Transkrypt

1 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI TOM NR 1 ( ) UDZIA NIEMIÊŒNIOWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH W REGENERACJI MIÊŒNI SZKIELETOWYCH* PARTICIPATION OF 'NON-MUSCLE' STEM CELLS IN REGENERATION OF SKELETAL MUSCLE Karolina ARCHACKA, Jerzy MORACZEWSKI, Iwona GRABOWSKA Zak³ad Cytologii, Instytut Zoologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski Streszczenie: Miêœnie szkieletowe s¹ zdolne do regeneracji w odpowiedzi na uszkodzenie bêd¹ce wynikiem na przyk³ad urazu mechanicznego, dzia³ania toksyny lub choroby. Kluczow¹ rolê w tym procesie odgrywaj¹ komórki satelitowe zlokalizowane w miêœniu szkieletowym. Jednak zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i eksperymentalnych w regeneracjê mog¹ zostaæ zaanga owane komórki macierzyste rezyduj¹ce w miêœniu lub pochodz¹ce z innego Ÿród³a. Budzi to nadzieje na potencjalne wykorzystanie tych komórek w terapii chorób miêœni szkieletowych, takich jak dystrofie miêœniowe czy rdzeniowy zanik miêœni. U pacjentów cierpi¹cych na te choroby obserwuje siê zaburzenia regeneracji miêœni, czêsto powi¹zane z wyczerpaniem lub zmniejszeniem endogennej populacji komórek satelitowych. Dlatego wykorzystanie komórek macierzystych mog³oby spowodowaæ przywrócenie mo liwoœci odbudowy miêœni szkieletowych. Jednak taka terapia bêdzie mo liwa dopiero po przeprowadzeniu precyzyjnej analizy w³aœciwoœci komórek macierzystych, której kluczowym elementem jest ocena ich potencja³u miogenicznego, czyli zdolnoœci do ró nicowania w komórki i w³ókna miêœniowe. Niniejsza praca podsumowuje aktualny stan wiedzy na temat potencja³u miogenicznego ró nych populacji komórek macierzystych i wskazuje te z nich, które maj¹ szansê staæ siê Ÿród³em komórek przeszczepianych podczas terapii chorób miêœni szkieletowych. S³owa kluczowe: miêœnie szkieletowe, regeneracja, komórki macierzyste, transplantacja, potencja³ miogeniczny. Summary: Skeletal muscle tissue is characterized by ability to regenerate in response to injury resulting for example from mechanical trauma, toxin or disease. The key role in this process is played by satellite cells localized in skeletal muscle. However, both under physiological and experimental conditions different types of stem cells originating either from skeletal muscle or other tissues can be also involved in regeneration. This raises the hope for potential use of stem cells in the therapy for skeletal muscles diseases, such as muscular dystrophies or spinal muscle atrophy. These pathologies are characterized by impairment of regeneration linked with depletion or reduction of endogenous population of satellite cells. Thus, transplantation of stem cells could improve regeneration of such muscle and, as a result, support their reconstruction. However, stem cells based therapy will be possible only after precise analysis of *Artyku³ powsta³ podczas realizacji projektów badawczych finansowanych ze œrodków na naukê MNiSW nr: N i N

2 188 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA their features, especially their myogenic potential, i.e. the ability to differentiate into muscle cells and fibers. This review summarizes current state of knowledge concerning myogenic potential of different types of stem cells and indicates those that are likely to be used in a future as a source of cells transplanted during skeletal muscle therapy. Keywords: skeletal muscles, regeneration, stem cells, transplantation, myogenic potential. 1. WPROWADZENIE Miêœnie szkieletowe s¹ zdolne do regeneracji w odpowiedzi na uszkodzenie mechaniczne (intensywny wysi³ek fizyczny, zmia d enie, rozerwanie), chemiczne (dzia³anie toksyn) oraz termiczne (dzia³anie wysokiej lub niskiej temperatury). Równie podczas rozwoju choroby wywo³anej np. nieprawid³owym unerwieniem miêœni lub brakiem istotnych bia³ek strukturalnych w miêœniach szkieletowych indukowana jest regeneracja. Podstawow¹ rolê w regeneracji odgrywaj¹ komórki prekursorowe miêœni szkieletowych komórki satelitowe. Komórki satelitowe zlokalizowane s¹ w niszy pomiêdzy sarkolemm¹ a b³on¹ podstawn¹ w³ókna miêœniowego i w warunkach fizjologicznych pozostaj¹ nieaktywne mitotycznie. Szacuje siê, e u myszy wkrótce po urodzeniu j¹dra komórek satelitowych stanowi¹ oko³o 30% wszystkich j¹der obecnych w miêœniach szkieletowych. Wraz z wiekiem ich liczba znacz¹co siê zmniejsza, co wp³ywa na ograniczenie zdolnoœci miêœni szkieletowych do regeneracji [68]. Komórki satelitowe syntetyzuj¹ wiele charakterystycznych dla nich czynników, takich jak: bia³ka transb³onowe M-kadheryna (cz¹steczka adhezyjna zale na od jonów wapnia), c-met (receptor dla hepatocytowego czynnika wzrostu), CD34 (marker hematopoetycznych komórek macierzystych) oraz czynniki transkrypcyjne Pax7 i Myf-5 [69]. Najwa niejsze z wymienionych czynników bia³ko Pax7 jest kluczowe dla powstania odpowiednio du ej puli komórek satelitowych. U myszy pozbawionych funkcjonalnego genu pax7 liczba komórek satelitowych jest znacznie mniejsza ni u myszy typu dzikiego, co powoduje zaburzenia procesu regeneracji [45]. Po uszkodzeniu miêœnia lub w trakcie rozwoju choroby, komórki satelitowe ulegaj¹ aktywacji, zaczynaj¹ siê intensywnie dzieliæ, a nastêpnie ró nicowaæ w mioblasty. Nastêpnie mioblasty w wyniku fuzji albo s¹ w³¹czane do istniej¹cych w³ókien miêœniowych, albo tworz¹ de novo wieloj¹drowe miotuby i w³ókna miêœniowe, co prowadzi do odtworzenia struktury regeneruj¹cego miêœnia. W zaktywowanych, ró nicuj¹cych komórkach dochodzi do sekwencyjnej syntezy miêœniowych czynników regulatorowych MRF (ang. myogenic regulatory factors, do rodziny tej nale ¹ MyoD, Myf-5, Mrf-4 oraz miogenina). W czêœci populacji aktywowanych komórek satelitowych rozpoczyna siê ekspresja genu myod, natomiast stopniowo zanika ekspresja pax7. Uruchamia to kaskadê sygna³ów prowadz¹cych do ró nicowania tych komórek w mioblasty. Kolejnym etapem ró nicowania jest fuzja mioblastów i utworzenie przez nie wieloj¹drowych miotub, a nastêpnie dojrzewanie powsta³ych w³ókien miêœniowych. Procesom tym towarzyszy ekspresja mrf4 i miogeniny czynników transkrypcyjnych zaliczanych do tzw. póÿnych MRF. W

3 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 189 pozosta³ych komórkach satelitowych nie dochodzi do ekspresji myod, dziêki czemu syntetyzuj¹ one nadal bia³ko Pax7, pozostaj¹ w stanie niezró nicowanym i odtwarzaj¹ pulê komórek satelitowych [68]. Z komórek satelitowych zwi¹zanych z jednym w³óknem miêœniowym mo e powstaæ ponad sto nowych w³ókien zawieraj¹cych tysi¹ce j¹der. Ponadto, poniewa komórki satelitowe charakteryzuje zdolnoœæ do samoodnawiania populacji, proces ten mo e byæ wielokrotnie powtarzany [16]. 2. PIERWSZE PRÓBY TERAPII DYSFUNKCJONALNYCH MIÊŒNI SZKIELETOWYCH Regeneracja miêœni szkieletowych nie zawsze przebiega w sposób prawid³owy. U pacjentów cierpi¹cych na choroby miêœni, takie jak dystrofie miêœniowe czy rdzeniowy zanik miêœni, obserwuje siê powa ne zaburzenia tego procesu [26, 37]. Najpowszechniejsz¹ grup¹ chorób miêœni s¹ dystrofie miêœniowe, w tym wystêpuj¹ca u 1 na 3500 urodzonych ch³opców dystrofia miêœniowa Duchenne'a [3]. Dystrofie miêœniowe stanowi¹ grupê ponad 30 chorób genetycznych, objawiaj¹cych siê stopniowym os³abieniem i zanikiem miêœni szkieletowych. We wczesnej fazie choroby w miêœniach zachodz¹ na zmianê fazy degeneracji i regeneracji, które prowadz¹ do wyczerpania puli komórek satelitowych. W efekcie miêsieñ nieprawid³owo regeneruje, dochodzi w nim do rozwoju fibrozy (zw³óknienia), która zaburza strukturê i funkcjê miêœni [26]. Opisane zmiany patologiczne mog¹ prowadziæ do niepe³nosprawnoœci ruchowej i czêsto do œmierci na skutek niewydolnoœci oddechowej. Do chwili obecnej nie zosta³a opracowana skuteczna terapia najciê szych dystrofii miêœniowych oraz wielu innych chorób neuromiêœniowych. Wyniki prowadzonych w ostatnich latach badañ œwiadcz¹, e wykorzystanie komórek macierzystych w terapii tych chorób mo e daæ satysfakcjonuj¹ce rezultaty [46, 47]. Podstawow¹ rolê w regeneracji miêœni szkieletowych odgrywaj¹ komórki satelitowe, dlatego te s¹ one komórkami pierwszego wyboru w terapiach komórkowych maj¹cych na celu leczenie lub ³agodzenie objawów chorób miêœni szkieletowych. Pionierskie doœwiadczenia z wykorzystaniem komórek satelitowych lub powsta³ych z nich, w wyniku ró nicowania, mioblastów przeprowadzono na prze³omie lat 80. i 90. W 1989 roku Partridge i wspó³pracownicy wprowadzili mioblasty linii komórkowej C2C12 do miêœni myszy mdx, stanowi¹cych zwierzêcy model dystrofii [46, 47]. Myszy mdx charakteryzuje mutacja w genie koduj¹cym dystrofinê, jedno z bia³ek strukturalnych, którego obecnoœæ jest niezbêdna do prawid³owego funkcjonowania miêœni szkieletowych [3]. Dystrofina zapewnia swoiste po³¹czenie pomiêdzy F-aktyn¹ wchodz¹c¹ w sk³ad cytoszkieletu w³ókna miêœniowego a kompleksem glikoproteinowym DAG (ang. dystrophin-associated glycoprotein complex) zlokalizowanym w jego sarkolemmie (ryc. 1). Kompleks DAG zbudowany jest z sarkoglikanów i dystroglikanów odpowiedzialnych z kolei za wi¹zanie bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej, np. lamininy. Dystrofina, tworz¹c po³¹czenie pomiêdzy cytoszkieletem a macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹ stabilizuje b³onê w³ókna miêœniowego podczas

