Prof. dr hab. Irena Staneczko-Baranowska Gliwice, Wydział Chemiczny Politechnika Śląska

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Irena Staneczko-Baranowska Gliwice, Wydział Chemiczny Politechnika Śląska Ocena rozprawy doktorskiej mgr inż. Magdaleny MATCZUK pt. Development of the Analytical Methodology for Investigations of the Anticancer Metallocomplexes Transportation under Simulated Physiological Conditions przygotowanej w formie serii tematycznie spójnych publikacji Choroby nowotworowe stanowią jeden z największych problemów współczesnej medycyny, a wg danych WHO z 2014 roku liczba zachorowań na nowotwory gwałtownie wzrośnie, co głównie wiąże się ze starzeniem społeczeństwa. Istotnym jest więc poszukiwanie nowych leków o potencjalnych właściwościach przeciwnowotworowych, z możliwością ich skutecznego zastosowania w chemioterapii. Jednakże w chemioterapii, która ciągle pozostaje podstawową metodą leczenia nowotworów, często niepożądane działania uboczne stosowanych leków przewyższają efekt terapeutyczny. Intensywne badania nad nowymi związkami o lepszej selektywności działania niż cis-platyna i jej analogi, doprowadziły do otrzymania szeregu potencjalnych leków, lecz tylko nieliczne z nich uzyskują pozytywną ocenę w testach klinicznych. W badaniach nad nowymi związkami szczególną uwagę zwraca się na połączenia o niskiej toksyczności, dużej specyficzności działania i wyższej skuteczności terapeutycznej. O skuteczności tych badań w dużym stopniu decyduje poznanie mechanizmu działania leku na poziomie lek biocząsteczka i na poziomie komórkowym. W rozprawie będącej przedmiotem recenzji prowadzono prace nad ciekawymi połączeniami, jakimi są kompleksy rutenu (III) i galu (III), a badania wykonywano w symulowanych warunkach fizjologicznych. Zainteresowanie związkami rutenu wynika z niektórych ich właściwości, w tym z dostępnych różnych stopni utlenienia, czy ze zdolności jonu rutenu do wiązania się z molekułami, np. z ludzką transferyną. Potencjał redoks związków rutenu wpływa na skuteczność działania terapeutycznego leków. Wyższą aktywność przypisuje się związkom Ru (II), które tworzą się w środowisku redukującym 1

2 chorych tkanek (nowotworowych) w stosunku do kompleksów Ru (III), znanych jako związki stosunkowo inertne. Ważną rolę w terapii przeciwnowotworowej przypisuje się koniugatom transferyny. Transferyny należą do grupy glikoprotein, które biorą udział w metabolizmie żelaza w organizmach zwierzęcych. Komórki nowotworowe charakteryzują się nadekspozycją receptorów transferyn w porównaniu z komórkami prawidłowymi, co pozwala na gromadzenie się leków typu kompleks rutenu w addukcie z transferyną w komórkach nowotworowych. Zmniejsza to w znacznym stopniu efekty uboczne, które zawsze towarzyszą chemioterapii. Aby możliwe były badania związków w formach specjacyjnych (na różnych stopniach utleniania) należy opracować odpowiednie procedury i metody analityczne. Analiza specjacyjna należy do wyjątkowo trudnych z uwagi na możliwość zakłócenia stabilności poszczególnych indywiduów nawet w prostych układach ciekłych, a szczególnie w roztworach fizjologicznych. Wymaga niezwykłej staranności w prowadzeniu doświadczeń i dobrego przygotowania teoretycznego i eksperymentalnego. W związku z ogromną nadzieją zastosowania w walce z nowotworami kompleksów rutenu (III) i galu (III) [trans-tetrachlorobis(1h-indazolo)rutenian (III)] indazolu oraz tris(8- hydroksychinolino) gal (III) celem rozprawy doktorskiej mgr inż. Magdaleny Matczuk było opracowanie metod i metodologii do badania specjacji tych kompleksów w symulowanych warunkach fizjologicznych. Z uwagi na fakt, że słabo poznane są mechanizmy przemian badanych leków w organizmie ludzkim, pomimo zaawansowanych testów medycznych, podjęte badania uważam za niezwykle istotne i aktualne. Wyniki badań z pewnością przydatne będą w weryfikacji hipotez związanych z działaniem badanych leków, jak i w przyszłości pomocne w ich terapeutycznym zastosowaniu. Praca wykonana została pod kierunkiem Panów: Profesora Macieja Jarosza, autorytetu z zakresu badań specjacyjnych z zastosowaniem wysokozaawansowanych technik analitycznych oraz Pan Profesora Zbigniewa Czarnockiego, specjalisty z zakresu chemii związków naturalnych, w tym badań czynności biologicznej ich metabolitów. Przesłana do oceny praca składa się z rozdziałów: 1. Spisu publikacji na których oparta jest rozprawa 2. Wstępu 3. Celu pracy 4. Przewodniku po publikacjach (krótkie omówienie osiągnięć) 5. Streszczenia 2

3 6. Kopii 6 publikacji 7. Oświadczenia współautorów publikacji. We wstępie scharakteryzowano krótko problem schorzeń nowotworowych w skali światowej i stosowane metody leczenia. Następnie omówiono leki przeciwnowotworowe bazujące na związkach Pt (II) i ich reaktywność, a kolejno badane przez Doktorantkę kompleksy Ru i Ga. Scharakteryzowano również techniki analityczne stosowane w badaniach bioanalitycznych metalokompleksów antynowotworowych. W Celu pracy jasno określono zakres badań, który obejmował opracowanie czułych, skutecznych metod separacyjnych do śledzenia zmian specjacyjnych badanych metalokompleksów w przypadku związku rutenu od momentu jego dożylnego podania do przemian w komórkach nowotworowych, a dla związku galu zaplanowano badania jego wydalania z moczem. Szczegółowe opisy opracowanych procedur i metod analitycznych wraz z dyskusją wyników znajdują się w kopiach 6 publikacji, wydrukowanych w renomowanych czasopismach specjalistycznych o łącznym IF=23,788. Każda z publikacji przed akceptacją do druku była oceniana przez co najmniej 2 3 zagranicznych recenzentów, specjalistów z danych dziedzin. W ramach przeprowadzonych badań: Zidentyfikowano 5 produktów hydrolizy kompleksu rutenu w warunkach zewnątrzkomórkowych. W badaniach zastosowano tandemową spektrometrię mas z jonizacją przez rozpraszanie. Zbadano kinetykę powstawania adduktu kompleksu Ru (III) i holotransferyny (tj. transferyny z dwoma jonami Fe) w symulowanych warunkach surowicy krwi ludzkiej, technikami CE-ICP-MS i ESI-TOF-MS. Stwierdzono, że kompleks rutenu i żelazo w holotransferynie są transportowane do komórek nowotworowych równocześnie. Proces ten ułatwia duża liczba receptorów transferyny zlokalizowana na powierzchni komórek nowotworowych. Nie zaobserwowano wyparcia żelaza z transferyny, co wg mojej opinii wynika z faktu, że w warunkach fizjologicznych (ph=7,4) wiązanie jonów żelaza przez transferynę jest bardzo trwałe. Dalsze badania adduktu prowadzono z zastosowaniem technik CE-ICP-MS i ESI- QqQ-MS, w symulowanych warunkach cytozolu komórek nowotworowych. W warunkach środowiska ph=6 i w obecności glutationu, kwasu askorbowego lub kwasu cytrynowego, stwierdzono małocząsteczkowe formy kompleksu rutenu, 3

