ROZPRAWA DOKTORSKA. Wpływ nowych bisfosfonianów na przebieg eksperymentalnie wywołanej osteoporozy u owiec.

Transkrypt

1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Biostruktury i Fizjologii Zwierząt Zakład Histologii i Embriologii mgr Ewa Mytnik ROZPRAWA DOKTORSKA Wpływ nowych bisfosfonianów na przebieg eksperymentalnie wywołanej osteoporozy u owiec. Promotor: prof. dr hab. Jan Kuryszko Wrocław 2012

2 Podziękowania W chwili zakończenia projektu mojej pracy doktorskiej pragnę podziękować osobom, które w sposób szczególny przyczyniły się do jej powstania, służąc zainteresowaniem, zaangażowaniem, pomocą, a przede wszystkim wsparciem w tym niełatwym przedsięwzięciu. Jako pierwsze kieruję swoje podziękowania do prof. dr hab. Jana Kuryszki, mojego promotora. Jestem Mu wdzięczna przede wszystkim za poświęcony czas oraz nieocenione, pełne profesjonalizmu rady. Rady dotyczące nie tylko prowadzonych przeze mnie badań, lecz również problemów, z jakimi boryka się na co dzień początkujący dydaktyk. Swoim nastawieniem prof. Kuryszko sprawił, że te cztery pracowicie spędzone lata były dla mnie również przygodą i mam nadzieję, że zebrane podczas niej doświadczenia owocować będą latami. Jego niezmierna wyrozumiałość dla mojego temperamentu pomogła mi również przetrwać trudne przeżycia osobiste, wymagające czasu oraz spokoju. Szczególnie wdzięczna Mu jestem za przyjacielskie nastawienie oraz pełną zrozumienia relację, jaką udało nam się wypracować i nieraz potwierdzić interesującymi rozmowami przy kawie. Z równą serdecznością dziękuję moim starszym Koleżankom, dr Katarzynie Kalecie-Kuratewicz oraz dr Violetcie Kapuśniak. Pierwszej z nich za to, że służyła nieocenionym wsparciem podczas prac laboratoryjnych, poświęcając swój czas na doskonalenie moich działań oraz nauczenie metod. Uwaga, jaką poświęciła na śledzenie moich postępów oraz ich weryfikację, bezsprzecznie przyczyniła się do obecnego kształtu mojej dysertacji. Pani dr Violetcie Kapuśniak wdzięczna jestem natomiast za pomoc w stawaniu się dobrym dydaktykiem, wsparcie w przygotowaniu się do zajęć oraz wszystkie udostępnione autorskie pomoce naukowe, które ułatwiły mi mierzenie się z trudnym zawodem nauczyciela akademickiego. Jej wsparcie pomogło mi przezwyciężyć zarówno chwile zwątpienia we własne siły, jak i trudny czas w życiu osobistym. Wspomnienia naszych pogawędek na różne tematy przywoływać będę z największą przyjemnością. Kluczową rolę w mojej czteroletniej pracy odegrał dr Jan P. Madej. Dziękuję Mu przede wszystkim za pomoc w przygotowaniu jednej z najważniejszych części mojej dysertacji, co wymagało od niego dużego nakładu czasu. To bardzo dobry Kolega, zawsze służący pomocą i wyrozumiały. Bez Jego wsparcia prowadzone przeze mnie zajęcia nie byłyby tak ciekawe i atrakcyjne dla młodszego pokolenia studentów. Wdzięczna Mu jestem również za ratunek w kryzysowych sytuacjach zawodowych, szczególnie tych wymagających odpowiedniego obchodzenia się z mikroskopem. Dziękuję Państwu serdecznie za pomoc i wsparcie, które przyczyniły się do sukcesu tego przedsięwzięcia. Zaczerpnięta od Was wiedza zaowocowała pracą, której tworzenie było dla mnie prawdziwą radością. mgr Ewa Mytnik

3 Spis treści 1. WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW I SYMBOLI WSTĘP WPROWADZENIE OSTEOPOROZA DIAGNOSTYKA OSTEOPOROZY LECZENIE FARMAKOLOGICZNE OSTEOPOROZY OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA BISFOSFONIANÓW STRUKTURA CHEMICZNA BISFOSFONIANÓW MOLEKULARNY MECHANIZM DZIAŁANIA BISFOSFONIANÓW ROLA BISFOSFONIANÓW W PRAKTYCE KLINICZNEJ STRUKTURA TKANKI KOSTNEJ A OSTEOPOROZA KOMÓRKI KOŚCI POZAKOMÓRKOWE KOMPONENTY TKANKI KOSTNEJ RODZAJE TKANKI KOSTNEJ PROCES PRZEBUDOWY KOŚCI PODSUMOWANIE CEL PRACY MATERIAŁY I METODY PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ MORFOLOGICZNYCH WYNIKI ŻUCHWY KOŚĆ PISZCZELOWA ANALIZA HISTOLOGICZNA GRUPA KONTROLNA NEGATYWNA (PN) GRUPA KONTROLNA POZYTYWNA (PP) GRUPA BADANA ED GRUPA BADANA ED ANALIZA STATYSTYCZNA OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUJA

4 7. WNIOSKI LITERATURA TABLICE

5 1. WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW I SYMBOLI ATP - adenozynotrifosforan b-alp - frakcja kostna alkalicznej fosfatazy (ang. bone alkaline phosphatase) BMD - mineralna gęstość kości (ang. bone mineral density) CORE - badania CORE (ang. Continued Outcomes Relevant to Evista) CSF - rodzaj cytokiny homeopoetycznej CTX - C-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (ang. collage type I crosslinked C-telopeptide). DHEA - dehydroepiandrosteron DNA - kwas deoksyrybonukleinowy DPD - dezoksypirydynolina DEXA - absorpcjometria podwójnej energii promieniowania rentgenowskiego (ang. dual energy X-ray absorptometry) ER - receptor androgenowy (ang. estrogen receptor) FPP - pirofosforan farnezylu GGPP - difosforan geranylogeranylu GK - glikokortykosteroidy HTZ - hormonalna terapia zastępcza (ang. hormone replacement therapy HRT) IGF - insulinopodobny czynnik wzrostu (ang. insulin-like growth factor) IL - interleukina INF-γ - interferon-gamma LH - hormon luteinizujący (ang. luteinizing hormone) MORE - badania MORE (ang. Multiple Outcomes of Raloxifene Evaluation) NFO - Narodowa Fundacja Osteoporozy (ang. National Osteoporosis Fundation) NIH - Narodowy Instytut Zdrowia (ang. National Institutes of Health) NTX - N-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (ang. collage type I crosslinked N-telopeptide), OC - osteokalcyna PBM - szczytowa masa kostna (ang. peak bone mass) PINP - N-końcowy peptyd pro kolagenu typu I (ang. procollagen I amino terminal propeptide) PPi - pirofosforan PTH - parathormon 5

6 PYD - pirydynolina QCT - ilościowa tomografia komputerowa (ang. Quantitative Computer Tomography) QUS - ilościowa ultrasonografia (ang. Quantitative Ultrasonography) RNA - kwas rybonukleinowy RTG - technika obrazowania wykorzystująca promieniowanie rentgenowskie SARM - selektywne modulatory receptorów androgenowych (ang. selective androgen receptor modulator) SERM - selektywne modulatory receptorów estrogenowych (ang. selective estrogen receptor modulators) SD - liczba odchyleń standardowych (ang. standard deviation) TGF-α - transformujący czynnik wzrostowy-α TNF-α - czynniki martwicy nowotworu-alfa T-score - stosunek gęstości mineralnej kości osoby badanej do średniej gęstości kości osoby młodej WHO - Światowa Organizacja Zdrowia (ang. World Health Organisation) Z-score - przedstawia jak bardzo gęstość mineralne kości osoby badanej różni się od przeciętnej gęstości mineralnej kości osoby w tym samym wieku 1,25(OH) 2 D 3-1,25-dihydroksywitamina D 3 1,25 (OH) 2 D - 1,25-dihydroksycholekalcyferol Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 hydroksyapatyt 6

7 2. WSTĘP 2.1. Wprowadzenie Osteoporoza charakteryzuje się redukcją masy kostnej oraz zaburzeniami mikroarchitektury tkanki kostnej. Zmiany te powodują zmniejszenie wytrzymałości kości, a także zwiększają ryzyko wystąpienia złamań zarówno kości długich, jak i kręgów. Najbardziej narażone na złamania są: szyjka kości udowej, kości nadgarstka, kości miednicy, oraz kręgi odcinka lędźwiowego kręgosłupa. Zagrożenie wystąpienia choroby wzrasta z wiekiem (29, 111). Do złamań dochodzi bez przyczyny bądź przy małych urazach, które dla zdrowej kości nie stanowią istotnego zagrożenia. Osteoporoza i związane z nią złamania stanowią znaczącą przyczynę zachorowalności i śmiertelności w starzejącej się populacji (5). Oblicza się, że tylko 25% chorych wraca do zdrowia po złamaniu szyjki kości udowej, ponad 50% wymaga opieki, w tym 20% stałej pielęgnacji. Śmiertelność w ciągu roku dochodzi do 40% (147). Kompresyjne złamanie kręgów, które jest charakterystycznym objawem osteoporozy, powoduje przewlekły i uporczywy ból, obniżenie wzrostu i jest zwiastunem złamania szyjki kości udowej. Częstość złamań kręgosłupa u kobiet wzrasta po 45 roku życia, co związane jest z okresem menopauzy, a u mężczyzn po 65 roku życia na skutek andropauzy (68, 147). Osteoporoza we wczesnych fazach rozwoju przez wiele lat przebiega bezobjawowo. Bardzo częstym pierwszym objawem jest złamanie i wówczas choroba jest już w zaawansowanym stadium. Do najczęściej występujących objawów osteoporozy zaliczamy: bóle kręgosłupa w odcinku piersiowym, krzyżowym i między łopatkami oraz zmiany zwyrodnieniowe i złamania kręgów, a także wspomniane już złamania kości długich (166). Dwoma najważniejszymi czynnikami w rozwoju i zapobieganiu osteoporozy są: szczytowa masa kostna (PBM ang. peak bone mass) oraz tempo utraty masy kostnej po osiągnięciu wartości PBM. Maksymalna masa kostna jest czynnikiem indywidualnym dla każdego osobnika i zostaje osiągnięta pomiędzy 25 a 35 rokiem życia, podczas gdy maksymalna mineralna gęstość kości (BMD ang. bone mineral density) może być osiągnięta przed 20 rokiem życia (64). Po osiągnięciu maksymalnej masy kostnej tempo osteogenezy pozostaje stałe, natomiast tempo osteoresorpcji ulega przyspieszeniu. Po 40 roku życia mężczyźni tracą 0,5-0,75% masy kostnej rocznie, a kobiety 1,5-2%. Tempo utraty masy kostnej wzrasta 7

8 dramatycznie w okresie menopauzy, a także po jej zakończeniu. Szacuje się, że utrata masy kostnej w przeciągu pierwszych 5 lat po okresie menopauzy wynosi 11% i dodatkowo kolejne 5% w ciągu następnych 20 lat. Inne badania podają, że utrata masy kostnej po okresie menopauzy wynosi 3-5% rocznie przez kolejne lat (64). Osteoporoza jako choroba cywilizacyjna, będąca przyczyną dużej śmiertelności populacji starzejącej, stała się jednym z priorytetów współczesnej medycyny, która poszukuje skutecznych terapeutyków przeciwko chorobie. Leczenie osteoporozy polega głównie na zapobieganiu złamaniom oraz zwiększeniu masy kostnej i wytrzymałości kości (145). W leczeniu stosuje się leki antyresorpcyjne, anaboliczne, a także leki o mieszanym mechanizmie działania (77). Najbardziej obiecujące efekty przynosi leczenie bisfosfonianami, które znane są chemikom od XIX wieku, a ich pierwsze syntezy datuje się na rok Są to chemicznie stabilne analogi nieorganicznych pirofosforanów, w których mostek tlenowy P-O-P został zastąpiony przez atom węgla. Bisfosfoniany używane były w przemyśle tekstylnym, nawozowym i olejowym, a obecnie są wykorzystywane jako inhibitory korozji czy zmiękczacze wody (12). Badania ostatnich 30 lat wykazały ich aktywność biologiczną. Obecnie stanowią ważną klasę związków chemicznych stosowanych w leczeniu chorób przebiegających z upośledzeniem metabolizmu wapnia, w tym osteoporozy. Różnorodność dziedzin zastosowania bisfosfonianów, relatywnie niski koszt produkcji oraz odkrywanie nowych bardziej aktywnych związków jest przyczyną rozwoju badań nad ich zastosowaniem Osteoporoza Definicja osteoporozy ewoluowała przez lata. W pierwszych etapach badań nad tą chorobą rozpoznanie złamań stanowiło diagnozę choroby. Obecne rozumienie problemu choroby spowodowało zmiany w jej definiowaniu (84). Pierwsza definicja osteoporozy stanowiła, że jest to systemowa choroba szkieletu, charakteryzująca się niską masą kostną i zaburzeniami mikroarchitektury tkanki kostnej, czego konsekwencją jest spadek wytrzymałości kości i podatność na złamania (26). W 2000 roku Narodowy Instytut Zdrowia (NIH - ang. National Institutes of Health) oraz Narodowa Fundacja Osteoporozy (NFO - ang. National Osteoporosis Fundation) zaproponowały nową definicję choroby. Osteoporoza jest układową chorobą 8

9 szkieletu, charakteryzującą się zmniejszeniem masy kostnej i zaburzeniem jej mikroarchitektury, skutkującą zmniejszoną wytrzymałością prowadzącą do zwiększenia ryzyka wystąpienia złamań (106). Od 1997 roku osteoporoza uważana jest przez Światową Organizację Zdrowia (WHO - ang. World Health Organisation) za chorobę cywilizacyjną. Ryc. 1. Architektura kości: A zdrowej, B osteoporotycznej wg Bone density test: Measure your risk of osteoporosis, Mayo Fondation for Medical Education and Research. Wyróżniamy dwa podstawowe typy osteoporozy: pierwotną i wtórną. Do osteoporozy pierwotnej zaliczamy osteoporozę idiopatyczną (młodzieńczą i dorosłą), a także osteoporozę typu I (pomenopauzalną) i typu II (starczą). Osteoporoza wtórna związana jest z przebiegiem innych chorób (64). Osteoporoza idiopatyczna jest chorobą o nieznanej etiologii, występującą zarówno u osobników płci żeńskiej przed okresem menopauzy, jak i u dzieci i młodych dorosłych płci męskiej z prawidłowo funkcjonującymi gonadami (146). Osteoporoza dziecięca występuje zazwyczaj przed okresem pokwitania (8-14 lat) i w fazie ostrej przebiega przez około 2-4 lata podczas, których zahamowany zostaje wzrost szkieletu. Do wielokrotnych złamań dochodzi zarówno w przypadku kręgów, jak i kości kończyn. Przebieg choroby może być łagodny i dotyczyć tylko jednego czy dwóch kręgów lub może być ostry i skutkować całkowitą deformacją wszystkich kręgów odcinka 9

10 lędźwiowego i piersiowego, doprowadzając do wielokrotnych złamań kręgosłupa. Okres remisji następuje spontanicznie i przebiega ze wznowieniem wzrostu szkieletu. Stąd też głównym zadaniem medycyny jest ochrona szkieletu do momentu wystąpienia zjawiska remisji (53). W przypadku młodych dorosłych choroba dotyka osoby między 30 a 50 rokiem życia i dotyczy szkieletu osiowego oraz złamań kręgów (5). Typ I osteoporozy, szeroko opisywany w literaturze, dotyczy kobiet w okresie pomenopauzalnym i stanowi 80% wszystkich rodzajów osteoporozy inwolucyjnej. Powodem wystąpienia choroby jest spadek hormonów płciowych, który towarzyszy procesowi przekwitania. Idea, twierdząca że spadek estrogenów jest głównym powodem wystąpienia osteoporozy, pojawiła się na skutek obserwacji faktu, że pomenopauzalne kobiety, u których naturalnie spada ilość tych hormonów, są bardziej narażone na wystąpienie choroby. Badania morfologiczne i pomiar markerów biochemicznych obrotu kostnego wykazały, że przebudowa kości jest przyspieszona podczas menopauzy (43, 113) i utrzymuje się na wysokim poziomie przez wiele lat (83). Obniżony poziom estrogenów jest przyczyną wzmożonej osteoresorpcji szczególnie u kobiet po 70 roku życia. Dowodem na potwierdzenie tej hipotezy są badania wskazujące, że leczenie estrogenami w krótkim czasie obniża ryzyko wystąpienia złamań (117), które jest odwrotnie proporcjonalne do poziomu estrogenów u kobiet po menopauzie. Typowa dla tego typu osteoporozy jest wybiórcza utrata masy kostnej, która dotyczy przede wszystkim kości gąbczastej, w tym głównie kręgów. Metabolicznie mniej aktywna kość zbita jest rzadziej narażona na osteoresorpcję (146). Utrata masy kostnej w przypadku kości gąbczastej może wynosić nawet 7% rocznie w ciągu pierwszych 5 lat po menopauzie. Poziom estrogenów u kobiet pomenopauzalnych, zarówno tych, u których wystąpiła osteoporoza, jak i zdrowych, jest porównywalny. Z tego powodu wysnuto hipotezę, iż prócz spadku poziomu estrogenów istotne są także inne czynniki, jak dieta uboga w wapń czy brak aktywności fizycznej (64). Typ II osteoporozy występuje zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet powyżej 70 roku życia. W przeciwieństwie do typu I dotyka zarówno kość gąbczastą, jak i zbitą. Wraz z wiekiem ilość osteoblastów zmniejsza się, co być może jest wynikiem spadku poziomu hormonu wzrostu, który stymulując produkcję insulinopodobnego czynnika wzrostu IGF-1 (ang. insulin-like growth factor), wpływa na proces mitogenezy i aktywację tych komórek (124). Za główną przyczynę osteoporozy typu II uznaje się 10