4 190 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA RYCINA 1. Oddzia³ywania dystrofiny z innymi bia³kami strukturalnymi we w³óknie miêœniowym. Dystrofina zlokalizowana jest w cytoplazmie w³ókna miêœniowego, gdzie odpowiada za po³¹czenie z F-aktyn¹, bia³kiem cytoszkieletu, a tak e z kompleksem glikoproteinowym obecnym w sarkolemmie. Kompleks ten sk³ada siê z licznych bia³ek transb³onowych, m.in. z sarkoglikanów i sarkospanu o nieznanych funkcjach, a tak e dystroglikanów odpowiedzialnych za wi¹zanie bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej, np. lamininy. Laminina miêdzy innymi wraz z kolagenem tworzy b³onê podstawn¹ otaczaj¹c¹ w³ókno miêœniowe FIGURE 1. Interactions of dystrophin with other structural proteins in a skeletal fiber: Dystrophin is localized in the cytoplasm of a skeletal fiber, where it forms links both with F-actin, a cytoskeletal protein, and the glycoprotein complex present in the sarcolemma. The complex includes many transmembrane proteins like sarcoglycans and sarcospan, not described functionally yet, as well as dystroglycans that bind proteins of the extracellular matrix, for example laminin. Laminin together with collagen are the major proteins of the basal lamina surrounding the muscle fiber skurczu miêœnia. Ponadto poœredniczy w przekazywaniu si³y generowanej w kurcz¹cych siê sarkomerach, podstawowych jednostkach strukturalno-czynnoœciowych miêœni szkieletowych, do macierzy zewn¹trzkomórkowej, a nastêpnie do œciêgien [3]. Nieobecnoœæ dystrofiny w miêœniu szkieletowym prowadzi wiêc do obni enia si³y jego skurczu, a tak e do ci¹g³ego uszkadzania b³ony w³ókien miêœniowych podczas kolejnych skurczów. W doœwiadczeniach przeprowadzonych przez Partridge'a i wspó³pracowników zaobserwowano wznowienie syntezy dystrofiny w miêœniach szkieletowych myszy mdx po transplantacji mioblastów linii C2C12. Œwiadczy³o to o tym, e wprowadzone komórki by³y zdolne do zasiedlenia dystroficznego miêœnia i tworzenia prawid³owo funkcjonuj¹cych w³ókien miêœniowych. Te i podobne doœwiadczenia zapocz¹tkowa³y w latach 90. lawinê badañ klinicznych, podczas których wstrzykiwano zdrowe mioblasty do miêœni szkieletowych pacjentów cierpi¹cych na dystrofiê. Próby te jednak zakoñczy³y siê niepowodzeniem. Obserwowano bardzo wysok¹ œmiertelnoœæ transplantowanych komórek (oko³o 75% z nich ginê³o wkrótce po transplantacji), ich niewielk¹ migracjê w miêœniu oraz, dodatkowo, eliminacjê wprowadzonych

5 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 191 komórek na skutek odpowiedzi immunologicznej chorego [46, 47]. Zastosowanie leków immunosupresyjnych oraz modyfikacja metod wprowadzania mioblastów do miêœni (np. przez wykorzystanie trójwymiarowych rusztowañ dla komórek, podawanie wraz z komórkami czynników wzrostu i bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej) pozwoli³o w ostatnich latach osi¹gn¹æ lepsze wyniki (wy sza prze ywalnoœæ transplantowanych komórek, lepsza migracja komórek w miêœniu). Ci¹gle jednak nie doprowadzono do znacz¹cej poprawy funkcjonowania miêœnia, co nie pozwala myœleæ o stosowaniu tej terapii w leczeniu chorób miêœni [60]. Standardowe metody izolacji komórek satelitowych z miêœni szkieletowych i ich póÿniejsza hodowla in vitro prowadz¹ do ró nicowania w mioblasty, a przez to niestety do obni enia ich potencja³u regeneracyjnego [42]. Pierwsze doœwiadczenia polegaj¹ce na wprowadzeniu do miêœni szkieletowych niezró nicowanych komórek satelitowych przeprowadzono dopiero w ostatnich latach. W doœwiadczeniach tych transplantowano ca³e w³ókna miêœniowe razem z obecnymi w nich komórkami satelitowymi lub komórki satelitowe bezpoœrednio po ich izolacji z w³ókien. W obu przypadkach obserwowano masow¹ regeneracjê miêœni oraz poprawê ich funkcjonowania. Ponadto, przeszczepione komórki zasiedla³y nisze charakterystyczne dla komórek satelitowych, co jest jednym z warunków powodzenia terapii komórkowej [12, 16, 42, 50]. Mimo obiecuj¹cych wyników, terapia z wykorzystaniem komórek satelitowych wydaje siê byæ jednak ma³o realna ze wzglêdu na liczne trudnoœci. Po pierwsze, populacja tych komórek jest ograniczona i wykorzystanie ich do transplantacji wymaga³oby zwiêkszenia ich liczby w warunkach in vitro, co niestety prowadzi do utraty ich zdolnoœci do wydajnego udzia³u w regeneracji [42]. Ograniczenia zwi¹zane z hodowl¹ in vitro uniemo liwiaj¹ tak e zabiegi, które mog³yby doprowadziæ do genetycznej korekty komórek pobranych od pacjenta cierpi¹cego na dystrofiê miêœniow¹ i powtórne ich wprowadzenie do organizmu chorego. St¹d te du e nadzieje wzbudza mo liwoœæ wykorzystania komórek macierzystych, które mog³yby stanowiæ alternatywne Ÿród³o komórek do przeszczepu. Du e zainteresowanie mo liwoœci¹ wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej wi¹ e siê z ich cechami charakterystycznymi, tj. zdolnoœci¹ do samoodnawiania, która gwarantuje uzyskanie wystarczaj¹co du ej populacji komórek do transplantacji, oraz ich zdolnoœci¹ do ró nicowania w wyspecjalizowane rodzaje komórek. Komórki macierzyste s¹ obecne w organizmach na wszystkich etapach rozwoju, od rozwoju zarodkowego do doros³oœci. Te wywodz¹ce siê z zarodków charakteryzuj¹ siê wysokim tempem proliferacji oraz du ymi zdolnoœciami do ró nicowania. Komórki macierzyste obecne w organizmach doros³ych zwykle maj¹ ograniczone mo liwoœci ró nicowania i odpowiadaj¹ za uzupe³nianie populacji komórek tkanki, w której rezyduj¹, a które zu ywane s¹ w trakcie ycia organizmu [34]. Jednak bez wzglêdu na istniej¹ce ró nice kluczow¹ cech¹ wszystkich rodzajów komórek macierzystych, które mog³yby stanowiæ Ÿród³o materia³u do przeszczepu w terapii chorób miêœni szkieletowych, musi byæ ich zdolnoœæ do ró nicowania w komórki miêœniowe. Zdolnoœæ ta okreœlana jest jako potencja³ miogeniczny.

6 192 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA 3. JAK OCENIÆ POTENCJA MIOGENICZNY KOMÓREK MACIERZYSTYCH? Potencja³ miogeniczny komórek macierzystych mo na oceniæ testuj¹c je zarówno w warunkach hodowli in vitro, jak i in vivo. Pozwala to na okreœlenie, czy z komórek macierzystych powstaj¹ komórki to same lub przypominaj¹ce pod wzglêdem w³aœciwoœci komórki miêœniowe czyli komórki satelitowe i wywodz¹ce siê z nich mioblasty, a nastêpnie wieloj¹drowe miotuby i w³ókna miêœniowe. a. Ocena potencja³u miogenicznego komórek macierzystych in vitro Poddawane ocenie komórki macierzyste porównuje siê do mioblastów sprawdzaj¹c obecnoœæ, zarówno na poziomie mrna jak i bia³ka, czynników z rodziny Pax oraz MRF, a tak e wystêpowanie bia³ek strukturalnych oraz niezbêdnych do fuzji bia³ek adhezyjnych (np. M-kadheryny, syndekanu-4, ciê kich ³añcuchów miozyny). Kolejnym istotnym etapem weryfikacji potencja³u miogenicznego komórek macierzystych jest okreœlenie, czy sygna³y p³yn¹ce ze œrodowiska, w którym siê znajduj¹ s¹ w stanie zaindukowaæ ich ró nicowanie w mioblasty. Proces ten mo na indukowaæ stosuj¹c kilka procedur. Badane komórki mog¹ byæ hodowane w standardowych po ywkach promuj¹cych proliferacjê, a nastêpnie ró nicowanie komórek miêœniowych. Komórki macierzyste mo na hodowaæ tak e w po ywce kondycjonowanej (inaczej warunkowanej) przez ró nicuj¹ce komórki miêœniowe, czyli takiej, która zawiera czynniki wydzielane przez mioblasty [6, 58]. W praktyce metody te czêsto okazuj¹ siê niewystarczaj¹ce do indukcji ró nicowania komórek macierzystych w mioblasty. Bardziej efektywna wydaje siê byæ hodowla mieszana (inaczej kokultura) komórek macierzystych z ró nicuj¹cymi komórkami miêœniowymi. Zapewnia ona bezpoœredni kontakt badanych komórek z mioblastami, dziêki czemu maj¹ one szansê odpowiedzieæ na czynniki wydzielane przez mioblasty, miêdzy innymi insulinopodobny czynnik wzrostu IGFI i IGFII (ang. insulin-like growth factor) czy czynnik wzrostu fibroblastów FGF (ang. fibroblast growth factor) i rozpocz¹æ ró nicowanie. Metoda ta umo liwia tak e okreœlenie czêstoœci wystêpowania hybrydowych miotub powsta³ych w wyniku fuzji komórek macierzystych z mioblastami, których obecnoœæ sugeruje, e z danego typu komórek mog¹ powstaæ funkcjonalne komórki miêœniowe bior¹ce aktywny udzia³ w procesie regeneracji miêœni szkieletowych [56]. Inn¹ strategi¹ mo e byæ wprowadzanie do po ywki, w której hodowane s¹ komórki macierzyste, czynników odpowiedzialnych za indukcjê miogenezy podczas rozwoju zarodkowego, takich jak: bia³ka z rodziny Wnt, bia³ko morfogenetyczne koœci BMP (ang. bone morphogenetic protein) czy Sonic Hedgehog. Próba naœladowania procesów zachodz¹cych in vivo jest jednak doœæ trudna i czêsto wymaga zastosowania kilku czynników dodawanych do po ywki w œciœle okreœlonym czasie i stê eniu. Dlatego popularnym sposobem testowania potencja³u miogenicznego komórek macierzystych jest ich hodowla w obecnoœci komórek wydzielaj¹cych wspomniane czynniki, takich jak np. fibroblasty syntetyzuj¹ce bia³ko Wnt7a, które podczas rozwoju zarodkowego odpowiada za indukcjê miogenezy [6].

