Katarzyna Markiewicz 1, Krzysztof Zeman 2, Agata Kozar 1, Maria Gołębiowska-Wawrzyniak 1, Wojciech Woźniak 3

Transkrypt

1 Medycyna Wieku Rozwojowego, 2012, XVI, 3 IMiD, Wydawnictwo Aluna Katarzyna Markiewicz 1, Krzysztof Zeman 2, Agata Kozar 1, Maria Gołębiowska-Wawrzyniak 1, Wojciech Woźniak 3 1 Zakład Immunologii Klinicznej, Instytut Matki i Dziecka Kierownik: dr n. med. M. Gołębiowska-Wawrzyniak 2 Klinika Pediatrii i Immunologii z Pododdziałem Nefrologii, I-CZMP., Klinika Pediatrii, Kardiologii Prewencyjnej i Immunologii Wieku Rozwojowego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. n. med. K. Zeman 3 Klinika Chirurgii Onkologicznej Dzieci i Młodzieży Kierownik: prof. dr hab. n. med. W. Woźniak Streszczenie Wstęp: Przyczyny powstawania osteosarcoma (OS) oraz mechanizmy efektorowe odpowiedzi immunologicznej przeciw komórkom OS oraz komórkom innych nowotworów nie są w pełni poznane. Zgodnie z aktualną wiedzą główną rolę przypisuje się limfocytom T cytotoksycznym, limfocytom Tγδ, limfocytom NKT i komórkom NK, których zadaniem jest eliminacja komórek nowotworowych poprzez rozpoznanie, a następnie doprowadzenie do ich śmierci. Ważną rolę odgrywają również limfocyty T CD4+ oraz pośrednio limfocyty B. Celem pracy była ocena wybranych elementów immunologicznej odpowiedzi komórkowej u dzieci z mięsakiem kościopochodnym w momencie rozpoznania choroby. Materiał i metody: Badania przeprowadzono w grupie 44 dzieci z mięsakiem kościopochodnym (osteosarcoma) w wieku między 6-20 lat (mediana 15,0 lat). Grupę kontrolną stanowiło 22 dzieci w tym samym wieku (mediana 14,5 lat) bez stwierdzonej choroby nowotworowej i aktywnego procesu zapalnego. Określono odsetek i liczbę całkowitą limfocytów: CD3+(T), CD4+(Th), CD8+ (CTL), CD3+/ HLA-DR+(T aktywowane), CD3+γδ (Tγδ), CD19+(B), CD3+CD56+(NKT) i CD56+CD16+ (NK) we krwi obwodowej metodą cytometrii przepływowej. Wyniki: U dzieci z osteosarcoma zaobserwowano, w momencie rozpoznania choroby, mniejszą liczbę populacji limfocytów krwi obwodowej w porównaniu z grupą kontrolną. Różnice dotyczyły komórek: CD3+(1609,0 vs 3038,0 kom/μl, p<0,001), CD4+(598,0 vs 1071,0 kom/l; p<0,001), CD8+(386,0 vs 866,0 kom/μl; p<0,001), CD3+/HLA-DR+(39,0 vs 81,0 kom/μl; p<0,025), CD 19+(205,0 vs 381,0 kom/μl; p<0,025), NK (161,0 vs 339,0 kom/μl; p<0,005). Wnioski: 1. Badanie morfologii krwi obwodowej nie różnicujące subpopulacji limfocytów jest niewystarczające do określenia zaburzeń, które powstają w układzie immunologicznym chorych z rozwijającą się chorobą nowotworową. 2. Reakcja układu odpornościowego pacjentów w wieku dziecięco-młodzieżowym na rozwój nowotworu jest bardzo zróżnicowana, związana z biologiczną zmiennością osobniczą. 3. Ocena stanu immunologicznego pacjentów z mięsakiem kościopochodnym w momencie rozpoznania może mieć znaczenie prognozujące dalszy przebieg choroby oraz może wskazywać okresy kiedy układ ten wymaga stymulacji w ramach leczenia przeciwnowotworowego. *Praca została wykonana w ramach realizacji grantu KBN nr 2PO5E *The work was supported by the Scientific Research Committee Grant No. PO5E

2 Ocena stanu immunologicznego dzieci i młodzieży z mięsakiem kościopochodnym 213 Słowa kluczowe: mięsak kościopochodny, dzieci, subpopulacje limfocytów, cytometria przepływowa Abstract The causes of osteosarcoma (OS) and effector mechanisms of the immune response against OS and other neoplastic diseases remain unknown. According to current knowledge, the major role is attributed to cytotoxic T lymphocytes, NK, NKT and Tγδ lymphocytes, which are engaged directly in the destruction of the tumour cells. Helper T lymphocytes (CD4+) and indirectly B lymphocytes are of special importance. There is sparse data on the state and efficiency of the immune system in children with neoplastic disease, with bone tumours in particular. The aim of the study was the evaluation of selected elements of cellular immunity in children with osteosarcoma at the time of diagnosis. Materials and methods: The study was performed on a group of 44 children with osteosarcoma, aged from 6 to 20 years (median 15.0 years). The control group consisted of 22 