11 spadek aktywności nerkowej 1-alfa- hydroksylazy z następowym obniżeniem syntezy 1,25-dihydroksywitaminy D 3 (1,25(OH) 2 D 3 ), co prowadzi do upośledzonego wchłaniania wapnia, wtórnej nadczynności przytarczyc i wzmożonej resorpcji kości przy jednoczesnym wolniejszym procesie osteogenezy (64). Osteoporoza wtórna towarzyszy innym chorobom lub jest ich skutkiem. Wyróżniamy tu: osteoporozę posterydową, związaną z nadczynnością przytarczyc, spowodowaną zespołem złego wchłaniania, niedoborem witaminy C i D, długim unieruchomieniem, przewlekłym leczeniem heparyną, nadużywaniem alkoholu i nikotyny (101). Przyczyny osteoporozy są różne w konkretnych przypadkach, jednak choroba ta zawsze polega na zachwianiu równowagi pomiędzy aktywnością czynników stymulujących tworzenie kości oraz czynników pobudzających resorpcję. Stymulatory osteogenezy to: estrogeny androgeny kalcytonina insulinopodobne czynniki wzrostowe (IGF-1, IGF-2) interferon-gamma (INF-γ) prostanoidy siły mechaniczne parathormon Stymulatory osteoresorpcji to: 1,25-dihydroksywitamina D 3 (1,25(OH) 2 D 3 ) hormony tarczycy glikokortykosteroidy czynnik martwicy nowotworu-alfa (TNF-α) transformujący czynnik wzrostowy-α (TGF-α) wolne rodniki tlenowe unieruchomienie 11

12 Do najczęstszych chorób powodujących osteoporozę należy hiperkalciuria, będąca rezultatem pierwotnej nadczynności przytarczyc. Wzrost kalciurii spowodowany jest nadmierną syntezą parathormonu (PTH), prowadzącą do hiperkalcemii, hipofosfatemii oraz wzrostu biosyntezy 1,25(OH) 2 D 3. Ten typ hiperkalciurii nazywa się resorpcyjnym. Ubytek masy kostnej jest wczesnym objawem choroby, ale wzrost ryzyka złamań z tego powodu jest niewielki. Hiperkalciuria idiopatyczna jest chorobą heterogenną. Z jednej strony może być spowodowana zmniejszeniem wchłaniania wapnia w nerkach (typ nerkowy), z drugiej zaś wzmożonym wchłanianiem wapnia z przewodu pokarmowego (typ absorpcyjny). W hiperkalciurii nerkowej występującej najczęściej rozwija się hipokalcemia pobudzająca sekrecję PTH. Parathormon, zwiększając mobilizację wapnia w kościach, biosyntezę aktywnych metabolitów witaminy D w nerkach, przywraca normokalcemię. U takich chorych obserwuje się normokalcemię, hipofosfatemię, wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej i tendencję do zmniejszania się masy tkanki kostnej. Nerkowa utrata wapnia związana jest z większą utratą masy kości zbitej niż gąbczastej. Hiperkalciuria może być również następstwem działania niektórych leków, jak diuretyki pętlowe, kalcytoniny, alkoholu, a także nieprawidłowego żywienia, polegającego na nadmiernej podaży białek, niedoborze fosforu, głodzeniu czy żywieniu pozajelitowym (118). Także choroby przewodu pokarmowego mogą stać się przyczyną zaburzenia wchłaniania witaminy D, wapnia i innych minerałów, skutkując zwiększeniem ryzyka wystąpienia osteoporozy (118). Inne choroby, które zwiększają ryzyko wystąpienia osteoporozy, to: reumatoidalne zapalenie stawów oraz choroby autoimmunologiczne tkanek łącznych, zaburzenia endokrynne: nadczynność kory nadnerczy, tarczycy, przytarczyc, cukrzyca typu I i II, anoreksja, bulimia, szpiczak mnogi, przerzuty nowotworowe do kości, przeszczepy narządów wewnętrznych (46). Nie tylko choroby, ale także leki mogą stać się przyczyną wystąpienia osteoporozy. Do najbardziej niebezpiecznych dla tkanki kostnej leków należą glikokortykosteroidy (GK), których główne działanie polega na zahamowaniu procesu kościotworzenia. Nawet niewielkie dawki tych związków hamują proliferacje i dojrzewanie osteoblastów, a także skracają czas przeżycia tych komórek. Konsekwencją jest zmniejszenie liczby komórek kościotwórczych. Efektem bezpośredniego działania GK na osteoblasty jest między innymi zahamowanie syntezy 12

13 kolagenu typu I i osteokalcyny, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia produkcji macierzy tkanki kostnej. Jednocześnie GK zwiększają ekspresję kolagenazy-3, enzymu powodującego degradację kolagenu typu I i II, co dodatkowo zmniejsza ilość macierzy tkanki kostnej. Glikokortkosteroidy nasilają proces resorpcji kości, powodując niedobór estrogenów, testosteronu i androgenów nadnerczowych, będący następstwem hamującego wpływu GK na czynność wydzielniczą komórek gonadotropowych i adrenokortykotropowych przysadki. Związki te nasilają również apoptozę osteocytów (48). Wśród innych leków mogących przyczynić się do wystąpienia choroby znajdują się: leki immunosupresyjne, cytotoksyczne, przeciwpadaczkowe, inhibitory aromatazy czy długotrwale stosowana heparyna Kolejnym czynnikiem mogącym być przyczyną wystąpienia osteoporozy jest długotrwałe unieruchomienie. Trzytygodniowe unieruchomienie powoduje zwiększenie resorpcji tkanki kostnej i zmniejszenie jej mineralizacji. Sześciomiesięczne unieruchomienie może spowodować utratę masy kostnej nawet o 33% (118). Osteoporoza wtórna może być także skutkiem nadużywania alkoholu i palenia papierosów. Nadużywanie alkoholu powoduje znaczne zmniejszenie gęstości mineralnej kości i zwiększa ryzyko wystąpienia złamań. Obserwuje się zmniejszenie ilości białek macierzy kostnej nawet o 30%, zmniejszenie liczby beleczek kostnych oraz ilości i aktywności metabolicznej osteoblastów. Obniżona jest także zdolność przyswajania wapnia. U mężczyzn nadużywających alkohol wykazano istotnie mniejsze stężenie testosteronu i zanik jąder. Badania in vitro wykazały bezpośredni, toksyczny wpływ etanolu na osteoblasty (118). Ponad 30 lat palenia 20 papierosów dziennie zwiększa ponad dwukrotnie ryzyko wystąpienia złamań w obrębie kręgosłupa. Efekt ten jest niezależny od innych czynników ryzyka. Gęstość mineralna kości wykazuje korelację z liczbą wypalanych papierosów i czasem trwania nałogu. Wykazano bezpośredni toksyczny wpływ substancji smolistych na osteoblasty. Dodatkowym czynnikiem ryzyka u palaczy jest istotnie mniejsza ilość tkanki tłuszczowej, zwłaszcza trzewnej, a zatem mniejsza liczba adipocytów. U mężczyzn powoduje to zmniejszenie aromatyzacji testosteronu do estradiolu i w konsekwencji pogłębia ryzyko wystąpienia osteoporozy (118). Jednym z istotnych czynników zwiększających ryzyko wystąpienia osteoporozy są predyspozycje genetyczne. Według dzisiejszego stanu wiedzy ryzyko zachorowania 13

14 na osteoporozę w rodzinach, w których ta choroba już wcześniej wystąpiła, jest znacznie wyższe niż w tych, w których jej uprzednio nie odnotowano. Istnieją dwie teorie na temat dziedziczenia choroby. Pierwsza z nich mówi o tym, że nie dziedziczy się osteoporozy, lecz tylko pewne skłonności, które mogą prowadzić do zachorowania, natomiast druga utrzymuje, że istnieją geny odpowiedzialne za osteoporozę, ale trudno jest je zidentyfikować. Najprawdopodobniej należy do nich gen sterujący syntezą receptora witaminy D, receptora estrogenowego, geny kolagenu typu I i geny kolagenazy. Niezależnie od obu koncepcji, łatwo zauważyć rodzinne występowanie osteoporozy (166). Czynnikami ryzyka jest także wiek, płeć, rasa i budowa ciała. Im człowiek starszy, tym prawdopodobieństwo wystąpienia choroby jest większe. Wiąże się to z fizjologicznym zaburzeniem równowagi pomiędzy procesami kościotworzenia a resorpcją tkanki kostnej. Najbardziej narażoną grupą wiekową, bez względu na płeć, są osoby powyżej 65 roku życia. Osteoporoza znacznie częściej występuje u kobiet niż u mężczyzn. Związane jest to z wcześniejszym występowaniem menopauzy niż andropauzy i skorelowanym z tym spadkiem poziomu hormonów płciowych. Zauważono, że znacznie częściej chorują osoby rasy białej i żółtej niż przedstawiciele rasy czarnej. Na rozwój choroby ma również wpływ masa ciała. Osoby o niskiej masie, drobnych kościach są znacznie bardziej narażone na wystąpienie u nich osteoporozy (106). Chociaż osteoporoza występuje głównie u kobiet, to jednak badania wykazały, że jest ona także elementem starzenia się mężczyzn (68, 69, 72). Pomimo że złamania osteoporotyczne występują rzadziej u mężczyzn niż u kobiet, to stanowią one wiodącą przyczynę zachorowalności i śmiertelności starzejących się mężczyzn (20, 116). Podobnie jak w przypadku kobiet, u mężczyzn spadek poziomu hormonów płciowych może warunkować zaistnienie osteoporozy. Niedobór testosteronu może prowadzić do złamań kości długich i kręgów. U mężczyzn za utrzymanie masy kostnej odpowiadają hormony płciowe: testosteron i estrogeny. W wyniku starzenia się poziom obu spada poniżej połowy wartości stwierdzanej u młodych mężczyzn, co powoduje utratę masy kostnej i spadek jej wytrzymałości (75, 125). Z upływem lat dochodzi u mężczyzn do obniżenia aktywności osi podwzgórze przysadka gonady, co powoduje zmniejszenie stężenia testosteronu. Wykazano związek stężenia testosteronu z gęstością mineralną 14

15 kości zarówno gąbczastej, jak i zbitej. Aż u 70% mężczyzn, którzy przeszli złamanie biodra i u 20% ze złamaniami kompresyjnymi kręgów stwierdzono niedobór testosteronu. U chorych leczonych glikokortykoidami stwierdza się nie tylko ujemny wpływ steroidów na gęstość kości, ale także obniżenie wydzielania androgenów w wyniku hamowania aktywności przysadki (spadek poziomu LH) oraz bezpośredniego hamowania syntezy testosteronu przez komórki gruczołu śródmiąższowego jąder. U około 20-30% mężczyzn po 70 roku życia obserwuje się zmniejszenie wydzielania testosteronu, będące wynikiem starzenia się. Niedobór testosteronu pogłębia ujemny bilans wapniowy i zmniejsza poziom aktywnych metabolitów witaminy D. Od pewnego czasu pojawiają się publikacje, w których podkreśla się rolę estrogenów w patogenezie osteoporozy u mężczyzn. U chorych z niedoborem aromatazy (brak aromatyzacji testosteronu do estradiolu) stwierdza się niską maksymalną masę kości. Również andropauza charakteryzuje się względnym obniżeniem stężenia estradiolu. Wydaje się, że prawidłowe stężenie estradiolu u mężczyzn jest niezbędne do uzyskania dużej masy kostnej, przy czym również u mężczyzn w starszym wieku estrogeny odgrywają ważną rolę w metabolizmie kostnym. Suplementacyjne leczenie dehydroepiandrosteronem (DHEA) wpływa korzystnie na gęstość mineralną kości u mężczyzn. Podczas wyrównywania niedoboru DHEA u mężczyzn dochodzi do wzrostu poziomu estradiolu, co może pośrednio mieć korzystny wpływ na masę kostną (98). Istotnym czynnikiem mogącym wywołać osteoporozę u mężczyzn jest hipogonadyzm. Androgeny poprzez receptory znajdujące się w błonie komórkowej osteoblastów wpływają na różnicowanie, proliferację oraz czynność metaboliczną tych komórek. Przy wystąpieniu hipogonadyzmu przedpokwitaniowego u chłopców nie dochodzi do osiągnięcia szczytowej masy kostnej mimo wysokiego wzrostu, w porównaniu do osób zdrowych w tym samym wieku. Również w zespole Klinefeltera i zespole Kalmana obserwuje się znaczne zmniejszenie masy kostnej. W przypadku hipogonadyzmu popokwitaniowego dochodzi do preferencyjnej utraty masy kości gąbczastej, a tempo tych zmian jest proporcjonalne do stopnia zaawansowania dysfunkcji jąder i czasu jej trwania. Ten typ hipogonadyzmu nasila się zwykle w przypadku niewydolności nerek i kortykoterapii (118). 15

16 Diagnostyka osteoporozy Odczuwalne lub widoczne objawy osteoporozy, takie jak: bóle pleców, zmniejszenie wzrostu, zniekształcenie sylwetki czy też złamania pojawiają się dopiero w zaawansowanej fazie choroby. Zanim to jednak nastąpi, ubytek masy kostnej postępuje powoli i nieubłagalnie bez ostrzeżenia. Badaniem pozwalającym na wczesne wykrywanie zmian zachodzących w tkance kostnej jest densytometria techniką DEXA (ang. Dual Energy X-ray Absorptiometry), która zalecana jest przez WHO. Badanie to pozwala na wiarygodną ocenę gęstości mineralnej kości (BMD) i cechuje się dużą precyzją, pozwalając na określenie kilkuprocentowych zmian ilości masy kostnej. Pomiar densytometryczny pozwala na rozpoznanie osteoporozy nawet przy braku złamań oraz oszacowanie indywidualnego ryzyka złamań. Wynikiem badania są dwa parametry: Z-score i T-score. Z-score przedstawia, jak bardzo gęstość mineralna kości osoby badanej różni się od przeciętnej gęstości mineralnej kości osoby w tym samym wieku, natomiast T-score porównuje BMD osoby badanej do gęstości mineralnej kości osób młodych. Wskaźnik T-score stanowi jedną z podstaw rozpoznawania osteoporozy (70). Densytometryczne kryteria rozpoznawania osteoporozy w oparciu o wskaźnik T-score ustalone zostały przez Światową Organizację Zdrowia i wynoszą odpowiednio: norma BMD > -1,0 SD osteopenia (niska masa kostna) BMD -1-2,5 SD osteoporoza BMD < -2,5 SD osteoporoza zaawansowana BMD < -2,5 SD wraz z wystąpieniem co najmniej jednego złamania osteoporotycznego. W przypadku już istniejących złamań osteoporotycznych badania rentgenowskie (RTG) są nadal najlepszym sposobem na ich identyfikację. Przy wystąpieniu dolegliwości bólowych ze strony układu kostnego jest to pierwsze z wykonywanych badań (31). Do metod diagnostycznych rzadziej stosowanych należą ilościowa tomografia komputerowa (QCT - ang. Quantitative Computer Tomography) oraz ultrasonografia (QUS - ang. Quantitative Ultrasonography). QCT jest badaniem bardzo precyzyjnym, ale trudno dostępnym i drogim. Wiąże się ponadto ze znaczną ekspozycją na promieniowanie rentgenowskie. Ultrasonografia natomiast jest metodą użyteczną w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji chorych o wysokim zagrożeniu 16

17 złamaniami. Nie nadaje się jednak ani do oceny postępu choroby, ani monitorowania skuteczności leczenia (76). Poza wymienionymi już metodami diagnostycznymi istnieją także metody biochemiczne, do których należy pomiar poziomu markerów obrotu kostnego. Obrót kostny jest procesem przebudowy kości opierającym się na osteoresorpcji i osteogenezie, powodując w efekcie przyrost lub spadek masy kostnej. Czynniki pobudzające resorpcje kości powodują zwiększenie aktywności komórkowej osteoblastów i uwolnienie minerałów oraz produktów rozpadu, głównie kolagenu z macierzy do krwioobiegu. Oznaczenie stężenia tych substancji we krwi może być wykorzystane jako pomiar markerów resorpcji kości. Czynniki stymulujące tworzenie nowej tkanki kostnej zwiększają aktywność metaboliczną osteoblastów oraz syntezę macierzy. Dochodzi do pobudzenia syntezy białek m.in. kolagenu typu I i osteokalcyny. Nowo zsyntetyzowana osteokalcyna, która jeszcze nie została wbudowana w kość, oraz zdegradowane propeptydy przedostają się do krwioobiegu i mogą być oznaczone jako markery kościotworzenia (76). Markery obrotu kostnego są zatem fragmentami białkowych elementów strukturalnych kości. Markery kościotworzenia: frakcja kostna alkalicznej fosfatazy (b-alp, ang. bone alkaline phosphatase), syntetyzowana przez osteoblasty, która bierze udział w tworzeniu macierzy tkanki kostnej i procesie mineralizacji, osteokalcyna (OC) jest niekolagenowym białkiem macierzy kostnej syntetyzowanym przez osteoblasty, N-końcowy peptyd prokolagenu typu I (PINP, ang. procollagen I amino terminal propeptide) jest uwalniany w trakcie syntezy kolagenu z cząsteczki prokolagenu typu I od końca N. W przeciwieństwie do dwóch poprzednich, nie jest wysoce swoistym markerem kości otworzenia, ponieważ może pochodzić z innych tkanek, np. ze skóry. 17