7 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 193 Ró nicowanie niektórych komórek macierzystych mo na osi¹gn¹æ przez stosowanie czynników chemicznych, np. 5-azacytydyny (5-AzaC), która jest inhibitorem metylacji DNA i przez zmianê konformacji chromatyny w komórce wp³ywa na zmianê wzoru ekspresji okreœlonych genów. Pod wp³ywem 5-AzaC wiele typów komórek, np. komórki macierzyste p³ynu owodniowego i mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego ró nicuje w komórki miêœniowe [11, 24]. Podobny efekt mo na osi¹gn¹æ wprowadzaj¹c do testowanych komórek wektory koduj¹ce okreœlone miêœniowe czynniki regulatorowe. Taka strategia przynios³a pozytywne wyniki m.in. w przypadku zarodkowych komórek macierzystych. Przyk³adowo, nadekspresja bia³ka Pax3 w tych komórkach wywo³a³a ich ró nicowanie w komórki miogeniczne [19]. b. Ocena potencja³u miogenicznego komórek macierzystych in vivo Ocena mo liwoœci ró nicowania komórek macierzystych w komórki miêœniowe w warunkach in vitro stanowi wstêp do najwa niejszej czêœci analizy, czyli weryfikacji ich potencja³u miogenicznego in vivo. Najpopularniejszym stosowanym testem jest wprowadzanie badanych komórek do regeneruj¹cych miêœni szkieletowych zwierz¹t laboratoryjnych (np. myszy), a nastêpnie kompleksowa analiza skutków tej transplantacji. Regeneracja miêœni szkieletowych mo e byæ wywo³ana na wiele sposobów, miêdzy innymi przez mechaniczne uszkodzenie miêœni, silne zmro enie lub nastrzykniêcie miotoksyn¹ (np. kardiotoksyn¹ otrzyman¹ z jadu kobry). Kardiotoksyna powoduje perforacjê b³on komórkowych i aktywacjê tkankowej fosfolipazy C, a w konsekwencji zaburzenia w funkcjonowaniu kana³ów jonowych, które prowadz¹ do depolaryzacji i degradacji b³on komórkowych [28]. Bez wzglêdu na sposób uszkodzenia, w miêœniu dochodzi do naruszenia integralnoœci b³ony w³ókien miêœniowych, które staj¹ siê bardziej przepuszczalne i pozwalaj¹ na uwolnienie do surowicy czynników zlokalizowanych do tej pory w ich cytoplazmie, np. kinazy kreatyninowej. Proces regeneracji przebiega wed³ug podobnego schematu i sk³ada siê z dwóch nak³adaj¹cych siê faz: degeneracyjnej (miolizy) oraz regeneracyjnej (rekonstrukcji). Podczas miolizy dochodzi do nekrozy uszkodzonych w³ókien miêœniowych, a uwalniane z nich cytokiny i czynniki wzrostu powoduj¹ rozwój stanu zapalnego w miejscu uszkodzenia. Komórki stanu zapalnego, takie jak neutrofile i makrofagi, fagocytuj¹ uszkodzone w³ókna miêœniowe i resztki uszkodzonej tkanki. Równoczeœnie w miêœniu dochodzi do aktywacji komórek satelitowych, które intensywnie proliferuj¹, ró nicuj¹ i odtwarzaj¹ w³ókna miêœniowe (ryc. 2) [15]. W doœwiadczeniach prowadzonych in vivo wa ne jest sprawdzenie, czy wprowadzone komórki potrafi¹ przetrwaæ w œrodowisku regeneruj¹cych miêœni, a tak e czy s¹ zdolne do proliferacji i migracji w obrêbie tej tkanki. Wprowadzone komórki mog¹ byæ rozpoznawane i eliminowane przez uk³ad odpornoœciowy biorcy, nale y wiêc okreœliæ, jak ich obecnoœæ w miêœniu szkieletowym wp³ywa na rozwój stanu zapalnego i czy nie wywo³uje odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko przeszczepowi, zaburzaj¹c w ten sposób przebieg regeneracji. W prowadzonych in vivo badaniach czêsto wykorzystuje siê myszy SCID, NOD lub Rag2 -/-. Zwierzêta te charakteryzuje

8 194K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA RYCINA 2. Regeneracja miêœni szkieletowych myszy. A przekrój poprzeczny przez nieuszkodzony miêsieñ szkieletowy myszy (m. gastrocnemius), widoczne w³ókna miêœniowe z peryferyjnie po³o onymi j¹drami komórkowymi; B przekrój poprzeczny przez miêsieñ szkieletowy myszy, 3. dzieñ po uszkodzeniu kardiotoksyn¹, widoczne uszkodzone w³ókna miêœniowe i liczne komórki stanu zapalnego rozwijaj¹cego siê w miêœniu; C przekrój poprzeczny przez miêsieñ szkieletowy myszy, 14 dni po uszkodzeniu kardiotoksyn¹,widoczne nowoutworzone w³ókna miêœniowe z centralnie po³o onymi j¹drami komórkowymi; D przekrój poprzeczny przez miêsieñ szkieletowy 3-miesiêcznej myszy SMN, widoczne liczne w³ókna miêœniowe z centralnie po³o onymi j¹drami komórkowymi powsta³e w wyniku spontanicznej regeneracji miêœnia w odpowiedzi na nieprawid³owe unerwienie miêœnia (skrawki barwione hematoksylin¹ Harrisa i eozyn¹ Y A, B, C oraz hematoksylin¹ Gilla i eozyn¹ Y D, skala 500 µm FIGURE 2. Regeneration of mouse skeletal muscles: A representative cross section of intact mouse skeletal musle (gastrocnemius muscle). Muscle fibers with peripherally located nuclei are visible. B cross section of mouse skeletal muscle 3 days after cardiotoxin injection. Damaged muscle fibers and numerous inflammatory cells are visible. C cross section of mouse skeletal muscle 14 days after cardiotoxin treatment. Newly regenerated fibers with central nuclei are visible. D cross section of skeletal muscle isolated from 3-month-old SMN mouse. As a result of spontaneous regeneration of muscle in response to improper innervation numerous muscle fibers with centrally located nuclei are visible. Sections stained with Harris' hematoxylin and eosin Y (A, B, C) or Gill's hematoxylin and eosin Y (D) Bar represents 500 µm niedobór odpornoœci [33, 35], a co za tym idzie nie odrzucaj¹ one przeszczepów nie tylko w uk³adzie allogenicznym (od osobników tego samego gatunku), ale tak e w uk³adzie ksenogenicznym (od osobników innych gatunków). Wykorzystanie tych zwierz¹t pozwala wiêc na testowanie udzia³u np. ludzkich komórek macierzystych w regeneracji miêœni szkieletowych. Najwa niejszym etapem analizy w³aœciwoœci