children of the same age (median 14.5 years) without the diagnosis of neoplastic disease and active inflammatory state. T lymphocytes with their subpopulations, activated T lymphocytes (CD3+/HLA-DR+), B lymphocytes, NK and NKT cells were analyzed in peripheral blood using the flow cytometry method. Examinations were performed before the therapy in the diagnostic period. Results: A lower number of peripheral blood lymphocyte population in children with osteosarcoma at diagnosis, compared to the control group was observed. The differences concerned T lymphocytes CD3+( vs kom/μl, p<0.001) CD4+(598.0 vs kom/l; p<0.001) and their cytotoxic subpopulation CD8+ (386.0 vs cells/μl; p<0.001), activated T lymphocytes CD3+/HLA-DR+(39.0 vs cells/μl; p<0.025), B lymphocytes CD19+(205.0 vs cells/μl; p<0.025) and NK cells (161.0 vs cells/μl; p<0.005). The number and percentage of peripheral blood lymphocytes in children and youth with osteosarcoma at diagnosis is over 50% lower compared to the patients without neoplastic disease. Conclusions: 1. The general analysis of peripheral blood without differentiating lymphocyte subpopulations is insufficient to determine disturbances which are forming in the immune system of patients developing the neoplastic disease. 2. The course of the neoplastic disease (osteosarcoma) in patients of developmental age is very diverse, and associated with individual biological variation. 3. The evaluation of the immunologic status in patients with osteosarcoma may have prognostic meaning for the further course of the disease, may prevent the formation of unfavourable clinical changes, and be the basis for correcting the administration of cytostatic agents. Key words: osteosarcoma, children, lymphocyte subpopulations, flow cytometry Mięsak kościopochodny (osteosarcoma, OS) jest pierwotnym, złośliwym nowotworem kości występującym najczęściej w pierwszej i drugiej dekadzie życia człowieka. Przyczyny powstawania tej choroby są ciągle niewyjaśnione, bierze się pod uwagę mutacje onkogenów lub genów supresorowych. Rozwój nowotworu jest procesem długotrwałym, faza utajona, w której dochodzi do nagromadzenia mutacji prowadzących do transformacji nowotworowej może trwać od kilku do kilkudziesięciu lat (1). Przeciętny okres rozwoju guza wynosi pięć lat (guz o średnicy 1 cm) (2). Pierwotne nowotwory kości w grupie wiekowej do 10 lat nie są częste, lecz w okresie młodzieńczym (14-19 lat) są drugą co do częstości, po chłoniakach, grupą nowotworów złośliwych (3). Dane epidemiologiczne z lat szacowały częstość występowania mięsaka kościopochodnego w Polsce na około 80 zachorowań rocznie co stanowiło 7% nowotworów złośliwych wieku dziecięcego (4). Statystyki prowadzone przez Zakład Patomorfologii Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie wykazały 35 nowych zachorowań w roku 2007/2008 (dane niepublikowane). Osteosarcoma występuje częściej u chłopców niż u dziewcząt (1.6:1) (5). Cechą charakterystyczną OS jest tworzenie osteoidu i beleczek kostnych. Intensywnie proliferujące w okresie wzrostowym osteoblasty, często są narażone na powstanie błędów mitotycznych prowadzących do transformacji nowotworowej (6). Ognisko pierwotne OS występuje najczęściej w kościach długich (90% guzów), w tym w ok. 50% w okolicy stawu kolanowego tzn. w okolicy przynasadowej najszybciej rosnącej (przynasada bliższa kości piszczelowej, przynasada dalsza kości udowej). Często może to być bliższy odcinek kości ramiennej lub kość biodrowa. Guz rozwija się w części centralnej kości i nacieka jej otoczenie. W momencie rozpoznania OS u około 80% pacjentów stwierdza się obecność przerzutów do tkanki płucnej. Uważa się, że najczęstszą drogą przerzutów mięsaków są naczynia krwionośne. Rzadko stwierdza się przerzuty do układu chłonnego (7). Badania genotypu pacjentów z osteosarcoma ujawniły istnienie mutacji genu TP53 zlokalizowanego w długim ramieniu chromosomu 17. Mutacja ta związana jest z występowaniem zespołu Li-Fraumeni, który polega na zwiększonej skłonności do zapadania na niektóre nowotwory w okresie dzieciństwa. Dotyczy to mięsaków, raków nadnercza, białaczek i guzów mózgu (1, 8).

