04 131,95 0, ,45 198,07 0, ,68 248,66 0, ,70 221,42 0, ,58 305,51 0, ,51 123,82 0, ,98 151,72 0, ,43 266,56 0,5250 GATAH ,97 146,42 0, ,94 305,06 0,8296 nych w innych populacjach Polski, Europy i świata [9, 11, 13, 15, 16]. Na uwagę zasługuje jednak duża różnica w sile dyskryminacji pomiędzy dwoma sąsiadującymi ze sobą populacjami: łódzką i warszawską, odnotowana w układzie 19, tj. 0,7658 vs 0,4923, co czyni go odpowiednio jednym z najsilniej (Łódź) i jednym z najsłabiej (Warszawa) dyskryminujących układów w zakresie 16 badanych. We wszystkich porównywanych populacjach, zarówno w Polsce, jak i na świecie, najwyższą zmiennością charakteryzuje się bialleliczny locus 385 [9, 10, 11, 12, 13, 14]. Przeszukując bazę danych Yfiler Haplotype Database [17], która jako jedyna uwzględnia zakres 16 analizowanych markerów tj I-389II YGATAH4-385, spośród 11 najczęstszych (nieunikalnych) haplotypów ujawnionych w badanej populacji tylko 3 z nich odnotowano również w populacji kaukaskiej, każdy po jednym razie na 1276 wszystkich haplotypów w bazie. W bazie Y STR Haplotype Reference Database (YHRD) uwzględniającej 8 loci z zakresu minimalnego haplotypu oraz 2 dodatkowe loci z za kre su SWAGDAM, tj I-389II , w obrębie 11 nieunikalnych haplotypów najczęstszą ilość trafień, tj. 59 na ujawniono dla haplotypu /14. Pozostałe najczęściej występujące w badanej populacji haplotypy w ograniczonym zakresie 10 loci odnotowano w bazie YHRD 4 21 razy, przy czym 60%, zgodności ujawniono w innych populacjach Polski, 38,5% w innych poza Polską, kaukaskich populacjach Europy oraz 1,5% w indo-irańskiej populacji Romów (po jednej zgodności haplotypowej w populacji Romów węgierskich oraz w populacji Romów słowackich) [18].

4 98 RENATA JACEWICZ, MACIEJ JĘDRZEJCZYK, KATARZYNA BĄBOL-POKORA i wsp. T a b e l a 3. Częstości alleli w zakresie loci 16 Y-STR dla badanej populacji z rejonu Polski centralnej T a b l e 3. The allele frequencies of the 16 Y-STR loci in the in the investigated population from the central region of Poland 1 2 9,13 0, ,14 0, ,10 0, ,11 0, ,13 0, ,004 10,14 0, ,15 0, ,008 0,016 0,004 11,11 0, ,564 0,020 0,280 0,372 0,008 11,13 0, ,004 0,404 0,704 0,008 0,544 0,360 0,228 11,14 0, ,108 0,020 0,052 0,068 0,152 0,200 0,604 11,15 0, ,032 0,744 0,004 0,140 0,792 0,008 0,060 0,032 0,144 11,16 0, ,216 0,140 0,076 0,120 0,728 0,004 0,116 0,048 0,016 12,14 0, ,252 0,004 0,004 0,008 0,184 0,288 0,284 12,15 0, ,240 0,004 0,084 0,380 0,308 12,18 0, ,256 0,004 0,160 0,260 13,13 0, ,004 0,020 0,024 0,084 13,14 0, ,272 0,016 13,15 0, ,652 0,016 13,17 0, ,004 0,056 0,096 13,18 0, ,080 0,104 14,14 0, ,124 0,668 14,15 0, ,308 0,088 14,16 0, ,448 0,028 15,15 0, ,036 15,16 0, ,004 15,18 0, ,108 15,19 0, ,284 16,17 0, ,384 16,19 0, ,168 16,22 0, ,044 18,18 0, ,008 19,20 0,004 Wysoka zmienność między haplotypami wewnątrz trzech porównywanych polskich populacji (99,87%), w porównaniu do niskiej zmienności pomiędzy populacjami (0,13%), świadczy o homogenności tych populacji (tab. 4). Potwierdza ją analiza AMOVA między trzema polskimi populacjami w obrębie grupy a innymi populacjami: serbską, hiszpańską, portugalską oraz brazylijską i japońską, która świadczy o tym, że w obrębie polskiej populacji występuje kilkakrotnie niższa zmienność niż pomiędzy polską populacją a pozostałymi populacjami Europy i świata. Wartość R ST wynosząca odpowiednio: 0,00006 oraz 0,00224 (p > 0,05) zawarta w tabeli 5, potwierdza brak statystycznie istotnych różnic między