18 Markery resorpcji: Pirydynolina i dezoksypirydynolina (PYD i DPD), N-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (NTX, ang. collagen type I crosslinked N-telopeptide), C-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (CTX, ang. collagen type I crosslinked C-telopeptide). PYD, DPD, NTX, CTX są wysoce swoistymi markerami resorpcji kości. Badania biochemiczne markerów obrotu kostnego stanowią podstawę różnicowania osteoporozy z innymi poważnymi chorobami układu kostnego, a także mogą ułatwiać decyzje terapeutyczne. Stężenie biochemicznych markerów obrotu kostnego określa się w krwi i moczu, a ich oznaczenie pozwala na precyzyjną ocenę tempa osteoresorpcji i osteogenezy. Umożliwia to monitorowanie i przewidywanie zmian pod wpływem leczenia (76) Leczenie farmakologiczne osteoporozy Leczenie osteoporozy polega na zapobieganiu złamaniom oraz zwiększaniu masy kostnej i wytrzymałości kości. Jest to właściwie profilaktyka złamań (33). W leczeniu osteoporozy stosuje sie obecnie leki antyresorpcyjne, anaboliczne, a także leki o mieszanym mechanizmie działania (77). Leki antyresorpcyjne hamują działanie osteoklastów, doprowadzając do przewagi procesu osteogenezy. Leczenie tego typu lekami najlepiej sprawdza się u kobiet w przypadku osteoporozy pomenopauzalnej, wywołanej niedoborem estrogenów, czy u mężczyzn, których osteoporoza jest wynikiem spadku androgenów, a także choroby będącej wynikiem długotrwałej glikokortykosteroidoterapii. Do leków antyresorpcyjnych zaliczamy szeroko stosowane bisfosfoniany, estrogeny, raloksyfen i kalcytoninę. Leczenie antyresorpcyjne jest skuteczne w przypadku niskiej masy kostnej (T-score < -2,0) i powinno być skorelowane z suplementacją wapnia i witaminy D (71). Leki anaboliczne pobudzają działanie osteoblastów, powodując wzrost masy beleczek kostnych w kości gąbczastej i pogrubienie części korowej. Leki te stosowane są zatem w przypadku osteoporozy zaawansowanej z występującymi już złamaniami 18

19 (88). Do tej grupy leków należą parathormon, fluorek sodu, hormon wzrostu i insulinopodobny czynnik wzrostu. Preparatem o mieszanym mechanizmie działania jest ranelinian strontu, który niezależnie hamuje osteoresorpcję i pobudza osteogenezę (77). Najczęściej stosowanym i najlepiej przebadanym bisfosfonianem jest alendronian. Zalecany jest w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej i posteroidowej, a także w przypadku osteoporozy u mężczyzn (77). Obecnie stosowany jest doustnie w postaci tabletek w dawce codziennej 10 mg lub cotygodniowo po 70 mg. W badaniach wykazano, że długotrwałe stosowanie alendronianu nie zagraża procesowi przebudowy kości, a efekt zmniejszenia ryzyka wystąpienia złamań utrzymuje się przez 5 lat po odstawieniu leku (11). Udowodniono, że stosowanie alendronianu zmniejsza ryzyko złamań w obrębie kręgosłupa o około 40-50%, złamań obwodowych o 30-40%, w tym 40-60% w obrębie szyjki kości udowej (95). Po 10 latach stosowania leku w przypadku kobiet z osteoporozą pomenopauzalną, którym podawano alendronian w codziennej dawce 10 mg, Bone (17) odnotował wzrost gęstości mineralnej kości o 13,7% w obrębie odcinka lędźwiowego kręgosłupa, 5,4% w szyjce kości udowej, 6,7% w części proksymalnej uda w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Podobne rezultaty uzyskano w grupie, która przyjmowała lek w cotygodniowej dawce 70 mg (131). Podobnie jak alendronian, rizedronian wykazuje dużą skuteczność w zapobieganiu złamaniom kręgosłupa i kości długich. Stosowany jest zarówno w profilaktyce, jak i leczeniu osteoporozy (122). W Polsce zarejestrowany jest w dawce 5 mg dziennie w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej oraz posteroidowej. Pomimo braku rejestracji, stosowana jest także podaż leku w dawce 35 mg raz w tygodniu (109). Stosowanie rizedronianu przez 1,5 roku w dawce 5 mg/dobę redukuje ryzyko wystąpienia pierwszego złamania kręgowego o 56%, po dwóch latach o 65%, a po 3 latach o 70-80%. Natomiast ryzyko wystąpienia kolejnych złamań w obrębie kręgosłupa jest redukowane w ciągu roku o 61-65%, a w ciągu 3 lat o 41-49% (56), w okresie 5 lat o 49% (63). Ibandronian natomiast jest bisfosfonianem trzeciej generacji (21). Wykazuje co najmniej dziesięciokrotnie silniejsze działanie antyresorpcyjne niż alendronian. Stosowany jest w dawkach doustnych 2,5 mg/dobę lub 150 mg/miesiąc (45). 19

20 Ibandronian podawany jest także dożylnie w dawkach 3 mg co 3 miesiące (142). Reginster (123) w swojej pracy przedstawił wyniki 2-letnich badań z podwójnie ślepą próbą, porównujących skuteczność podawania doustnie ibandronianu w różnych dawkach (2,5 mg/dobę, 50 mg/miesiąc, 100 mg/miesiąc, 150 mg/miesiąc). W grupie 1609 kobiet z osteoporozą pomenopauzalną po 2 latach leczenia wykazano porównywalną skuteczność terapii ibandronianem podawanym raz dziennie (2,5 mg) i raz w miesiącu (50 mg, 100 mg) oraz zdecydowanie korzystniejsze efekty dawki 150 mg/miesiąc. Zwiększenie masy kostnej w odcinku lędźwiowym kręgosłupa wynosiło odpowiednio: 5,0%, 5,3%, 5,6% oraz 6,6%. W każdej grupie zauważono także wzrost BMD w obrębie biodra oraz szyjki kości udowej, przy czym największy wzrost wystąpił przy dawce 150 mg/miesiąc (24). Kolejnym bisfosfonianem jest etidronian, który jako pierwszy został zastosowany w leczeniu osteoporozy. W Polsce zarejestrowany jest do leczenia osteoporozy pomenopauzalnej i posteroidowej w sposób cykliczny (2, 24, 77). Zaleca się stosowanie etidronianu przez 14 dni w codziennej dawce 400 mg, a następnie przez 76 dni preparatu wapnia w dawce 500 mg dziennie (109). Etidronian zmniejsza ryzyko wystąpienia złamań kręgosłupa u kobiet z osteoporozą pomenopauzalną o 85% (2). Etidronian w dawce 400 mg na dobę podawany przez 14 dni 4 razy w roku, nie dłużej niż dwa lata, powoduje wzrost gęstości kości w trzonach kręgów (24, 148). Dwuletnie stosowanie leku zmniejsza ryzyko wystąpienia nowych złamań w obrębie kręgosłupa o 65% (155) i szyjki kości udowej o 34% (160). Etidronian obecnie stosowany jest rzadziej. Pamidronian, który zarejestrowano do leczenia innych chorób metabolicznych kości, podaje się także w przypadku wystąpienia osteoporozy pomenopauzalnej i posteroidowej (77). W leczeniu osteoporozy podawany jest w dawce 30 mg dożylnie nie szybciej niż 1,5 mg/godzinę. W przeciwieństwie do ibandronianu może wykazywać działanie neurotoksyczne, tworząc nierozpuszczalne agregaty uszkadzające barierę filtracyjną nerek (25, 109, 142). Zolendronian natomiast stosowany jest w chorobach nowotworowych, dających przerzuty do kości (77). Podawany w formie dożylnej w dawce 4 mg co 6 miesięcy zwiększa masę kostną zarówno w trzonach kręgów, jak i szyjce kości udowej (81). 20

21 Jednym z najnowszych aminobisfosfonianów jest olpadronian. Wykazuje on właściwości terapeutyczne i farmakologiczne podobne do pamidronianu i alendronianu, ale charakteryzuje się większą amplitudą dawkowania oraz znacznie lepszą tolerancją ze strony układu pokarmowego (24, 130). Poza bisfosfonianami, w leczeniu osteoporozy stosuje się także kalcytoninę, która jest hormonem produkowanym przez komórki C tarczycy. Poprzez działanie hamujące aktywność osteoklastów zmniejsza zjawisko osteoresorpcji (24). Kalcytonina podawana jest w postaci iniekcji podskórnej w dawce 50 lub 100 j.m. dziennie lub w postaci doustnej 200 j.m. dziennie (156). Kalcytonina obniża ryzyko wystąpienia złamań w obrębie trzonów kręgów. Nie udowodniono jednak skuteczności jej działania w zapobieganiu złamaniom pozakręgowym (89). Obecnie stosowana jest jako lek drugiego rzutu w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej i lek pierwszego rzutu w leczeniu złamań kręgów (88, 121). Kalcytonina wywołuje działanie przeciwbólowe, stąd też jej zastosowanie przydatne jest w przypadku świeżych złamań kręgów, zwłaszcza w początkowym okresie, kiedy niemożliwe jest utrzymanie pozycji siedzącej wymaganej przy stosowaniu bisfosfonianów (77). W praktyce klinicznej obok preparatów antyresorpcyjnych stosuje się także leki anaboliczne, jak parathormon (PTH). Jest on wydzielany przez przytarczyce i wpływa na funkcje nerek i metabolizm kości oraz pośrednio na czynność absorpcyjną jelit. Pod wpływem jego działania zachodzi zwiększenie zwrotnego wchłaniania wapnia w nerkach, aktywacji witaminy D, wchłaniania wapnia z jelit, a także zwiększenie resorpcji wapnia z kości. Nadczynność przytarczyc powoduje nadmierne wydzielanie PTH, co skutkuje wzmożoną osteoresorpcją (60). W warunkach fizjologicznej równowagi PTH stymuluje działanie osteoblastów i hamuje ich apoptozę, przyspieszając osteogenezę (77). Badania u kobiet z osteoporozą pomenopauzalną udowodniły, że stosowanie PTH znacznie zmniejsza ryzyko wystąpienia nowych złamań (36). Wykazano także wzrost masy kostnej u kobiet po przewlekłym leczeniu glikokortykoidami. W badaniach u mężczyzn z osteoporozą uzyskano podobne rezultaty w zakresie zwiększenia gęstości mineralnej kości (110). W Polsce PTH zarejestrowany jest w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej w dawce 20 µg dziennie maksymalnie przez 18 miesięcy u chorych z: 21

22 kompresyjnymi złamaniami kręgów i złamaniami pozakregowymi oraz T-score poniżej -2,5, bardzo niską masą kostną (T-score poniżej -3,5), osteoporozą posteroidową, przeciwwskazaniami do stosowania bisfosfonianów (57). Ranelinian strontu jest lekiem o podwójnym działaniu. Działa niezależnie, hamując osteoresorpcję oraz stymulując osteogenezę. Mechanizm jego działania polega na zmniejszeniu różnicowania i aktywności osteoklastów oraz zwiększeniu replikacji preosteoblastów stymulując syntezę kolagenu przez osteoblasty. Ranelinian strontu łączy się z powierzchnią kryształów hydroksyapatytu, zmniejszając ich rozpuszczalność (32). W badaniu SOTI (ang. Spinal Osteoporosis Therapeutic Intervention), przeprowadzonym w grupie 1649 kobiet w okresie pomenopauzalnym po 3 latach stosowania leku, wykazano zmniejszenie ryzyka wystąpienia złamań kręgów oraz zwiększenie gęstości kości w odcinku lędźwiowym kręgosłupa. Badanie TROPS (ang. Treatment of Peripheral Osteoporosis) w grupie 5091 kobiet o średniej wieku 77 lat wykazało natomiast zmniejszenie ryzyka wystąpienia złamań pozakregowych (141). Od 2004 roku lek ten jest zarejestrowany w całej Unii Europejskiej do leczenia osteoporozy pomenopauzalnej. Zalecana dawka to 2,0 g/dobę podawane w postaci granulatu do sporządzania zawiesiny doustnej, przyjmowanej wieczorem co najmniej dwie godziny po posiłku (77). Wśród efektów ubocznych występują nudności, biegunka, zapalenie skóry, bóle głowy (141). Poza lekami podawanymi osobom chorym ważna jest także suplementacja wapnia i witaminy D, które odgrywają istotną rolę w osiągnięciu szczytowej masy kostnej i prawidłowym rozwoju kośćca. Podaż wapnia i witaminy D zapobiega także utracie tych pierwiastków z kości podczas starzenia się organizmu. Niedobór wapnia prowadzi do wzrostu wydzielania parathormonu i zwiększenia osteoresorpcji. Głównym czynnikiem wpływającym na wchłanianie wapnia jest aktywna forma witaminy D (1,25-dihydroksycholekalcyferol), powstająca w nerkach z witaminy D syntetyzowanej w skórze pod wpływem światła słonecznego (77). Zalecana codzienna dawka wapnia to: do 10 roku życia 800 mg/dobę, u młodzieży 1000 mg/dobę, 22

23 u kobiet w ciąży, laktacji, po menopauzie i osób po 65 roku życia 1500 mg/dobę (90). Wystarczająca ilość witaminy D jest syntetyzowana przez skórę po 15 minutach ekspozycji na słońce 2-3 razy w tygodniu. Zalecana suplementacja to j.m. dziennie. Suplementacja preparatami wapnia i witaminy D jest często wystarczająca w przypadku osteoporozy starczej i zalecana jako profilaktyka w przypadku osteoporozy posteroidowej (77). Wiele badań dowodzi skuteczności działania estrogenów w zapobieganiu złamaniom kręgów i kości długich. Estrogeny hamują resorpcję kości beleczkowej i korowej, osteoklastogenezę oraz pobudzają osteoblasty do syntezy czynników wzrostu, co w konsekwencji skutkuje uruchomieniem procesu apoptozy osteoklastów (77). Dawki estrogenów zalecane w leczeniu osteoporozy to 0,5 mg/dobę 17-betaestradiolu podawanego doustnie, µg/dobę podawanego podskórnie, 0,3 mg/dobę estrogenów koniugowanych (49, 154). Badania wykazały, że stosowanie profilaktyczne hormonalnej terapii zastępczej (HTZ) w okresie menopauzy przez co najmniej 5-7 lat zmniejsza znacznie ryzyko wystąpienia osteoporozy (153). Podczas stosowania hormonalnej terapii zastępczej konieczna jest suplementacja preparatów wapnia i witaminy D (77). Obecnie coraz częściej prowadzi się badania nad zastosowaniem selektywnych modulatorów receptorów estrogenowych (SERM - ang. selective estrogen receptor modulators) oraz selektywnych modulatorów receptorów androgenowych (SARM - ang. selective androgen receptor modulator). SERM są związkami wiążącymi się z receptorem estrogenowym (ER) oraz modulującymi transkrypcję genu zależnego od ER. W niektórych tkankach jak wątroba i kości, pełnią rolę agonistów, a w innych antagonistów (gruczoły mlekowe, macica). SERM odpowiedzialne są za inhibicję rekrutacji osteoklastów oraz hamowanie resorpcji kostnej na drodze ich wiązania się z receptorem estrogenowym (24). W leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej stosowany jest rolaksyfen w dawce 200 mg dziennie, skutecznie obniżający markery obrotu kostnego. W badaniu MORE (ang. Multiple Outcomes of Raloxifene Evaluation) i CORE (ang. Continued Outcomes Relevant to Evista) u kobiet w okresie pomenopauzalnym, leczonych rolaksyfenem 23

24 w dawce 60 mg lub 120 mg dziennie stwierdzono wzrost masy kostnej zarówno w trzonach kręgów, jak i kościach długich, co znacznie zmniejsza ryzyko wystąpienia złamań (77, 95). SARM natomiast są związkami hamującymi osteoresorpcję, a pobudzającymi osteogenezę. Są to leki o mieszanym mechanizmie działania i obecnie znajdują się w fazie badań klinicznych (51, 133, 135). Oprócz farmakoterapii istotnym elementem w leczeniu osteoporozy jest kompleksowa rehabilitacja. Ma ona na celu zapobieganie ubytkowi masy kostnej, zmniejszenie ryzyka upadku, zapobieganie i korekcję deformacji wynikających ze złamań i zniesienie bólu. Celem ćwiczeń ruchowych jest utrzymanie lub zwiększenie gęstości kości, siły mięśniowej, zakresu ruchowego w stawach, poprawę kondycji ruchowej, równowagi i gibkości. Na kompleksową rehabilitację składa się kinezyterapia, fizykoterapia i odpowiednie zaopatrzenie ortopedyczne (77) Ogólna charakterystyka bisfosfonianów Bisfosfoniany są lekami powszechnie stosowanymi w leczeniu chorób wynikających ze wzmożonej resorpcji kostnej, zależnej od funkcjonowania osteoklastów. Leków tych używa się w przypadkach osteoporozy pomenopauzalnej i starczej (35, 108), osteoporozy indukowanej glikokortykoidami (38), a także chorób związanych z zaburzeniami aparatu ruchu u dzieci, jak osteoporoza wieku dziecięcego (22, 73, 87, 164), czy wrodzona łamliwość kości (78, 84). Od momentu wprowadzenia bisfosfonianów do praktyki klinicznej, leki te są stosowane w terapii chorób związanych z zaburzeniami struktury tkanki kostnej. Oprócz wymienionych powyżej chorób stanowią one terapię w przypadku występowania przerzutów nowotworowych do kości, choroby Paget a (128), szpiczaka mnogiego czy hiperkalcemii (38, 126). Bisfosfoniany dają istotne kliniczne korzyści w leczeniu chorób związanych z zaburzeniami równowagi pomiędzy działaniem osteoklastów odpowiedzialnych za resorpcję kości a osteoblastów formujących tkankę kostną (38). Do pozytywnych efektów działania tych związków zaliczamy także ich przeciwbólowe działanie. Pomimo nieznajomości obecnie mechanizmu przeciwbólowego działania leków wykazano, że zmniejszają one dolegliwości bólowe w przypadku złamania kręgów (55, 96). Także u dzieci z osteoporozą pierwotną i wtórną po zastosowaniu bisfosfonianów, 24