3 214 Katarzyna Markiewicz i wsp. Cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych kości jest ich szybki rozwój i występowanie przerzutów. Dlatego tak poważnym problemem staje się leczenie pacjentów z przerzutami, tym bardziej, że w chwili rozpoznania 30% pacjentów ma uogólniony proces choroby [9]. Leczenie nowotworów złośliwych kości u dzieci i młodzieży jest zagadnieniem trudnym. Rokowanie w dużej mierze zależy od wczesnego rozpoznania choroby, której początek jest niestety nietypowy. Najczęstszym objawem, z jakim pacjent zgłasza się do lekarza jest ból, który intensywnie narasta w okresie nocnym. Objawy te trwają od 6 tygodni do 4 miesięcy, zanim zostanie postawione rozpoznanie (10). Immunologiczne mechanizmy obronne w chorobie nowotworowej, zaczynają być aktywne dopiero z chwilą powstania zmienionych fenotypowo komórek nowotworu. Układ odpornościowy nie zawsze jest w stanie rozpoznać i zniszczyć komórki nowotworowe bowiem wiele z nich wymyka się spod nadzoru immunologicznego zmniejszając na swej powierzchni ekspresję cząsteczek układu MHC (11). Od dawna wiadomo, że procesowi transformacji nowotworowej towarzyszą zmiany antygenowe. Na powierzchni komórki nowotworowej mogą pojawić się spontanicznie antygeny, które nie mają charakteru antygenów swoistych określane jako TAA (tumor associated antygen), antygeny związane z nowotworem. Występują one także, w niewielkich ilościach, na prawidłowych komórkach lecz nie są zdolne do wywołania reakcji odpornościowych (12). Odrębnym zagadnieniem są antygeny swoiste dla nowotworu TSA (tumor specific antygen) występujące tylko na niektórych nowotworach. Należy do nich antygen swoisty dla gruczołu krokowego PSA (prostate specific antygen) i antygen kodowany przez zmutowany onkogen ras. U pacjentów z mutacją tego onkogenu stwierdzono przeciwciała i limfocyty T cytotoksyczne (CTLs) rozpoznające białko Ras (13). Innym antygenem wykrywanym przez limfocyty T i przeciwciała jest antygen CEA (carcino-embrionic antygen) będący glikoproteiną należącą do cząsteczek immunoglobulino podobnych, funkcjonujący jako cząsteczka adhezyjna w nabłonkach przewodu pokarmowego, dróg oddechowych i moczowo-płciowych (14). Antygenami rozpoznawanymi przez przeciwciała nie mającymi swoistego charakteru są AFP (α-fetoproteina rak wątroby, rak jądra) i antygen CA 125 (rak jajnika, trzustki, płuc) (15, 16). Mimo istnienia tzw. nadzoru immunologicznego, przeważnie dochodzi do progresji choroby nowotworowej, co może sugerować słabą immunogenność antygenów nowotworowych. Aby zwalczyć powstające komórki nowotworowe układ odpornościowy uruchamia szereg mechanizmów komórkowych i humoralnych. Zazwyczaj dochodzi do powstania przewlekłego procesu zapalnego. Do zainicjowania odpowiedzi na powstałe ognisko nowotworowe niezbędne jest pobudzenie układu immunologicznego. Istotną rolę w tym procesie pełni odpor- ność komórkowa swoista, zależna od prezentacji antygenu. Szczególnie ważne są komórki bezpośrednio zaangażowane w niszczenie nowotworu: limfocyty T cytotoksyczne CD8, limfocyty CD4 (Th1, Th2), limfocyty Tγδ, komórki NK, NKT oraz pośrednio limfocyty B. Niestety, aktywacja układu immunologicznego często prowadzi również do progresji choroby nowotworowej. Wytwarzane bowiem przez aktywowane komórki odpornościowe cytokiny wpływają pobudzająco na mikrośrodowisko, w którym powstaje nowotwór i często jest to działanie promujące jego wzrost (17). Badania limfocytów CD8 (CTLs) osób z chorobą nowotworową (nowotworami pierwotnymi) wykazują ich rolę w lizie komórek guza. Limfocyty CTLs rozpoznają antygeny komórek nowotworowych w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I poprzez receptor TCR, ulegając w ten sposób aktywacji. Ważne znaczenie w przypadku aktywacji CTLs ma cząsteczka adhezyjna LFA1 limfocytu i cząsteczka ICAM na komórce nowotworowej. Połączenie się tych molekuł daje dodatkowy sygnał kostymulujący konieczny dla aktywacji limfocyta, uruchomienia zjawiska cytotoksyczności oraz związanej z nim apoptozy komórki docelowej. Zaktywowane i przygotowane do pełnienia funkcji efektorowej limfocyty T CD4+ subpopulacji Th1, odpowiedzialne za zjawiska odporności komórkowej, zaczynają syntetyzować IL-2 oraz zwiększają ekspresję na swojej powierzchni receptora IL-2R, co stymuluje proliferację. Subpopulacja Th2 pełni natomiast funkcje pomocnicze w odpowiedzi humoralnej, wspomagając limfocyty B w produkcji przeciwciał antynowotworowych (18, 19). Aktywowane komórki układu odpornościowego (CD4+, CTLs, NK, NKT, Tγδ,) zabijają komórki nowotworowe często wykorzystując cytokinę TNF-α lub FasL (CD95L). Drugi mechanizm cytotoksyczności zależny od granulosomów, w których zgromadzone są enzymy lityczne, wydaje się jednak być najczęściej występującym mechanizmem niszczenia komórek docelowych. Jest on uwarunkowany uwalnianiem z ziarnistości cytoplazmatycznych (granulosomów) perforyny i granzymów. Kluczową rolę w tym procesie odgrywają pary cząsteczek adhezyjnych LFA1-CAM1 i CD28-B7 oraz sygnał aktywujący przekazywany przez TCR. W przypadku komórek NK sygnał przekazywany jest przez receptor CD16, a w przypadku limfocytów Tγδ CD7. Limfocyty T CD8 (CTLs) zabijają komórki nowotworowe wykorzystując oba mechanizmy lecz częściej posługują się mechanizmem zależnym od granulosomów, podobnie komórki NK. Limfocyty T CD4 zabijają głównie przez FasL (CD95L) a Tγδ posługują się również obydwoma mechanizmami. Istnieje także trzeci mechanizm niszczenia komórek nowotworowych związany z przeciwciałami IgG (ADCC antybody dependent cell cytotoxicity) produkowanymi przez limfocyty B. Mechanizmem tym posługują się komórki NK i limfocyty NKT. To jaki mechanizm zostanie wykorzystany w danym momencie zależy od komórki efektorowej (20). Obecnie duże zainteresowanie wzbudza status immunologiczny pacjentów z chorobą nowotworową i zwią-

4 Ocena stanu immunologicznego dzieci i młodzieży z mięsakiem kościopochodnym 215 zane z tym możliwości diagnostyczno-terapeutyczne. Niewiele jest danych dotyczących stanu i wydolności układu immunologicznego dzieci z chorobą nowotworową, a szczególnie z nowotworami kości. Celem pracy była ocena wybranych elementów odpowiedzi komórkowej u dzieci z mięsakiem kościopochodnym w momencie rozpoznania choroby. Pacjenci do grupy badanej zakwalifikowano 44 dzieci (21 dziewcząt, 23 chłopców) w wieku od 6 do 20 lat (mediana 15,0) z rozpoznanym w badaniu histopatologicznym mięsakiem kościopochodnym. Do grupy porównawczej zakwalifikowano 22 dzieci (8 dziewcząt i 14 chłopców) w wieku od 6 do 20 lat (mediana 14,5 lat) bez stwierdzonej choroby nowotworowej i aktywnego procesu zapalnego. Kryteriami włączenia pacjentów było: rozpoznanie pierwotnego mięsaka kościopochodnego, lokalizacja guza w zakresie kończyn, przed biopsją nie stosowano chemio- lub radioterapii, wiek chorych w chwili rozpoznania do 20 roku życia. Stan kliniczny pacjentów oceniano na podstawie wieku, wielkości guza, stopnia agresywności histologicznej, zaawansowania choroby (zlokalizowana, rozsiana). Dla oceny stopnia złośliwości histologicznej wykonano badania histopatologiczne tkanki guza z ogniska pierwotnego pobranej w czasie biopsji wstępnej. U 44 pacjentów z grupy badanej i 22 z grupy porównawczej dokonano oceny profilu immunologicznego w żylnej krwi obwodowej pobranej w ilości 0,5 ml do probówek z EDTA. Określono liczbę całkowitą leukocytów, liczbę całkowitą i odsetek limfocytów CD3+, oraz komórek: CD4+, CD8+, CD3+/HLA-DR+, CD3+γδ(Tγδ), CD19+(B), CD16+CD56+ (NK) i CD3+CD56+(NKT). Metody do oceny markerów powierzchniowych charakterystycznych dla danej populacji limfocytów stosowano metodę cytometrii przepływowej. Do 100 μl krwi dodawano 20 μl przeciwciał mono klonalnych związanych z fluorochromami: FITC (izotiocjanian fluoresceiny), PE (fikoerytryna), lub Per-CP (Peridinin-Chlorophyll Protein). Badania przeprowadzone zostały przy zastosowaniu cytometru przepływowego Epics XL firmy Coulter (Beckman). Analizę otrzymanych wyników oceny fenotypu komórek krwi przeprowadzono z użyciem programu System II software for the Epics XL flow cytometer version 3.0. Doświadczenia przeprowadzono w jednym powtórzeniu. Limfocyty T i subpopulacje, limfocyty Tγδ, limfocyty B, komórki NK, NKT, oznaczono znakując je odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi. Inkubacja z przeciwciałami trwała 15 minut. Następnie w celu usunięcia erytrocytów i utrwalenia próbek dodawano 100 μl płynu lizującego odczynnik A Dako Uti-Lyse Erythrocyte-Lysing Reagent (Dako Cytomation) i inkubowano 15 minut. Po tym czasie dodawano 1000 μl odczynnika B i również inkubowano 15 minut. Próbki uzyskane od pacjentów z grupy porównawczej przygotowane były w analogiczny sposób. Do analizy statystycznej wykorzystano pakiet statystyczny Statistica 8 (Statsoft), przyjęto poziom istotności p<0,05. Do opisu właściwości zmierzonych parametrów badanych