populacją badaną a populacją z regionu Polski północno-zachodniej i centralnej [9]. Badana populacja, podobnie jak 2 pozostałe populacje polskie, nie różni się statystycznie znamiennie wyłącznie od populacji hiszpańskiej [11]. Na uwagę zasługuje odmienność badanej populacji od dwu innych populacji europejskich: serbskiej i portugalskiej (R ST = 0,18419; 0,12709) [10, 12]. Największą wartość R ST = 0,35156, obrazującą największą różnicę w rozkładach haplotypów, ujawniło porównanie badanej populacji i populacji Japonii [14]. Analiza graficzna przedstawiona na rycinie 1, oparta na obliczeniach dystansu genetycznego zgodnie z formułą Slatkina, ujawniła, że uzyskany rozkład haplotypów w zakresie 16 loci STR jest zbliżony do innych populacji Polski, a poza Polską najbliższy rozkładowi haplotypów w populacji Hiszpanii. Najodleglejszy dystans genetyczny zaobserwowano w odniesieniu do populacji Japonii [14], co odzwierciedla jej odległy geograficzny i kulturowy dystans od Polski. Wnioski Dla badanego zestawu 16 markerów Y-STR uzyskano wysoką wartość różnorodności genowej (GD) oraz haplotypowej (HD), co daje niskie prawdopodobieństwo przypadkowego powtórzenia się haplotypu i wysoką siłę dyskryminacji tego zestawu markerów. Ujawnione wysokie

5 ZASTOSOWANIE 16 MARKERÓW Y-STR W POPULACJI POLSKI CENTRALNEJ 99 T a b e l a 4. Liczebności alleli w zakresie loci 16 Y-STR dla badanej populacji z rejonu Polski centralnej T a b l e 4. The allele number of the 16 Y-STR loci in the in the investigated population from the central region of Poland 1 2 9, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,20 1 T a b e l a 5. Rezultaty analizy molekularnej wariancji (AMOVA) T a b l e 5. The results of the analysis of the molecular variance (AMOVA) Porównywane populacje Compared populations Łódź vs. Szczecin vs. Warszawa Lodz vs. Szczecin vs. Warsaw Łódź, Warszawa, Szczecin (grupa) vs. Serbia vs. Hiszpania, vs. Portugalia, vs. Japonia, vs. Brazylia Lodz, Warsaw, Szczecin (group) vs. Serbia vs. Spain, vs. Portugal, vs. Japan, vs. Brasil Źródło wariancji Source of variation Pomiędzy populacjami Among populations W obrębie populacji Within population Pomiędzy grupami Among groups Pomiędzy populacjami w grupie Among populations within groups W obrębie populacji Within populations Wariancja (%) Variance (%) 0,13 99,87 1,51 0,39 98,88 wskaźniki zmienności, jak i męska specyficzność badanego zestawu markerów, warunkują ich wysoką przydatność w analizach z zakresu genetyki sądowej. Uzyskane dane populacyjne posłużą do opracowania bazy danych do obliczeń wartości dowodowej ekspertyz. Przeprowadzone porównanie międzypopulacyjne wykazało homogenność w obrębie 3 polskich populacji i zobrazowało rosnący dystans genetyczny dzielący badaną populację od populacji serbskiej, hiszpańskiej, portugalskiej, brazylijskiej i japońskiej. Piśmiennictwo 1. Butler J.M., Schoske R., Vallone P.M., Kline M.C., Redd A.J., Hammer M.F.: A novel multiplex for simultaneous amplification of 20 Y chromosome STR markers. Forensic Sci. Int. 2002, 129, Roewer L., Kayser M., de Knijff P., Anslinger K., Betz A., Caglià A. et al.: A new method for evaluation of matches in non-recombining genomes:

6 100 RENATA JACEWICZ, MACIEJ JĘDRZEJCZYK, KATARZYNA BĄBOL-POKORA i wsp. T a b e l a 6. Dystans genetyczny oparty na wartościach R st dla każdej pary z 8 porównywanych populacji. Statystycznie znamienne różnice (p < 0,05) zaznaczono wytłuszczonym drukiem T a b l e 6. Genetic distance matrix based upon pairwise R st values for each of the sets of 8 compared populations. Statistically significant differences (p < 0.05) are marked in bold Porównywane populacje Łódź Warszawa Hiszpania Portugalia Japonia Szczecin Serbia Compared populations Lodz Warsaw Spain Portugal Japan Szczecin 0,00451 Warszawa Warsaw 0, ,00006 Serbia 0, , ,01580 Hiszpania Spain 0, , , ,00622 Portugalia Portugal 0, , , , ,00312 Japonia Japan 0, , , , , ,11486 Brazylia Brasil 0, , , , , , ,02531 Ryc. 1. Drzewo filogenetyczne dla haplotypów chromosomu Y skonstruowane w oparciu o dystans Slatkina obliczony dla populacji badanej oraz innych populacji Polski, Europy, Ameryki i Azji Fig. 1. Phylogenetic tree of the Y-chromosome haplotypes constructed from Slatkin s distance estimated for the investigated population and other Polish, European, American and Asian populations application to Y-chromosomal short tandem repeat (STR) haplotypes in European males. Forensic Sci. Int. 2000, 114, Gusmao L., Butler J.M., Carracedo A., Gill P., Kayser M., Mayr W.R. et al.: DNA Commission of International Society of Forensic Genetics (ISFG): an update of recommendations on the use of Y-STRs in forensic analysis. Forensic Sci. Int. 2006, 157, Schneider S., Kueffer J.M., Roessli D., Excoffier L. : Arlequin version 2.0: a software for population genetic data analysis, Genetics and Biometry Laboratory. University of Geneva, Geneva Slatkin M. : A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequency. Genetics, 1995, 139, Lewis P.O., Zaykin D. : Data Analysis: Computer program for the analysis of allelic data, Version 1.1, 2003 ( lewishome/sofwtware.html). 7. RodPage s Home Page ( html). 8. Nei M. : Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 197, 889,

7 ZASTOSOWANIE 16 MARKERÓW Y-STR W POPULACJI POLSKI CENTRALNEJ Sołtyszewski I., Pepinski W., Spolnicka M., Kartasinska E., Konarzewska M., Janica J.: Y-chromosomal haplotypes for the AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit in a population sample from Central Poland. Forensic Sci. Int. 2007, 168, Veselinovic I.S., Zgonjanin D.M., Maletin M.P., Stojkovic O., Djurendic- Brenesel M., Vukovic R.M. et al.: e frequencies and population data for 17 Y-chromosome STR loci in a Serbian population sample from Vojvodina province. Forensic Sci. Int. 2008, 176 (2-3), Sanchez C., Barrot C., Xifro A., Ortega M., Gomez de Aranda I., Huguet E. et al.: Haplotype frequencies of 16 Y-chromosome STR loci in the Barcelona metropolitan area population using Y-Filer TM kit, Forensic Sci. Int. 2007, 172, Alves C., Gomes V., Joao Prata M., Amorim A., Gusmao L. : Population data for Y-chromosome haplotypes defined by 17 STRs (AmpFlSTR YFiler) in Portugal, Forensic Sci. Int. 2007, 171, Pereira R.W., Monteiro E.H.G., Hirschfeld G.C.R., Wang A.Y., Grattapaglia D.: Haplotype diversity of 17 Y-chromosome STRs in Brazilians. Forensic Sci. Int. 2007, 171, Hara M., Kido A., Takada A., Adachi N., Saito K. : Genetic data for 16 Y-chromosomal STR loci in Japanese. J. Legal Med. 2007, 9, 2007, Pontes M.L., Caine L., Abrantes D., Lima G., Pinheiro M.F. : e frequencies and population data for 17 Y-STR loci(ampflstr Y-filer TM ) in a Northern Portuguese population sample. Forensic Sci. Int. 2007, 170, Long K.Li, Kai L., Yuming M. : Y chromosome STR haplotypes of Tibetan Living Tibet Lassa. Forensic Sci. Int. 2007, 172, Applied Biosystems, Yfiler Haplotype Database ( YHRD, Y STR Haplotype Reference Database (