4 zawierające głównie Ru (II). Należy to tłumaczyć tym, że obecne w układach biologicznych organizmów żywych glutation i kwas askorbowy uczestniczą w procesach przeniesienia elektronów i tym samym w zmianach stopnia utlenienia. Zmiana metabolizmu komórek nowotworowych w stosunku do komórek zdrowych jest przyczyną zmniejszenia zawartości tlenu w środowisku, co sprzyja powstawaniu warunków redukcyjnych. Równocześnie następuje zwiększenie stężenia glutationu i obniżenie ph. Redukcja w tych warunkach Ru (III) do Ru (II) jest istotą dla mechanizmu działania leku rutenowego. Kolejno badania nad formami specjacyjnymi adduktu kompleks rutenu holotransferyna prowadzono w cytozolu komórek z linii komórkowych gruczolaka jelita grubego. W badaniach stosowano techniki SEC (chromatografia wykluczania) z ICP-MS oraz µhplc w połączeniu z ESI-QqQ-MS. Stwierdzono rozpad adduktu z utworzeniem nowych form specjacyjnych Ru na +III i +II stopniu utlenienia. Stosowano również postępowanie proteomiczne typu shotgun. Prowadzono jednoczesną identyfikację różnych form kompleksu Ru białka za pomocą metody selektywnego cięcia enzymatycznego połączeń. Stwierdzono, że większość form to kompleks Ru (II). Są to obserwacje niezwykle istotne, gdyż potwierdzają założenia dużej efektywności leku, przy zminimalizowaniu ubocznych efektów terapii. Na wszystkich etapach badań, jak wspomniałam wcześniej stosowano wysokozaawansowane sprzężone techniki analityczne, jednak w każdym eksperymencie opracowano dla danego układu warunki rozdzielania, detekcji i oznaczania. Z wszystkich tych zadań Doktorantka wywiązała się, co zaowocowało określeniem specjacji rutenu w krwi i cytozolu komórek nowotworowych, tworzeniu charakterystycznej mapy oddziaływań kompleksu Ru (III) z białkami cytozolu, zaproponowaniem mechanizmu ich transportu do komórek, zmienionych chorobowo. Oprócz badań nad kompleksami rutenu opracowano metodę izotachoforezy kapilarnej połączonej z micelarną elektrokinetyczną chromatografią (CITP-MECK) do oznaczania kompleksu galu (III) w moczu ludzkim. Przeprowadzono optymalizację metody, ze szczególnym uwzględnieniem efektu ogniskowania micelarnego i krótkiego przygotowania próbek do oznaczeń analitów nieobdarzonych ładunkiem. Stwierdzono, że ogniskowanie micelarne może być istotnym krokiem w kierunku bezpośredniego oznaczania metaloleków za pomocą MECK. 4

5 Szerokie badania podstawowe i aplikacyjne w symulowanych układach fizjologicznych z pewnością znajdą zastosowanie w badaniach próbek rzeczywistych. Poznanie mechanizmu transportu i metabolizmu badanych leków będą przydatne w terapii nowymi, potencjalnymi lekami na bazie kompleksów rutenu i galu, jak również w poszukiwaniu innych metaloleków. Szczególnie chciałabym podkreślić przydatność opracowanych metodologii, które z pewnością wykorzystają również inne zespoły badawcze w świecie, w celu poznania przemian i transportu dokomórkowego nowych leków dedykowanych do terapii antynowotworowej. Zrealizowane cele pracy i osiągnięte wyniki badań wnoszą bezsprzecznie istotne elementy nowości naukowej w zakresie bioanalityki, co potwierdzają publikacje tych wyników w tak znaczących czasopismach jak: Metallomics (2), Analytical and Bioanalytical Chemistry (1), Analytica Chimica Acta (1), Analyst (1) i Journal of Chromatography A (1). Doktorantka wykazała się bardzo dobrym przygotowaniem teoretycznym, znacznie wykraczającym poza dziedzinę chemii. Wykazała się również dużą sprawnością w wykorzystaniu nowoczesnych technik analitycznych, a przede wszystkim w interpretacji wyników badań, bardzo trudnych analitycznie układów. Jakkolwiek publikowane prace są wieloautorskie, z oświadczeń współautorów wynika, że badania przedstawione w formie rozprawy należy uznać za osiągnięcia Pani mgr inż. Magdaleny Matczuk i uważam je za jej pracę doktorską. Oprócz prac załączonych w formie rozprawy posiada jeszcze w dorobku dodatkowo 5 innych publikacji, a także 17 ustnych komunikatów z tego 12 wygłoszonych przez Doktorantkę (w tym 7 za granicą) oraz 20 wystąpień konferencyjnych w formie plakatów. Łączny IF=31,435, co z pewnością świadczy o jej miejscu w czołówce młodych badaczy z obszaru analityki chemicznej. Jej działalność została dostrzeżona również poza Politechniką Warszawską uzyskała finansowanie projektu Preludium 6 z NCN, szereg nagród za prezentacje ustną i plakatowe oraz indywidualne stypendium za osiągnięcia naukowe. Na podkreślenie zasługuje również fakt, że odbyła 3 staże zagraniczne 2 w Moskwie i 1 w Wiedniu. 5

6 W podsumowaniu pragnę podkreślić, że przedstawiona do oceny rozprawa doktorska mgr inż. Magdaleny Matczuk z naddatkiem spełnia wymagania ustawowe stawiane pracom doktorskim (Ustawa z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach i tytule naukowym z późniejszymi zmianami). Moja opinia jest wysoce pozytywna i wnoszę do Rady Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Równocześnie wnioskuję o wyróżnienie rozprawy uzasadnienie w załączeniu. 6