pacjentów stosowano statystyki opisowe wartości średnie, mediany i zakresy. Metody analizy statystycznej stosowano adekwatnie do typu zmiennych. Istotność różnic sprawdzano stosując test U Mann-Whitney a lub Smirnowa-Kołmogorowa. Dodatkowo, sprawdzano normalność rozkładu przeprowadzając test Shapiro-Wilka. Wykazano, że badane cechy nie mają rozkładu normalnego, dlatego przy liczebności badanej próby n=44 zaistniała konieczność wykorzystania testów nieparametrycznych. Liczba leukocytów (tab. I) grupy badanej (OS) 6980,0 kom/µl nie różniła się od liczby krwinek białych grupy po- Mediana Median s valid cases K OS K OS K OS 6900,0 1609, p NS p<0,001 p<0,005

5 216 Katarzyna Markiewicz i wsp. A Mediana Median s valid cases A K OS K OS K OS K OS 1932,0 957,0 62,5 205, p p<0,001 NS p<0,05 NS Mediana Median s valid cases C K OS K OS K OS K OS 339,0 161,0 10,5 17,0 0,7 1, p p<0,005 NS NS NS Mediana Median s valid cases K OS K OS K OS K OS 39,0 2,5 10,5 2, p p<0,05 NS NS NS

6 Ocena stanu immunologicznego dzieci i młodzieży z mięsakiem kościopochodnym 217 równawczej 6900,0 kom/µl. Istotna statystycznie jest różnica wartości bezwzględnej liczby limfocytów (1609,0 vs 3038,0 kom/μl; p<0,001) jak i ich odsetka (24,7% vs 42,4%; p<0,005). Dzieci z OS wykazują o 47% mniejszą liczbę limfocytów w chwili rozpoznania choroby niż dzieci zdrowe. Wyniki przedstawiono w tabeli I i na rycinie 1A, B. Analizowano też wartości subpopulacji limfocytów krwi obwodowej i porównano je z subpopulacjami limfocytów dzieci zdrowych. Otrzymane wyniki zestawiono w tabelach IIA, IIB, IIC, różnice istotne statystycznie dotyczyły liczby limfocytów T, B i NK. Liczba bezwzględna limfocytów T CD3+ (957,0 vs 1932,0 kom/µl; p<0,001; tab. IIA) i komórek NK (161,0 vs 339,0 kom/µl; p<0,005; tab. IIB) u pacjentów z mięsakiem kościopochodnym (OS) była ponad dwukrotnie niższa od liczby tych komórek u zdrowych dzieci (K). Liczba limfocytów B CD19+ (205,0 vs 381,0 kom/μl; p<0,05; tab. IIA) u dzieci z OS stanowiła 54% liczby komórek dzieci z grupy porównawczej. Wartości odsetkowe nie wykazywały różnic istotnych statystycznie. Dla zilustrowania różnic uzyskane dane przedstawiono graficznie w formie wykresów na rycinach 2A, 2B, 2C, 2D. Tabela IIC przedstawia liczbę aktywowanych limfocytów T CD3+ z ekspresją HLA-DR antygenów głównego układu MHC. U pacjentów z OS liczba aktywowanych limfocytów T jest wyraźnie niższa w porównaniu do liczby aktywowanych limfocytów T pacjentów grupy porównawczej (mediana: 39,5 kom/μl vs 81,0 kom/μl; p<0,05). Liczba limfocytów Tγδ (mediana: 10,5 vs 45,0 kom/μl; p>0,05; tab. IIC) była w chwili rozpoznania choroby czterokrotnie niższa u pacjentów z OS w porównaniu do grupy porównawczej lecz bez różnicy istotnej statystycznie (ryc. 2D). Analiza liczby limfocytów CD4+ i CD8+ (tab. III) pozwala na wykazanie różnicy pomiędzy liczbą tych komórek u dzieci z grupy badanej w porównaniu do dzieci zdrowych w momencie ustalenia rozpoznania. Zarówno w przypadku limfocytów CD4+ jak i CD8+ różnica jest statystycznie istotna, pacjenci z mięsakiem kościopochodnym wykazują w chwili rozpoznania choroby 1,8 razy niższą liczbę limfocytów CD4+ (598,0 vs 1071,0 kom/μl; p<0,001) i 2,3 razy niższą limfocytów CD8+ (373,0 vs 866,0 kom/μl; p<0,001) w porównaniu z grupą dzieci zdrowych. Nie wykazano istotności statystycznych w ocenie odsetka tych parametrów. Wyniki zilustrowano na rycinach 3A i 3B. Podsumowanie wyników u badanych osób z mięsakiem kościopochodnym w okresie postawienia diagnozy liczba bezwzględna i odsetek wszystkich limfocytów krwi obwodowej oraz liczby bezwzględne limfocytów T, ich subpopulacji A C D

7 218 Katarzyna Markiewicz i wsp. A - Mediana Median s valid cases K OS K OS K OS K OS 1071,0 35,7 39,3 373,0 36, p p<0,001 NS p<0,001 NS 32,3 CD4+ i CD8+, limfocytów B, komórek NK, oraz limfocytów CD3+ wykazujących ekspresję antygenów HLA-DR, są istotnie statystycznie niższe w porównaniu do wartości uzyskanych u ocenianych osób zdrowych. Pomimo dużego postępu w dziedzinie onkologii, dynamicznie rozwijającej się genetyki i immunologii, nadal wiele mechanizmów doprowadzających do rozwoju choroby nowotworowej jest niewyjaśnionych co bezpośrednio wiąże się z ograniczonymi możliwościami skutecznego leczenia chorych (21). Nowotwór powstaje w momencie pojawienia się w organizmie pierwszej komórki, która przestaje reagować na wysyłane przez organizm sygnały dotyczące jej rozmnażania