9 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 195 wprowadzonych do miêœnia komórek macierzystych jest okreœlenie, czy komórki te ró nicuj¹ w mioblasty, czy podczas regeneracji bior¹ udzia³ w tworzeniu hybrydowych w³ókien miêœniowych i czy s¹ zdolne do zasiedlenia niszy charakterystycznej dla komórek satelitowych. Tylko taka obserwacja pozwala na w³aœciw¹ weryfikacjê potencja³u miogenicznego wprowadzonych komórek, a pozytywny wynik daje szansê na uzyskanie d³ugofalowych efektów transplantacji komórek. Oprócz zwierz¹t, u których regeneracja jest wywo³ana uszkodzeniem miêœnia, w doœwiadczeniach in vivo wykorzystuje siê tak e zwierzêta, które stanowi¹ zwierzêce modele chorób miêœni wystêpuj¹cych u ludzi. Przyk³adem mog¹ byæ wspomniane ju myszy mdx oraz myszy SMN (ang. survival of motor neurons), które stanowi¹ zwierzêcy model choroby okreœlanej jako rdzeniowy zanik miêœni [44]. W miêœniach szkieletowych obu rodzajów myszy obserwuje siê spontaniczn¹ regeneracjê indukowan¹ w odpowiedzi na rozwój choroby (ryc. 2). Regeneracja miêœni dystroficznych przebiega standardowo we wczesnych stadiach choroby. Jednak w wyniku kolejnych rund regeneracji i degeneracji miêœni populacja komórek satelitowych ulega wyczerpaniu. Nastêpstwem tego s¹ powa ne zaburzenia struktury i funkcji miêœni szkieletowych, a nastêpnie ich stopniowy zanik. Poniewa rozwój choroby u myszy mdx jest du o wolniejszy i ³agodniejszy ni u ludzi, model ten nie jest doskona³y. W przeciwieñstwie do ludzi chorych na dystrofiê Duchenne'a, mimo widocznych zmian w strukturze miêœni myszy mdx s¹ zdolne do poruszania siê, a d³ugoœæ ich ycia jest tylko nieznacznie krótsza w porównaniu z myszami typu dzikiego. Ró nice w przebiegu choroby u ludzi i myszy t³umaczy siê wiêksz¹ zdolnoœci¹ miêœni szkieletowych myszy do regeneracji, a tak e czêœciow¹ kompensacj¹ braku dystrofiny przez inne bia³ka strukturalne, np. utrofinê [3]. Pomimo tego myszy mdx stanowi¹ popularny model wykorzystywany do oceny potencja³u miogenicznego komórek macierzystych. Dowodem na to, e przeszczepione komórki macierzyste bior¹ udzia³ w regeneracji miêœni myszy mdx jest synteza dystrofiny, poprawa architektury i zwiêkszenie si³y skurczu miêœnia. Z kolei u myszy SMN obserwuje siê postêpuj¹c¹ degeneracjê miêœni szkieletowych wywo³an¹ nieprawid³owym unerwieniem tej tkanki, co prowadzi do przedwczesnej œmierci zwierz¹t [37, 44]. Przeprowadzone w ostatnich latach badania wykaza³y jednak, e proces ten mo e zostaæ zahamowany przez wprowadzenie do miêœni myszy SMN ró nych rodzajów komórek macierzystych, m.in. komórek satelitowych i komórek izolowanych ze szpiku kostnego [43, 51]. Obecnoœæ tych komórek nie tylko wp³ynê³a na poprawê struktury i funkcjonowania miêœni, ale tak e przed³u y³a ycie tych myszy, co stanowi kluczowy argument przemawiaj¹cy za kontynuowaniem badañ poœwiêconych poszukiwaniu najlepszego Ÿród³a komórek do terapii chorób miêœni. Potencja³ miogeniczny komórek macierzystych mo na badaæ nie tylko w regeneruj¹cych, ale tak e w rozwijaj¹cych siê miêœniach szkieletowych. Doœwiadczenia takie polegaj¹ na wprowadzeniu badanych komórek do zarodków myszy na stadium blastocysty, a nastêpnie przeszczepieniu blastocysty do dróg rodnych samicy. Jeœli wprowadzone blastocysty ulegn¹ implantacji w macicy samicy-biorczyni, mo na

10 196 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA spodziewaæ siê, e badane komórki wezm¹ udzia³ w tworzeniu tkanek rozwijaj¹cego siê zarodka, w tym równie miêœni szkieletowych. Udzia³ poddawanych analizie komórek macierzystych w budowie miêœni szkieletowych mo na oceniaæ na ró nych etapach rozwoju zarodka, a tak e po narodzinach uzyskanego w ten sposób zwierzêcia chimerowego. Stosuj¹c tê technikê Schulze i wspó³pracownicy wykazali, e mezenchymalne komórki macierzyste izolowane ze szpiku kostnego mog¹ braæ udzia³ w tworzeniu miêœni szkieletowych [56]. 4. POTENCJA MIOGENICZNY KOMÓREK MACIERZYSTYCH Dotychczas przeprowadzono wiele badañ weryfikuj¹cych potencja³ miogeniczny komórek macierzystych pochodz¹cych z ró nych Ÿróde³. Najwiêcej publikacji naukowych poœwiêconych jest roli komórek macierzystych ze szpiku kostnego, mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek macierzystych z naczyñ krwionoœnych oraz zarodkowych komórek macierzystych (tab. 1) w regeneracji miêœni szkieletowych. a. Hematopoetyczne komórki macierzyste Pierwszym rodzajem komórek macierzystych, które wzbudzi³y zainteresowanie jako potencjalne Ÿród³o komórek do wykorzystania w terapii chorób miêœni szkieletowych, by³y komórki izolowane ze szpiku kostnego. Obecne s¹ w nim co najmniej dwie populacje komórek macierzystych, tj. hematopoetyczne komórki macierzyste HSC (ang. hematopoietic stem cells) i mezenchymalne komórki macierzyste MSC (ang. mesenchymal stem cells). HSC odpowiedzialne s¹ za wytwarzanie wszystkich komórek krwi, zaœ MSC s¹ Ÿród³em cytokin i czynników wzrostu oraz zapewniaj¹ odpowiednie mikroœrodowisko w szpiku kostnym. Pionierskie doœwiadczenia przeprowadzone przez Meyera i Yaroma w latach 80. udowodni³y, e obecnoœæ komórek izolowanych ze szpiku znacz¹co poprawia³a przebieg regeneracji miêœni szkieletowych szczurów i ma³p, a tak e zmniejsza³a w³óknienie tkanki miêœniowej [61]. W 1988 roku Ferrari i wspó³pracownicy wykazali, e komórki izolowane ze szpiku kostnego s¹ zdolne do zasiedlenia uszkodzonego miêœnia szkieletowego, a w odpowiedzi na sygna³y docieraj¹ce ze œrodowiska s¹ w stanie ró nicowaæ i braæ udzia³ w odtwarzaniu w³ókien miêœniowych [47]. Kolejne doniesienia sugerowa³y jednak, e mimo i transplantacji komórek uzyskanych ze szpiku kostnego do miêœni myszy mdx towarzyszy³o wznowienie syntezy dystrofiny w powstaj¹cych w³óknach miêœniowych, to wprowadzone komórki by³y w³¹czane do zaledwie 1% regeneruj¹cych w³ókien [27]. W tym samym czasie LaBarge i Blau opublikowali jednak pracê, w której wykazali, e komórki macierzyste wyizolowane ze szpiku kostnego myszy transgenicznej, w której komórkach dochodzi do ekspresji GFP (ang. green fluorescent protein), i wprowadzone przez y³ê ogonow¹ do krwioobiegu myszy biorczyni wziê³y udzia³ w odtworzeniu 3,5% zregenerowanych w³ókien. Ponadto komórki syntetyzuj¹ce bia³ko GFP by³y zdolne do zasiedlenia niszy komórek

11 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 197 T ABELA 1. P o równanie wybranych populacji komórek macierzystych pod wzglêdem potencja³u miogenicznego. Wyt³uszczone nazwy rodzajó w komóre k wskazuj¹ te, które w chwili obecnej budz¹ najwiêksze nadzieje na zastosowanie w terapii chorób miêœni szkieletowych TABLE 1. Comparison of myogenic potential of selected types of stem cells. Names in bold indicate those types of cells that currently are considered to best source of cells in the therapy for skeletal muscle diseas e s Zalety Wad y Literatur a be the Komórki satelitowe o gromny potencja³ regeneracyjny in vivo, zasiedlanie niszy komórek satelitowych biorcy, funkcjonalna poprawa zasiedlonych miêœni, brak koniecznoœci wstêpnego ró nicowania komórek H SC rutynowo izolowane ze szpiku kostnego, w ykazuj¹ potencja³ miogeniczny in vitr o i in viv o M SC wystêpuj¹ w wielu niszach w organizmie, s¹ dostêpne, ³atw e w izolacji i hodowli i n vitr o wykazuj¹ potencja³ miogeniczn y i n vitro i i n viv o zasiedlaj¹ miêsieñ z wysok¹ czêstoœci¹ (60%), zasiedlaj¹ niszê komórek satelitowych (kilkanaœcie procent), syntetyzuj¹ charakterystyczne markery i bior¹ udzia³ w kolejnych rundach regeneracji, tolerowane przez uk³ad immunologiczny gospodarza Mezangioblasty Komórki AC133+ Komórki ES z dolne do ró nicowania w warunkach i n vitr o zasiedlaj¹ niema l wszystkie miêœnie szkieletowe po wprowadzeniu do uk³adu kr¹ enia, wykrywane w 80% w³ókien miêœniowych, poprawiaj¹ funkcje motoryczne zwierzêcia obecne w kilku niszach w organizmie, ³atwe w izolacji ze wzglêdu na okreœlony marker powierzchniowy (bia³ko D133) zdolne do r ó nicowania w warunkach i n vitr o po transplantacji tworz ¹ hybrydowe w³ókna i zasiedlaj¹ niszê komórek satelitowych, ich obecnoœæ w miêœniu poprawia si³ê skurczu, ogranicza rozwój fibrozy i powoduje lepsze ukrwienie zdolne do podjêcia ró nicowania miogenicznego w warunkach i n vitro obecne w miêœniu nawet 6 miesiêcy po transplantacji, wykrywane w 20% w³ókien miêœniowych, poprawiaj¹ funkcje motoryczne zwierz¹t, zasiedlaj¹ niszê komórek satelitowych nisk¹ czêstoœci¹, zdolnoœæ do nieograniczonej proliferacji samoodnawiania, uzyskanie indukowanych komórek pluripotentnych ze Ÿród³a niebudz¹cego kontrowersj i etycznyc h ograniczona liczba komórek,trudnoœci w izolacji i hodowli i n vitr o bez utrat y potencja³u regeneracyjnego zasiedlaj¹ miêœnie szkieletowe z nisk¹ czêstoœci¹, komórki obecne w niszy komórek satelitowych s¹ niefunkcjonalne, nieznany mechanizm ró nicowania sprzeczne wyniki na temat ich mechanizmu ró nicowania (fuzja vs "autonomiczna" zmiana wzoru ekspresji genów), brak oceny wp³ywu obecnoœci komórek na si³ê kurczu miêœni i funkcje motoryczne zwierzêcia (testy fizjologiczne) koniecznoœæ opracowania izolacji komórek, wyniki potwierdzone przez inne koniecznoœæ klinicznych przeprowadzenia metody wydajnej musz¹ zostaæ grupy badawcze badañ Collins i wsp [16] Montarras i wsp [42] Cerletti i wsp [12] Sacco i wsp [50] Camargo i wsp [10] Corbel i wsp [17] Sherwood i wsp [57] Sherwood i wsp [58] Abedi i wsp [1] Wakitani i wsp [65] De Bari i wsp [23] Schulze i wsp [56] Dezawa i wsp [25] Gang i wsp [30] De Angelis Sampaolesi Sampaolesi i i i z i samoistne ró nicowanie komórek ES w kulach zarodkowych zachodzi z nisk¹ czêstoœci¹, nieznany mechanizm r ó n icowania, synteza tylko niektóryc h markerów miogenicznych, mo liwoœæ tworzenia guzów nowotworowych po transplantacji, sprzeczne wyniki na temat immunogennoœci komórek ES, kontrowersje etyczne dotycz¹ce uzyskiwania komórek ES z zarodków wsp wsp.2003 wsp.2006 Torrente i wsp., 2004 Gavina i wsp., 2006 Shi i wsp., 2009 [59] [64] [32] [22] [53] [52] Rohwedel i wsp., 1994 [49] Barberi i wsp., 2005 [5] Kamochi i wsp., 2006 [36] Zheng i wsp., 2006 [70] Barberi i wsp., 2007 [4] Darabi i wsp., 2008 [19] Chang i wsp., 2009 [14],,,,,