25 zauważono ustąpienie dolegliwości bólowych towarzyszących chorobie, co zdecydowanie wpływa na poprawę jakości życia i zwiększenie aktywności ruchowej (1, 6, 23, 67). Bisfosfoniany, które są obecnie stosowane w leczeniu chorób kości, wykazują także aktywność jako potencjalne leki przeciwpasożytnicze, zwalczające pierwotniaki chorobotwórcze (93). Ze względu na wykrycie ujemnych skutków działania bisfosfonianów, do których zalicza się m. in. osteonekrozę szczęki (158), patologiczne złamania czy zwiększającą się częstość migotania przedsionków (38), szczególną uwagę w badaniach klinicznych poświęca się odpowiedniemu dawkowaniu poszczególnych typów bisfosfonianów w celu wyeliminowania skutków ubocznych. Do niepożądanych skutków leczenia bisfosfonianami przy doustnym podaniu należą bóle brzucha, nudności, nieżyty błony śluzowej żołądka i przełyku (108). W przypadku dożylnego podania może pojawić się podwyższenie temperatury ciała (6, 18), ogólnoustrojowe reakcje zapalne, niewydolność nerek, zespół nerczycowy oraz zaburzenia równowagi elektrolitowej. Dożylne bisfosfoniany są szeroko stosowane w przypadku hiperkalcemii, a najpoważniejsze wymienione komplikacje występują u mniej niż 2% pacjentów uczestniczących w testach klinicznych (149). Do najgroźniejszych powikłań terapii oprócz nekrozy szczęki (67) należy rozrzedzenie struktury kostnej aż do osteomalacji (87, 158) Struktura chemiczna bisfosfonianów Bisfosfoniany są grupą syntetycznych związków, pochodnych kwasu pirofosforowego (PPi), naturalnie występującego w organizmach (103). Jest on produktem ubocznym wielu reakcji syntetycznych, dlatego też wykrywany jest z łatwością w wielu tkankach, także w krwi i moczu (38, 136). Cechą charakterystyczną pirofosforanów jest wiązanie fosfor-tlen-fosfor (P-O-P). Pionierskie badania z lat 60- tych XX wieku wykazały, że PPi były zdolne do hamowania kalcyfikacji poprzez wiązanie się z kryształami hydroksyapatytu. Z tych obserwacji powstała hipoteza, że mając wpływ na poziom tych związków w organizmie można regulować mineralizację kości (47). 25

26 O HO P O O OH P OH OH a Kwas pirofosforowy O HO P R 1 R 2 O P OH OH b Kwas OH gem-bisfosfonowy R 1 = H, OH, alkil, aryl, R 2 = H, alkil, aryl Ryc. 2. Wzory strukturalne kwasów: pirofosforowego (a) i gem-bisfosfonowego (b) W przypadku bisfosfonianów centralny atom tlenu zastąpiono atomem węgla, co skutkuje powstaniem wiązania fosfor-węgiel-fosfor (P-C-P). Dzięki temu są one chemicznie stabilne (38, 126), odporne na hydrolizę. Odporność na działanie obecnych w ustroju fosfataz umożliwia utrzymanie ich stężenia terapeutycznego. Podobnie jak pirofosforany, bisfosfoniany mają wysokie powinowactwo do minerałów kości, ponieważ wiążą się z kryształami hydroksyapatytu. Są one w sposób uprzywilejowany włączane do aktywnych miejsc przebudowy kości. To wysokie powinowactwo do wapnia umożliwia osiągnięcie wysokiego miejscowego stężenia tych związków. Właśnie dzięki temu są one doskonałym terapeutykiem w chorobach charakteryzujących się wzmożonym obrotem kostnym. Bisfosfoniany nie są zatrzymywane w organizmie, szybko zostają wydalone przez nerki (38). Z atomem węgla połączone są dwa łańcuchy boczne. Prawie wszystkie bisfosfoniany mają grupę hydroksylową połączoną z centralnym atomem węgla w pozycji R 1 łańcucha bocznego. Grupy fosforanowe zapewniają związkom wysokie powinowactwo do kryształów hydroksyapatytu, a obecność grupy hydroksylowej zwiększa ich zdolność do wiązania wapnia (38). Wspólnie fosforan i grupy hydroksylowe warunkują silne powinowactwo bisfosfonianów do kości (136). Ostatecznie to jednak druga połowa strukturalna (w pozycji R 2 ) jest główną determinantą zdolności bisfosfonianów do hamowania resorpcji kości. Obecność azotu lub grupy amonowej w pozycji R 2 w łańcuchu bocznym zwiększa zdolności antyresorpcyjne tych związków nawet z 10x do 10000x w stosunku do tych 26

27 niezawierających azotu (40, 136). Bisfosfoniany nieazotowe stanowiły pierwszą generację leków, natomiast te zawierające azot należą do nowej generacji Molekularny mechanizm działania bisfosfonianów Molekularny mechanizm działania bisfosfonianów jest warunkowany strukturą chemiczną związku. Sprowadza się on do indukowania apoptozy osteoklastów, a różnice polegają na drodze do tego procesu (42, 79). Zdolność bisfosfonianów niezawierających azotu do indukcji apoptozy została dobrze opisana. Z powodu struktury zbliżonej do PPi związki te zostają włączone w cząsteczki nowo formowanego ATP przez II klasy aminotransferazę RNA. Wewnątrzkomórkowe nagromadzenie się tych ulegających rozpadowi analogów ATP jest cytotoksyczne dla osteoklastów, ponieważ hamuje wiele procesów komórkowych zależnych od ATP, prowadząc do ich apoptozy (69). Obserwuje się typowe dla tego procesu zmiany: zmniejszenie objętości komórki, fragmentację DNA, a także utratę potencjału błonowego mitochondriów oraz aktywację kaspazy-3. Powstały analog ATP jest bardzo stabilny, nie podlegający hydrolizie, a jego nagromadzenie w cytozolu osteoklastów hamuje działanie istotnych enzymów warunkujących funkcjonowanie i przeżycie komórki (79). Inhibicja translokazy nukleotydów adeninowych pociąga za sobą reakcję łańcuchową, skutkującą zaburzeniem potencjału błonowego mitochondriów, uwolnieniem cytochromu C, aktywacją kaspazy-3, a w konsekwencji apoptozą komórki (74, 103, 132). Ryc. 3. Reakcja syntezy analogu ATP z bisfosfonianu (pcp - bisfosfonian; pop pirofosforan, AppCp bisfosfonianowy analog ATP; ATP adenozynotrifosforan) wg Kryśkiewicz E., Lorenc R. S. (79). 27

28 Ryc. 4. Oddziaływanie bisfosfonianów na osteoklasty dr Jan P. Madej wg Dziedzic- Gocławska i in. (42) W odróżnieniu od poprzednich związków bisfosfoniany drugiej i trzeciej generacji, a więc zawierające azot, wiążą i hamują aktywność syntazy difosforanu farnezylu kluczowego enzymu szlaku mewalonowego, mającego znaczenie w produkcji cholesterolu i innych steroli, a także lipidów izoprenoidowych, takich jak difosforan farnezylu (FPP) oraz difosforan geranylogeranylu (GGPP) (74, 79). Hamowanie tego enzymu odbywa się nawet przy bardzo małym stężeniu bisfosfonianów (146). Wyżej wymienione metabolity stanowią podstawę syntezy ważnych związków, np. dolicholu czy ubichinonu (40) oraz są niezbędne w prenylacji 28

29 białek, włączając w to małe GTPazy (82, 97). Prenylacja polega na przeniesieniu grupy izoprenowej z FPP lub GGPP na obecną w modyfikowanym białku resztę cysteinową w specyficznym rozpoznawalnym motywie na C-końcu danego białka. Modyfikacja ta jest niezbędna ze względu na prawidłowe funkcjonowanie ważnych dla transdukcji sygnałów na terenie komórki. Wskutek zahamowania działania syntazy FPP prenylacji nie ulegają takie GTPazy jak: Ras, Rho, Rac, Cdc42 oraz Rab. Wynikiem tego jest zaburzenie organizacji cytoszkieletu osteoklastów, formowania pierścienia aktynowego, fałdowania błony oraz ruchu różnego rodzaju pęcherzyków na terenie komórki (79). W konsekwencji prowadzi to do utraty własności resorpcyjnych osteoklastów, a ostatecznie do apoptozy komórki (128, 129). Ponieważ FPP jest enzymem powszechnie występującym w tkankach, bisfosfoniany azotowe mają zdolność oddziaływania także na komórki innego typu. Wykazano ich zdolność hamowania prenylacji Rap 1A w hodowlach wszystkich komórek macierzystych, a także osteoklastów, osteoblastów, makrofagów i komórek nabłonkowych. Makrofagi i osteoklasty wydają się być najbardziej wrażliwe na niskie stężenia bisfosfonianów azotowych in vitro. Wrażliwość różnych komórek na bisfosfoniany azotowe najprawdopodobniej zależy w dużej mierze od ich zdolności przyswajania wystarczającej ilości tych związków do hamowania syntazy FPP (126). Badania sugerują, że syntaza FPP jest głównym celem farmakologicznego działania bisfosfonianów azotowych w osteoklastach in vivo (150). Ryc. 5. Schemat szlaku mewalonowego wg Kryśkiewicz E., Lorenc R. S. (79). 29

30 Innym miejscem działania bisfosfonianów jest ATP-zależna pompa protonowa, znajdująca się w błonie komórkowej rąbka brzeżnego osteoklastów. Jej rolą jest zakwaszanie zatoki resorpcyjnej, niezbędnej do rozkładu macierzy kostnej. Bisfosfoniany mają dodatkowo zdolność bezpośredniej inhibicji enzymów hydrolitycznych, biorących udział w resorpcji zależnej od osteoklastów. Wpływają także na aktywność fosfataz tyrozynowych, odpowiedzialnych za tworzenie i dojrzewanie osteoklastów (128, 138). Reasumując, związki te mogą oddziaływać na dojrzałe osteoklasty bezpośrednio hamując ich aktywność resorpcyjną na skutek zaburzeń w ich strukturze, co potwierdziły badania in vitro (102, 140), jak i in vivo (144). Obserwuje się zmiany w substrukturze cytoszkieletu, szczególnie filamentów aktynowych (102) i zaburzenia w formowaniu struktur rąbka brzeżnego (71, 76, 89, 114), zahamowanie produkcji kwasu mlekowego oraz hamowanie aktywności pomp H + -ATPazowych (33), w konsekwencji prowadząc do apoptozy. Zauważono, że bisfosfoniany oddziałują na osteoblasty (107, 128, 139, 163), dzięki czemu hamowanie resorpcji tkanki kostnej odbywa się także na drodze pośredniej. Syntetyzowane miejscowo przez osteoblasty cytokiny wpływają na oseoklastogenezę (41). Bisfosfoniany hamują syntezę niektórych cytokin, co powoduje zahamowanie rekrutacji prekursorów osteoklastów i ich fuzji w dojrzałe wielojądrzaste komórki (52, 65, 151). Uwalniany pod wpływem bisfosfonianów czynnik o niskim ciężarze molekularnym hamuje aktywność dojrzałych osteoklastów, a także osteoklastogenezę (162) Rola bisfosfonianów w praktyce klinicznej Osteoporoza jest najbardziej powszechną chorobą, w której stosuje się terapię bisfosfonianami. Przez ostatnie dwie dekady terapia bisfosfonianami stała się przodującym zabiegiem w przypadku pomenopauzalnej osteoporozy. Powodem jest zdolność bisfosfonianów do tłumienia aktywności osteoklastów, a przez to opóźnianie resorpcji kości. Stosując terapię bisfosfonianami zauważono redukcję złamań kręgów (9, 28, 54), jak i biodra (9, 96), a także towarzyszące temu zjawisko zwiększenia gęstości kości (30). 30

31 Testy kliniczne osób poddanych długotrwałej glikokortykosteroidoterapii wykazały dużą skuteczność bisfosfonianów w ograniczeniu ryzyka wystąpienia złamań kości (161). Oprócz osteoporozy, bisfosfoniany stosuje się także w przypadku innych chorób: choroba Paget a, wrodzona łamliwość kości u dzieci, choroby nowotworowe oraz redukcja bólu związanego z występowaniem osteoporozy. Choroba Paget a jest chorobą przewlekłą charakteryzującą się występowaniem co najmniej jednego ogniska nieprawidłowego tworzenia kości przez osteoblasty, poprzedzonego nasiloną resorpcją kości przez osteoklasty (157). Okresowo wyraźnie zwiększona osteogeneza doprowadza do znacznego zaburzenia struktury i kształtu kości. Rezultatem zmian są silne bóle, złamania i poważne deformacje szkieletu. W przypadku choroby Paget a terapia bisfosfonianami wyraźnie powstrzymuje wzrost resorpcji kości, będącej podstawą choroby, normalizując poziom fosfatazy zasadowej, będącej podstawowym parametrem monitorowania aktywności choroby (38). Doustne oraz dożylne bisfosfoniany zostały zaaprobowane w leczeniu, ponieważ ich zdolność do powstrzymywania aktywności osteoklastów jest wyjątkowo silna. Wiele z chorób nowotworowych daje przerzuty do kości, włączając w to nowotwór piersi, prostaty, płuc lub nerek. Są też takie jak szpiczak mnogi, które rosną głównie w obszarze szpiku kostnego. Ich wzrost często prowadzi do hiperkalcemii, powoduje dotkliwy ból kości, zniszczenie struktury kości i w rezultacie doprowadza do patologicznych złamań. Badania wykazują, że najbardziej powszechnym miejscem powstawania przerzutów jest szkielet, a u co najmniej 90% pacjentów z zaawansowanym stanem choroby nowotworowej, rozwijają się zmiany patologiczne kości (15). Stosowanie terapii bisfosfonianami podawanymi doustnie i dożylnie w przypadku nowotworu piersi skutkowało znacznym uśmierzeniem bólu kości oraz zmniejszeniem powikłań ze strony szkieletu (13, 14, 34, 61, 62, 86, 134). W przypadku leczenia szpiczaka mnogiego, bisfosfoniany stanowią terapię uzupełniającą, która skierowana jest głównie przeciw dodatkowym przypadłościom, jak hiperkalcemia czy powikłania ze strony układu kostnego (7, 8, 13, 14, 34, 86, 129, 134). Bisfosfoniany stosuje się także u dzieci w leczeniu ciężkich postaci osteoporozy wieku rozwojowego oraz wrodzonej łamliwości kości (73, 164). Podejmowane są także próby zastosowania tych związków u dzieci z osteoporozą wtórną, spowodowaną długotrwałym unieruchomieniem lub przewlekłą steroidoterapią oraz nadmiernym 31

32 uwapnieniem tkanek miękkich (13). W przypadku wrodzonej łamliwości kości leczenie jest szczególnie trudne. Genetyczny defekt w syntezie kolagenu skutkuje dużą podatnością na złamania. Zastosowanie niektórych bisfosfonianów zmniejsza ból oraz skutkuje zwiększeniem zdolności ruchowych chorych. Zauważono także zdecydowane zmniejszenie częstości złamań leczonych u dzieci (1, 6, 80). Obserwuje się także wzrost gęstości kości oraz zahamowanie resorpcji tkanki kostnej. W przypadku osteoporozy młodzieńczej obserwowano zmniejszenie się liczby złamań, wzrost gęstości mineralnej kości oraz zahamowanie procesów osteoresorpcji (18). Leczenie zaburzeń mineralizacji kośćca jest zawsze terapią skojarzoną. Oprócz leków antyresorpcyjnych dzieciom podaje się także preparaty wapnia i witaminy D, stosuje dietę bogatowapniową oraz rehabilitację ruchową (87). Wyniki badań są obiecujące. Do chorób przeciwko, którym stosuje się bisfosfoniany, należą także choroby spowodowane zakażeniem pierwotniakami, które dotykają około 3 miliardów ludzi rocznie, powodując zgonów (3, 103). Choroby oporne na dotychczas stosowane leki to: malaria, śpiączka afrykańska, leiszmanioza, choroba Chagasa, oportunistyczne zakażenia u chorych na AIDS powodujące biegunki oraz toksoplazmoza. Badania laboratoryjne wykazały, że bisfosfoniany hamują rozwój i rozmnażanie się pasożytów wywołujących powyższe choroby (94, 99, 127, 152). Prawdopodobnie interferują one z enzymami istotnymi dla kluczowego procesu metabolicznego pierwotniaków. Najprawdopodobniej istnieją substruktury, do których wnikają bisfosfoniany, powodując zmiany w ich działaniu. Rola bisfosfonianów w zwalczaniu bólu towarzyszącego osteoporozie, jak i mechanizm ich działania wydają się być w tym kontekście nie do końca określone (143). Badania kliniczne potwierdzają skuteczność alendronianu i rizendronianu (55, 96). U pacjentek ze złamaniami kręgów, które przyjmowały alendronian oceniano występowanie bólu pleców i ograniczenia aktywności ruchowej. Badania wykazały, że w grupie przyjmującej alendronian statystycznie mniej uczestniczek korzystało z odpoczynku na skutek bólu kręgosłupa (104). Badania kliniczne wykazały, że bisfosfoniany zwiększają gęstość mineralną kości i redukują ryzyko złamań kręgowych i pozakręgowych. Udowodniono przeciwzłamaniowe działanie ibandronianu oraz alendronianu (10, 27, 85, 115). 32

33 2.4. Struktura tkanki kostnej a osteoporoza Kość jest wyspecjalizowaną i najbardziej złożoną formą tkanki łącznej, charakteryzującą się sztywnością i twardością. Spełnia ona cztery podstawowe funkcje: mechaniczną (podporową), umożliwia ruch organizmu, stanowi ochronę narządów (37) a także pełni rolę metabolicznego magazynu soli mineralnych, co z punktu widzenia zagadnienia związanego z osteoporozą stanowi najważniejszy element rozważań. Tkanka kostna jest głównym magazynem wapnia, fosforu, sodu, magnezu (17). Tkanka kostna zawiera elementy komórkowe, a także macierz organiczną zbudowaną z kolagenu i glikozaminoglikanów, zwaną osseomukoidem oraz macierz nieorganiczną zbudowaną z soli mineralnych zmagazynowanych w niezmineralizowanej substancji międzykomórkowej. Wewnętrzna i zewnętrzna powierzchnia kości pokryta jest odpowiednio śródkostną i okostną (105) Komórki kości Do komórek kości zaliczamy: pluripotrncjalne komórki osteogenne, komórki powierzchni kości, osteoblasty, osteocyty, osteoklasty (19, 91). Pierwsze trzy rodzaje powstają z niezróżnicowanych komórek mezenchymalnych zwanych osteoprogenitorowymi lub preosteoblastami. Są to komórki zlokalizowane w szpiku kostnym, śródkostnej i okostnej orazmające zdolność migracji. Komórki mezenchymalne są kształtu gwiaździstego o stosunkowo niewielkiej ilości cytoplazmy i organelli oraz pojedynczym jądrze. Osteoklasty natomiast są pochodnymi komórek hemopoetycznych (39). Lokalizacja poszczególnych typów komórek jest różnorodna. Pluripotencjalne komórki osteogenne, komórki powierzchni kości, osteoblasty i osteoklasty ułożone są na powierzchni kości, podczas gdy osteocyty znajdują się wewnątrz kości zmineralizowanej (19, 37, 92). Pluripotencjalne komórki osteogenne (ang. osteo-progenitors cells) zachowują zdolność dzielenia się i różnicowania w dojrzałe komórki kostne. Występują one zarówno w dojrzałej, jak i rozwijającej się tkance kostnej (105). Komórki te obecne są w rozrodczej warstwie okostnej oraz wchodzą w skład śródkostnej, która wyściela jamy szpikowe, kanały odżywcze, kanały osteonów oraz pokrywa beleczki tkanki kostnej gąbczastej (76, 105). Pluripotencjalne komórki osteogenne są cienkie i wydłużone. Wypustki cytoplazmatyczne poszczególnych komórek łączą się ze sobą bądź z wypustkami osteocytów (19, 58, 91, 92). Komórki te 33

34 występują w dwóch formach: aktywnej i spoczynkowej (105). Jako komórki nieaktywne metabolicznie zawierają mniej organelli, a więcej cytoplazmy w porównaniu z osteoblastami (19, 58, 91, 92). Wyróżniamy dwa typy komórek macierzystych tkanki kostnej. Pierwszy to preosteoblast, czyli prekursor osteoblastów, który charakteryzuje się małą ilością siateczki śródplazmatycznej i słabo rozwiniętym aparatem Golgiego. Drugi typ to preosteoklast prekursor osteoklastów mający większą ilość mitochondriów i zawierający wolne rybosomy (105). Komórki powierzchni kości (ang. bone lining cells) pokrywają większość powierzchni kości w dojrzałym organizmie, przylegając bezpośrednio do nieczynnej powierzchni kości. Wypustki cytoplazmatyczne poszczególnych komórek łączą się ze sobą lub z wypustkami osteocytów. Ponieważ komórki te są metabolicznie nieaktywne, zawierają mniej organelli, a więcej cytoplazmy niż osteoblasty. Na tym etapie zwane są one osteoblastami spoczynkowymi lub osteocytami powierzchniowymi (19, 58, 91, 92). Rola komórek powierzchni kości jest wciąż nieznana. Buckwalter i wsp. (19) wykazują, że w obecności PTH komórki te wydzielają enzymy usuwające osseoid pokrywający macierz kości, przygotowując podłoże dla osteoklastów resorbujących kość. Marks i wsp. (91, 92) wykazują, że komórki te mogą być prekursorami osteoblastów, regulując wewnętrzny wzrost kości lub pełnić funkcję bariery między pozakomórkowym płynem a kością. Komórki te stanowią zatem najprawdopodobniej barierę jonową, spełniającą rolę mineralnej homeostazy, regulując dopływ i odpływ jonów wapnia i fosforu. Kontroluje ona także wzrost kryształów w tkance kostnej poprzez utrzymanie właściwego mikrośrodowiska (105). Osteoblasty leżą ściśle obok siebie na powierzchni kości. Aktywne formy są kształtu owalnego i zawierają duże ilości szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, mitochondriów, a ich jądro znajduje się w centralnej części komórki. Pozostałe komponenty komórkowe znajdują się pomiędzy wymienionymi strukturami (37). Osteoblasty odpowiedzialne są za proces osteogenezy. Syntetyzują kolagen kości, białka niekolagenowe i fosfatazę zasadową (91, 105), a także kontrolują proces mineralizacji tkanki kostnej. Istnieją dowody, że osteoblasty działają pod wpływem hormonów gruczołu przytarczowego, a także lokalnych cytokin, uwalniając mediatory aktywujące osteoklasty (19). Ostatecznie osteoblasty podążają jednym z trzech szlaków: mogą pozostać aktywnymi osteoblastami, mogą zostać otoczone przez macierz i stać się osteocytami lub mogą przekształcić się w nieaktywne komórki osteogenne (37). 34

35 W tkance kostnej osteoporotycznej dochodzi do zaburzenia proporcji pomiędzy ilością osteoblastów a osteoklastów. Część osteoblastów ulega apoptozie, a pozostałe najczęściej wykazują zmniejszoną aktywność metaboliczną, co doprowadza do nadmiernej działalności osteoklastów, a w rezultacie do wzmożonej resorpcji tkanki kostnej. W ten sposób zaburzona zostaje naturalna homeostaza kości. Osteocyty, czyli komórki właściwe kości, stanowią 90% wszystkich komórek dorosłego szkieletu. W cytoplazmie form niedojrzałych, przypominających osteoblasty, obserwuje się dużą ilość szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, mitochondriów oraz rozwinięty aparat Golgiego, natomiast mniejszą ilość elementów cytoszkieletu i lizosomów. W fazie tej, zwanej fazą formacyjną, zachowują zdolność do produkcji macierzy oraz włókien kolagenowych tkanki kostnej (58, 91, 92). Podczas rozwoju osteocyty ulegają zmianom czynnościowym i strukturalnym. Wyróżniono cztery fazy aktywności osteocytów: formacyjną, resorpcyjną, spoczynkową i zwyrodnieniową. W fazie resorpcyjnej osteocyty wykazują zmniejszenie obszaru ziarnistej siateczki śródplazmatycznej i wzrost frakcji lizosomalnej (105). Osteocyty zlokalizowane są w jamkach kostnych i dzięki licznym wypustkom cytoplazmatycznym, tkwiącym w kanalikach kostnych tworzą sieć (105). Wypustki poszczególnych osteocytów łączą się ze sobą oraz z wypustkami komórek osteogennych i komórek powierzchni kości a także z naczyniami włosowatymi, umożliwiając przepływ związków małocząsteczkowych i jonów z naczyń krwionośnych do płynu tkankowego. Wyróżniamy dwa typy osteocytów: wydłużone w kości blaszkowatej i owalne w kości gąbczastej (58, 91, 92, 105). Osteocyty są zatem komórkami odpowiadającymi za integralność substancji międzykomórkowej kości, chroniąc ją przed resorpcją przez osteoklasty (105). W tkance kostnej osteoporotycznej ilość osteocytów znacznie zmniejsza się na skutek procesu apoptozy, któremu te komórki ulegają. Osteoklast to duża wielojądrzasta komórka odpowiedzialna za osteoresorpcję zarówno w warunkach zachowanej homeostazy, jak i warunkach patologicznych, takich jak osteoporoza. Morfologicznie osteoklasty są większe niż pozostałe typy komórek i zlokalizowane są na powierzchni resorbowanej kości. Aktywne osteoklasty resorbujące kość leżą w jamkach na powierzchni kości. W zwiększonej liczbie występują w miejscu modelowania i przebudowy wewnętrznej tkanki kostnej (105). Osteoklasty charakteryzują się dużą ruchliwością, umożliwiającą im przesuwanie się 35

36 wzdłuż powierzchni kości (58). Każda komórka może zawierać od 3 do 20 owalnych jąder zlokalizowanych w środkowej części. W porównaniu z osteoblastami osteoklasty zawierają mniej szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, co wynika z mniejszego natężenia produkcji i sekrecji białek. Ilość mitochondriów jest natomiast największa w porównaniu z pozostałymi komórkami organizmu. Pomiędzy jądrami rozproszone są struktury aparatu Golgiego. W cytoplazmie znajdują się liczne lizosomalne wakuole różnego typu, nadając jej piankowaty wygląd. Błona komórkowa aktywnych osteoklastów jest pofałdowana i tworzy tzw. rąbek brzeżny, zwiększający jej powierzchnię, co zwiększa wymianę pomiędzy środowiskiem wenątrzi zewnątrzkomórkowym (19, 59, 137). Osteoklasty mają specyficzną grupę dehydrogenaz, czynną anhydrazę węglanową oraz receptory dla kalcytoniny. Nie mają receptorów dla parathormonu i dlatego w odpowiedzi na PTH uczestniczą osteoblasty. Wywierają one tym samym wpływ na umiejscowienie, indukcję, stymulację oraz hamowanie resorpcji kostnej przez osteoklasty. Po zakończeniu osteoresorpcji osteoklasty migrują z powierzchni kości do powierzchni przyległych do szpiku, gdzie ulegają degradacji (105). W przypadku osteoporozy zauważa się zwiększenie ilości i aktywności osteoklastów. Doprowadza to do wzmożonej resorpcji kości, która zdecydowanie przeważa nad procesami osteogenezy Pozakomórkowe komponenty tkanki kostnej Pozakomórkowe komponenty tkanki kostnej stanowią około 90% jej całkowitej objętości w porównaniu do pozostałych 10%, będących komórkami i naczyniami krwionośnymi. W skład macierzy pozakomórkowej wchodzą zarówno elementy organiczne (35% substancji międzykomórkowej), jak i nieorganiczne (65%) (19). Do macierzy organicznej zalicza się głównie kolagen typu I, syntetyzowany przez osteoblasty, a następnie wydzielany i gromadzony pozakomórkowo. Poza I typem kolagenu występuje tu także w bardzo niewielkiej ilości kolagen V, VI, VIII i XII. Wewnątrzkomórkowe cząsteczki kolagenu typu I tworzą potrójną helisę polipeptydowego łańcucha, budując włókna kolagenowe zewnątrzkomórkowe. Włókna są precyzyjnie zorganizowane w zachodzący na siebie sposób, utrzymując jednocześnie przestrzeń pomiędzy sąsiednimi włóknami. Oprócz białek kolagenowych, stanowiących 36

37 95% macierzy organicznej, występują tutaj także białka niekolagenowe: proteoglikany, osteonektyna, sialoproteiny, osteokalcyna, morfogenetyczne białka kości. W badaniach nad osteoporozą zauważono, że zmniejszenie ilości białek macierzy kostnej może dochodzić nawet do 30% (118). Zadaniem macierzy nieorganicznej jest zapewnienie kości przede wszystkim wytrzymałości mechanicznej oraz spełnienie fizjologicznej funkcji magazynu jonów. Sole mineralne tkanki kostnej zawierają 99% wapnia, 85% fosforu, 40-60% sodu i magnezu zawartego w organizmie. Fizjologiczne funkcjonowanie przewodnictwa nerwowego oraz pobudzenie mięśni zależne jest od wapnia, dlatego tak istotne jest utrzymanie jego właściwego poziomu we krwi. Stąd też istotna rola tkanki kostnej (19). Część mineralną kości tworzą agregaty soli wapniowo-fosforanowych w postaci hydroksyapatytów Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 oraz amorficzne fosforany wapnia (64). W dojrzałej kości hydroksyapatyt przyjmuje postać kryształów w formie igiełek, płytek, listków. Kryształy hydroksyapatytu charakteryzują się regularnym rozmieszczeniem pomiędzy włóknami kolagenowymi. Interakcja hydroksyapatytu i włókien kolagenowych z białkami niekolagenowymi macierzy gwarantuje twardość i sztywność kości (66). Powierzchnia kryształów hydroksyapatytowych jest uwodniona, co ułatwia szybką wymianę jonów pomiędzy kryształami a pozakomórkowym płynem (64) Rodzaje tkanki kostnej Histologicznie wyróżniamy dwa rodzaje tkanki kostnej: niedojrzałą, pierwotną kość grubowłóknistą, która z czasem zastępowana jest przez wtórną kość drobnowłóknistą. Kość grubowłóknista charakteryzuje się nieuporządkowanym układem włókien kolagenowych, dużą ilością komórek i słabą wytrzymałością mechaniczną. Włókna kolagenowe biegną nieregularnie, tworząc grube pęczki. Rozwija się ona zarówno na podłożu błoniastym, jak i na podłożu chrzęstnym, tworząc zawiązki szkieletu. U dorosłych ssaków występuje tylko w szwach kostnych pokrywy czaszki, w wyrostkach zębodołowych, w kostkach słuchowych, w błędniku kostnym ucha wewnętrznego i w miejscach przyczepu ścięgien do kości. Jako że tempo tworzenia przez osteoblasty kości grubowłóknistej jest dużo szybsze niż kości drobnowłóknistej, powstaje ona w przypadku złamań, tworząc kostninę pierwotną. Z czasem zostaje zastąpiona przez kość wtórną w procesie przebudowy (105). 37

38 W przeciwieństwie do kości grubowłóknistej kość drobnowłóknista charakteryzuje się regularnym, równoległym układem włókien kolagenowych, tworzących blaszki zapewniające jej odpowiednią mechaniczną wytrzymałość. Tkanka kostna drobnowłóknista występuje w dwóch postaciach, jako tkanka kostna gąbczasta i tkanka kostna blaszkowata (105). Tkanka kostna gąbczasta występuje w nasadach i częściach przynasadowych kości długich oraz stanowi zrąb kręgów, kości krótkich i płaskich. W nasadach i częściach przynasadowych kości długich zbudowana jest z beleczek wykazujących różną grubość i kierunkowy uporządkowany przebieg upodabniający się do łuków gotyckich. Taki układ zapewnia kości dużą wytrzymałość na nacisk. Powierzchnię beleczek pokrywa śródkostna, zawierająca liczne komórki osteogenne, a przestrzenie pomiędzy nimi wypełnia czerwony szpik kostny (105). W przypadku osteoporozy pomenopauzalnej tkanka kostna gąbczasta narażona jest na utratę masy kostnej w większym stopniu niż nieaktywna metabolicznie kość zbita. Badania wykazały, że utrata masy kostnej w przypadku kości gąbczastej może dochodzić nawet do 7% rocznie w ciągu pierwszych 5 lat po menopauzie (146). Tkanka kostna blaszkowata, zwana także zbitą tworzy trzony kości długich oraz zewnętrzną warstwę kości krótkich i płaskich. Odznacza się ona złożonym układem blaszek oraz obecnością osteonów. Wyróżniamy blaszki kostne: podstawowe zewnętrzne, leżące tuż pod okostną, tworząc zewnętrzną warstwę kości zbitej, podstawowe wewnętrzne, położone pod śródkostną, tworząc wewnętrzną warstwę kości zbitej, ograniczającą jamę szpikową systemowe, czyli blaszki osteonu ułożone koncentrycznie na kształt cylindrów wokół kanału z naczyniem krwionośnym, tworząc osteon będący podstawową jednostką morfologiczno-czynnościową kości zbitej, międzysystemowe, będące pozostałością po przebudowanych osteonach (105). Toczący się w tkance kostnej blaszkowatej proces osteoporozy powoduje znaczne ścieńczenie blaszek kostnych zarówno systemowych jak i międzysystemowych. 38