i różnicowania, wytwarza coraz więcej komórek potomnych, które także przestają reagować na sygnały regulacyjne (22). Proces powstawania i rozwoju nowotworu uwarunkowany jest wieloczynnikowo genetycznie i środowiskowo. Wiele obserwacji przemawia za istotnym udziałem układu immunologicznego w odporności przeciwnowotworowej. Kontakt zmienionej antygenowo komórki nowotworowej z układem odpornościowym wywołuje powstanie szeregu reakcji, w których biorą udział komórki tego układu, zapoczątkowując odpowiedź typu humoralnego lub komórkowego (23). Należy jednak pamiętać, że układ odpornościowy nie zawsze jest w stanie rozpoznać i zniszczyć komórki nowotworowe. Przyczyn braku lub niedostatecznej odpowiedzi immunologicznej na komórki zmienione nowotworowo może być bardzo wiele, poczynając od braku odpowiedniej liczby komórek efektorowych i prezentujących antygen, poprzez brak receptorów i cząsteczek kostymulujących po brak antygenów MHC, zarówno na komórkach immunologicznie kompetentnych, jak też na komórkach nowotworowych (24). Jedną z przyczyn mogą być również zaburzenia szlaków przekazywania

8 Ocena stanu immunologicznego dzieci i młodzieży z mięsakiem kościopochodnym 219 sygnałów pobudzenia (transdukcji) w komórkach układu odpornościowego i syntezy odpowiednich mediatorów wewnętrznych, a także syntezy cytokin lub substancji cytotoksycznych (21). Pomimo tego, że nowotwory u dzieci i młodzieży nie występują często stanowiąc około 1-1,5% nowotworów całej populacji, to są jednym z podstawowych zagadnień medycyny wieku rozwojowego będąc drugą, po zatruciach, wypadkach i urazach, przyczyną zgonów. Odrębność biologiczna rozwijającego się dziecka, a zwłaszcza powolne dojrzewanie jego układu odpornościowego, warunkują odmienną dynamikę choroby i odmienną reakcję organizmu na toczący się proces chorobowy. 75% wszystkich przypadków występowania osteosarcoma przypada na okres między rokiem życia. OS rzadko pojawia się u dzieci poniżej 6 r.ż. Według innych źródeł średni wiek rozpoznania OS wynosi ok. 15 lat, więc jest zgodny z medianą wieku grupy badanych przez nas pacjentów (25, 26). Wśród potencjalnych czynników sprzyjających wystąpieniu OS obok czynników genetycznych czy przewlekłych stanów zapalnych kości, wymienia się nadmierne pobudzanie wzrostu tkanki kostnej. Szybki wzrost kości może być czynnikiem ryzyka. Byłoby to zgodne z obserwacjami wskazującymi na zwiększoną częstość występowania OS u osób w okresie skoku pokwitaniowego (27, 28). Wśród potencjalnie ważnych czynników przyczyniających się do rozwoju OS wymienia się rolę niedostatecznie dojrzałej odpowiedzi immunologicznej u dzieci, bądź jej osłabienie wskutek działania czynników infekcyjnych, fizycznych, hormonalnych lub stosowanego leczenia (np. immunosupresyjnego). Dowodem na współzależność pomiędzy dysfunkcją układu odpornościowego a wystąpieniem choroby nowotworowej są pierwotne zaburzenia odporności, które u dzieci w pewnych zespołach mogą powodować niemal 100% ryzyko wystąpienia nowotworu (29). W niniejszej pracy wykazano, że u badanych dzieci z mięsakiem kościopochodnym w okresie postawienia rozpoznana liczba bezwzględna i odsetek limfocytów krwi obwodowej oraz liczby bezwzględne limfocytów T(CD3+), ich subpopulacji CD4+ i CD8+, były istotnie statystycznie niższe w porównaniu do wartości uzyskanych u dzieci z grupy porównawczej (bez choroby nowotworowej). Podobne do naszych obserwacje można znaleźć we wcześniej publikowanych pracach. Wskazują one, że u osób z nowotworami kości liczba małych, nie przekraczających 7,5 mikrona limfocytów oceniana we krwi obwodowej stanowiła 45-75% wartości uzyskiwanych u osób zdrowych; tak wówczas określano limfocyty T, prawdopodobnie cytotoksyczne o wysokiej aktywności (30). Inna praca wskazuje na fakt, że jedna trzecia pacjentów z nowotworami kości, głównie z OS, ma niedobór limfocytów T we krwi obwodowej. Limfocyty te wykazują ponadto niską odpowiedź na fitohemaglutyninę (PHA) co sugeruje osłabienie ich funkcji (31). U dzieci z OS w momencie rozpoznania choroby zaobserwowaliśmy mniejszą liczbę bezwzględną komórek NK, limfocytów z markerem aktywacji HLA- DR i niższą liczbę limfocytów CD3+γδ, w porównaniu z grupą kontrolną. Świadczyć to może o zaburzeniach składu i funkcji tych ważnych składowych odpowiedzi immunologicznej. Jedną z najwyraźniej zaznaczonych zależności obserwowanych w prezentowanych badaniach była niska liczba limfocytów B (CD19+) w