12 198 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA satelitowych i ekspresji markerów miogenicznych, takich jak: Myf-5, integryna a7 i c-met [47]. Komórki syntetyzuj¹ce GFP (komórki dawcy), które wyizolowano z miêœni myszy biorczyñ, by³y zdolne do podjêcia ró nicowania in vitro i utworzenia wieloj¹drowych miotub. W 2003 roku opublikowano wyniki doœwiadczeñ, w których do uszkodzonych miêœni szkieletowych wprowadzono wy³¹cznie wyselekcjonowane, hematopoetyczne komórki macierzyste, a nie mieszaninê wszystkich komórek izolowanych ze szpiku kostnego, jak poprzednio. Camargo i wspó³pracownicy oraz Corbel i wspó³pracownicy niezale nie wykazali, e pojedyncza komórka HSC wprowadzona do organizmu biorcy wykazuje nie tylko potencja³ hematopoetyczny, ale tak e miogeniczny. Wywodz¹ce siê z niej komórki potomne zasiedla³y uszkodzony miêsieñ szkieletowy i bra³y udzia³ w tworzeniu hybrydowych w³ókien, jednak nie by³y zdolne ani do zasiedlenia niszy komórek satelitowych, ani do przekszta³cenia w funkcjonalne mioblasty. Zdaniem Camargo i wspó³pracowników komórki te bra³y udzia³ w regeneracji wy³¹cznie dziêki fuzji z komórkami biorcy podczas tworzenia nowych w³ókien miêœniowych [47]. Obserwacje te zosta³y rozszerzone o wyniki innych badañ, które dowiod³y, e mimo i HSC s¹ zdolne do zasiedlania uszkodzonego miêœnia, to jednak proces ten zachodzi z nisk¹ czêstoœci¹. HSC wykryte w niszy komórek satelitowych by³y, w przeciwieñstwie do uprzednio opisanych badañ, niefunkcjonalne [57, 58]. Wyniki te zakwestionowa³y sens prowadzenia terapii z wykorzystaniem hematopoetycznych komórek macierzystych. Pomimo to ci¹gle prowadzone s¹ badania poœwiêcone ustaleniu optymalnych warunków transplantacji komórek macierzystych ze szpiku kostnego do miêœni szkieletowych, choæ uzyskiwane wyniki s¹ nadal niesatysfakcjonuj¹ce [1, 2, 38, 40]. Mo e warto wiêc pamiêtaæ o hipotezie Sherwooda i wspó³pracowników mówi¹cej o tym, e jeœli jakieœ komórki obecne w szpiku kostnym maj¹ potencja³ miogeniczny, to nie s¹ to z pewnoœci¹ HSC, a z du ym prawdopodobieñstwem mezenchymalne komórki macierzyste [58]. b. Mezenchymalne komórki macierzyste Mezenchymalne komórki macierzyste po raz pierwszy zidentyfikowano w szpiku kostnym. Obecne s¹ one w wielu tkankach zarówno zarodkowych, jak i doros³ych organizmów, a tak e we krwi pêpowinowej i p³ynie owodniowym [11, 39]. Komórki te s¹ wiêc ³atwiej dostêpne ni np. komórki macierzyste szpiku kostnego. Wiadomo równie, e MSC mog¹ ró nicowaæ w wiele tkanek pochodzenia mezodermalnego, w tym np. tkankê t³uszczow¹, chrz¹stkê czy koœæ. W 1995 roku po raz pierwszy stwierdzono, e wykazuj¹ one tak e potencja³ miogeniczny. Badania przeprowadzone przez grupê pod kierownictwem Caplana wykaza³y, e MSC wyizolowane ze szpiku kostnego szczura i hodowane w obecnoœci 5-AzaC ró nicuj¹ w mioblasty, syntetyzuj¹ specyficzne miêœniowo czynniki, takie jak np. miozyna, oraz tworz¹ wieloj¹drowe, spontanicznie kurcz¹ce siê miotuby [11]. Ci sami naukowcy wykazali te, e komórki te hodowane z mioblastami tworz¹ hybrydowe miotuby, a po wprowadzeniu MSC do miêœni myszy mdx zaobserwowano nie tylko wzrost masy miêœni, ale tak e ekspresjê dystrofiny w nowopowstaj¹cych w³óknach. Zdaniem autorów œwiadczy³o

13 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 199 to o tym, e w populacji MSC znajduj¹ siê komórki zdolne do ró nicowania w mioblasty [11]. W roku 2002 i 2003 de Bari i wspó³pracownicy stwierdzili, e ludzkie MSC wyizolowane z b³ony maziowej i wprowadzone do miêœni myszy SCID-mdx s¹ zdolne do ekspresji jedynie jednego markera miogenicznego Myf-5. Pomimo to komórki te uczestniczy³y w tworzeniu 60% nowopowsta³ych w³ókien, a tak e zasiedli³y niszê charakterystyczn¹ dla komórek satelitowych. Tak e MSC izolowane z krwi pêpowinowej, p³ynu owodniowego oraz krwi p³odowej ró nicuj¹ i tworz¹ w³ókna miêœniowe w odpowiedzi na czynniki, takie jak: 5-azaC, sterydy, surowica koñska czy wydzielana przez ró nicuj¹ce mioblasty galektyna [13, 24, 31]. We wszystkich przypadkach hodowane komórki syntetyzowa³y charakterystyczne dla miêœni szkieletowych bia³ka. Dla zrozumienia mechanizmu udzia³u MSC w regeneracji miêœni istotne by³o znalezienie odpowiedzi na pytanie, czy ich ró nicowanie jest wynikiem autonomicznej reakcji na stosowane bodÿce, czy te wi¹ e siê z fuzj¹ tych komórek z mioblastami i ich w³¹czaniem do tworz¹cych siê miotub i w³ókien miêœniowych. Wyniki uzyskane przez grupê kierowan¹ przez Brauna œwiadczy³y o tym, e MSC hodowane w obecnoœci komórek wydzielaj¹cych czynniki istotne dla ró nicowania komórek miêœniowych, takie jak Wnt7a czy Wnt11 s¹ zdolne do podjêcia ró nicowania, ale samodzielnie nie s¹ w stanie utworzyæ funkcjonalnych komórek miêœniowych, a ich pe³ne ró nicowanie wymaga kontaktu i fuzji z mioblastami [6, 56]. Hipoteza Brauna i wspó³pracowników mówi¹ca o niemo noœci pe³nego i niezale nego od fuzji z mioblastami ró nicowania macierzystych komórek mezenchymalnych wydaje siê byæ jednak sprzeczna z obserwacjami innych grup badawczych, m.in. Dezawy i wspó³pracowników oraz Ganga i wspó³pracowników. Wykazali oni, e w hodowanych in vitro MSC, w których doprowadzono do nadekspresji czynników reguluj¹cych miogenezê, takich jak Notch1 i Pax3, dochodzi do ekspresji zarówno markerów charakterystycznych dla wczesnych (MyoD, Myf-5), jak i póÿnych stadiów ró nicowania mioblastów (miogenina, ciê kie ³añcuchy miozyny [25, 30]). Komórki te tworzy³y tak e zdolne do spontanicznych skurczów wieloj¹drowe miotuby. Warto zaznaczyæ, e w populacji ró nicuj¹cych MSC obecne by³y tak e takie, które syntetyzowa³y markery komórek satelitowych Pax7, Myf-5 i c-met, co jest niezwykle istotnym parametrem œwiadcz¹cym o potencjale miogenicznym badanych komórek [25, 30]. Oprócz wyników doœwiadczeñ przeprowadzonych in vitro, niezwykle obiecuj¹ce dla opracowania metod potencjalnej terapii s¹ równie rezultaty badañ prowadzonych w warunkach in vivo. Dezawa i wspó³pracownicy wykazali, e MSC zaindukowane do ró nicowania w komórki miêœniowe przez nadekspresjê bia³ka Notch-1, a nastêpnie wprowadzone do regeneruj¹cych miêœni, by³y wykrywane w 30 40% zregenerowanych w³ókien [25]. Komórki te zasiedla³y tak e niszê komórek satelitowych i co istotne bra³y udzia³ w kolejnych rundach regeneracji. W regeneracji miêœni szkieletowych myszy SCID mog¹ uczestniczyæ równie ludzkie komórki krwi pêpowinowej, które po wstrzykniêciu do uszkodzonych mechanicznie miêœni szkieletowych bior¹ udzia³ w budowie oko³o 10% nowych w³ókien miêœniowych i zasiedlaj¹