39 Osteon jest walcem utworzonym z koncentrycznie ułożonych blaszek, przebiegającym wzdłuż długiej osi kości. W centrum znajduje się kanał osteonu z naczyniami krwionośnymi (naczynia włosowate lub małe żyły) i nerwami otoczonymi tkanką łączną wiotką. Poprzez kanały odżywcze osteony są połączone z jamą szpikową oraz z powierzchnią kości. Włókna kolagenowe w poszczególnych blaszkach biegną równolegle względem siebie, natomiast w blaszkach sąsiadujących układają się pod różnymi kątami. Wytrzymałość mechaniczna kości, a także jej odporność na złamania wynika z cylindrycznego układu blaszek, naprzemiennego przebiegu oraz wyprostnego systemu włókien kolagenowych w poszczególnych blaszkach systemowych. Osteocyty leżą w jamkach kostnych, znajdujących się na styku dwóch blaszek. Od jamek odchodzą kanaliki kostne, w których znajdują się wypustki osteocytów i płyn śródtkankowy. Zaburzenia w krążeniu krwi i płynu śródtkankowego powodują obumieranie osteonów, na miejscu których tworzone są nowe. Jest to rezultat trwającego przez całe życie osobnicze procesu przebudowy i modelowania kości (105). Kość zbita narażona jest na utratę masy kostnej głównie w przypadku osteoporozy wtórnej, spowodowanej nerkową utrata wapnia w hiperkalciurii (25). Zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie kości pokryte są warstwą tkanki łącznej włóknistej, określanej odpowiednio okostną i śródkostną (105). Okostna pokrywa zewnętrzne powierzchnie kości z wyjątkiem powierzchni stawowych. Jest ona dobrze unaczyniona błoną łącznotkankową, zbudowaną z tkanki łącznej zbitej splotowatej. Jest ona przymocowana do kości za pomocą pęczków włókien kolagenowych, zwanych włóknami wnikającymi. W okostnej wyróżnia się dwie warstwy: leżącą na zewnątrz, relatywnie grubszą warstwę włóknistą oraz przylegającą bezpośrednio do powierzchni kości warstwę rozrodczą zawierającą komórki osteogenne (105). Śródkostna pokrywa powierzchnię beleczek tkanki kostnej gąbczastej, wyściela jamę szpikową, kanały osteonów i kanały odżywcze. Tworzy ją warstwa płaskich i nieaktywnych komórek osteogennych. Komórki osteogenne znajdujące się w kanałach osteonów stanowią źródło osteoblastów dla nowo tworzących się osteonów podczas procesu przebudowy kości (105). W przypadku osteoporozy typu II oba rodzaje tkanki kostnej są narażone na utratę masy kostnej w jednakowym stopniu. Obserwuje się ścieńczałe beleczki kości 39

40 gąbczastej lub też całkowity ich zanik. Kanały osteonów są poszerzone, warstwa korowa kości długich jest cienka, ale zewnętrzna średnica ich trzonów ma wymiary prawidłowe. Badania wykonane u osób z osteoporozą pomenopauzalną, jak i starczą wykazały zwiększenie powierzchni objętej procesem osteoresorpcji. Pomiary szybkości nawarstwiania tkanki kostnej i ośrodków przebudowy u osób z zaawansowaną osteoporozą wykazały zmniejszenie ilości ośrodków przebudowy, szybkości tworzenia tkanki kostnej i ilości osteonów, a zwiększenie obszaru resorpcji na powierzchniach śródkostnych (50) Proces przebudowy kości W kontekście problemów związanych z występowaniem osteoporozy ważnym zagadnieniem jest proces przebudowy kości, na który składają się dwa etapy: osteoresorpcja i osteogeneza. W warunkach fizjologicznych oba procesy przebiegają w sposób ciągły z zachowaniem homeostazy tkanki kostnej. Zaburzenie naturalnej równowagi pomiędzy tymi procesami prowadzi do wystąpienia stanów patologicznych. Podczas życia osobniczego kość ulega permanentnej resorpcji i odbudowie, a tempo obrotu wapnia w ciągu roku wynosi u dzieci 100%, a u dorosłych 18%. Roczny obrót kostny zależny jest od powierzchni kości, a więc i od rodzaju kości. Szacuje się, że w przypadku kości zbitej wynosi on 4%, podczas gdy w przypadku kości gąbczastej aż 20%. Nie dziwi zatem fakt, że kręgi są miejscem dużo bardziej narażonym na występowanie osteoporozy niż pozostałe elementy szkieletu. Na fizjologiczny proces remodelingu kości wpływa poziom wapnia i fosforu we krwi, poziom hormonów, zwłaszcza estrogenów i androgenów oraz zjawiska mechaniczne (siły fizyczne, nacisk na kość) (64). Remodeling jest główną aktywnością wykazywaną przez komórki w dojrzałym szkielecie (113, 119). Remodeling tkanki kostnej jest procesem wieloetapowym. Na cykl przebudowy wewnętrznej tkanki kostnej składają się następujące fazy: spoczynku, resorpcji, odwrócenia i tworzenia (64). Osteoresorpcja rozpoczyna się od pozyskania prekursorów osteoklastów, ich fuzji w komórki wielojądrzaste, migracji do miejsc resorpcji, adhezji do zmineralizowanej powierzchni kości oraz aktywacji resorpcji tkanki kostnej (159). Osteoklasty pochodzą z niedojrzałych prekursorów linii monocytowo-makrofagowej, a ich powstawanie zależne jest od takich czynników jak cytokiny (CSF, IL-1, IL-6, TNF), czynniki wzrostowe (TGF) czy hormony (PTH, 1,25(OH)D 3, kalcytonina). 40

41 Następną fazą jest resorpcja tkanki kostnej. Osteoklasty resorbują macierz, powodując powstanie zatok erozyjnych, co doprowadza do wypłukania jonów wapnia i degradacji macierzy kostnej. Konsekwencją tego procesu jest uwolnienie odpowiednich polipeptydowych czynników wzrostu, co skutkuje zahamowaniem osteoresorpcji, rekrutacją prekursorów osteoblastów, które zasiedlają zatoki erozyjne, rozpoczynając proces osteogenezy. Osteoblasty syntetyzują nową macierz, podlegającą procesowi dojrzewania, a następnie mineralizacji. Powstają osteony pierwotne, które z czasem w procesie przebudowy zostają zastąpione przez osteony wtórne (165). Ponieważ osteoresorpcja i osteogeneza są procesami stosunkowo szybko przebiegającymi, a czas wymagany na pojawienie się osteoblastów jest długi, każdy wzrost szybkości przebudowy kości może doprowadzić do spadku masy kostnej (119). Pomiędzy 20 a 30 rokiem życia zachowana jest równowaga pomiędzy procesami osteogenezy a osteoresorpcji, co pozawala to na utrzymanie względnie stałej masy kostnej (4). Osteoporoza pojawia się, gdy ostra resorpcja kości jest zbyt szybka lub gdy osteogeneza zachodzi zbyt wolno. Następuje to na skutek zwiększenia ilości i aktywności metabolicznej osteoklastów przy jednoczesnym spadku ilości i aktywności osteoblastów, a także ilości osteocytów na skutek ich wzmożonej apoptozy Podsumowanie Bisfosfoniany są głównymi czynnikami farmakologicznymi przeciwko osteoklastycznej utracie masy kostnej wywołującej osteoporozę, chorobę Paget a czy w leczeniu przerzutów nowotworowych do kości, szpiczaka mnogiego, jak i hiperkalcemii. Są one powszechnie stosowane także przy spadku gęstości kości czy wrodzonej łamliwości kości. Od momentu ich wprowadzenia do praktyki klinicznej bisfosfoniany są używane w coraz szerszym spektrum zaburzeń szkieletu, a obecnie trwają badania nad możliwością ich zastosowania w przypadku innych chorób (38). Bisfosfoniany, które hamują resorpcję kości i zwiększają jej masę, stały się jedną z najważniejszych grup terapeutyków w leczeniu osteoporozy. Kolejne badania potwierdzają ich wysoką skuteczność w walce z chorobą. Stosowanie bisfosfonianów zarówno zabezpiecza przed utratą masy kostnej, jak i zwiększa BMD w szkielecie centralnym, redukując ryzyko wystąpienia złamań osteoporotycznych. 41

42 Obecnie bisfosfoniany są pierwszą i najskuteczniejszą linią obrony w walce z osteoporozą, stąd też wydaje się, że przyszłość należy również do tych związków. Poszukiwanie zatem nowych ulepszonych związków wydaje się być w pełni uzasadnione. Poszerzanie wiedzy na temat patogenezy osteoporozy oraz mechanizmów działania bisfosfonianów pozwala na tworzenie kolejnych, lepszych generacji terapeutyków. Celem jest stworzenie najbardziej optymalnego leku obarczonego jak najmniejszymi skutkami ubocznymi. 42

43 3. CEL PRACY 1. Wykazanie zmian histomorfologicznych zachodzących w tkance kostnej pod wpływem procesu wywołania osteoporozy, jak i podawania bisfosfonianów przy użyciu metod histologicznych, histochemicznych i ultrastrukturalnych. 2. Sprawdzenie wpływu bisfosfonianów na tkankę kostną osteoporotyczną owiec. 3. Oszacowanie, który z zastosowanych w doświadczeniu związków wykazuje najbardziej optymalne oddziaływanie na strukturę tkanki kostnej. 43

44 4. MATERIAŁY I METODY Praca doktorska jest częścią projektu EIT+ nr POIG /08/WCB/5/I/2010: Terapia chorób cywilizacyjnych innowacyjne leki przeciwrakowe i przeciw osteoporozie, w którym udział wzięły: Zakład Chemii Bioorganicznej Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej, Katedra i Klinika Chirurgii oraz Zakład Histologii i Embriologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Na przeprowadzenie badań zgodę wyraziła II Lokalna Komisja Etyczna do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach uchwałą nr 85/2009 z dn Wyżej wymieniony projekt daje nadzieję na znalezienie nowego bisfosfonianu o lepszych niż dotychczas opisanych właściwościach farmakologicznych. Badanie nowych bisfosfonianów stwarza także możliwość poznania mechanizmów działania tych leków. Pierwszym etapem doświadczenia, wykonanym przez pracowników Zakładu Chemii Bioorganicznej Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej, była synteza nowych, strukturalnie różnorodnych pochodnych kwasu aminometylenobisfosfonowego, analogów bisfosfonianu najnowszej generacji inkadronianu oraz zbadanie ich kompleksotwórczości wobec jonów metali. Spośród wszystkich zsyntetyzowanych związków do dalszych testów wybrano dwa cechujące się najwyższą aktywnością: ED 38 oraz ED 49. Ogólny wzór obu aminobisfosfonianów wygląda następująco: z tym, że dla ED 38 R=aryl lub aryl z heteroatomem, natomiast dla ED 49 R=alkil. Kolejny etap doświadczenia odbywał się z udziałem zwierząt i obejmował dwa podetapy: wywołanie osteoporozy u owiec, a następnie podanie grupom badanym nowych związków. Oba etapy doświadczenia przeprowadzono w Katedrze i Klinice Chirurgii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. 44

45 Ostatnim etapem, będącym przedmiotem pracy doktorskiej, była ocena histologiczna zmian tkanki kostnej zwierząt poddanych działaniu leków. Badanie przeprowadzono w Katedrze Biostruktury i Fizjologii Zwierząt, Zakładzie Histologii i Embriologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Doświadczeniu poddano samice owcy w wieku około 10 lat o wadze 30-45kg. Pierwszą (ED 38) i drugą (ED 49) grupę badaną stanowiły zwierzęta, którym podawano nowe związki. Każda z grup liczyła pięć owiec. Do celów monitorowania zmian zachodzących w organizmach zwierząt biorących udział w doświadczeniu utworzono grupę kontrolną dodatnią (PP) i ujemną (PN). Pierwszą z nich stanowiły dwie owce, u których wykonano zabieg owariektomii i poddano steroidoterapii, a następnie nie podawano nowych bisfosfonianów. Jej przeznaczeniem było umożliwienie obserwacji rozwijającego się procesu osteoporozy podobnego do osteoporozy pomenopauzalnej. Grupę kontrolną ujemną stanowiły dwie owce, u których nie przeprowadzono zabiegu owariektomii i nie poddano ich steroidoterapii. Były to owce zdrowe, dzięki którym możliwe było prowadzenie obserwacji prawidłowego histologicznego obrazu tkanki kostnej. Zwierzęta obu grup kontrolnych przetrzymywane były w takich samych warunkach jak owce obu grup badanych oraz podawano im takie samo pożywienie. W ostatnich latach prześledzono kilka strategii wywołania osteoporozy u zwierząt i owce wydają się być obiecującym modelem do badań związanych z tą chorobą. Są to zwierzęta łagodne, łatwe w utrzymaniu, a ich profil hormonalny jest zbliżony do kobiecego. Rozmiar szkieletu i jego podstawowa budowa anatomiczna jest zbliżona do ludzkiej. Budowa histologiczna tkanki kostnej oraz jej przebudowa u człowieka i owcy jest do siebie bardzo podobna. Usunięcie jajników u owiec indukuje chorobę, jednak badania wykazały, że spadek gęstości mineralnej kości jest zdecydowanie mniejszy w porównaniu do tego, który występuje u człowieka z osteoporozą. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń, mających na celu ocenę owcy jako modelu dla osteoporozy człowieka, opracowano kilka schematów indukcji choroby (44). Na podstawie powyższych badań w doświadczeniu został użyty jeden z wcześniej opracowanych modeli. Przed rozpoczęciem badań wszystkie owce zważono w celu późniejszego monitorowania zmian w ciężarze ciała zwierząt w trakcie trwania eksperymentu. Owce 45

46 umieszczono w boksach o powierzchni 10m² po dwie sztuki w celu ograniczenia ich aktywności fizycznej. Zwierzęta karmiono dwa razy dziennie sianem w celu utrzymania diety ubogiej w białko. Dostęp do świeżej wody był nieograniczony. Proces badawczy rozpoczął się od wykonania zabiegu owariektomii. Przed zabiegiem od każdej z owiec pobrano krew do badań hematologicznych i biochemicznych w celu ustalenia wyjściowych parametrów krwi. Zwierzęta premedykowano ksylazyną w dawce 0,25 mg/kg m.c. i.m. Po zakłuciu dożylnym (vena cephalica antebrachii) znieczulenie ogólne otrzymano stosując vetbutal w dawce wstępnej 8 mg/kg, a następnie podaż kontynuowano wg efektu działania. Analgezję otrzymano drogą znieczulenia podpajęczynówkowego lignokainą 2,0% w ilości 3-5 ml/owcę. Po 18 dniach od zabiegu rozpoczęto podawanie methyloprednisolonu w dawce 150 mg/owcę i.m. Lek podano 4-krotnie w odstępach 20-dniowych. Przed zaaplikowaniem leku wykonano badania radiologiczne kości piszczelowej każdej z owiec w dwóch projekcjach - bocznej i strzałkowej w celu uwidocznienia struktury kostnej. Ponadto wykonano powtórne hematologiczne i biochemiczne badania krwi. Za każdym razem przed podaniem leku wykonywano badania krwi w celu dokładnego monitorowania zmian. Po 40 dniach od ostatniego podania leku sterydowego wykonano kolejny raz badanie rentgenowskie kości piszczelowej w dwóch projekcjach, a następnie przeprowadzono biopsję kości z guzowatości kości piszczelowej. Wycinki kostne pobrano przy użyciu trepanów (trefiny) o diamentowych końcówkach, średnicy 9 mm. Do zabiegu zwierzęta zostały spremedykowane ksylazyną w dawce 0,25 mg/kg m.c., i.v. Po zakłuciu dożylnym (vena cephalica antebrachii) znieczulenie ogólne otrzymano stosując vetbutal w dawce wstępnej 8 mg/kg, a następnie podaż kontynuowano wg efektu działania. Analgezję otrzymano stosując znieczulenie podpajęczynówkowe przy zastosowaniu lignokainy 2,0% w ilości 3-5 ml/owcę. Następnie zwierzętom podawano bisfosfoniany ED 38 i ED 49 sondą bezpośrednio do żacza w dawce 35 mg/owcę. Nowe związki podano 10 razy w odstępach 7-dniowych. Po 2 miesiącach od podania ostatniej dawki bisfosfonianów zakończono eksperyment, a zwierzęta poddano eutanazji. Owce premedykowano ksylazyną 46

47 podawaną domięśniowo w dawce 2 ml/owcę, a następnie dożylnie podano morbital w dawce 10 ml/owcę Przygotowanie materiału do badań morfologicznych Bioptaty kostne pobrane z guzowatości kości piszczelowej a także fragmenty kości piszczelowej i żuchwy poddano badaniu w skaningowym mikroskopie elektronowym Do badań w skaningowym mikroskopie elektronowym materiał kostny utrwalano w 3,5% roztworze aldehydu glutarowego na 0,1M buforze fosforanowym o ph 7,2-7,4 przez 3 godziny. Następnie płukano w/w buforze i utrwalono w 1,0% roztworze czterotlenku osmu, sporządzonego na bazie 0,1M buforu fosforanowego. Tak przygotowany materiał odwodniono w szeregu alkoholowo acetonowym, a następnie napylano złotem i suszono. Materiał analizowano w skaningowym mikroskopie elektronowym LEO-Zeiss 435, wyposażonym w przystawkę Roentec do mikroanalizy rentgenowskiej. Do badań histologicznych od każdej owcy pobrano fragmenty kości udowej, ramieniowej, kręgu lędźwiowego oraz żuchwy. Pobrany materiał do badań histologicznych poddano konserwacji w 4,0% zobojętnionym roztworze formaliny przez okres 21 dni, a następnie odwapniono w następujących po sobie kąpielach wg schematu: 10% wersenian sodu 21 dni woda destylowana 24 godziny mieszanina kwasu mrówkowego i cytrynianu sodu 30 dni woda destylowana 24 godziny. Materiał kostny po takim opracowaniu chemicznym odwadniano i zatapiano w parafinie. Skrawki seryjne o grubości 6,0 µm barwiono wg następujących metod: 1. Hematoksylina i eozyną wg Delafielda 2. Barwienie wg van Gieson a 3. Barwienie wg Goldner a-masson a 4. Barwienie wg von Koss a Barwienie HiE jest metodą przeglądową, która pozwala na zaobserwowanie ogólnej morfologii tkanki kostnej. Dzięki tej metodzie możliwe było obserwowanie 47

48 różnic pomiędzy tkanką kostną zdrową i osteoporotyczną oraz tkanką obu grup badanych. Zastosowanie barwienia wg van Gieson a w morfometrii umożliwiło zliczenie ilości osteonów pierwotnych i wtórnych, a także zmierzenie grubości blaszek systemowych i międzysystemowych tkanki kostnej. Celem użycia tej metody było dokonanie pomiarów, które pozwoliły na statystyczne oszacowanie zmian zachodzących we wszystkich grupach badanych. Barwienia wg Goldner a-masson a i von Koss a miało na celu obserwację stopnia zmineralizowania tkanki kostnej. Ze względu na poprzedzający barwienie proces odwapniania metodę wg Goldner a-masson a oraz von Koss a należy traktować jako metodę jakościową, a nie ilościową. Ponieważ wszystkie skrawki traktowano w taki sam sposób, założono, że ilość wapnia, który został uwolniony podczas kąpieli odwapniających, jest taka sama. Po wstępnej analizie histologicznej przeprowadzono morfometrię struktur tworzących tkankę kostną. Parametrami branymi pod uwagę były: liczba osteonów pierwotnych kości ramieniowej w polu widzenia przy powiększeniu 200x; liczba osteonów wtórnych kości ramieniowej w polu widzenia przy powiększeniu 200x; grubość blaszek systemowych osteonów pierwotnych kości ramieniowej; grubość blaszek systemowych osteonów wtórnych kości ramieniowej; grubość blaszek międzysystemowych kości ramieniowej; liczba osteonów pierwotnych kości udowej w polu widzenia przy powiększeniu 200x; liczba osteonów wtórnych kości udowej w polu widzenia przy powiększeniu 200x; grubość blaszek systemowych osteonów pierwotnych kości udowej; grubość blaszek systemowych osteonów wtórnych kości udowej; grubość blaszek międzysystemowych kości udowej; grubość beleczek kostnych w trzonie kręgu lędźwiowego. 48

49 Do analizy statystycznej otrzymanych danych użyto pakietu Statistica 9.1 firmy StatSoft Inc. Poddano je analizie wariancji (ANOVA) porównując 4, a w dwóch przypadkach 3, grupy PN, PP, ED 38, ED 49. W przypadku, gdy analiza wariancji pozwalała na odrzucenie hipotezy o równych średnich we wszystkich grupach, dokonano dalszej analizy (post-hoc) testem Tukey a w wersji dla grup o różnych liczebnościach celem stwierdzenia, między którymi grupami występują statystycznie istotne różnice na poziomie 5%. Wyniki w postaci wykresów średnich wraz z 95% przedziałami ufności oraz tabel prawdopodobieństwa poszczególnych testów post-hoc zaprezentowano na stronach

50 5. WYNIKI 5.1. Żuchwy Do najpoważniejszych skutków ubocznych podawania bisfosfonianów należy martwica żuchwy. Po zakończeniu eksperymentu od zwierząt grup badanych pobrano fragmenty materiału kostnego i przeprowadzono badania histologiczne i ultrastrukturalne w celu skontrolowania tkanki kostnej żuchwy. Badania wykonane w skaningowym mikroskopie elektronowym fragmentów żuchwy zwierząt grupy badanej ED 38 wykazały prawidłowy przebieg blaszek kostnych w części korowej żuchwy (tab. 1, zdj. A, B, C). W obrazie obserwowano ścisłe przyleganie do siebie poszczególnych blaszek kostnych (tab. 1, zdj. C), nie stwierdzono rozwarstwień pomiędzy nimi. Beleczki kostne w obszarze tkanki kostnej gąbczastej (tab. 1, zdj. B) również przedstawiają prawidłowy obraz. Na powierzchni beleczek kostnych obecne są komórki śródkostnej oraz elementy szpiku kostnego. Obraz ultrastrukturalny w grupie badanej ED 49 jest zbliżony do grupy poprzedniej. Tutaj również tkanka kostna wykazuje prawidłową budowę, z tym że obserwuje się delikatne rozwarstwienia pomiędzy strefą korową a tkanką kostną gąbczastą (tab. 2, zdj. B). Analiza histologiczna tkanki kostnej żuchwy w obu grupach badanych nie wykazała nekrozy. Obrazy histologiczne wskazują na toczący się proces naprawczy (tab. 3, zdj. A, tab. 4, zdj. C). Zarówno obrazy uzyskane w barwieniach HiE, jak i wg Goldner a-masson a i van Gieson a wskazują na zachodzący proces mobilizacji osteogennej (tab. 3, zdj. A, B, C, tab. 4. zdj. A, B, C). Dowodem na to jest zwiększony napływ pluripotencjalnych komórek osteogennych w strefie przebudowującej się tkanki kostnej. W niektórych miejscach wokół istniejących obszarów tkanki kostnej grubowłóknistej pojawiają się osteoblasty oraz osteoklasty zmieniające istniejące struktury tkanki kostnej. Następuje proces przebudowy i modelowania jej struktur Kość piszczelowa W celu określenia zmian zachodzących podczas procesu indukcji osteoporozy i podjęciu decyzji o rozpoczęciu podawania związków od zwierząt wszystkich grup pobrano biopsje z guzowatości kości piszczelowej i poddano je analizie ultrastrukturalniej. Po zakończeniu trwania eksperymentu również fragmenty kości 50

51 piszczelowej poddano badaniom ultrastrukturalnym, co umożliwiło obserwacje zmian zachodzących pod wpływem podawanych związków. Analiza ultrastrukturalna kości piszczelowej w grupie kontrolnej negatywnej (PN) wykazała w strefie kości korowej regularnie układające się blaszki kostne o równoległym układzie (tab. 5, zdj. C). W preparatach widoczne są kanały odżywcze, wokół których koncentrycznie układają się blaszki systemowe (tab. 5, zdj. B). W obszarze kości gąbczastej komórki szpiku kostnego przylegają do śródkostnej (tab. 5, zdj. A). Blaszki kostne oraz przestrzenie w tej strefie wykazują prawidłowy obraz. Obrazy ultrastrukturalne biopsji pobranych z guzowatości kości piszczelowej po wywołaniu osteoporozy u zwierząt w grupie kontrolnej dodatniej (PP) oraz w obu grupach badanych (ED 38 i ED 49), a także fragmenty kości piszczelowych zwierząt kontroli dodatniej po zakończeniu eksperymentu są do siebie zbliżone i przedstawiają obraz rozwiniętej osteoporozy (tab. 7, zdj. A, B, C, tab. 9, zdj. A, B, C). W strefie kości korowej występują delikatne rozwarstwienia blaszek kostnych (tab. 2 zdj. B). Szczególnie dobrze jest to widoczne w obszarze styku tkanki kostnej gąbczastej i tkanki kostnej zbitej. W strefie tkanki kostnej gąbczastej beleczki wykazują wyraźne ścieńczenia i poszerzenie przestrzeni pomiędzy blaszkami (tab. 7, zdj. C). Po zakończeniu podawania związków w grupie badanej ED 38 obserwowano ścisłe przyleganie do siebie blaszek kostnych. Pogranicze obu stref, kości korowej i gąbczastej, jest ze sobą ściśle zespolone (tab. 8, zdj. C). Tkanka kostna gąbczasta przedstawia obraz bardziej korzystny, porównywalny z obrazem kości zdrowej. W grupie badanej ED 49 w obszarze kości korowej pomiędzy blaszkami kostnymi rysują się delikatne przestrzenie obrazujące rozwarstwienia (tab. 10, zdj. C, D). W obszarze śródkostnej widoczne są przylegające, liczne komórki szpiku kostnego, a także komórki samej śródkostnej. Pomiędzy beleczkami kości gąbczastej występują poszerzenia (tab. 10, zdj. B) Analiza histologiczna Grupa kontrolna negatywna (PN) Analiza histologiczna fragmentów kości ramieniowej i udowej zwierząt kontroli negatywnej wykazała prawidłową budowę tkanki kostnej. Najbardziej zewnętrzną strefę stanowią blaszki podstawowe zewnętrzne (tab. 13, zdj. B, tab. 17, zdj. A) o wyprostnym układzie blaszek kolagenowych. W strefie tej widoczne są fibrocyty, 51

52 fibroblasty, a także komórki kostne osteocyty. W obrazie mikroskopowym obserwuje się licznie występujące osteony wtórne, które są strukturami wieloblaszkowymi o prawidłowym przebiegu włókien kolagenowych (tab. 11, zdj. A, B, D, tab. 15, zdj. A, B, D, tab. 16, zdj. A, B, C). Pomiędzy blaszkami osteonów widoczne są osteocyty. W centrum osteonu znajduje się kanał osteonu, a w nim małe naczynie krwionośne. Pomiędzy osteonami znajdują się blaszki międzysystemowe o typowym dla zdrowej kości układzie, będącym efektem przebudowy i modelowania kości (tab. 11, zdj. A, B, C, D, tab. 16, zdj. D). Obecność blaszek międzysystemowych dowodzi zachowania równowagi pomiędzy procesami osteoresorpcji i osteogenezy i jest efektem przebudowy kości. Blaszki międzysystemowe świadczą o utrzymaniu homeostazy tkanki kostnej. Ostatnią obserwowaną strefą są blaszki podstawowe wewnętrzne o prawidłowym falistym układzie. Barwienie HiE wykazało licznie uformowane wtórne osteony (tab. 11, zdj. A, B, D tab. 15, zdj. B, C) pomiędzy którymi widnieją blaszki międzysystemowe, będące efektem zbilansowanej przebudowy i modelowania kości (tab. 11, zdj. A, B, C, D). Barwienie wg van Gieson a wykazało, że blaszki osteonów wtórnych posiadają wyraźnie zaznaczony układ, układając się koncentrycznie wokół kanału osteonu (tab. 12, zdj. B, tab. 16, zdj. B, C). Blaszki międzysystemowe również wykazują regularność układu, co jest dowodem na prawidłowo funkcjonującą kość (tab. 12, zdj. A, tab. 16, zdj. D). W obrazie histologicznym skrawków barwionych wg Goldner a-masson a na uwagę zwraca zróżnicowanie topograficzne, wyraźnie wskazujące na obszary kości zmineralizowanej (kolor zielony) i niezmineralizowanej macierzy (kolor czerwony) (tab. 13, zdj. A, C, tab. 18, zdj. B, C). Pod okostną, a więc w strefie blaszek podstawowych zewnętrznych, w preparatach dominuje kolor czerwony, świadczący o intensywnej przebudowie i modelowaniu tkanki kostnej (tab. 13, zdj. B, tab. 17, zdj. A). W głębszych strefach obserwuje się głównie obszary kości zmineralizowanej. Jedynie w strefach obwodowych osteonów oraz blaszkach międzysystemowych występują niewielkie obszary przebudowy tkanki kostnej (tab. 13, zdj. A, tab. 18, zdj. B, C). Trzony kręgów zbudowane są z tkanki kostnej gąbczastej. Beleczki kostne tej tkanki ograniczają przestrzenie wypełnione szpikiem kostnym czerwonym. 52

53 W barwieniu HiE fragmentów trzonu kręgu lędźwiowego widoczne są komórki hemopoetyczne i osteopoetyczne przylegające do blaszek wewnętrznych (tab. 19, zdj. B, C, D). W obrazie histologicznym obserwuje się intensywną mobilizację komórek osteogennych (tab. 19, zdj. B, C, D). Strefy i granice między blaszkami ograniczone są liniami demarkacyjnymi (tab. 19, zdj. C, D, tab. 20, zdj. A), co może stanowić dowód na przebudowującą się kość. Taki obraz tkanki kostnej gąbczastej wskazuje na prawidłowo toczące się procesy modelowania kości. Charakterystyczną cechą tak zachowującej się tkanki kostnej są strefy osteoresorpcji i osteogenezy, pozostające ze sobą w równowadze. W preparatach histologicznych barwionych wg van Gieson a obserwuje się nabudowujące blaszki kostne od strony wewnętrznej (tab. 22, zdj. A) czyli od ściany odgraniczającej przestrzenie szpiku kostnego. W strefie pośredniej obecne są obszary poddane przebudowie wewnętrznej i modelowaniu. Pomiędzy powstającymi blaszkami kostnymi a strefą modelowania występuje koncentracja osteoblastów (tab. 22, zdj. A). Trzon kręgów charakteryzuje się w niektórych miejscach tym, że wśród tkanki kostnej gąbczastej widnieją pojedyncze osteony (tab. 22, zdj. A, B). Jest to strefa tkanki kostnej, gdzie następuje połączenie dwóch rodzajów kości (kości blaszkowatej i gąbczastej). W preparatach obserwuje się także pojedyncze strefy osteoresorpcji (tab. 21, zdj. C). W barwieniu wg von Koss a w preparatach widoczne są obszary toczącej się mineralizacji (kolor czarny). Najwyraźniej obszary te są uwidocznione w strefie środkowej blaszek rozgraniczających przestrzenie szpiku kostnego (tab. 23, zdj. A, B). W strefach zewnętrznych proces mineralizacji jest słabo wyrażony (kolor różowy) i postępuje w kierunku strefy pośredniej (tab. 23, zdj. B) Grupa kontrolna pozytywna (PP) Analiza histologiczna skrawków pobranych z kości ramieniowej i udowej barwionych HiE wykazała, że w miejscach wzmożonej osteoresorpcji znajdują się komórki uczestniczące w tym procesie czyli osteoklasty i makrofagi. Ubytek masy kostnej jest równoważony wzmożonym napływem komórek osteoblastycznych. Liczne osteony pierwotne znajdujące się w fazie formowania przedstawiają słabo wyraźny układ blaszek systemowych, których ilość jest niewielka (tab. 24, zdj. A, tab. 25, zdj. A, tab. 29, zdj. A, B). W obszarze blaszek międzysystemowych widoczne są liczne, duże ogniska osteoresorpcji. Układ blaszek międzysystemowych jest zaburzony poprzez 53

54 licznie występujące pomiędzy nimi rozwarstwienia. Struktury te mają także mniej regularny przebieg. Barwienie wg van Gieson a wskazuje na wyraźnie ścieńczenie blaszek systemowych i międzysystemowych (tab. 26, zdj. A, B, tab. 27, zdj. A, B). W obrazie histologicznym strefy blaszek międzysystemowych wyraźnie widoczne są przeważające ogniska osteoresorpcji (tab. 26, zdj. C, tab. 30, zdj. B). Blaszki międzysystemowe są słabo zarysowane w obrazach histologicznych, a także wykazują zaburzenia w ich układzie. Tutaj również na plan pierwszy wysuwają się osteony pierwotne, składające się z kilku blaszek systemowych przedstawiających słabo wyraźny zarys. Zarówno w obrazie histologicznym skrawków barwionych HiE, jak i wg van Gieson a dominują osteony pierwotne (tab. 25, zdj. A, B, tab. 26, zdj. A, B, C, tab. 29, zdj. A, B, tab. 30, zdj. A, B). W obrazach histologicznych zarówno kości ramieniowej, jak i udowej nie obserwuje się osteonów wtórnych, które uległy resorpcji. W obrazie histologicznym skrawków barwionych wg Goldner a-masson a również dominują osteony pierwotne (tab.28, zdj. A, B, C, D, tab. 31, zdj. A, B), złożone z dwóch do pięciu blaszek. Blaszki systemowe są mało wyraźnymi strukturami. Uwagę zwracają bardzo liczne osteoblasty, znajdujące się zarówno w strefie tworzących się blaszek, jak również w obszarach pomiędzy osteonami. Praktycznie nie występują osteony wtórne. Kość przedstawia stan wzmożonej osteoresorpcji, zlokalizowany na peryferium osteonów, a także pomiędzy blaszkami międzysystemowymi i podstawowymi (tab. 28, zdj. C, D). Blaszki międzysystemowe są słabo widoczne z powodu licznych ognisk osteoresorpcji, a także wykazują zaburzenie struktury kości. W obrazie histologicznym fragmentów trzonu kręgu lędźwiowego barwionych HiE beleczki tkanki kostnej gąbczastej są wyraźnie zróżnicowane względem profilu i ich grubości. Jedne są wyraźnie cienkie, inne natomiast znajdują się w stanie formowania, a są także takie, gdzie stwierdza się strefy osteoresorpcji (tab. 32, zdj. A). Pluripotencjalne komórki hematogenne i osteogenne (tab. 32, zdj. B, C, D), przylegające do powierzchni wewnętrznej beleczek i uczestniczące w tworzeniu blaszek, tworzą charakterystyczne wyspy, na obrzeżu których widnieją obszary powstającej tkanki kostnej pierwotnej (tab. 32, zdj. A, B, C). Nielicznie występujące osteony stanowią populację osteonów pierwotnych (tab. 32, zdj. B, C, D), znajdujących 54

55 się zasadniczo w fazie tworzenia. Na peryferium tych struktur znajdują się jamki osteoresorpcyjne, w pobliżu których tworzą się nowe blaszki kostne (tab. 32, zdj. B). Barwienie wg van Gieson a wykazało, że blaszki kostne kości gąbczastej są wyraźnie cieńsze niż w przypadku zwierząt grupy kontrolnej ujemnej. Zauważa się także, że są one poprzedzielane strefami osteoblastów. Dotyczy to szczególnie blaszek rozgraniczających przestrzenie szpiku kostnego (tab. 33, zdj. D). W strefach pośrednich tkanka kostna ulega wyraźnej osteoresorpcji (tab. 33, zdj. A). Stwarza to wrażenie osłabienia struktury. Sporadycznie występujące osteony również przedstawiają struktury osteonów pierwotnych (tab. 33, zdj. A). Obecność osteonów, a więc elementów tkanki kostnej blaszkowatej w obrębie kości gąbczastej ma na celu wzmocnienie wytrzymałości biomechanicznej kręgów. Jako że obserwowane w preparatach osteony są generacją osteonów pierwotnych, ich zasadnicza funkcja nie jest spełniona. W barwieniu wg von Koss a, które uwidacznia proces mineralizacji (kolor czarny), nie obserwuje się stref kości zmineralizowanej. Stąd też w preparatach histologicznych fragmenty trzonu kręgu lędźwiowego wybarwiły się na kolor różowy, świadczący o braku zawartości wapnia w kości. W skrawkach barwionych tą metodą dostrzega się jedynie formującą się tkankę kostną gąbczastą z dużą koncentracją osteoblastów oraz osteoklastów. Koncentracja pluripotencjalnych komórek osteogennych jest podobna jak w kości zdrowej, ale procesy osteogenezy są słabiej wyrażone (tab. 34, zdj. A, B) Grupa badana ED 38 Obraz histologiczny fragmentów kości ramieniowej w barwieniu HiE przedstawia toczący się proces naprawczy. Dominują tu osteony pierwotne (tab. 35, zdj. B, C, tab. 36, zdj. C), pomiędzy którymi stwierdza się ogniska osteoresorpcji (tab. 35, zdj. A, B, tab. 36, zdj. A, B). Struktury te zbudowane są z kilku blaszek systemowych, dobrze widocznych w preparatach histologicznych. W obrazach widoczne są liczne nowo formujące się osteony, wokół których powstają nowe blaszki systemowe. Nieliczne z osteonów pierwotnych znajdują się w fazie przebudowy z widocznie zachodzącym procesem osteoresorpcji (tab. 35, zdj. C). Na peryferiach wysp osteoresorpcyjnych notuje się liczne osteoblasty uczestniczące w procesie naprawczym (tab. 35, zdj. B). Dochodzi więc do powstawania nowych osteonów, początkowo dwu-, 55

56 trzyblaszkowych. W strefie pomiędzy powstałymi osteonami istnieją jeszcze blaszki międzysystemowe, które w swoich strefach biegunowych również ulegają osteoresorpcji (tab. 35, zdj. A, B, tab. 36, zdj. A, B). Stanowi to miejsce dla tworzenia nowych struktur tkanki kostnej. Blaszki międzysystemowe przybierają ponownie regularny układ, a nieliczne ogniska osteoresorpcji świadczą o odbudowie tej strefy. Osteony wtórne to struktury wieloblaszkowe o wyraźnie koncentrycznym układzie blaszek systemowych (tab. 36, zdj. B). W barwieniu wg van Gieson a - które ujawnia głównie układ blaszek kostnych obserwuje się ogniska osteoresorpcji (tab. 37, zdj. A, C) oraz powstawanie nowych osteonów (tab. 37, zdj. A, B, C, D). Wokół nowo formujących się osteonów obserwuje się powstawanie nowych blaszek systemowych, przybierających wyraźny koncentryczny układ (tab. 37, zdj. D). Wyspy osteoresorpcji zlokalizowane są głównie pomiędzy istniejącymi blaszkami międzysystemowymi a powstałymi osteonami pierwotnymi (tab. 37, zdj. C). Blaszki międzysystemowe wykazują regularny układ, zbliżony do prawidłowego występującego w tkance kostnej zdrowej (tab. 37, zdj. C, D). W obszarze blaszek międzysystemowych widoczny jest proces powstawania nowych struktur. W obrazie histologicznym skrawków barwionych wg Goldner a-masson a widnieją strefy osteoresorpcji (tab. 38, zdj. B) oraz ogniska powstawania nowych osteonów (tab. 38, zdj. A). W strefie tworzących się blaszek kostnych notuje się strefy niepełnej mineralizacji (kolor czerwony) (tab. 38, zdj. B). Można więc sądzić, że są to nowo powstałe blaszki i proces mineralizacji nastąpi z biegiem czasu. Z podobną sytuacją spotykamy się w podczas powstawania nowych osteonów, które są zmineralizowane w około 30-40% (tab. 38, zdj. D). Osteony wtórne są strukturami wieloblaszkowymi o regularnym, koncentrycznym układzie blaszek systemowych (tab. 38, zdj. D). Na obrazach histologicznych przekrojów poprzecznych osteonów pierwotnych występuje zróżnicowana odcinkowa mineralizacja. W strefie peryferyjnej przebudowujących się osteonów wtórnych dostrzega się ogniska osteoresorpcji (kolor czerwony) (tab. 38, zdj. C). W przypadku kości udowej obraz histologiczny w barwieniu HiE przedstawia formujące się osteony pierwotne (tab. 39, zdj. C, tab. 40, zdj. A). Na peryferium powstających osteonów występują liczne zatoki resorpcyjne, świadczące o zachodzącym procesie przebudowy struktur (tab. 39, zdj. C). Nowo powstające 56

57 osteony to zazwyczaj struktury zawierające od dwóch do czterech blaszek. Występujące w obrazie histologicznym osteony wtórne są strukturami wieloblaszkowymi (tab. 39, zdj. A, B, C, tab. 40, zdj. A, B, C). Blaszki systemowe osteonów wtórnych wykazują regularny, koncentryczny układ. W obszarze blaszek międzysystemowych widoczne są ogniska osteoresorpcji, a także nowo powstające blaszki międzysystemowe. Istniejące już struktury tej strefy wykazują regularny układ. W strefie między powstającymi osteonami stwierdza się duże nagromadzenie ognisk osteoresorpcji oraz napływające osteoblasty. W barwieniu wg van Gieson a stwierdza się obszary osteoresorpcji w strefie blaszek międzysystemowych oraz na peryferium istniejących osteonów wtórnych (tab. 41, zdj. A, B, C). Blaszki międzysystemowe wykazują regularny, prawidłowy układ. Nowo formujące się osteony pierwotne wykazują wyraźny, koncentryczny układ blaszek systemowych (tab. 41, zdj. B, C). W barwieniu skrawków wg Goldner a-masson a w strefach pomiędzy formującymi się osteonami widnieją obszary osteoresorpcji (wybarwione na kolor ceglasto-czerwony) (tab. 43, zdj. B, C). W centralnej strefie obszarów osteoresorpcyjnych obserwuje się przejaśnienia oznaczające ogniska osteogenezy, a na ich obrzeżach skupiają się osteoblasty. Obserwowane osteony to generacja osteonów pierwotnych (tab. 42, zdj. C). W strefach formujących się osteonów zjawiska osteogenezy są wyeksponowane w postaci charakterystycznych wybarwień o różnym stopniu natężenia. Formujące się także osteony wtórne wykazują obrazy tkanki kostnej niezmineralizowanej (tab. 43, zdj. A, B, C). W barwieniu HiE skrawków trzonu kręgu lędźwiowego uwagę zwraca nabudowywanie się blaszek kostnych od strony śródkostnej (tab. 44, zdj. A, B, C). Na pograniczu strefy odbudowy obserwuje się nagromadzenie osteoblastów (tab. 44, zdj. A). W strefie pośredniej beleczek tworzących tkankę kostną gąbczastą notuje się miejsca osteoresorpcji oraz przebudowującą się tkankę kostną (tab. 45, zdj. B). Zauważa się pojedyncze, formujące się osteony (tab. 44, zdj. C). Komórki osteogenne, przylegające do blaszek kostnych po wewnętrznej stronie, rozpłaszczają się wąskim pasmem i przylegają do śródkostnej (tab. 45, zdj. B). W barwieniu wg van Gieson a obserwuje się cienkie nowo wytworzone blaszki kostne przylegające do śródkostnej (tab. 46, zdj. B). Blaszki ograniczające śródkostną są wysłane wąskim pasmem komórek osteogennych (tab. 47, zdj. B, D), które są 57

58 odpowiedzialne za tworzenie nowych struktur tkanki kostnej gąbczastej. Podobnie jak w barwieniu HiE w strefie pośredniej obserwuje się pojedyncze osteony (tab. 46, zdj. B, tab. 47, zdj. A). Na peryferium wytworzonych osteonów notuje się miejsca osteoresorpcji i przebudowy (tab. 47, zdj. A). Barwienie skrawków wg von Koss a wyraźnie uwidocznia w beleczkach kości gąbczastej strefy odbudowujących się blaszek kostnych (kolor różowy), które ograniczają śródkostną. Strefa pośrednia natomiast wykazuje wyraźnie zmineralizowaną kość (kolor czarny) (tab. 48, zdj. A). W tejże strefie, w miejscu występowania osteonów (tab. 48, zdj. B, C) obserwuje się wyraźne zróżnicowanie ich struktury. Strefa centralna skupiona wokół kanału osteonu jest zmineralizowana (kolor czarny), natomiast w pewnych miejscach obecne są miejsca niezmineralizowane (kolor różowy) (tab. 48, zdj. B). Spotyka się także nowo powstałe osteony wykazujące minimalny stopień zmineralizowania (tab. 48, zdj. C) Grupa badana ED 49 W barwieniu HiE fragmentów pobranych z kości ramieniowej obserwuje się bardzo liczne strefy osteoresorpcji (tab. 49, zdj. A, B, C), formujące się osteony pierwotne (tab. 49, zdj. A) oraz ogniska zagęszczenia osteoblastów. Osteony pierwotne wykazują mniej wyraźne blaszki systemowe, obrazem przypominające osteony pierwotne fragmentów kości pobranych w grupie kontroli pozytywnej. Duża część osteonów pierwotnych w obserwowanych obrazach wykazuje zachodzący w nich proces osteoresorpcji. Obraz histologiczny w porównaniu z grupą badaną ED 38 jest mniej korzystny ze względu na dominację obszarów osteoresorpcji w strefie blaszek międzysystemowych (tab. 49, zdj. A, B, C). Blaszki międzysystemowe wykazują mniej regularny układ w porównaniu z obrazami grupy badanej ED 38. Obserwowane osteony wtórne są mniej liczne oraz posiadają mniejszą ilość blaszek systemowych. W barwieniu wg van Gieson a stwierdza się liczne obszary osteoresorpcji (tab. 50, zdj. B, C, D). Na obrzeżach pól osteoresorpcyjnych pojawiają się pierwotne osteony zwykle trzy-, czteroblaszkowe (tab. 50, zdj. C, D). Tocząca się osteoresorpcja dotyczy głównie blaszek międzysystemowych oraz niewielkiej liczby osteonów. W metodzie wg Goldner a-masson a zarówno w strefie okostnej, jak i śródkostnej stwierdza się obszary nowo powstającej i przebudowującej się tkanki kostnej, które przedstawiają się jako intensywnie wybarwione czerwono-ceglaste strefy 58

59 (tab. 51, zdj. A, C). Często takie obrazy obserwuje się w strefie wokół naczyń krwionośnych, natomiast w strefie tkanki kostnej blaszkowatej zbitej dominują zasadniczo obszary kości zmineralizowanej (kolor zielony) (tab. 51, zdj. B, tab. 52, zdj. A, B). Na obrzeżu stref okołoresorpcyjnych występują ogniska nowo tworzącej się kości (intensywnie wybarwione na odcień czerwono-ceglasty). Obraz histologiczny kości udowej przedstawia się korzystniej niż obraz kości ramieniowej tej grupy. W obrazie histologicznym skrawków barwionych HiE widoczne są osteony wtórne, które ulegają w strefach peryferyjnych osteoresorpcji (tab. 53, zdj. C, D). Są to zwykle osteony wieloblaszkowe, swoją budową przypominające struktury występujące w obrazie fragmentów kości pobranych od zwierząt grupy kontrolnej negatywnej. W obszarach peryferyjnych toczącego się procesu osteoresorpcji pojawiają się osteony pierwotne (tab. 53, zdj. B, D). Osteony pierwotne formują się także w strefach osteoresorpcji blaszek międzysystemowych (tab. 53, zdj. D). Blaszki systemowe osteonów pierwotnych są bardzo wyraźnie zarysowane w obrazach histologicznych. W barwieniu wg van Gieson a podobnie jak w przypadku kości udowej stwierdza się liczne obszary osteoresorpcji (tab. 54, zdj. B, C, D). Na obrzeżach pól osteoresorpcyjnych pojawiają się pierwotne osteony zwykle trzy-, czteroblaszkowe (tab. 54, zdj. B, C). Wokół osteonów pierwotnych wyraźnie widać nowo powstające blaszki systemowe przybierające koncentryczny układ. Na peryferium tworzących się osteonów pierwotnych, podobnie jak i już istniejących osteonów wtórnych, widoczne są ogniska osteoresorpcji (tab. 54, zdj. D). Tocząca się osteoresorpcja dotyczy głównie blaszek międzysystemowych oraz niewielkiej liczby osteonów. Układ blaszek międzysystemowych wykazuje większą regularność niż w przypadku kości ramieniowej tej grupy. W porównaniu z kością ramieniową tej grupy zauważa się zdecydowanie mniejszą ilość ognisk osteoresorpcji. W barwieniu wg Goldner a-masson a zarówno w strefie okostnej, jak i śródkostnej stwierdza się obszary nowo powstającej i przebudowującej się tkanki kostnej, które przedstawiają się jako intensywnie wybarwione czerwono-ceglaste strefy (tab. 55, zdj. A). W strefie tkanki kostnej zbitej licznie występują osteony wtórne o zróżnicowanym stopniu zmineralizowania tkanki kostnej (tab. 55, zdj. B, C). Blaszki systemowe osteonów wtórnych wykazują wyraźnie koncentryczny układ. Nowo formujące się blaszki kostne przyjmują odcinkowy charakter kości niezmineralizowanej 59

60 i są poprzedzielane strefami kości zmineralizowanej. Osteony wtórne ulegają stopniowemu procesowi mineralizacji (tab. 55, zdj. B, C). Osteony pierwotne, będące w fazie tworzenia, posiadają kilka blaszek przybierających koncentryczny układ (tab. 55, zdj. D). W strefie blaszek międzysystemowych dostrzega się mniejszą ilość stref osteoresorpcji (tab. 55, zdj. C), ale same blaszki międzysystemowe wykazują mniej regularny układ. W obrazach histologicznych są one mniej wyraźne. W strefach peryferyjnych blaszek systemowych widoczne są niewielkie ogniska osteoresorpcji (tab. 55, zdj. A, B, C). W barwieniu HiE skrawków pobranych z trzonu kręgu lędźwiowego beleczki kości gąbczastej wykazują bardziej pierwotny charakter ukształtowania (tab. 56, zdj. A, B, C, tab. 57, zdj. A, B, C) niż w przypadku grupy preparatu ED 38. W obrazie histologicznym występują liczne obszary osteoblastyczne (tab. 57, zdj. A). Blaszki tkanki kostnej występujące w beleczkach są różnej grubości, porozdzielane wyspami osteoblastów i obszarami osteoresorpcyjnymi. Osteony występujące sporadycznie są strukturami pierwotnymi (tab. 56, zdj. A, tab. 57, zdj. A, B). Blaszki przylegające do śródkostnej są mniej liczne. Wyspy komórek osteogennych są mniej obfite niż w grupie ED 38. Barwienie wg van Gieson a wyraźnie uwidoczniło blaszki kostne, natomiast osteony występujące sporadycznie są strukturami pierwotnymi, w początkowej fazie tworzenia (tab. 59, zdj. B). Wyspy komórek osteogennych ściśle przylegają do powierzchni śródkostnej, rozpłaszczając się na jej powierzchni. W obrazie widoczne są także wyspy nowo tworzącej się kości (tab. 59, zdj. B, C). W barwieniu wg von Koss a obserwuje się cienką strefę nowo wytworzonej niezmineralizowanej kości (tab. 60, zdj. A, B, C, D). Profile pośrednie beleczek zawierają w niektórych miejscach osteony wtórne, które ulegają mineralizacji (tab. 60, zdj. A, B). Wyraźna mineralizacja występuje w profilach pośrednich. Często obszary mineralizacji są poprzedzielane tkanką kostną niezmineralizowaną (tab. 60, zdj. A, B, C, D). Tym obszarom niezmineralizowania towarzyszą ogniska osteoresorpcji. Na uwagę zasługuje fakt, że we wszystkich badanych grupach w barwieniu metodą Goldner-Masson w obszarze blaszek podstawowych zewnętrznych obserwuje się duży obszar tkanki niezmineralizowanej (kolor intensywnie ceglasto-czerwony), świadczący o intensywnej osteogenezie. 60

61 5.4. Analiza statystyczna Wykres 1 Wykres 2 61

62 Wykres 3 Wykres 4 62

63 Wykres 5 Wykres 6 63

64 Wykres 7 Wykres 8 64

65 Wykres 9 Wykres 10 65

66 Wykres 11 66