momencie diagnozy. Dla sprawdzenia czy niska liczba limfocytów nie wywołuje hipogammaglobulinemii, wybranym pacjentom oznaczono stężenie podstawowych klas immunoglobulin (G, A, M). Pomimo niskiej liczby limfocytów B nie zaobserwowano zdecydowanie niższych wartości głównych klas immunoglobulin w surowicy. Wyjaśnienie tego zjawiska wymaga dłuższego okresu obserwacji. Należałoby także zwrócić uwagę na komórki pamięci, których liczba może okazać się niewystarczająca do zapewnienia w późniejszym okresie odpowiedniej syntezy przeciwciał. Ocena histologiczna materiału biopsyjnego uzyskanego z guza wskazuje, że komórki OS są głęboko nacieczone (68% wszystkich ocenianych próbek) cytotoksycznymi limfocytami T CD8+, a jedna trzecia z nich wykazuje ekspresję antygenów HLA-DR+ co jest wykładnikiem aktywacji tych komórek i ich aktywności przeciwnowotworowej. Co więcej, ekspresja HLA-DR na komórkach linii osteosarcoma wykazywała pozytywną korelację z ekspresją HLA-DR na limfocytach krwi obwodowej (32). W naszych badaniach liczba komórek z HLA-DR+ świadcząca o aktywacji limfocytów T była u dzieci z OS o 50% niższa w porównaniu do dzieci nie wykazujących choroby nowotworowej i jest to różnica statystycznie istotna. Takie obniżenie może sugerować upośledzenie zdolności do aktywacji limfocytów, a w konsekwencji zaburzenie odpowiedzi komórkowej. Obserwacja młodych pacjentów z OS pokazuje, że mechanizmy obronne chorego, zwłaszcza z niecałkowicie jeszcze sprawnym układem odpornościowym, odgrywają głównie rolę modyfikującą przebieg choroby nowotworowej i nie są w stanie całkowicie zahamować nowotworzenia. Potrzeba jeszcze wielu badań wyjaśniających rolę poszczególnych elementów systemu odpornościowego i ich związku z komórkami spoza tego układu. Szczególną uwagę należy zwrócić na bardzo indywidualny przebieg choroby nowotworowej związany z biologiczną zmiennością osobniczą każdego organizmu. Jest to wyraźnie widoczne zwłaszcza w grupie pacjentów w okresie wieku rozwojowego, u których uzyskane wyniki badań wykazywały duży rozrzut, utrudniając opracowanie statystyczne. Ostatnio coraz częściej obserwuje się tendencję do badania kondycji immunologicznej pacjenta i wprowadzania prób leczenia stymulującego układ odpornościowy [33-35]. Wiedza ta może być przydatna w prognozowaniu dalszego przebiegu choroby oraz może wpływać na optymalizację leczenia minimalizując powikłania.

9 220 Katarzyna Markiewicz i wsp. WNIOSKI 1. Badanie morfologii krwi obwodowej nie różnicujące subpopulacji limfocytów jest niewystarczające do określenia zaburzeń, które powstają w układzie immunologicznym chorych z rozwijającą się chorobą nowotworową. 2. Reakcja układu odpornościowego pacjentów w wieku dziecięco-młodzieżowym na rozwój nowotworu jest bardzo zróżnicowana, i związana jest z biologiczną zmiennością osobniczą. 3. Ocena stanu immunologicznego pacjentów z mięsakiem kościopochodnym w momencie rozpoznania może mieć znaczenie prognozujące dalszy przebieg choroby oraz może wskazywać okresy kiedy układ ten wymaga stymulacji w ramach leczenia przeciwnowotworowego. 1. Bal J. (red.): Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. PWN, Warszawa, 2001, Kordek R. (red.): Onkologia, Medical Press, Gdańsk 2003, Bożek J. (red.): Postępy w rozpoznawaniu i leczeniu nowotworów u dzieci. PZWL, Warszawa, 1981, Chybicka A., Jaworski W., Liebhardt M.: Wyniki leczenia dzieci chorych na mięsaka kościopochodnego według protokołu SFOP-94 w materiale Polskiej Grupy Pediatrycznej ds. Leczenia Guzów Litych. Med. Wieku Rozwoj., 2000, IV, supl. II do nr 1, Crofton P.M., Evans N., Taylor M.R. i wsp.: Serum CrossLaps: Pediatric reference intervals from birth to 19 years of age. Clin. Chem., 2002, 48, Van Diest P., Brugal G., Baak J.P.: Proliferation markers in tumours: interpretation and clinical value. J. Pathol., 1998, 51, Zhang P., Yang Y., Zweidler-McKay P.A.: Critical role of notch signaling in osteosarcoma invasion and metastasis. Clin. Cancer Res., 2008, 14(10), Ambrożkiewicz J.: Przydatność wybranych markerów obrotu kostnego do oceny resorpcji kości i kości otworzenia u dzieci i młodzieży z mięsakiem kościopochodnym. Praca doktorska, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa, Szafrański A., Woźniak W.: Przerzuty do płuc u pacjentów z mięsakiem kościopochodnym wyniki leczenia. Med. Wieku Rozwoj., 2000, 4, supl. 2, Woźniak W., Rychłowska M., Kuczabski M. i wsp.: Ocena wskazań i