14 200 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA nisze charakterystyczne dla komórek satelitowych [9]. Udowodniony potencja³ miogeniczny oraz mo liwoœæ pozyskania mezenchymalnych komórek macierzystych z ró nych Ÿróde³ czyni z nich potencjalne Ÿród³o materia³u do przeszczepów. c. Komórki macierzyste pochodz¹ce z naczyñ krwionoœnych Oprócz MSC, du e nadzieje na wykorzystanie w leczeniu dystrofii i poprawie regeneracji miêœni szkieletowych budz¹ komórki macierzyste pochodz¹ce z naczyñ krwionoœnych, tj. mezangioblasty oraz komórki syntetyzuj¹ce CD133 i okreœlane jako AC133+. Pierwsze z nich, mezangioblasty, opisano po raz pierwszy w 1999 roku jako syntetyzuj¹ce markery endotelialne i miogeniczne komórki obecne w œcianie aorty grzbietowej rozwijaj¹cego siê zarodka myszy [18]. Hodowane in vitro mezangioblasty nie ró ni¹ siê morfologi¹ od mioblastów, poza tym syntetyzuj¹ one m.in. MyoD, Myf-5 oraz M-kadherynê i s¹ zdolne do fuzji z mioblastami. Najistotniejsze jest jednak to, e wprowadzenie mezangioblastów do krwioobiegu myszy lub psów cierpi¹cych na dystrofiê prowadzi do ich rozleg³ej migracji w miêœniach poprzez system kapilar, dziêki czemu s¹ one wykrywane nawet w 70% w³ókien [52]. Obecnoœæ mezangioblastów w dystroficznych miêœniach doprowadzi³a do poprawy funkcji zasiedlonej tkanki, co stwierdzono miêdzy innymi na podstawie analizy si³y skurczów miêœni [18]. Poprzedzaj¹ca przeszczep ekspozycja mezangioblastów na stromalny czynnik wzrostu (SDF-1), przy równoczesnej nadekspresji L-selektyny w tych komórkach, zwiêkszy³a ich zdolnoœæ do migracji i adhezji. W konsekwencji po wprowadzeniu do organizmu komórki te bra³y udzia³ w budowie ponad 80% w³ókien miêœniowych [29]. Przytoczone wyniki badañ czyni¹ z mezangioblastów jeden z najbardziej obiecuj¹cych rodzajów komórek mo liwych do wykorzystania w terapii dysfunkcjonalnych miêœni szkieletowych. Ci¹gle jednak istnieje potrzeba opracowania wydajnej i wysoce selektywnej metody izolacji tych komórek. Pozwoli³oby to na odrzucenie zarzutów o mo liwej kontaminacji populacji mezangioblastów przez inne komórki, a tak e o wp³ywie stosowanych przez autorów leków immunosupresyjnych na poprawê funkcjonowania miêœni dystroficznych [8, 21, 48]. Inn¹ grup¹ komórek zwi¹zan¹ z naczyniami krwionoœnymi s¹ komórki syntetyzuj¹ce bia³ko powierzchniowe CD133 i okreœlane jako komórki AC133+. Komórki te obecne s¹ m.in. w krwi obwodowej, szpiku kostnym, nerkach, trzustce, krwi pêpowinowej oraz p³odowej w¹trobie. Wykazuj¹ one zdolnoœæ do wielokierunkowego ró nicowania, m.in. w komórki linii hematopoetycznej, œródb³onkowej i neuronalnej [41]. Komórki AC133+ hodowane z mioblastami s¹ tak e zdolne do rozpoczêcia ró nicowania miogenicznego wyra anego ekspresj¹ takich czynników, jak: Pax7, Myf5, M-kadheryna i CD34 [64]. Wprowadzenie ich do krwioobiegu myszy mdx doprowadzi³o do znacz¹cej poprawy regeneracji dystroficznych miêœni, utworzenia przez komórki AC133 w³ókien syntetyzuj¹cych dystrofinê oraz zasiedlenia przez nie niszy komórek satelitowych. Ich obecnoœæ w miêœniach wp³ynê³a tak e na wzrost si³y skurczu miêœni [64]. Potencja³ miogeniczny komórek AC133+ zosta³ potwierdzony w kolejnych badaniach, które wykaza³y miêdzy innymi, e wzrost ekspresji odpowiedzialnego za adhezjê bia³ka VCAM-1 (ang. vascular cell adhesion

15 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 201 molecule-1) w miêœniach szkieletowych, wywo³any wysi³kiem fizycznym, czterokrotnie zwiêkszy³ liczbê w³ókien miêœniowych powsta³ych przy udziale komórek AC133+ [32]. Obecnoœæ komórek AC133+ w regeneruj¹cych miêœniach wp³ynê³a na przyspieszenie procesu rekonstrukcji miêœni przez ograniczenie rozwoju fibrozy oraz lepsze ukrwienie regeneruj¹cego miêœnia [59]. Zdolnoœæ komórek AC133+ oraz mezangioblastów do migracji w naczyniach krwionoœnych umo liwiaj¹ca im zasiedlenie niemal wszystkich miêœni szkieletowych, a tak e wp³yw tych komórek na poprawê struktury i fizjologii miêœni szkieletowych sprawiaj¹, e s¹ one uwa ane za najpowa niejszych kandydatów do wykorzystania w terapii komórkowej dystrofii miêœniowych. d. Zarodkowe komórki macierzyste Zarodkowe komórki macierzyste komórki ES (ang. embryonic stem cells) s¹ komórkami pluripotencjalnymi, zdolnymi do ró nicowania we wszystkie linie komórek i tkanek buduj¹cych organizm. Stosuj¹c odpowiednie warunki hodowli in vitro mo na sprawiæ, e bêd¹ one tworzy³y trójwymiarowe agregaty okreœlane jako kule zarodkowe, zbudowane z ekto-, endo- i mezodermy. In vivo, po wprowadzeniu komórek ES np. pod skórê myszy SCID, przejawem ich pluripotencji jest tworzenie teratom, czyli ³agodnych guzów nowotworowych zawieraj¹cych ró ne rodzaje tkanek. W teratomach znajdowane s¹ równie komórki wykazuj¹ce ekspresjê genów charakterystycznych dla tkanki miêœniowej szkieletowej [66]. Sugeruje to, e komórki ES maj¹ potencja³ miogeniczny, pomimo e utrzymywane w stanie niezró nicowanym nie syntetyzuj¹ czynników miêœniowych [4, 5, 14, 20, 36, 63, 70]. Po raz pierwszy obecnoœæ komórek eksprymuj¹cych czynniki MRF zosta³a stwierdzona w kulach zarodkowych w 1994 roku przez Rohwedela i wspó³pracowników. Analiza ta by³a oparta jedynie na obserwacji zmian morfologii komórek oraz wykrywaniu transkryptów MRF metod¹ RT-PCR, co sta³o siê podstaw¹ w¹tpliwoœci podnoszonych przez inne grupy badawcze. Badania przeprowadzone w ostatnich latach wykaza³y bowiem, e komórki buduj¹ce kule zarodkowe nie s¹ zdolne do samodzielnego rozpoczêcia ró nicowania w mioblasty [19, 54] lub te ró nicowanie takie zachodzi bardzo sporadycznie [63, 70]. Indukcja ró nicowania w mioblasty by³a mo liwa dopiero po zastosowaniu dodatkowego czynnika (np. sperminy lub 5-AzaC) [54, 70]. Jednak uzyskane w ten sposób komórki syntetyzuj¹ tylko niektóre markery miogeniczne i fuzjuj¹ z nisk¹ czêstoœci¹, co stawia pod znakiem zapytania ich funkcjonalnoœæ. Inna strategia indukcji ró nicowania miogenicznego komórek ES zosta³a wykorzystana przez Barberi'ego i wspó³pracowników. Hodowali oni ludzkie komórki ES w kokulturze z komórkami zrêbu szpiku, które wydzielaj¹ czynniki promuj¹ce ró nicowanie w mezodermê. Po 6 tygodniach spoœród hodowanych komórek wyselekcjonowano te, które syntetyzowa³y charakterystyczne dla komórek mezodermalnych bia³ko CD73, a nastêpnie hodowano je w warunkach umo liwiaj¹cych ich ró nicowanie w mioblasty. Uzyskane komórki nie by³y jednak zdolne do podjêcia takiego ró nicowania nie wykryto w nich obecnoœci adnych markerów miogenicznych, ani nie zaobserwowano zmian morfologii. Dopiero hodowla komórek CD73+