możliwości leczenia tzw. oszczędzającego, mniej okaleczającego, w najczęstszych nowotworach złośliwych kości u dzieci i młodzieży. Med. Wieku Rozwoj., 2000, 4, supl. 2, Ishido S.,Wang C., Lee B.S.: Downregulation of major histocompatibility complex class I molecules by Kaposi's sarcoma associated herpesvirus K3 and K5 proteins. J. Virol., 2000, 7, Glińska H.: Onkologia ogólna. Instytut Onkologii, Warszawa, 1982, , Jakubisiak M., Lasek W.: Immunologia Nowotworów. W: Immunologia. Red. Gołąb J., Jakubisiak M., Lasek W., Sokłosa T. PWN, Warszawa, 2009, Thomas P., Forse R., Bajenova O.: Carcinoembryonic antigen (CEA) and its receptor hnrnp M are mediators of metastasis and the inflammatory response in the liver. Clin. Exp. Metastasis, 2011, 28 (8), Li P., Wang S., Liu H., Li N., McNutt M.A., Li G., Ding H.G.: Elevated serum alpha feto protein levels promowe pathological progression of hepatocellular carcinoma. World Journ. of Gastroenterol., 2011, 7, 17(41), Rustin G.J.: Follow-up with CA125 after primary therapy of advanced ovarian cancer has major implications for treatment outcome and trial performances and should not be routinely performed. Ann. of Oncol., 2011, 22, Suppl. 8, Zou W.: Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance. Nature Rev. Cancer, 2005, 5, Wakabayashi A., Nakagawa Y., Shimizu M.: Suppresion of an already established tumor growing through activated mucosal CTLs induced by oral administration of tumor antigen with cholera toxin. J. Immunol., 2008, 180, Male D., Roth D.B., Roitt I.: Immunologia, Wydawnictwo Medyczne Urban&Partner, Wrocław, 2008, Lasek W., Jakubisiak M.: Populacje i subpopulacje limfocytów. W: Immunologia. Red. Gołąb J., Jakubisiak M., Lasek W., Sokłosa T. PWN, Warszawa, 2009, Gross S., Walden P.: Immunosuppressive mechanisms in human tumors: Why we still cannot cure cancer. Immunol. Lett., 2008, 116, Jędrzejczak W.: Biologia nowotworów. W: Onkologia, Kordek R. (red). Via Medica, Gdańsk 2007, Cariappa A., Pillai S.: Antigen dependent B-cell development. Curr. Opin. Immunol., 2002, 14, Ishido S., Wang C., Lee B.S.: Downregulation of major histocompatibility complex class I molecules by Kaposi's sarcoma associated herpesvirus K3 and K5 proteins. J. Virol., 2000, 7, Marina N., Gebhardt M., Teot L.: Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma. Oncologist, 2004, 9, Picci P.: Osteosarcoma (osteogenic sarcoma). Orphanet J. Rare Dos., 2007, 2, Longhi A., Pasini A., Cicognani A.: Height as a risk factor for osteosarcoma. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 2005, 27, Troisi R., Masters MN., Joshipura K.: Perinatal factors, growth and development, and osteosarcoma risk. Br. J. Cancer, 2006, 95, Zeman K., Pokoca L.: Dojrzewanie układu odpornościowego. W: Zaburzenia odporności u dzieci. Zeman K. (red.): PZWL, Warszawa, 2002, Govallo V.I., Grigorieva M.P., Kosmiadi G.A. i wsp.: Decreased count of small lymphocytes in the blood of patients with malignant bone tumors. Vopr. Oncol., 1987, 33, Govallo V.I., Grigor'eva M.P., Kosmiadi G.A.: Comparative analysis of immunoreactive indices in malignant and benign bone tumors. Vopr. Oncol., 1984, 30,

10 Ocena stanu immunologicznego dzieci i młodzieży z mięsakiem kościopochodnym Trieb K., Lechleitner T., Lang S.: Evaluation of HLA-DR expression and T-lymphocyte infiltration in osteosarcoma. Pathol. Res. Pract., 1998, 194, Luksch R., Perotti D., Cefalo G.: Immunomodulation in a treatment program including pre- and post-operative interleukin-2 and chemotherapy for childhood osteosarcoma. Tumori, 2003, 89, Ługowska I.: Ocena przydatności badań immunohistochemicznych w mięsaku kościopochodnym u dzieci w korelacji z przebiegiem klinicznym i rokowaniem. Praca doktorska. Instytut Matki i Dziecka, Warszawa Mori K., Rédini F., Gouin F.: Osteosarcoma: current status of immunotherapy and future trends (Review). Oncol. Rep., 2006, 15, Wkład Autorów/Authors' contributions Według kolejności Konflikt interesu/conflicts of interest Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. The Authors declare that there is no conflict of interest. Nadesłano/Received: r. Zaakceptowano/Accepted: r. Published on line/dostępne on line Adres do korespondencji: Katarzyna Markiewicz Instytut Matki i Dziecka Zakład Immunologii Klinicznej ul. Kasprzaka 17a, Warszawa zaklad.immunologii@imid.med.pl katarzyna.markiewicz@imid.med.pl INFORMACJA PRASOWA Referencje natologii.