16 202 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA w obecnoœci mioblastów linii komórkowej C2C12 lub inkubacja z 5-AzaC zaindukowa³y ekspresjê myod i miogeniny [5]. Modyfikacja procedury doœwiadczenia o dodatkow¹ selekcjê komórek, które syntetyzowa³y charakterystyczne m.in. dla komórek satelitowych i ró nicuj¹cych mioblastów bia³ko N-CAM (ang. neural cell adhesion molecule), przynios³a lepsze wyniki. Po 6 tygodniach hodowli od 2 do 10% komórek komórek CD73+ i N-CAM+ syntetyzowa³o markery miogeniczne [4]. Wyselekcjonowane w ten sposób komórki wykrywano jeszcze po 6 miesi¹cach od ich wprowadzenia do uszkodzonych miêœni szkieletowych myszy SCID [4]. Najlepsze rezultaty w uzyskiwaniu komórek miêœniowych z komórek ES otrzymano w wyniku nadekspresji okreœlonych czynników w komórkach ES. Nadekspresja insulinopodobnego czynnika wzrostu II IGFII (ang. insulin-like growth factor-ii), wydzielanego przez ró nicuj¹ce mioblasty zarówno w hodowli in vitro, jak i w regeneruj¹cym miêœniu szkieletowym, doprowadzi³a do rozpoczêcia syntezy MyoD, Myf5, miogeniny i M-kadheryny. Komórki, w których zaindukowano zwiêkszon¹ ekspresjê igfii, by³y zdolne do fuzji i utworzenia wieloj¹drowych, kurcz¹cych siê miotub [36, 66]. Natomiast nadekspresja genu pax3 doprowadzi³a do zmiany morfologii zarodkowych komórek macierzystych oraz do ekspresji czynników miogenicznych [19]. Potencja³ miogeniczny komórek ES zosta³ tak e poddany ocenie w warunkach in vivo. Bhagavati i Xu przeprowadzili doœwiadczenia, w których wykorzystano komórki ES hodowane uprzednio przez kilka dni z mioblastami. Procedura ta mia³a zaindukowaæ ró nicowanie komórek ES w mioblasty. Dowodem na potencja³ miogeniczny tych komórek mia³ byæ ich udzia³ w regeneracji miêœni myszy mdx i obecnoœæ w³ókien, w których stwierdzono syntezê dystrofiny [7]. Jednak liczba w³ókien zawieraj¹cych dystrofinê by³a bardzo ma³a i mog³a byæ wynikiem tzw. spontanicznego odwrócenia mutacji. Zjawisko to obserwowane jest u myszy mdx, u których pomimo mutacji w genie koduj¹cym dystrofinê sporadycznie wykrywa siê obecnoœæ tego bia³ka w miêœniach [67]. Transplantacja wstêpnie zró nicowanych komórek ES do miêœni szkieletowych, a nastêpnie ocena skutków takiego zabiegu zosta³a przeprowadzona tak e przez kilka innych grup badawczych. Wprowadzenie komórek ES, w których najpierw zaindukowano ekspresjê igfii, wp³ynê³o na poprawê funkcji motorycznych regeneruj¹cych miêœni ju po 14 dniach od zabiegu [36]. Transplantowane komórki syntetyzowa³y specyficzne miêœniowo czynniki oraz receptory acetylocholiny, co œwiadczy³o o dojrzewaniu utworzonych w³ókien miêœniowych oraz tworzeniu funkcjonalnych p³ytek motorycznych. W miêœniach, do których wprowadzono komórki ES zaindukowane do ró nicowania przez nadekspresjê genu pax3, czêstoœæ wystêpowania w³ókien zasiedlonych przez te komórki wynios³a 10 20% [19]. Mimo e wprowadzone do miêœnia komórki syntetyzowa³y M-kadherynê, syndekan-4 i CD34, markery komórek satelitowych, to transplantowanych komórek nie wykryto w niszy komórek satelitowych. Zasiedlenie niszy komórek satelitowych stwierdzono w innych doœwiadczeniach, w których wykorzystano komórki ES uprzednio zaindukowane do ró nicowania przez hodowlê w obecnoœci epidermal-nego czynnika wzrostu, 5-azaC lub surowicy koñskiej [14, 70]. Komórki

17 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 203 takie by³y zdolne do syntezy markerów komórek satelitowych, takich jak: Pax7, Myf-5, c-met, M-kadheryna, i bra³y udzia³ w kolejnych rundach regeneracji, mimo i zasiedla³y niszê komórek satelitowych z nisk¹ czêstoœci¹. Przeszczepianie do miêœni wstêpnie zró nicowanych komórek znacz¹co zwiêksza mo liwoœæ wykorzystania komórek ES w terapii chorób miêœni. Do najpowa niejszych problemów stoj¹cych przed badaczami oceniaj¹cymi szanse na wykorzystanie komórek ES w medycynie regeneracyjnej jest zagro enie zwi¹zane z powstawaniem w organizmie biorcy teratom, problemy zwi¹zane z usuwaniem przeszczepionych komórek w wyniku reakcji immunologicznej oraz budz¹ce zastrze- enia natury etycznej zarodkowe pochodzenie komórek ES. Tworzenie teratom u myszy, którym wszczepiono komórki ES, stwierdzono tylko w nielicznych przypadkach, gdy niezró nicowane komórki by³y przeszczepiane do tkanek myszy z upoœledzonym uk³adem odpornoœci [19, 63]. Jednak w wiêkszoœci opisanych badañ, w których wykorzystywano wstêpnie zró nicowane komórki ES, nie zaobserwowano rozwoju guzów [4, 14, 70]. Wed³ug Tiana i wspó³pracowników brak teratom w organizmie niepoddawanego immunosupresji, allogenicznego biorcy œwiadczy o usuniêciu tych komórek z zasiedlonego miêœnia w wyniku odpowiedzi immunologicznej [63]. Jednak w dwóch niezale nych badaniach potwierdzono obecnoœæ komórek ES w miêœniach biorcy pomimo wykorzystania w doœwiadczeniu uk³adu allogenicznego [14, 36]. Trzeba jednak wspomnieæ, e Autorzy pierwszej pracy nie podali czêstoœci wystêpowania tych komórek, w drugiej pracy opisano, e by³y one obecne jedynie w 1% wszystkich w³ókien. Zatem mimo obiecuj¹cych wyników przeprowadzonych do tej pory badañ, ci¹gle istnieje wiele niewiadomych dotycz¹cych mo liwoœci ró nicowania komórek ES w warunkach in vitro i in vivo, a tak e oceny skutków transplantacji tych komórek do organizmu biorcy. W 2006 roku z fibroblastów uzyskano indukowane komórki pluripotencjalne ips (ang. induced pluripotent stem [62]). W kolejnych latach komórki takie otrzymano tak e z innych rodzajów komórek [55]. Poniewa pochodzenie komórek ips jak dotychczas nie budzi w¹tpliwoœci natury etycznej, nale y rozwa aæ je jako nowe Ÿród³o komórek, które mog³yby w przysz³oœci wspomagaæ regeneracjê miêœni szkieletowych. Ze wzglêdu na wiele cech wspólnych w badaniach komórek ips wykorzystywana jest wiedza uzyskana z badañ nad komórkami ES. Stwarza to nadziejê na szybki postêp badañ, a co za tym idzie identyfikacjê czynników, które pozwoli³yby nie tylko wydajnie uzyskiwaæ z komórek pluripotencjalnych komórki miêœniowe, ale tak e dok³adnie przeanalizowaæ mechanizmy ich ró nicowania. 5. PODSUMOWANIE Jednym z najbardziej fascynuj¹cych aspektów badañ nad biologi¹ komórek macierzystych jest szansa na opracowanie nowych terapii chorób, których do tej pory nie mo na by³o skutecznie leczyæ. Prace badawcze nad zastosowaniem komórek

18 204K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA macierzystych jako potencjalnego Ÿród³a komórek do wspomagania regeneracji miêœni szkieletowych s¹ prowadzone od wielu lat i w wielu laboratoriach. Przytoczone powy ej wyniki badañ przyczyni³y siê do lepszego poznania ró nych populacji komórek, dziêki czemu byæ mo e niektóre z nich (np. mezenchymalne komórki macierzyste) znajd¹ w przysz³oœci zastosowanie w leczeniu chorób miêœni. Jednak e pomimo prowadzenia intensywnych analiz wiele pytañ dotycz¹cych udzia³u niemiêœniowych komórek macierzystych w regeneracji miêœni szkieletowych pozostaje bez odpowiedzi. 6. LITERATURA [1] ABEDI M, FOSTER BM, WOOD KD, COLVIN GA, MCLEAN SD, JOHNSON KW, GREER DA. Haematopoietic stem cells participate in muscle regeneration. Br J Haematol 2007; 138: [2] ABEDI M, GREER DA, FOSTER BM, COLVIN GA, HARPEL JA, DEMERS DA, PIMENTEL J, DO- ONER MS, QUESENBERRY PJ. Critical variables in the conversion of marrow cells to skeletal muscle. Blood 2005; 106: [3] BANKS GB, CHAMBERLAIN JS. The value of mammalian models for duchenne muscular dystrophy in developing therapeutic strategies. Curr Top Dev Biol 2008; 84: [4] BARBERI T, BRADBURY M, DINCER Z, PANAGIOTAKOS G, SOCCI ND, STUDER L. Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells. Nat Med 2007; 13: [5] BARBERI T, WILLIS LM, SOCCI ND, STUDER L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Med 2005; 2: e161. [6] BEDADA FB, BRAUN T. Partial induction of the myogenic program in noncommitted adult stem cells. Cells Tissues Organs 2008; 188: [7] BHAGAVATI S, XU W. Generation of skeletal muscle from transplanted embryonic stem cells in dystrophic mice. Biochem Biophys Res Commun 2005; 333: [8] BRUNELLI S, SCIORATI C, D'ANTONA G, INNOCENZI A, COVARELLO D, GALVEZ BG, PERROT- TA C, MONOPOLI A, SANVITO F, BOTTINELLI R, ONGINI E, COSSU G, CLEMENTI E. Nitric oxide release combined with nonsteroidal antiinflammatory activity prevents muscular dystrophy pathology and enhances stem cell therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: [9] BRZOSKA E, GRABOWSKA I, HOSER G, STREMINSKA W, WASILEWSKA D, MACHAJ EK, POJDA Z, MORACZEWSKI J, KAWIAK J. Participation of stem cells from human cord blood in skeletal muscle regeneration of SCID mice. Exp Hematol 2006; 34: [10] CAMARGO FD, GREEN R, CAPETANAKI Y, JACKSON KA, GOODELL MA. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat Med 2003; 9: [11] CAPLAN AI. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J Pathol 2009; 217: [12] CERLETTI M, JURGA S, WITCZAK CA, HIRSHMAN MF, SHADRACH JL, GOODYEAR LJ, WAGERS AJ. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell 2008; 134: [13] CHAN J, O'DONOGHUE K, GAVINA M, TORRENTE Y, KENNEA N, MEHMET H, STEWART H, WATT DJ, MORGAN JE, FISK NM. Galectin-1 induces skeletal muscle differentiation in human fetal mesenchymal stem cells and increases muscle regeneration. Stem Cells 2006; 24: [14] CHANG H, YOSHIMOTO M, UMEDA K, IWASA T, MIZUNO Y, FUKADA S, YAMAMOTO H, MOTOHASHI N, MIYAGOE-SUZUKI Y, TAKEDA S, HEIKE T, NAKAHATA T. Generation of transplantable, functional satellite-like cells from mouse embryonic stem cells. Faseb J 2009; 23: [15] CHARGE SB, RUDNICKI MA. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev 2004; 84: [16] COLLINS CA, OLSEN I, ZAMMIT PS, HESLOP L, PETRIE A, PARTRIDGE TA, MORGAN JE. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell 2005; 122:

19 KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊŒNI 205 [17] CORBEL SY, LEE A, YI L, DUENAS J, BRAZELTON TR, BLAU HM, ROSSI FM. Contribution of hematopoietic stem cells to skeletal muscle. Nat Med 2003; 9: [18] COSSU G, SAMPAOLESI M. New therapies for muscular dystrophy: cautious optimism. Trends Mol Med 2004; 10: [19] DARABI R, GEHLBACH K, BACHOO RM, KAMATH S, OSAWA M, KAMM KE, KYBA M, PERLIN- GEIRO RC. Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells. Nat Med 2008; 14: [20] DARABI R, SANTOS FN, PERLINGEIRO RC. The therapeutic potential of embryonic and adult stem cells for skeletal muscle regeneration. Stem Cell Rev 2008; 4: [21] DAVIES KE, GROUNDS MD. Treating muscular dystrophy with stem cells? Cell 2006; 127: [22] DE ANGELIS L, BERGHELLA L, COLETTA M, LATTANZI L, ZANCHI M, CUSELLA-DE ANGELIS MG, PONZETTO C, COSSU G. Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta coexpress endothelial and myogenic markers and contribute to postnatal muscle growth and regeneration. J Cell Biol 1999; 147: [23] DE BARI C, DELL'ACCIO F, VANDENABEELE F, VERMEESCH JR, RAYMACKERS JM, LUYTEN FP. Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from synovial membrane. J Cell Biol 2003; 160: [24] DE COPPI P, BARTSCH G, JR., SIDDIQUI MM, XU T, SANTOS CC, PERIN L, MOSTOSLAVSKY G, SERRE AC, SNYDER EY, YOO JJ, FURTH ME, SOKER S, ATALA A. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol 2007; 25: [25] DEZAWA M, ISHIKAWA H, ITOKAZU Y, YOSHIHARA T, HOSHINO M, TAKEDA S, IDE C, NABE- SHIMA Y. Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration. Science 2005; 309: [26] EMERY AE. The muscular dystrophies. Lancet 2002; 359: [27] FERRARI G, MAVILIO F. Myogenic stem cells from the bone marrow: a therapeutic alternative for muscular dystrophy? Neuromuscul Disord 2002; 12 Suppl 1: S7 10. [28] FLETCHER JE, HUBERT M, WIELAND SJ, GONG QH, JIANG MS. Similarities and differences in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon 1996; 34: [29] GALVEZ BG, SAMPAOLESI M, BRUNELLI S, COVARELLO D, GAVINA M, ROSSI B, CONSTANTIN G, TORRENTE Y, COSSU G. Complete repair of dystrophic skeletal muscle by mesoangioblasts with enhanced migration ability. J Cell Biol 2006; 174: [30] GANG EJ, BOSNAKOVSKI D, SIMSEK T, TO K, PERLINGEIRO RC. Pax3 activation promotes the differentiation of mesenchymal stem cells toward the myogenic lineage. Exp Cell Res 2008; 314: [31] GANG EJ, JEONG JA, HONG SH, HWANG SH, KIM SW, YANG IH, AHN C, HAN H, KIM H. Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood. Stem Cells 2004; 22: [32] GAVINA M, BELICCHI M, ROSSI B, OTTOBONI L, COLOMBO F, MEREGALLI M, BATTISTELLI M, FORZENIGO L, BIONDETTI P, PISATI F, PAROLINI D, FARINI A, ISSEKUTZ AC, BRESOLIN N, RUSTICHELLI F, CONSTANTIN G, TORRENTE Y. VCAM-1 expression on dystrophic muscle vessels has a critical role in the recruitment of human blood-derived CD133+ stem cells after intra-arterial transplantation. Blood 2006; 108: [33] HAWLEY RG, SOBIESKI DA. Of mice and men: the tale of two therapies. Stem Cells 2002; 20: [34] HIPP J, ATALA A. Sources of stem cells for regenerative medicine. Stem Cell Rev 2008; 4: [35] ITO M, KOBAYASHI K, NAKAHATA T. NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) mice more appropriate for humanized mouse models. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 324: [36] KAMOCHI H, KUROKAWA MS, YOSHIKAWA H, UEDA Y, MASUDA C, TAKADA E, WATANABE K, SAKAKIBARA M, NATUKI Y, KIMURA K, BEPPU M, AOKI H, SUZUKI N. Transplantation of myocyte precursors derived from embryonic stem cells transfected with IGFII gene in a mouse model of muscle injury. Transplantation 2006; 82: [37] LUNN MR, WANG CH. Spinal muscular atrophy. Lancet 2008; 371: [38] LUTH ES, JUN SJ, WESSEN MK, LIADAKI K, GUSSONI E, KUNKEL LM. Bone marrow side population cells are enriched for progenitors capable of myogenic differentiation. J Cell Sci 2008; 121: [39] MARKERT CD, ATALA A, CANN JK, CHRIST G, FURTH M, AMBROSIO F, CHILDERS MK. Mesenchymal stem cells: emerging therapy for Duchenne muscular dystrophy. Pm R 2009; 1:

20 206 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA [40] MATZIOLIS G, WINKLER T, SCHASER K, WIEMANN M, KROCKER D, TUISCHER J, PERKA C, DUDA GN. Autologous bone marrow-derived cells enhance muscle strength following skeletal muscle crush injury in rats. Tissue Eng 2006; 12: [41] MIZRAK D, BRITTAN M, ALISON MR. CD133: molecule of the moment. J Pathol 2008; 214: 3 9. [42] MONTARRAS D, MORGAN J, COLLINS C, RELAIX F, ZAFFRAN S, CUMANO A, PARTRIDGE T, BUCKINGHAM M. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science 2005; 309: [43] NICOLE S, DESFORGES B, MILLET G, LESBORDES J, CIFUENTES-DIAZ C, VERTES D, CAO ML, DE BACKER F, LANGUILLE L, ROBLOT N, JOSHI V, GILLIS JM, MELKI J. Intact satellite cells lead to remarkable protection against Smn gene defect in differentiated skeletal muscle. J Cell Biol 2003; 161: [44] NICOLE S, DIAZ CC, FRUGIER T, MELKI J. Spinal muscular atrophy: recent advances and future prospects. Muscle Nerve 2002; 26: [45] OUSTANINA S, HAUSE G, BRAUN T. Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification. Embo J 2004; 23: [46] PEAULT B, RUDNICKI M, TORRENTE Y, COSSU G, TREMBLAY JP, PARTRIDGE T, GUSSONI E, KUNKEL LM, HUARD J. Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol Ther 2007; 15: [47] PRICE FD, KURODA K, RUDNICKI MA. Stem cell based therapies to treat muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta 2007; 1772: [48] RADLEY HG, DE LUCA A, LYNCH GS, GROUNDS MD. Duchenne muscular dystrophy: focus on pharmaceutical and nutritional interventions. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39: [49] ROHWEDEL J, MALTSEV V, BOBER E, ARNOLD HH, HESCHELER J, WOBUS AM. Muscle cell differentiation of embryonic stem cells reflects myogenesis in vivo: developmentally regulated expression of myogenic determination genes and functional expression of ionic currents. Dev Biol 1994; 164: [50]. SACCO A, DOYONNAS R, KRAFT P, VITOROVIC S, BLAU HM. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456: [51] SALAH-MOHELLIBI N, MILLET G, ANDRE-SCHMUTZ I, DESFORGES B, OLASO R, ROBLOT N, COURAGEOT S, BENSIMON G, CAVAZZANA-CALVO M, MELKI J. Bone marrow transplantation attenuates the myopathic phenotype of a muscular mouse model of spinal muscular atrophy. Stem Cells 2006; 24: [52] SAMPAOLESI M, BLOT S, D'ANTONA G, GRANGER N, TONLORENZI R, INNOCENZI A, MOGNOL P, THIBAUD JL, GALVEZ BG, BARTHELEMY I, PERANI L, MANTERO S, GUTTINGER M, PAN- SARASA O, RINALDI C, CUSELLA DE ANGELIS MG, TORRENTE Y, BORDIGNON C, BOTTINEL- LI R, COSSU G. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 2006; 444: [53] SAMPAOLESI M, TORRENTE Y, INNOCENZI A, TONLORENZI R, D'ANTONA G, PELLEGRINO MA, BARRESI R, BRESOLIN N, DE ANGELIS MG, CAMPBELL KP, BOTTINELLI R, COSSU G. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science 2003; 301: [54] SASAKI T, MATSUOKA H, SAITO M. Generation of a multi-layer muscle fiber sheet from mouse ES cells by the spermine action at specific timing and concentration. Differentiation 2008; 76: [55] SCHEPER W, COPRAY S. The molecular mechanism of induced pluripotency: a two-stage switch. Stem Cell Rev Rep 2009; 5: [56] SCHULZE M, BELEMA-BEDADA F, TECHNAU A, BRAUN T. Mesenchymal stem cells are recruited to striated muscle by NFAT/IL-4-mediated cell fusion. Genes Dev 2005; 19: [57] SHERWOOD RI, CHRISTENSEN JL, CONBOY IM, CONBOY MJ, RANDO TA, WEISSMAN IL, WAGERS AJ. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell 2004; 119: [58] SHERWOOD RI, CHRISTENSEN JL, WEISSMAN IL, WAGERS AJ. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells 2004; 22: [59] SHI M, ISHIKAWA M, KAMEI N, NAKASA T, ADACHI N, DEIE M, ASAHARA T, OCHI M. Acceleration of skeletal muscle regeneration in a rat skeletal muscle injury model by local injection of human peripheral blood-derived CD133-positive cells. Stem Cells 2009; 27: