Komórki satelitowe zlokalizowane w niszy między błoną włókna mięśniowego a otaczającą

Transkrypt

1 Czy komórki satelitowe są macierzyste? Streszczenie Komórki satelitowe zlokalizowane w niszy między błoną włókna mięśniowego a otaczającą go błoną podstawną są źródłem mioblastów niezbędnych do wzrostu i regeneracji mięśni szkieletowych. Oprócz możliwości przekształcenia się w mioblasty komórki te zachowują także zdolność do samoodnawiania własnej populacji, dzięki czemu spełniają kryteria stawiane tkankowo ukierunkowanym, unipotencjalnym komórkom macierzystym. Przeprowadzone w ostatnich latach badania wykazały, że populacja komórek satelitowych jest niejednorodna. W niniejszej pracy przedstawiono aktualne wiadomości dotyczące biologii i charakterystyki komórek satelitowych, a także modele opisujące mechanizmy ich samoodnawiania i różnicowania się. Omówiono również próby ich różnicowania in vitro w inne rodzaje komórek. Ponadto, opisano pozostałe populacje komórek macierzystych obecnych w mięśniach szkieletowych. WPROWADZENIE Narodziny komórek satelitowych Ponad 50 lat temu Bernard Katz i Alexander Mauro, dwaj uczeni badający niezależnie od siebie mięśnie szczura i żaby, opisali jednojądrowe komórki zlokalizowane między błoną włókien mięśniowych (sarkolemmą) a błoną podstawną, otaczającą każde włókno [1,2]. Komórki te nazwano komórkami satelitowymi. Ich pochodzenie i rola pozostały przez długi czas niejasne. Równocześnie, tj. w latach 60. XX wieku, wiadomo było, że podstawową jednostkę funkcjonalną mięśnia szkieletowego stanowi wielojądrowe włókno mięśniowe. Wykazano, że syncytium to powstaje w wyniku fuzji jednojądrowych komórek mięśniowych, mioblastów, a jego główną rolą jest generowanie siły podczas skurczu [3,4]. Badania dotyczące miogenezy zarodkowej ssaków pozwoliły na wyróżnienie dwóch etapów formowania włókien mięśniowych. U myszy pierwszy z nich (tzw. zarodkowy) przypada na okres między 11 a 13 dniem, a drugi (tzw. płodowy) między 14 a 16 dniem rozwoju zarodkowego [5]. W 17 dniu rozwoju włókna mięśniowe otacza już błona podstawna, a w przestrzeni pomiędzy nią a sarkolemmą można po raz pierwszy stwierdzić obecność komórek satelitowych [6-8]. W trakcie rozwoju zarodkowego źródłem mioblastów niezbędnych do powstania włókien mięśniowych, jak również komórek satelitowych, są wywodzące się z dermomiotomów mięśniowe komórki prekursorowe [9-15]. Dermomiotomy to części somitów, czyli powstających w wyniku somitogenezy segmentów mezodermy przyosiowej, zlokalizowane po obu stronach wzdłuż cewki nerwowej i struny grzbietowej [16]. Cechą charakterystyczną mięśniowych komórek prekursorowych jest ekspresja genów czynników transkrypcyjnych z rodziny Pax (ang. paired-box transcription factor), Pax3 oraz Pax7 [9,10]. O kluczowej roli tych czynników w miogenezie zarodkowej świadczy to, że zarodki myszy pozbawione funkcjonalnych genów Pax3 i Pax7 lub takie, w których doprowadzono do ablacji komórek syntetyzujących Pax3 lub Pax7, pozbawione są mięśni tułowia i kończyn [11,17]. W zarodkach myszy synteza Pax3 ulega wyciszeniu podczas drugiego etapu formowania włókien mięśniowych, podczas gdy Pax7 jest obecny zarówno w płodowych mioblastach, jak i w komórkach satelitowych [18]. Co ciekawe, brak jedynie funkcjonalnego genu Pax7 nie powoduje zaburzeń w rozwoju mięśni szkieletowych [19,20]. Stwierdzono, że masa mięśni, liczba i średnica włókien mięśniowych, a także liczba komórek satelitowych jest taka sama w mięśniach nowonarodzonych myszy pozbawionych genu Pax7 (Pax7-/-), jak w mięśniach myszy eksprymujących ten czynnik [19-22]. Z kolei obecność mutacji w genie Pax3 uniemożliwia powstanie mięśni szkieletowych kończyn, podczas gdy mięśnie tułowia są formowane. Fenotyp myszy pozbawionych funkcjonalnego genu Pax3 wynika z różnic w rozwoju mięśni tułowia oraz kończyn i towarzyszących im komórek satelitowych. Podczas gdy mięśnie tułowia rozwijają się z komórek zlokalizowanych w środkowej części dermomiotomów, mięśnie kończyn powstają z komórek zlokalizowanych w bocznej części demomiotomów, które migrują do zawiązków kończyn [23-25]. W trakcie tego procesu komórki wywodzące się z bocznej części dermomiotomów syntetyzują Pax3, natomiast Karolina Archacka Kamil Kowalski Edyta Brzóska * Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa * Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, Warszawa; tel.: (22) , edbrzoska@biol.uw.edu.pl Artykuł otrzymano 12 marca 2013 r. Artykuł zaakceptowano 21 marca 2013 r. Słowa kluczowe: komórki satelitowe, komórki macierzyste, regeneracja mięśni, miogeneza Wykaz skrótów: BMP ang. bone morphogenic protein; CXCR4 ang. chemokine (C-X-C motif) receptor 4; EDL ang. extensor digitorum longus; MDSC ang. muscle derived stem cell; MRF ang. muscle regulatory factor; MSC ang. mesenchymal stem cell; NICD ang. notch intracellular domain; Pax ang. paired-box transcription factor; PICs ang. PW1+/Pax7-interstital cells; SP ang. side population Podziękowania: Praca powstała podczas realizacji projektu finansowanego przez MNiSW w ramach programu IUVENTUS PLUS nr 048/IP1/2011/71 oraz projektu nr /1 finansowanego przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej w ramach programu POMOST i współfinansowanego przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. Postępy Biochemii 59 (2)

2 ekspresja Pax7 jest w nich wykrywana dopiero po zasiedleniu zawiązków kończyn [10,15]. Przytoczone przykłady wskazują, że Pax3 i Pax7 mogą wzajemnie zastępować się podczas formowania puli mięśniowych komórek prekursorowych w środkowej części dermomiotomów, a następnie w trakcie rozwoju mięśni szkieletowych tułowia. Pax3 jest natomiast niezbędny do powstania mięśni szkieletowych kończyn i nie może być zastąpiony w tej roli przez Pax7. Rola komórek satelitowych podczas wzrostu mięśni szkieletowych W ciągu pierwszych trzech tygodni życia myszy masa ich mięśni szkieletowych zwiększa się trzykrotnie. Liczba włókien mięśniowych pozostaje w tym czasie niezmieniona, zaś intensywny wzrost masy mięśni możliwy jest dzięki fuzji włókien mięśniowych z kolejnymi mioblastami [7]. Mioblasty te powstają w wyniku proliferacji komórek satelitowych zlokalizowanych bezpośrednio przy włóknach rosnących mięśni [26]. Szacuje się, że około 90% jąder zlokalizowanych we włóknach mięśniowych dorosłych ssaków pochodzi z mioblastów, które w okresie pourodzeniowym powstały w wyniku podziałów komórek satelitowych [27]. U myszy, między 3 a 21 dniem po urodzeniu liczba jąder obecnych we włóknach mięśniowych prostownika palców długiego (łac. musculus extensor digitorum longus, EDL) zwiększa się pięciokrotnie, w wyniku czego staje się równa liczbie jąder obecnych we włóknach EDL dojrzałej płciowo, dorosłej myszy [28]. Równocześnie liczba komórek satelitowych, zlokalizowanych w niszy między błoną włókna mięśniowego a błoną podstawną, gwałtownie spada. O ile u nowonarodzonej myszy stosunek liczby jąder komórek satelitowych i jąder zlokalizowanych we włóknach mięśniowych wynosi 1:2, to po 3 tygodniach proporcje te wynoszą 1:50 [28-30]. Stwierdzono także, że w tym czasie, tj. ok. 21 dnia po urodzeniu myszy, komórki satelitowe przestają się dzielić i pozostają w stanie spoczynkowym aż do czasu ewentualnego uszkodzenia mięśnia szkieletowego [28,30]. Podczas pierwszych tygodni życia myszy nie wszystkie komórki wykrywane w niszy komórek satelitowych proliferują. Od 20 do 40% komórek nie dzieli się. Komórki te charakteryzuje obecność Myod1 (poprzednio opisywanej w literaturze jako MyoD) i miogeniny, a więc mięśniowych czynników regulatorowych (MRF, ang. muscle regulatory factor) odpowiedzialnych za różnicowanie mioblastów prowadzące do powstania włókien mięśniowych [31,32]. Pozostałe komórki syntetyzują białka Pax7 i/lub Myod1. W efekcie, w rosnących mięśniach można wyróżniać aż trzy różne subpopulacje dzielących się komórek: Pax7+/Myod1-, Pax7+/Myod1+ oraz Pax7-/Myod1+ [32]. Proporcje między tymi subpopulacjami są zbliżone w różnych grupach mięśni, mimo że mięśnie szkieletowe tak rosnących, jak i dorosłych osobników różnią się między sobą pod względem liczby komórek satelitowych w nich obecnych [32,33]. Przykładowo, u dorosłej myszy z każdym włóknem EDL lub mięśnia brzuchatego łydki (łac. musculus gastrocnemius, m.gastrocnemius) związanych jest 6 9 komórek, podczas gdy w mięśniu płaszczykowatym (łac. musculus soleus, m. soleus) jest to aż komórek satelitowych [34]. Znaczenie różnic w wielkości populacji komórek satelitowych pomiędzy różnymi mięśniami nie zostało dotychczas jednoznacznie wyjaśnione. Mimo że nie stwierdzono zaburzeń w rozwoju mięśni szkieletowych myszy Pax7-/- [19,20], to zaobserwowano, że w okresie pourodzeniowym populacja komórek satelitowych w mięśniach tych myszy szybko się zmniejsza. W 10 dniu życia ich liczba stanowi zaledwie 15-25% liczby komórek satelitowych obecnych w mięśniach myszy typu dzikiego [21,22,26,28]. Wykazano także, że średnica włókien mięśniowych, a także liczba zlokalizowanych w nich jąder jest dwukrotnie niższa w mięśniach myszy Pax7-/- [13,20-22]. Gwałtowny spadek liczby komórek satelitowych prowadzi do wolniejszego przyrostu masy mięśni myszy Pax7-/- [20,21]. W rezultacie myszy te są znacznie mniejsze niż myszy typu dzikiego, mają trudności w poruszaniu się i zwykle umierają w ciągu 3 tygodni od urodzenia. Powodem śmierci jest niewydolność mięśni oddechowych oraz nieprawidłowy rozwój układu nerwowego [19,20,35]. Zaburzenia procesu wzrostu ich mięśni wskazują na kluczową rolę czynnika Pax7 w utrzymaniu odpowiedniej puli komórek satelitowych w okresie pourodzeniowym. Wykazano, że szybki spadek liczby komórek satelitowych jest efektem zwiększonej apoptozy obserwowanej od pierwszych dni życia myszy Pax7-/- [22]. W komórkach satelitowych rosnących mięśni białko Pax7 pełni więc rolę antyapoptotyczną, chociaż nie wyklucza to jego udziału w innych procesach. Podczas miogenezy zarodkowej rolę czynnika antyapoptotycznego pełni natomiast białko Pax3 [36]. Wykazano jednak, że w tej roli nie zastępuje ono białka Pax7 podczas wzrostu mięśni [22]. W mięśniach nielicznych myszy Pax7-/-, które przeżyły do 8 tygodnia, a więc miały szansę osiągnąć dojrzałość płciową, nie wykryto komórek satelitowych [35]. Jak wspomniano wcześniej, komórki satelitowe myszy typu dzikiego przechodzą w stan spoczynkowy około 21 dnia po jej narodzinach. Natomiast komórki satelitowe myszy Pax7-/- kontynuują podziały komórkowe [13], co w połączeniu ze zwiększoną apoptozą prowadzi do wyczerpania populacji tych komórek. O ile więc brak Pax7 nie ma zauważalnego wpływu na przebieg miogenezy zarodkowej, to jego obecność jest niezbędna dla utrzymania odpowiedniej liczby komórek satelitowych i prawidłowego wzrostu mięśni szkieletowych w okresie po urodzeniu. Znaczenie komórek satelitowych dla przebiegu procesu regeneracji mięśni szkieletowych Komórki satelitowe obecne w mięśniach szkieletowych dorosłych myszy pozostają w stanie spoczynkowym do momentu uszkodzenia mięśnia wywołanego np. mechanicznym urazem (rozerwanie, zmiażdżenie), działaniem wysokich lub niskich temperatur (poparzenie, zmrożenie), niedotlenieniem czy rozwojem choroby. Uszkodzenie mięśnia rozpoczyna szereg procesów prowadzących do jego regeneracji i odbudowy. W warunkach laboratoryjnych proces regeneracji można zaindukować poprzez nastrzyknięcie mięśnia substancją toksyczną, taką jak kardiotoksyna wyizolowana z jadu kobry Naja naja lub mechaniczne uszkodzenie mięśnia [37]. Wydzielane w uszkodzonym mięśniu cytokiny i czynniki wzrostu przyciągają do miejsca zranienia komórki stanu zapalnego odpowiedzialne za fagocytozę resztek uszkodzonej tkanki, a także aktywują komórki satelitowe. Aktywowane komórki satelitowe wznawiają 206

3 cykl komórkowy, zaczynają intensywnie się dzielić, a następnie różnicują w mioblasty, z których na drodze fuzji odtwarzane są włókna mięśniowe (Ryc. 1) [38,39]. Aktywacja komórek satelitowych związana jest z ekspresją czynników transkrypcyjnych z rodziny MRF, do której należą Myod1, Myf5, Myf6 (poprzednio opisywany w literaturze jako MRF4) oraz miogenina. W niedzielących się komórkach satelitowych obecny jest czynnik transkrypcyjny Pax7, niewykrywany jest w nich natomiast czynnik Myod1. Komórki te opisywane są zatem jako Pax7+/Myod1-. Do syntezy Myod1 dochodzi w komórkach aktywowanych i proliferujących (Pax7+/Myod1+) [40,41]. Myod1 wiąże się z promotorami licznych genów kodujących białka charakterystyczne dla mięśni szkieletowych, takie jak ciężkie łańcuchy miozyny (MyHC, ang. myosin heavy chains) czy M-kadheryna [42]. Myod1 indukuje także reorganizację chromatyny, co umożliwia działanie kolejnych czynników transkrypcyjnych [42]. Podczas różnicowania się mioblastów syntetyzowany jest kolejny MRF miogenina, a następnie Myf6. W różnicowanie komórek mięśniowych zaangażowane są także liczne białka adhezyjne takie, jak integryny alfa3, alfa7, alfa9, beta1, tetraspaniny CD9 i CD81, białko ADAM12 (ang. a disintegrin and metalloproteinase), M-kadheryna [39], a także metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej MMP2 i MMP9 (ang. matrix metalloproteinases) [43]. Rycina 1. Przebieg regeneracji mięśni szkieletowych. W warunkach fizjologicznych komórki satelitowe związane z włóknem mięśniowym pozostają w stanie spoczynkowym (1). Uszkodzenie włókna (2) prowadzi do aktywacji komórek satelitowych i napływu komórek stanu zapalnego (3; zielone strzałki oznaczają podziały komórek). Komórki satelitowe dzielą się (4), różnicują w mioblasty (5), które ulegają fuzji (6) i tworzą miotuby (7). Z miotub powstają włókna mięśniowe z centralnie położonymi jądrami komórkowymi (8), które dojrzewają, dając funkcjonalne włókna (1). Równocześnie, w zregenerowanym mięśniu odtworzona zostaje populacja komórek satelitowych. Wykazano, że komórki satelitowe związane z jednym włóknem mięśniowym wytwarzają w ciągu 4-5 dni liczbę mioblastów odpowiadającą liczbie jąder zlokalizowanych w tym włóknie [34]. Po uszkodzeniu mięśnia szkieletowego myszy pierwsze odtworzone włókna obserwowane są po 5-7 dniach regeneracji [37]. Cechą charakterystyczną tych włókien jest ich niewielka średnica oraz centralnie położone jądra, które w trakcie dojrzewania włókna przemieszczają się pod sarkolemmę (Ryc. 1). W zregenerowanym mięśniu, w bezpośrednim sąsiedztwie odtworzonych włókien mięśniowych, obecne są także niezróżnicowane komórki satelitowe, powstałe na drodze samodnawiania. Możliwość samoodnawiania własnej populacji przez komórki satelitowe postulowali po raz pierwszy Moss i Leblond. Stwierdzili oni, że w wyniku podziału tych komórek powstają zarówno różnicujące się mioblasty, jak i nieróżnicujące komórki, które pozostają w niszy komórek satelitowych [31]. Jednak zdolność komórek satelitowych do samoodnawiania własnej populacji została eksperymentalnie potwierdzona dopiero w 2005 roku. Collins i współpracownicy przeprowadzili doświadczenie, podczas którego do uszkodzonych mięśni myszy, pozbawionych na skutek naświetlenia własnych komórek satelitowych, przeszczepiali pojedyncze włókna mięśniowe z towarzyszącymi im kilkoma komórkami satelitowymi. Po transplantacji mięśnie zostały odbudowane, a ponadto wykryto w nich kilkaset komórek satelitowych [44]. Wyniki te zostały potwierdzone i uzupełnione przez Sacco i współpracowników, którzy wykazali, że transplantacja nawet pojedynczej komórki satelitowej do uszkodzonego mięśnia szkieletowego umożliwia jego regenerację oraz pozwala na odtworzenie puli komórek satelitowych [45]. Udowodniono także, że komórki satelitowe powstałe z przeszczepionej komórki są w pełni funkcjonalne. Oznacza to, że w przypadku ponownego uszkodzenia mięśnia uczestniczyły one w regeneracji, a także miały zdolność do samoodnowienia własnej populacji [44,45]. Tym samym komórki satelitowe spełniają kryteria stawiane tkankowo ukierunkowanym, unipotencjalnym komórkom macierzystym. Rola komórek satelitowych jako źródła mioblastów w regenerującym mięśniu była postulowana już od momentu ich odkrycia [1,2,46], została zaś ostatecznie potwierdzona w badaniach, w których wykorzystano myszy syntetyzujące β-galaktozydazę pod kontrolą promotora genu Pax7. W nieuszkodzonych mięśniach szkieletowych aktywność β-galaktozydazy stwierdzono tylko w komórkach satelitowych pozostających w stanie spoczynkowym. Jednak po uszkodzeniu mięśnia aktywność enzymu wykryto także w zregenerowanych włóknach mięśniowych, co było dowodem na to, że w ich formowaniu uczestniczyły mioblasty pochodzące z aktywowanych komórek satelitowych [13,47]. Te i inne badania przyczyniły się do ugruntowania poglądu, że aktywność czynnika transkrypcyjnego Pax7 jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania komórek satelitowych, a w konsekwencji do zajścia procesu regeneracji mięśni szkieletowych w dorosłych organizmach [48]. Jednak w 2009 roku Lepper i współpracownicy wykazali, że także u myszy u których gen Pax7 został inaktywowany po 21 dniu życia, regeneracja mięśni szkieletowych przebiega Postępy Biochemii 59 (2)

4 prawidłowo [13]. Stwierdzono, że liczba i właściwości komórek satelitowych były takie same dla myszy poddanych takiej manipulacji genetycznej, jak i myszy kontrolnych. Wyniki te zapoczątkowały dyskusję na temat rzeczywistej roli białka Pax7 w regulacji funkcjonowania komórek satelitowych w dorosłych organizmach. Kolejne doświadczenia wykazały, że o ile aktywność genu Pax7 istotnie nie ma wpływu na przebieg regeneracji u dorosłych myszy (powyżej 21 dnia życia), to wyłączenie ekspresji tego genu w okresie wzrostu pourodzeniowego (między 7 a 18 dniem życia) prowadzi do zmniejszenia puli komórek satelitowych w mięśniu, a w rezultacie do zaburzeń w przebiegu regeneracji [13]. Obserwacje te są zbieżne z wynikami badań przeprowadzonych z wykorzystaniem myszy Pax7-/-, które przeżyły powyżej 3 tygodni i osiągnęły dojrzałość płciową. Stwierdzono, że mięśnie szkieletowe dorosłych myszy Pax7-/- nie są zdolne do regeneracji, co wskazuje na kluczową rolę komórek satelitowych w procesie odbudowy mięśnia [21,35]. Ostatecznym dowodem potwierdzającym znaczenie komórek satelitowych dla prawidłowego przebiegu regeneracji mięśni szkieletowych są wyniki doświadczeń opisanych niezależnie przez cztery grupy badawcze w 2011 roku [49-52]. Badania te zostały przeprowadzone z wykorzystaniem myszy zmodyfikowanych genetycznie w taki sposób, że możliwe było precyzyjne usunięcie komórek satelitowych z mięśni dorosłych osobników. W każdym przypadku stwierdzono, że zabieg ten doprowadził do nieodwracalnej utraty zdolności mięśni do regeneracji [49-52]. Tak więc po 21 dniu życia myszy obecność komórek satelitowych jest niezbędna do odbudowy uszkodzonych mięśni szkieletowych. Co istotne, w tym okresie regeneracja mięśni jest niezależna od aktywności genu Pax7. Jednak synteza białka Pax7 w pierwszych trzech tygodniach życia myszy warunkuje utrzymanie populacji komórek satelitowych na odpowiednim poziomie. Niejednorodność komórek satelitowych Przez długi czas lokalizacja komórek satelitowych w niszy między sarkolemmą a błoną podstawną była jedynym sposobem ich identyfikacji. Na przestrzeni lat opisano jednak ponad 30 różnych czynników, które funkcjonują w literaturze jako markery komórek satelitowych. Należy jednak podkreślić, że większość z nich obecna jest także w innych komórkach i tkankach (Tab. 1). Ponadto, niektóre czynniki wykrywane są nie tylko w komórkach satelitowych w stanie spoczynkowym, ale także w aktywowanych komórkach satelitowych oraz różnicujących się mioblastach. Przykładem może być M-kadheryna, która zlokalizowana jest na powierzchni zarówno komórek satelitowych, jak i mioblastów, które ulegają fuzji oraz wielojądrowych miotub [53,54]. Trzeba także zaznaczyć, że żaden z markerów komórek satelitowych nie występuje we wszystkich komórkach zlokalizowanych w charakterystycznej dla nich niszy Tabela 1. Charakterystyka wybranych markerów komórek satelitowych. Marker Pax7 Pax3 Myf5 M-kadheryna syndekan 3 syndekan 4 integryna α7 CD34 CXCR4 kaweolina nestyna Lokalizacja, sposób izolacji komórek w jądrze komórkowym TM (Pax7-GFP) w jądrze komórkowym TM (Pax3-GFP) w jądrze komórkowym TM (Myf5-LacZ) w błonie komórkowej FACS ND w błonie komórkowej FACS w błonie komórkowej FACS w błonie komórkowej FACS w błonie komórkowej FACS w błonie komórkowej FACS ND w błonie komórkowej TM (nestyna-gfp) Uwagi Piśmiennictwo obecny w niemal wszystkich ludzkich i mysich komórkach satelitowych w stanie spoczynkowym; jego synteza stopniowo spada [20,120] po aktywacji; wykrywany także w komórkach układu nerwowego wykryty tylko w komórkach satelitowych niektórych mięśni myszy, brak danych na temat ludzkich komórek; wykrywany także w komórkach układu nerwowego [22,77] gen aktywny w 80-90% mysich komórek satelitowych; nie stwierdzono obecności białka w komórkach w stanie spoczynkowym; białko [64,121] obecne w komórkach aktywowanych; brak danych na temat komórek ludzkich; wykrywany także w komórkach układu nerwowego obecna w większości ludzkich i mysich komórek satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych; także we włóknach [122,123] mięśniowych, wykrywana w komórkach układu nerwowego obecne w niemal wszystkich komórkach satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych; brak danych na temat komórek ludzkich; [101,124] wykrywane także w innych komórkach i tkankach, np. komórkach układu nerwowego i komórkach nowotworów piersi i jajnika obecna w większości komórek satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych; brak danych na temat ludzkich; wykrywana w [45,125,126] komórkach układu nerwowego i naczyń krwionośnych obecny w większości mysich komórek satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych; nieobecny [45,121] w ludzkich komórkach satelitowych; wykrywany w komórkach hematopoetycznych i śródbłonku obecny w 80-90% mysich komórek satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych, w mioblastach, ale także w wielu innych komórkach, np. [57,127,128] szpiku kostnego; brak danych na temat ludzkich komórek satelitowych obecna w większości mysich komórek satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych; brak danych na temat komórek ludzkich; wykrywana [126,129]; także w adipocytach, fibroblastach i komórkach układu nerwowego obecna w niemal wszystkich mysich komórkach satelitowych w stanie spoczynkowym i aktywowanych; brak danych na temat komórek [74] ludzkich; wykrywana w komórkach układu nerwowego Skróty: FACS cytometria przepływowa; GFP zielone białko fluorescencyjne; TM transgeniczna mysz

5 [55,56]. Oznacza to, że populacja komórek satelitowych jest niejednorodna. Wykazano, że w niszy komórek satelitowych zlokalizowane są m.in. komórki prekursorowe mięśni szkieletowych (SMP, ang. skeletal muscle precursors), wykazujące fenotyp CD45+/Sca1+/Mac1+/CXCR4+/integryna β1+. Komórki te po transplantacji do uszkodzonych kardiotoksyną mięśni myszy SCID (ang. severe combined immunodeficiency)/mdx, z bardzo dużą wydajnością (94%) włączane są do istniejących i nowopowstających włókien mięśniowych, a także są zdolne do zasiedlenia niszy komórek satelitowych [57]. Zasiedlanie przez przeszczepione komórki niszy komórek satelitowych jest bardzo istotne, ponieważ potencjalnie komórki te będą uczestniczyły w kolejnych rundach regeneracji. Jednakże, komórki SMP charakteryzują się niewielką zdolnością do migracji w obrębie mięśnia, do którego zostały podane. O heterogenności populacji komórek satelitowych świadczą również wyniki badań Collins i współpracowników oraz Sacco i współpracowników, którzy wykazali, że tylko część (poniżej 10%) komórek izolowanych z niszy komórek satelitowych wykazuje zdolność do samoodnawiania własnej populacji [44,45]. Ciągle niejasne jest, która subpopulacja komórek satelitowych istotnie ma właściwości komórek macierzystych, tj. charakteryzuje ją zarówno zdolność do samoodnawiania własnej populacji, jak i różnicowania. Do tej pory opisano kilka modeli wyjaśniających przebieg procesów samoodnawiania i różnicowania się komórek satelitowych. Wybrane modele przedstawiono w kolejnym podrozdziale. Modele samoodnawiania i różnicowania komórek satelitowych Komórki macierzyste mogą dzielić się symetrycznie lub asymetrycznie. W wyniku podziałów asymetrycznych powstaje komórka zachowująca cechy komórki macierzystej, biorąca udział w odtwarzaniu populacji, oraz komórka, która ulega różnicowaniu. Efektem podziału symetrycznego jest natomiast powstanie dwóch komórek macierzystych lub dwóch komórek różnicujących się. Jedna z hipotez zakłada, że istotną rolę w determinacji losów komórek potomnych odgrywa dziedziczona przez nie nić DNA. Komórka zachowująca cechy komórki macierzystej dziedziczy nieśmiertelną nić DNA, czyli te siostrzane chromatydy, które zawierają rodzicielskie nici DNA (Ryc. 2) [58]. Selektywną segregację rodzicielskich nici DNA stwierdzono w niektórych komórkach satelitowych zarówno in vivo, jak i in vitro [59]. Rando i współpracownicy przeprowadzili doświadczenie, podczas którego dwa dni po uszkodzeniu mięśni myszom podawano analog tymidyny CldU (5-chloro-2 deoksyurydyna), który włączany był podczas pierwszej replikacji do nowopowstającej nici DNA [60]. Następnie, po 12h podawano IdU (jododeoksyurydyna), kolejny analog tymidyny, co pozwalało wyznakować nić syntetyzowaną podczas drugiej rundy replikacji DNA. Następnie, z regenerujących mięśni izolowano komórki satelitowe, a więc takie, które syntetyzowały czynnik transkrypcyjny Pax7 i białko adhezyjne syndekan-4. Analiza tych komórek wykazała, że część z nich nielosowo dziedziczy rodzicielskie nici DNA. Ponadto, w większości (75%) komórek, które uległy podziałowi rodzicielskie nici DNA były obecne w komórkach, które nie różnicowały, brały więc udział w odtwarzaniu populacji komórek satelitowych. Rycina 2. Podczas replikacji DNA na matrycy rodzicielskiej nici DNA (kolor zielony) powstaje nowa nić DNA, którą można wyznakować, podając do komórek BrdU (bromodeoksyurydyna, kolor czerwony). Podczas pierwszego podziału chromosomy rozchodzą się do komórek potomnych. Podczas kolejnego podziału DNA ponownie ulega replikacji. Rodzicielskie, starsze nici DNA są dziedziczone losowo. W niektórych przypadkach obserwuje się nielosowe dziedziczenie rodzicielskich nici DNA. Komórki, które dziedziczą rodzicielską nić DNA nie różnicują i zachowują cechy komórek macierzystych. W dzielących się asymetrycznie aktywowanych komórkach satelitowych obserwowana jest również nierównomierna lokalizacja białka Numb [61]. Białko Numb jest antagonistą receptora Notch-1, który z kolei jest aktywowany po przyłączeniu ligandów takich, jak Delta i Jagged. Efektem połączenia tych białek jest odcięcie domeny wewnątrzkomórkowej receptora Notch (NICD, ang. notch intracellular domain) i jej translokacja do jądra komórkowego, gdzie aktywuje ona szereg czynników transkrypcyjnych. Białko Numb hamuje przekazywanie sygnału poprzez receptor Notch, wiążąc domenę wewnątrzkomórkową receptora i uniemożliwiając jej translokację do jądra komórkowego. Badania, w których hodowano włókna mięśniowe ex vivo [62] oraz związane z nimi komór- Postępy Biochemii 59 (2)

6 Rycina 3. Aktywacja białka Notch-1 prowadzi do wznowienia cyklu komórkowego w komórkach satelitowych. Po podziale asymetrycznym ta z komórek potomnych, w której obecne jest białko Numb (kolor niebieski), a tym samym zahamowana jest aktywność Notch, rozpoczyna proces różnicowania w mioblasty (kolor czerwony), czego przejawem jest ekspresja Myod1, Myf5 oraz desminy. Druga komórka (kolor zielony) zachowuje swój niezróżnicowany charakter i bierze udział w samoodnawianiu populacji komórek satelitowych. ki satelitowe wykazały, że aktywacja receptora Notch-1 w tych komórkach prowadzi do wznowienia przez nie cyklu komórkowego [61]. W komórkach potomnych białko Numb zlokalizowane jest asymetrycznie (Ryc. 3). Komórki, w których obecne jest to białko różnicują w mioblasty, co przejawia się obecnością czynnika transkrypcyjnego Myf5 oraz desminy, wchodzącej w skład filamentów pośrednich typowych dla komórek mięśniowych. Natomiast komórki, w których poziom Numb po podziale jest niski odtwarzają populację komórek satelitowych. Nadprodukcja białka Numb, a co za tym idzie zahamowanie ścieżki Notch-1 w komórkach satelitowych uniemożliwia ich samoodnawianie się i indukuje różnicowanie w mioblasty. Natomiast efektem nadprodukcji konstytutywnie aktywnego receptora Notch-1 jest spadek poziomu białka Myf5, Myod1 i desminy, a więc zahamowanie różnicowania [61]. Aktywność receptora Notch w komórkach satelitowych oraz proliferujących mioblastach została także wykazana w doświadczeniach przeprowadzonych przez Tajbakhsha i współpracowników [63]. Analizowali oni komórki satelitowe wyizolowane z transgenicznych myszy Pax7-nGFP, w komórkach których ekspresja GFP (ang. green fluorescent protein) zależy od ekspresji genu Pax7. Wyizolowane komórki satelitowe zawierające duże ilości białka Pax7 charakteryzował wysoki poziom aktywności ścieżki sygnalizacyjnej Notch, czego efektem był wysoki poziom ekspresji genów docelowych dla Notch takich, jak Hes1, Hey1 i HeyL. Podczas różnicowania tych komórek spadał poziom Pax7, a wzrastała ekspresja Myod1 i miogeniny. Jednocześnie dochodziło do obniżenia aktywności ścieżki zależnej od Notch [63]. Dodatkowo przeprowadzono badania z wykorzystaniem myszy, w których gen Rbpj poddawano indukowanej delecji jedynie w komórkach satelitowych [63]. Białko Rbpj wiąże się z NICD i uczestniczy w regulacji transkrypcji genów docelowych dla Notch. Na skutek usunięcia genu Rbpj w komórkach satelitowych doszło więc do zahamowania aktywności ścieżki Notch. W rezultacie w komórkach tych zaobserwowano spadek poziomu transkryptów Hes1, Hey1 i HeyL, a także Pax7, podczas gdy poziom miogeniny był kilkukrotnie wyższy niż w kontroli. Świadczy to o tym, że zahamowanie aktywności receptora Notch indukuje różnicowanie mioblastów. Ponadto, brak genu Rbpj w komórkach satelitowych miał negatywny wpływ zarówno na liczbę komórek satelitowych, która uległa obniżeniu o 75%, jak również na przebieg regeneracji mięśni myszy transgenicznych. Zatem obniżona aktywność ścieżki przekazywania sygnału zależnej od receptora Notch skutkuje ograniczeniem zdolności komórek satelitowych do samoodnawiania własnej populacji [63]. Przytoczone powyżej wyniki badań wskazują, że aktywność ścieżki sygnałowej zależnej od receptora Notch ma kluczowe znaczenie w aktywacji, proliferacji, samoodnawianiu i różnicowaniu komórek satelitowych. Wiadomo również, że położenie płaszczyzny podziału aktywowanych komórek satelitowych w stosunku do błony podstawnej włókna mięśniowego ma wpływ na losy komórek potomnych (Ryc. 4) [64]. Analizę takich zależności umożliwia hodowla włókien mięśniowych łącznie ze związanymi z nimi komórkami satelitowymi. Badania tak hodowanych komórek satelitowych wykazały, że są one niejednorodne pod względem ekspresji czynnika transkrypcyjnego Myf5 [64]. Większość komórek satelitowych eksprymuje zarówno czynnik transkrypcyjny Pax7, jak i Myf5. Jednak około 10% komórek satelitowych, w których stwierdzono obecność Pax7, nie wykazywała obecności Myf5. Dalsze doświadczenia pozwoliły na stwierdzenie, że komórki satelitowe Pax7+/Myf5- mogą dzielić się asymetrycznie, a w wyniku takiego podziału powstaje komórka Pax7+/Myf5- oraz komórka Pax7+/Myf5+, która rozpoczyna różnicowanie, wyrażające się m.in. syntezą Myod1. W opisywanym modelu komórki Pax7+/Myf5- nie różnicują, są więc odpowiedzialne za samoodnawianie populacji komórek satelitowych. Komórki Pax7+/Myf5- mogą powstawać w wyniku podziałów symetrycznych lub asymetrycznych, a płaszczyzna podziału może być zorientowana prostopadle lub równolegle do błony podstawnej włókna mięśniowego (Ryc. 4). Komórki potomne Pax7+/ Myf5-, zachowujące cechy komórek niezróżnicowanych, zawsze pozostają w kontakcie z błoną podstawną włókna mięśniowego (Ryc. 4). W celu weryfikacji biologicznych właściwości obu populacji komórek satelitowych, to jest Pax7+/Myf5- i Pax7+/Myf5+, komórki te rozdzielano i niezależnie poddawano analizom, m.in. przeszczepiano je do mięśni myszy Pax7-/-. Myszy te, jak wcześniej wspomniano, charakteryzują się niedoborem komórek satelitowych. Komórki Pax7+/Myf5+ tworzyły od 20 do 60 nowych włókien mięśniowych, podczas gdy komórki Pax7+/Myf5- nie formowały więcej niż 20 nowych włókien. Transplantowa

7 Rycina 4. Komórki satelitowe mogą dzielić się asymetrycznie lub symetrycznie. W wyniku podziału asymetrycznego powstają komórki zachowujące charakter komórek macierzystych Pax7+/Myf5- (kolor zielony), które pozostają w kontakcie z błona podstawną lub komórki różnicujące Pax7+/Myf5+ (kolor czerwony). Efektem podziałów symetrycznych jest powstanie dwóch komórek macierzystych lub dwóch komórek różnicujących. ne komórki Pax7+/Myf5+ preferencyjnie różnicowały w mioblasty i włókna mięśniowe, sporadycznie zaś zasiedlały niszę komórek satelitowych. Natomiast podziały komórek Pax7+/Myf5- prowadziły do powstawania obu populacji komórek satelitowych (Pax7+/Myf5- i Pax7+/Myf5+). Co istotne, w odróżnieniu od komórek Pax7+/Myf5+, komórki Pax7+/Myf5- były zdolne do migracji i zasiedlenia całego mięśnia, do którego zostały przeszczepione [64]. Przytoczone powyżej wyniki badań podkreślają znaczenie oddziaływań pomiędzy komórkami satelitowymi a ich niszą utworzoną przez sarkolemmę i błonę podstawną. Okazuje się jednak, że niezwykle istotna jest również obecność w sąsiedztwie komórek satelitowych komórek śródbłonka budującego naczynia włosowate [65]. Wiadomo także, że aktywowane komórki satelitowe oddziałują z makrofagami napływającymi do uszkodzonej tkanki. Czynniki uwalniane przez makrofagi prowadzą do aktywacji i proliferacji komórek satelitowych, a także mają wpływ antyapoptotyczny [66]. Badania, w których wykorzystano transgeniczne myszy (Myf5-nLacZ/+, Myf5-GFP-P/+), w których komórki satelitowe identyfikowano na podstawie aktywności β-galaktozydazy lub obecności GFP, wykazały, że komórki satelitowe występują zawsze w sąsiedztwie naczyń włosowatych. Ponadto analizy hodowli mieszanych komórek śródbłonka i mioblastów dowiodły, że czynniki wydzielane przez śródbłonek (takie jak IGF-1, HGF, bfgf, PDGF-BB i VEGF) indukują proliferację komórek satelitowych. Różnicujące mioblasty wydzielają natomiast czynniki proangiogenne [65]. Czynnikiem produkowanym przez komórki sąsiadujące z komórkami satelitowymi, np. fibroblasty czy komórki mięśni gładkich naczyń, jest także angiopoetyna-1. Wiąże się ona z receptorem o aktywności kinazy tyrozynowej, Tie-2. Receptor ten wykrywany jest w niedzielących się komórkach satelitowych. Wiązanie angiopoetyny-1 z receptorem Tie-2 zapobiega apoptozie, hamuje podziały i różnicowanie mioblastów. Proces ten związany jest ze spadkiem poziomu mrna kodujących Myod1 i miogeninę, towarzyszy mu natomiast wzrost poziomu Pax7, Myf-5, M-kadheryny, czyli białek charakterystycznych dla komórek satelitowych. Traktowanie aktywowanych komórek satelitowych angiopoetyną-1 prowadzi do wzrostu liczby komórek Pax7+/Myod1-. Zatem oddziaływanie angiopoetyny-1 z receptorem Tie-2 może mieć kluczowe znaczenie w procesie odtwarzania puli komórek satelitowych i ich powrotu do stanu spoczynkowego [67]. Liczne prace dotyczą także roli białka Pax7 w samoodnawianiu się puli komórek satelitowych [68-73]. Jak wspomniano powyżej, Pax7 ulega syntezie w komórkach satelitowych w stanie spoczynkowym (komórki Pax7+/Myod1-), a następnie wspólnie z Myod1 w aktywowanych, proliferujących komórkach (komórki Pax7+/Myod1+). Zawartość Pax7 ulega obniżeniu, kiedy komórki zaczynają różnicować i pojawia się w nich miogenina (komórki Pax7-/miogenina+) [69]. Wiadomo jednak, że pewna subpopulacja proliferujących komórek satelitowych, tzn. komórek Pax7+/Myod1+, nie różnicuje. W komórkach tych spada poziom Myod1, natomiast utrzymywana jest ekspresja Pax7 (Ryc. 5). Badania, podczas których komórki hodowano w obecności analogu tymidyny BrdU włączanego do nowosyntetyzowanego DNA, wykazały, że komórki Pax7+/Myod1- pochodzą z komórek Pax7+/Myod1+ [69, 74]. Byłaby to zatem populacja komórek odpowiedzialna za samoodnawianie się puli komórek satelitowych. Obserwacje te zostały potwierdzone w badaniach, w których hodowano włókna mięśniowe i towarzyszące im komórki satelitowe, uzyskane z transgenicznych myszy syntetyzujących fuzyjne białko nestyna-gfp. Nestyna obecna jest zarówno w niedzielących się komórkach, jak i w komórkach proliferujących. Jej poziom obniża się natomiast w różnicujących mioblastach [73,74]. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że odtwarzana populacja niezróżnicowanych komórek satelitowych charakteryzuje się obecnością zarówno nestyny, jak i Pax7, oraz brakiem Myod1 (nestyna+/pax7+/ Myod1-) [73,74]. Komórki te odpowiadają więc za samoodnawianie populacji komórek satelitowych. Wyniki uzyskane przez grupę badawczą Olwina wskazują jednak, że decyzja o tym, czy komórka satelitowa będzie różnicować czy powróci do stanu spoczynkowego zapada wcześniej, to znaczy podczas pierwszego podziału po aktywacji komórek [75]. Komórki satelitowe hodowane ex vivo, czyli na włóknach mięśniowych, po pierwszym podziale były traktowane inhibitorem replikacji DNA AraC (arabinozyd cytozyny). AraC jest toksyczny dla dzielących się komórek. Okazało się jednak, że niewielka część komórek przeżywa traktowanie AraC. Te komórki charakteryzowały się obecnością czynnika Pax7 i brakiem Myod1 (Pax7+/ Postępy Biochemii 59 (2)

8 Myod1-). Stwierdzono, że po usunięciu AraC komórki Pax7+/Myod1- ponownie ulegały aktywacji i przechodziły podział, w wyniku którego powstawały zarówno komórki Pax7+/Myod1-, uczestniczące w odnawianiu się populacji komórek satelitowych, jak i różnicujące mioblasty o fenotypie Pax7+/Myod1+ oraz Pax7-/Myod1+. Dalsze badania wykazały, że asymetryczna lokalizacja czynnika Myod1 w komórkach powstających w wyniku pierwszego podziału po aktywacji komórek satelitowych związana była z asymetryczną aktywacją kinazy p38α/β MAP (ang. mitogen activated protein), lokalizacją białka PAR-3 (ang. partitioning defective 3) i kinazy PKCλ (ang. protein kinase C λ) należących do kompleksu białek PAR [75]. W wyniku pierwszego asymetrycznego podziału aktywowanej komórki satelitowej w jednej z komórek potomnych dochodzi do aktywacji kompleksu białek PAR na drodze zależnej od PKCλ, co z kolei prowadzi do aktywacji kinazy MAP i wzrostu aktywności transkrypcyjnej Myod1. W ten sposób powstaje populacja proliferujących mioblastów. Natomiast w drugiej komórce Myod1 nie jest aktywowane i komórka nie dzieli się (Ryc. 5). Ostatnie doniesienia wskazują, że w samoodnawianie się komórek satelitowych może być zaangażowany także kofaktor transkrypcji Yap (ang. Yes-associated protein) [76]. Czynnik Yap jest jednym z elementów ścieżki sygnalizacyjnej Hippo, ale może oddziaływać także z α-kateniną i β-kateniną. Yap wiąże i koaktywuje czynniki transkrypcyjne Tead (ang. TEA/ATTS domain/tef/scalloped). Kompleks Yap i Tead wiąże się do regionów MCAT (ang. muscle C, Rycina 5. Komórki satelitowe w stanie spoczynkowym (kolor zielony) syntetyzują czynnik transkrypcyjny Pax7 (komórki Pax7+/Myf5-/Myod1-). W wyniku aktywacji komórki te dzielą się asymetrycznie. W jednej z komórek potomnych pojawia się Myod1 (kolor czerwony), co prowadzi do różnicowania komórek w mioblasty (komórka Pax7+/Myf5-/Myod1+). Druga komórka, w której Myod1 nie pojawia się, powraca do stanu spoczynkowego i odnawia populację komórek satelitowych. W proliferujących mioblastach syntezie ulega czynnik Myf5 (komórki (Pax7+)/Myf5+/Myod1+). Komórki, w których zawartość Pax7 jest obniżona, różnicują w miotuby, czemu towarzyszy pojawienie się miogeniny. Miotuby z kolei odtwarzają włókna mięśniowe. W komórkach Pax7+/Myf5-/Myod1+ może także dojść do zaniku Myod1 przy równoczesnym utrzymywaniu syntezy Pax7. Powstałe w ten sposób komórki Pax7+/Myf5-/Myod1- przechodzą w stan spoczynkowy i odtwarzają pulę komórek satelitowych, mogących uczestniczyć w kolejnych rundach regeneracji. A and T; 5 -CATTCC-3 ), które występują w obrębie promotorów i sekwencji wzmacniających genów regulujących proliferację (np. cyklina D1), wczesne etapy miogenezy (np. Myod1, Myf5, Myf6), a także końcowe etapy różnicowania mioblastów (miogenina). Synteza Yap w komórkach satelitowych w stanie spoczynkowym jest bardzo niska, wzrasta natomiast podczas ich aktywacji, równocześnie ze wzrostem zawartości Myod1. Podczas różnicowania się mioblastów poziom Yap spada. Konstytutywna ekspresja Yap indukuje proliferację aktywowanych komórek satelitowych i mioblastów, hamuje natomiast ich różnicowanie. Wyciszenie ekspresji Yap prowadzi z kolei do zahamowania proliferacji. Yap kontroluje syntezę białek ważnych w funkconowaniu komórek satelitowych, takich jak np. Myf6. Choć dokładna rola Yap w regulacji procesów samoodnawiania i różnicowania komórek satelitowych wymaga jeszcze dalszych badań, czynnik ten wydaje się odgrywać ważką rolę w omawianych procesach [76]. Próby hodowli in vitro niezróżnicowanych komórek satelitowych Badania in vivo oraz ex vivo potwierdzają zdolność komórek satelitowych do odnawiania swojej populacji. W hodowli in vitro utrzymanie komórek satelitowych w stanie niezróżnicowanym jest trudne. Komórki satelitowe w warunkach in vitro można utrzymywać w hodowli jednowarstwowej, gdzie są one przyczepione do podłoża naczynia hodowlanego. Jednakże, w tych warunkach komórki satelitowe tracą swoje pierwotne właściwości. Zdecydowanie największą zdolność do zasiedlania regenerującego mięśnia posiadają komórki satelitowe przeszczepiane razem z włóknem mięśniowym [77]. Jest to jednak strategia uniemożliwiająca ekspansję komórek in vitro, a tym samym uzyskanie ich odpowiedniej liczby przed przeszczepieniem do mięśnia biorcy. Sposobem na podtrzymanie macierzystego charakteru komórek satelitowych in vitro może być próba odtworzenia warunków panujących w niszy, to jest ich hodowla w warunkach biofizycznych odpowiadających niszy [78]. Częściowe odtworzenie oddziaływań komórka-komórka typowych dla niszy umożliwiło m.in. uzyskanie in vitro psich mioblastów o dużej zdolności do zasiedlania regenerującej tkanki. Komórki te hodowane były na podłożu z przeciwciałami skonjugowanymi z ligandem Delta-1 receptora Notch, co zapewniało ciągłą stymulację ścieżki sygnalizacyjnej zależnej od Notch. Stymulowane w taki sposób mioblasty były zdolne do zasiedlania i uczestniczenia w regeneracji uszkodzonego mięśnia myszy NOD/ SCID z wydajnością porównywalną do tej, jaka charakteryzuje komórki satelitowe transplantowane do mięśnia bezpośrednio po ich izolacji [79]

9 Jedną z zasadniczych różnic pomiędzy warunkami panującymi w niszy komórek satelitowych in vivo i warunkami, które można stworzyć in vitro jest stężenie tlenu w inkubatorach hodowlanych. W standardowej hodowli in vitro wynosi ono 20%. Tlen nie pełni w fizjologii komórek wyłącznie roli substratu metabolicznego, jego stężenie jest również elementem sygnałowym determinującym podziały komórkowe oraz różnicowanie [80]. W mięśniach osobnika dorosłego stężenie tlenu waha się między 2 a 10% [81]. Hodowla komórek satelitowych w atmosferze zawierającej stężenie tlenu odpowiadające temu fizjologicznemu (hypoksia fizjologiczna 1 10% O 2 ) promuje podziały komórkowe [80], podczas gdy hypoksia patologiczna (<1% O 2 ) zmniejsza zdolność komórek satelitowych do różnicowania [82]. Warunki obniżonego stężenia tlenu in vitro sprzyjają ekspansji w hodowli subpopulacji komórek satelitowych charakteryzujących się wyższą zawartość białka CD34, które jest markerem komórek macierzystych. Komórki takie, po przeszczepieniu do uszkodzonego mięśnia szkieletowego myszy, z większą wydajnością uczestniczyły w regeneracji tkanki [83]. Czy komórki satelitowe są multipotencjalne? Zdolność komórek satelitowych do różnicowania w mioblasty, a następnie w wielojądrowe miotuby oraz włókna mięśniowe została potwierdzona zarówno in vitro, jak i in vivo. Znane są także doniesienia na temat możliwości różnicowania komórek satelitowych in vitro w inne rodzaje komórek. Wykazano, że uzyskane z komórek satelitowych mioblasty są zdolne przy odpowiedniej stymulacji do różnicowania w osteocyty [84] oraz adipocyty [85,86]. Różnicowanie komórek satelitowych w mioblasty regulowane jest przez czynniki z rodziny MRF, podczas gdy powstawanie adipocytów wymaga ekspresji genu kodującego receptor gamma aktywowany przez proliferatory peroksysomów (PPARγ, ang. peroxisome proliferator-activated receptor gamma) oraz aktywacji samego receptora PPARγ, zaangażowanego w transport kwasów tłuszczowych [87]. Znanymi substancjami indukującymi różnicowanie mioblastów w kierunku adipocytów są kwasy tłuszczowe [87], a także czynniki blokujące szlak sygnalizacyjny Wnt [88]. Zdolność komórek satelitowych do różnicowania w adipocyty nie jest jednak taka sama w obrębie całej populacji. Określone subpopulacje komórek satelitowych można wyróżnić nie tylko na podstawie syntezy omówionych wcześniej markerów, ale także np. na podstawie tempa ich proliferacji. W ten sposób zidentyfikowano wolno dzielące się komórki satelitowe o cechach komórek macierzystych i szybko dzielące się komórki, które ulegają różnicowaniu. W adipocyty różnicują wyłącznie komórki dzielące się szybciej [86]. Stwierdzono także, że komórki satelitowe uzyskane z osobników starych przekształcają się w komórki tłuszczowe częściej niż te uzyskane z osobników młodych [89]. Wynik ten może sugerować, że to właśnie subpopulacja komórek satelitowych różnicujących w adipocyty jest odpowiedzialna za typową dla starczego wieku akumulację tkanki tłuszczowej w mięśniach. Wykazano także, że mioblasty traktowane przez 6 dni kwasem γ-linolenowym gromadzą w cytoplazmie wiele kropel tłuszczu, co może świadczyć o ich różnicowaniu w kierunku adipocytów [90]. Najnowsze badania dowodzą jednak, że co prawda komórki satelitowe mogą akumulować krople tłuszczu, ale nie są one zdolne do ostatecznego przekształcenia się w adipocyty [91]. Wiadomo Tabela 2. Komórki macierzyste obecne w mięśniu szkieletowym. Komórki msp mezangioblasty perycyty Sk-34 mioendotelialne komórki progenitorowe AC133 PIC MSC Lokalizacja w mięśniu śródmiąższowa (Sca1+/CD45+), 0.25% tych komórek (Pax7+/syndekan-4+/ ABCG2 +/Sca1+) obecnych jest w niszy komórek satelitowych związane z naczyniami, stanowią subpopulację perycytów, opisywane jako CD34+/Sca1+/PDGFRα+/ PDFGRβ+/NG2β+/ ALP+ związane z siecią naczyń krwionośnych, izolowane na podstawie obecności proteoglikanu NG i alkalicznej fosfatazy śródmiąższowa, charakteryzowane jako CD34+/CD45- wyizolowane na podstawie obecności CD56, CD34, i CD144 obecne w naczyniach krwionośnych, wyizolowane z mięśni na podstawie obecności CD133 śródmiąższowa, posiadają fenotyp PW1+/Pax7- izolowane na podstawie zdolności do adhezji do plastiku, intensywnej proliferacji in vitro, morfologii podobnej do fibroblastów oraz potencjału do różnicowania Różnicowanie in vitro tak tak tak tak Udział w regeneracji in vivo podawane domięśniowo lub do tętnicy; w zależności od sposobu sortowania tworzą 1-30% nowych włókien i zasiedlają niszę komórek satelitowych podawane dotętniczo formują około 50% nowych włókien w warunkach fizjologicznych uczestniczą we wzroście i regeneracji mięśni, ludzkie perycyty po przeszczepieniu uczestniczą w rekonstrukcji dystroficznych mięśni myszy podawane domięśniowo uczestniczą w rekonstrukcji mięśni, naczyń i nerwów Piśmiennictwo [99-101] [ ] [105, 107] [108, 109] tak tak [110] tak tak po przeszczepieniu do mięśnia uczestniczą w jego rekonstrukcji a także naprawie naczyń krwionośnych podawane domięśniowo uczestniczą w regeneracji uszkodzonych mięśni posiadają zdolność do udziału w regeneracji i zasiedlania niszy komórek satelitowych, wydajność tego procesu zależy od rodzaju uszkodzenia oraz źródła komórek Skróty: msp komórki msp (ang. muscle side population); PIC śródmiąższowe komórki wykazujące ekspresję PW1 (ang. PW1+/Pax7 interstitial cells); MSC mezenchymalne komórki macierzyste (ang. mesenchymal stem cells). tak [112] [113] [116,118] Postępy Biochemii 59 (2)

10 jednak, że nadekspresja PPARγ w mioblastach hodowanych in vitro prowadzi do zróżnicowania w adipocyty. W celu weryfikacji tych wyników wykonano także doświadczenia in vivo. Stwierdzono, że nadekspresja PPARγ nie powoduje wzmożonej adipogenezy w tkance mięśniowej, zatem czynnik ten jest niewystarczającym bodźcem do zaindukowania adipogenezy in vivo [92]. Świadczyć to może o determinującej roli niszy, która uniemożliwia komórkom satelitowym różnicowanie inne niż miogeniczne. Różnicowanie mioblastów w kierunku osteocytów można zaindukować in vitro poprzez traktowanie ich białkiem BMP7 i/lub BMP2 (ang. bone morphogenic factor 7/2) [84,93]. Prowadzi to do wzrostu poziomu alkalicznej fosfatazy oraz odkładania wapnia wewnątrz mioblastów [90]. In vivo proces tworzenia osteocytów z komórek satelitowych wydaje się jednak bardziej złożony. Wzmożona synteza BMP-7 oraz BMP-2 w komórkach mięśnia powoduje ektopowe powstawanie tkanki kostnej [94]. Warto jednak zauważyć, że wzrost poziomu danego czynnika, uzyskany dzięki elektroporacji plazmidem całego mięśnia, dotyczy nie tylko komórek satelitowych czy mioblastów, lecz całej tkanki mięśniowej i komórek jej towarzyszących. Z tego powodu nie można powiązać obserwowanego efektu wyłącznie ze zmianą sposobu różnicowania aktywowanych komórek satelitowych. W celu weryfikacji udziału tych komórek w ektopowym powstawaniu tkanki kostnej przeprowadzono badania, które wykazały, że po domięśniowym podaniu białka BMP-2 komórki satelitowe z bardzo niską wydajnością, tj. mniejszą niż 5%, uczestniczą w ektopowym powstawaniu tkanki kostnej [95]. Wiele nadziei wiązano z możliwością wykorzystania komórek satelitowych i uzyskanych z nich mioblastów mięśni szkieletowych do poprawy regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego (omówione w [96]). Pierwsze doświadczenia wykazały zdolność wszczepionych komórek satelitowych do uczestniczenia w regeneracji mięśnia sercowego i istotnej poprawy wydajności tego procesu [97]. Jednak badania weryfikujące losy komórek satelitowych po transplantacji udowodniły, że są one co prawda w stanie przetrwać w tkance biorcy, ale nigdy nie różnicują w funkcjonalne miocyty serca [98]. Opisane powyżej doświadczenia nie dostarczają jednoznacznych danych potwierdzających zdolność komórek satelitowych zlokalizowanych w niszy, a także stymulowanych in vitro mioblastów do różnicowania w adipocyty lub osteocyty. Należy również pamiętać, że poza komórkami satelitowymi w mięśniach obecne są inne populacje komórek macierzystych (Tab. 2). Populacje komórek macierzystych obecnych w mięśniu W mięśniach szkieletowych zidentyfikowano mięśniowe komórki SP (msp, ang. muscle side population) posiadające zdolność do usuwania ze swojej cytoplazmy barwnika Hoechst oraz wykazujące obecność białek Sca1 (ang. stem cell antigen-1) i CD45 [99]. W 2002 roku Asakura i współpracownicy wykazali, że komórki te mogą fuzjować z mioblastami in vitro, a przeszczepione do uszkodzonego mięśnia tibialis anterior myszy SCID uczestniczą w tworzeniu 1% nowych włókien [99]. Większą wydajność (5-8%) zasiedlania uszkodzonych mięśni przez komórki msp uzyskano po ich przeszczepieniu do tętnicy udowej myszy mdx. Myszy te nie syntetyzują dystrofiny, białka zapewniającego prawidłowe połączenie między cytoszkieletem aktynowym włókna mięśniowego a białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i stanowią jeden ze zwierzęcych modeli ludzkiej choroby mięśni szkieletowych - dystrofii mięśniowej Duchenne a [100]. Niewielka populacja komórek msp (0.25%), charakteryzująca się produkcją zarówno markerów komórek satelitowych Pax7 i syndekan-4, jak i markerów komórek SP białka transportującego ABCG2 (ang. ATP-binding cassette sub-family G member 2) i Sca1, jest wykrywana w niszy komórek satelitowych. Wykazano, że komórki te przeszczepione do uszkodzonego mięśnia tibialis anterior myszy wzięły udział w tworzeniu 30% włókien mięśniowych. Ponadto, w zregenerowanym mięśniu aż 75% komórek obecnych w niszy komórek satelitowych wywodziło się z przeszczepionych komórek [101]. Kiedy komórki te przeszczepiono do mięśnia tibialis anterior myszy mdx weszły one w skład aż 70% nowoutworzonych włókien [101]. Kolejną populacją komórek zlokalizowanych w mięśniach szkieletowych poza niszą komórek satelitowych są mezangioblasty (Tab. 2). Te multipotencjalne komórki związane są z naczyniami krwionośnymi i uzyskiwane są m.in. z aorty grzbietowej 9.5-dniowych zarodków myszy [102] lub mięśni szkieletowych dorosłych ssaków (np. myszy, psa czy człowieka) [ ]. Mezangioblasty prawdopodobnie stanowią subpopulację perycytów i charakteryzowane są jako komórki CD34+/Sca1+/PDGFRα+/PDFGRβ+/NG2β+/ ALP+ [106]. Komórki te nie tylko zachowują zdolność do proliferacji in vitro, ale także mogą różnicować w mioblasty, osteocyty, chondrocyty i adipocyty. Po transplantacji do myszy pozbawionych genu kodującego α-sarkoglikan (stanowiących zwierzęcy model sarkoglikanopatii) lub psów rasy golden retriver nieeksprymujących dystrofiny (wykorzystywanych jako zwierzęcy model dystrofii mieśniowej Duchenne a) komórki te tworzą aż 50% nowych włókien w regenerujących mięśniach. U badanych zwierząt zaobserwowano także pojawienie się odpowiednio α-sarkoglikanu lub dystrofiny oraz przywrócenie funkcji wszystkich mięśni [103,104]. Równie dobre efekty uzyskano przeszczepiając ludzkie mezangioblasty do myszy SCID/mdx [105]. Również mysie perycyty związane z małymi naczyniami krwionośnymi obecne w mięśniach szkieletowych mogą uczestniczyć w ich wzroście i regeneracji [107]. Natomiast ludzkie perycyty w hodowli in vitro spontanicznie różnicują w miotuby, a in vivo uczestniczą w regeneracji dystroficznych mięśni myszy SCID/mdx [105]. Z kolei komórki Sk-34 nie posiadają białka CD45, syntetyzują natomiast białko CD34 (CD34+/CD45-) i w większości Sca1 [108,109]. Populacja ta może in vitro różnicować w komórki śródbłonka, adipocyty i mioblasty. Natomiast po 6 tygodniach po przeszczepieniu do nieuszkodzonych mięśni komórki Sk-34 wchodziły w skład włókien mięśniowych i naczyń krwionośnych [108]. Komórki Sk-34 przeszczepione do uszkodzonych mięśni różnicowały w mioblasty, perycyty, komórki mięśni gładkich, komórki śródbłonka, komórki Schwanna, uczestniczyły zatem w rekonstrukcji mięśni, a także naczyń i nerwów obwodowych [109]. Grupą komórek macierzystych o potencjale miogenicznym są również mioendotelialne komórki progenitorowe, wyizolowane z populacji 214

11 ludzkich komórek śródbłonka obecnych w dorosłym mięśniu. Komórki te identyfikowane są za pomocą cytometrii przepływowej na podstawie obecności antygenów charakterystycznych dla komórek miogenicznych i śródbłonkowych takich, jak białka CD56, CD34 i CD144. Po przeszczepieniu do uszkodzonych mięśni myszy SCID komórki te zasiedlają je i biorą udział w tworzeniu nowych włókien [110]. W mięśniach szkieletowych opisano także populację komórek macierzystych syntetyzujących białko CD133. Komórki wykazujące obecność tego białka, nazywane AC133, zlokalizowane są głównie w krwioobiegu i posiadają potencjał miogeniczny [111]. Komórki AC133 można uzyskać również sortując jednojądrowe komórki wyizolowane z ludzkich mięśni [112]. Wykazano, że po przeszczepieniu tych komórek do mięśnia myszy SCID/mdx uczestniczą one w jego rekonstrukcji [112]. Co ważniejsze, komórki AC133 pobrane od pacjentów chorych na dystrofię, w których przywrócono obecność dystrofiny z wykorzystaniem metody exon skipping, po przeszczepieniu dotętniczo lub do mięśni myszy SCID/ mdx były zdolne do udziału w regeneracji [112]. Śródmiąższową lokalizację w mięśniu wykazują tzw. komórki PIC (ang. PW1+/Pax7 interstitial cells). Komórki PIC syntetyzują białko PW1 uczestniczące w szlaku sygnałowym TNFα NFkB, nie wykazują zaś obecności Pax7 [113]. Białko PW1 jest markerem komórek linii miogenicznej, wykrywanym m.in. w komórkach satelitowych i komórkach śródmiąższowych dorosłych mięśni [114,115]. Wykazano, że komórki PIC mogą fuzjować z mioblastami w hodowli in vitro, a po przeszczepieniu do uszkodzonego mięśnia tibialis anterior myszy uczestniczą w jego regeneracji [113]. Do komórek, które wyizolowano z ludzkich mięśni szkieletowych należą także mezenchymalne komórki macierzyste (MSC, ang. mesenchymal stem cells) [116]. Te multipotencjalne komórki macierzyste mogą być izolowane z różnych tkanek [117], a najczęściej definiowane są na podstawie łatwej adhezji do plastiku, morfologii podobnej do fibroblastów, intensywnej proliferacji w hodowli in vitro oraz zdolności do różnicowania w adipocyty, chondrocyty i osteoblasty. Potencjał miogeniczny MSC różni się w zależności od tkanki, z której zostaną one uzyskane [118]. Kompleksowe badania in vitro i in vivo wykazały, że wszystkie opisane powyżej rodzaje komórek charakteryzuje potencjał miogeniczny, tj. zdolność do różnicowania w funkcjonalne komórki i włókna mięśniowe. Mimo to ich rzeczywista rola w rekonstrukcji mięśni szkieletowych pozostaje niewyjaśniona. Należy pamiętać, że w regenerację mięśni szkieletowych mogą być zaangażowane również komórki macierzyste pochodzące z innych tkanek czy narządów, jak komórki pochodzące ze szpiku kostnego [65], a także przeszczepione do uszkodzonego mięśnia komórki takie, jak komórki mezenchymalne czy mezangioblasty [119]. Piśmiennictwo 1. Mauro A (1961) Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol 9: Katz B (1961) The terminations of the afferent nerve fibre in the muscle spindle of the frog. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 243: Capers CR (1960) Multinucleation of skeletal muscle in vitro. J Biophys Biochem Cytol 7: Mintz B, Baker WW (1967) Normal mammalian muscle differentiation and gene control of isocitrate dehydrogenase synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 58: Evans D, Baillie H, Caswell A, Wigmore P (1994) During fetal muscle development, clones of cells contribute to both primary and secondary fibers. Dev Biol 162: Kelly AM, Zacks SI (1969) The histogenesis of rat intercostal muscle. J Cell Biol 42: Ontell M, Kozeka K (1984) The organogenesis of murine striated muscle: a cytoarchitectural study. Am J Anat 171: Feldman JL, Stockdale FE (1992) Temporal appearance of satellite cells during myogenesis. Dev Biol 153: Gros J, Manceau M, Thome V, Marcelle C (2005) A common somitic origin for embryonic muscle progenitors and satellite cells. Nature 435: Kassar-Duchossoy L, Giacone E, Gayraud-Morel B, Jory A, Gomes D, Tajbakhsh S (2005) Pax3/Pax7 mark a novel population of primitive myogenic cells during development. Genes Dev 19: Relaix F, Rocancourt D, Mansouri A, Buckingham M (2005) A Pax3/ Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature 435: Engleka KA, Gitler AD, Zhang M, Zhou DD, High FA, Epstein JA (2005) Insertion of Cre into the Pax3 locus creates a new allele of Splotch and identifies unexpected Pax3 derivatives. Dev Biol 280: Lepper C, Conway SJ, Fan CM (2009) Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature 460: Lepper C, Fan CM (2010) Inducible lineage tracing of Pax7-descendant cells reveals embryonic origin of adult satellite cells. Genesis 48: Schienda J, Engleka KA, Jun S, Hansen MS, Epstein JA, Tabin CJ, Kunkel LM, Kardon G (2006) Somitic origin of limb muscle satellite and side population cells. Proc Natl Acad Sci USA 103: Pourquie O (2003) Vertebrate somitogenesis: a novel paradigm for animal segmentation? Int J Dev Biol 47: Hutcheson DA, Zhao J, Merrell A, Haldar M, Kardon G (2009) Embryonic and fetal limb myogenic cells are derived from developmentally distinct progenitors and have different requirements for beta-catenin. Genes Dev 23: Horst D, Ustanina S, Sergi C, Mikuz G, Juergens H, Braun T, Vorobyov E (2006) Comparative expression analysis of Pax3 and Pax7 during mouse myogenesis. Int J Dev Biol 50: Mansouri A, Stoykova A, Torres M, Gruss P (1996) Dysgenesis of cephalic neural crest derivatives in Pax7-/- mutant mice. Development 122: Seale P, Sabourin LA, Girgis-Gabardo A, Mansouri A, Gruss P, Rudnicki MA (2000) Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell 102: Kuang S, Charge SB, Seale P, Huh M, Rudnicki MA (2006) Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol 172: Relaix F, Montarras D, Zaffran S, Gayraud-Morel B, Rocancourt D, Tajbakhsh S, Mansouri A, Cumano A, Buckingham M (2006) Pax3 and Pax7 have distinct and overlapping functions in adult muscle progenitor cells. J Cell Biol 172: Bober E, Franz T, Arnold HH, Gruss P, Tremblay P (1994) Pax-3 is required for the development of limb muscles: a possible role for the migration of dermomyotomal muscle progenitor cells. Development 120: Goulding M, Lumsden A, Paquette AJ (1994) Regulation of Pax-3 expression in the dermomyotome and its role in muscle development. Development 120: Postępy Biochemii 59 (2)

12 25. Williams BA, Ordahl CP (1994) Pax-3 expression in segmental mesoderm marks early stages in myogenic cell specification. Development 120: Moss FP, Leblond CP (1970) Nature of dividing nuclei in skeletal muscle of growing rats. J Cell Biol 44: Zhang M, Koishi K, McLennan IS (1998) Skeletal muscle fibre types: detection methods and embryonic determinants. Histol Histopathol 13: White RB, Bierinx AS, Gnocchi VF, Zammit PS (2010) Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development. BMC Dev Biol 10: Allbrook DB, Han MF, Hellmuth AE (1971) Population of muscle satellite cells in relation to age and mitotic activity. Pathology 3: Schultz E (1974) A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. Anat Rec 180: Moss FP, Leblond CP (1971) Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat Rec 170: Schultz E, Chamberlain C, McCormick KM, Mozdziak PE (2006) Satellite cells express distinct patterns of myogenic proteins in immature skeletal muscle. Dev Dyn 235: Kelly AM (1978) Satellite cells and myofiber growth in the rat soleus and extensor digitorum longus muscles. Dev Biol 65: Zammit PS, Heslop L, Hudon V, Rosenblatt JD, Tajbakhsh S, Buckingham ME, Beauchamp JR, Partridge TA (2002) Kinetics of myoblast proliferation show that resident satellite cells are competent to fully regenerate skeletal muscle fibers. Exp Cell Res 281: Oustanina S, Hause G, Braun T (2004) Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification. EMBO J 23: Borycki AG, Li J, Jin F, Emerson CP, Epstein JA (1999) Pax3 functions in cell survival and in pax7 regulation. Development 126: Czerwinska AM, Streminska W, Ciemerych MA, Grabowska I (2012) Mouse gastrocnemius muscle regeneration after mechanical or cardiotoxin injury. Folia Histochem Cytobiol 50: Ciemerych MA, Archacka K, Grabowska I, Przewozniak M (2011) Cell cycle regulation during proliferation and differentiation of mammalian muscle precursor cells. Results Probl Cell Differ 53: Brzoska E, Ciemerych MA, Przewozniak M, Zimowska M (2011) Regulation of muscle stem cells activation - the role of growth factors and extracellular matrix. Vitamins Hormones, in press 40. Scharner J, Zammit PS (2011) The muscle satellite cell at 50: the formative years. Skelet Muscle 1: Relaix F, Zammit PS (2012) Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development 139: Berkes CA, Tapscott SJ (2005) MyoD and the transcriptional control of myogenesis. Semin Cell Dev Biol 16: Zimowska M, Olszynski KH, Swierczynska M, Streminska W, Ciemerych MA (2012) Decrease of MMP-9 activity improves soleus muscle regeneration. Tissue Eng Part A 18: Collins CA, Olsen I, Zammit PS, Heslop L, Petrie A, Partridge TA, Morgan JE (2005) Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell 122: Sacco A, Doyonnas R, Kraft P, Vitorovic S, Blau HM (2008) Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 456: Church JCT, Noronha RFX, Allbrook DB (1966) Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Br J Surg 53: Shea KL, Xiang W, LaPorta VS, Licht JD, Keller C, Basson MA, Brack AS (2010) Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell 6: Lagha M, Sato T, Bajard L, Daubas P, Esner M, Montarras D, Relaix F, Buckingham M (2008) Regulation of skeletal muscle stem cell behavior by Pax3 and Pax7. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 73: Lepper C, Partridge TA, Fan CM (2011) An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development 138: McCarthy JJ, Mula J, Miyazaki M, Erfani R, Garrison K, Farooqui AB, Srikuea R, Lawson BA, Grimes B, Keller C, Van Zant G, Campbell KS, Esser KA, Dupont-Versteegden EE, Peterson CA (2011) Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development 138: Murphy MM, Lawson JA, Mathew SJ, Hutcheson DA, Kardon G (2011) Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development 138: Sambasivan R, Yao R, Kissenpfennig A, Van Wittenberghe L, Paldi A, Gayraud-Morel B, Guenou H, Malissen B, Tajbakhsh S, Galy A (2011) Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development 138: Donalies M, Cramer M, Ringwald M, Starzinski-Powitz A (1991) Expression of M-cadherin, a member of the cadherin multigene family, correlates with differentiation of skeletal muscle cells. Proc Natl Acad Sci USA 88: Wrobel E, Brzoska E, Moraczewski J (2007) M-cadherin and beta-catenin participate in differentiation of rat satellite cells. Eur J Cell Biol 86: Biressi S, Rando TA (2010) Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol 21: Boldrin L, Muntoni F, Morgan JE (2010) Are human and mouse satellite cells really the same? J Histochem Cytochem 58: Cerletti M, Jurga S, Witczak CA, Hirshman MF, Shadrach JL, Goodyear LJ, Wagers AJ (2008) Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell 134: Lark KG, Consigli RA, Minocha HC (1966) Segregation of sister chromatids in mammalian cells. Science 154: Shinin V, Gayraud-Morel B, Gomes D, Tajbakhsh S (2006) Asymmetric division and cosegregation of template DNA strands in adult muscle satellite cells. Nat Cell Biol 8: Conboy MJ, Karasov AO, Rando TA (2007) High incidence of non-random template strand segregation and asymmetric fate determination in dividing stem cells and their progeny. PLoS Biol 5: e Conboy IM, Rando TA (2002) The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis. Dev Cell 3: Rosenblatt JD, Lunt AI, Parry DJ, Partridge TA (1995) Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim 31: Mourikis P, Sambasivan R, Castel D, Rocheteau P, Bizzarro V, Tajbakhsh S (2012) A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells 30: Kuang S, Kuroda K, Le Grand F, Rudnicki MA (2007) Asymmetric self- -renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell 129: Christov C, Chretien F, Abou-Khalil R, Bassez G, Vallet G, Authier FJ, Bassaglia Y, Shinin V, Tajbakhsh S, Chazaud B, Gherardi RK (2007) Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Mol Biol Cell 18: Chazaud B, Sonnet C, Lafuste P, Bassez G, Rimaniol AC, Poron F, Authier FJ, Dreyfus PA, Gherardi RK (2003) Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. J Cell Biol 163: Abou-Khalil R, Le Grand F, Pallafacchina G, Valable S, Authier FJ, Rudnicki MA, Gherardi RK, Germain S, Chretien F, Sotiropoulos A, Lafuste P, Montarras D, Chazaud B (2009) Autocrine and paracrine angiopoietin 1/Tie-2 signaling promotes muscle satellite cell self-renewal. Cell Stem Cell 5: Halevy O, Piestun Y, Allouh MZ, Rosser BW, Rinkevich Y, Reshef R, Rozenboim I, Wleklinski-Lee M, Yablonka-Reuveni Z (2004) Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken esta

13 blishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn 231: Zammit PS, Golding JP, Nagata Y, Hudon V, Partridge TA, Beauchamp JR (2004) Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal? J Cell Biol 166: Shefer G, Van de Mark DP, Richardson JB, Yablonka-Reuveni Z (2006) Satellite-cell pool size does matter: defining the myogenic potency of aging skeletal muscle. Dev Biol 294: Yablonka-Reuveni Z, Day K, Vine A, Shefer G (2008) Defining the transcriptional signature of skeletal muscle stem cells. J Anim Sci 86: E Day K, Paterson B, Yablonka-Reuveni Z (2009) A distinct profile of myogenic regulatory factor detection within Pax7+ cells at S phase supports a unique role of Myf5 during posthatch chicken myogenesis. Dev Dyn 238: Day K, Shefer G, Shearer A, Yablonka-Reuveni Z (2010) The depletion of skeletal muscle satellite cells with age is concomitant with reduced capacity of single progenitors to produce reserve progeny. Dev Biol 340: Day K, Shefer G, Richardson JB, Enikolopov G, Yablonka-Reuveni Z (2007) Nestin-GFP reporter expression defines the quiescent state of skeletal muscle satellite cells. Dev Biol 304: Troy A, Cadwallader AB, Fedorov Y, Tyner K, Tanaka KK, Olwin BB (2012) Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par- -complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell 11: Judson RN, Tremblay AM, Knopp P, White RB, Urcia R, Bari CD, Zammit PS, Camargo FD, Wackerhage H (2012) The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. J Cell Sci: 77. Montarras D, Morgan J, Collins C, Relaix F, Zaffran S, Cumano A, Partridge T, Buckingham M (2005) Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science 309: Gilbert PM, Havenstrite KL, Magnusson KE, Sacco A, Leonardi NA, Kraft P, Nguyen NK, Thrun S, Lutolf MP, Blau HM (2010) Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture. Science 329: Parker MH, Loretz C, Tyler AE, Duddy WJ, Hall JK, Olwin BB, Bernstein ID, Storb R, Tapscott SJ (2012) Activation of Notch signaling during ex vivo expansion maintains donor muscle cell engraftment. Stem Cells 30: Csete M, Walikonis J, Slawny N, Wei Y, Korsnes S, Doyle JC, Wold B (2001) Oxygen-mediated regulation of skeletal muscle satellite cell proliferation and adipogenesis in culture. J Cell Physiol 189: Greenbaum AR, Etherington PJ, Manek S, O Hare D, Parker KH, Green CJ, Pepper JR, Winlove CP (1997) Measurements of oxygenation and perfusion in skeletal muscle using multiple microelectrodes. J Muscle Res Cell Motil 18: Di Carlo A, De Mori R, Martelli F, Pompilio G, Capogrossi MC, Germani A (2004) Hypoxia inhibits myogenic differentiation through accelerated MyoD degradation. J Biol Chem 279: Urbani L, Piccoli M, Franzin C, Pozzobon M, De Coppi P (2012) Hypoxia increases mouse satellite cell clone proliferation maintaining both in vitro and in vivo heterogeneity and myogenic potential. PLoS One 7: e Asakura A, Komaki M, Rudnicki M (2001) Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation 68: Shefer G, Wleklinski-Lee M, Yablonka-Reuveni Z (2004) Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J Cell Sci 117: Rossi CA, Pozzobon M, Ditadi A, Archacka K, Gastaldello A, Sanna M, Franzin C, Malerba A, Milan G, Cananzi M, Schiaffino S, Campanella M, Vettor R, De Coppi P (2010) Clonal characterization of rat muscle satellite cells: proliferation, metabolism and differentiation define an intrinsic heterogeneity. PLoS One 5: e Grimaldi PA, Teboul L, Inadera H, Gaillard D, Amri EZ (1997) Trans- -differentiation of myoblasts to adipoblasts: triggering effects of fatty acids and thiazolidinediones. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 57: Scarda A, Franzin C, Milan G, Sanna M, Dal Pra C, Pagano C, Boldrin L, Piccoli M, Trevellin E, Granzotto M, Gamba P, Federspil G, De Coppi P, Vettor R (2010) Increased adipogenic conversion of muscle satellite cells in obese Zucker rats. Int J Obes (Lond) 34: Guan Y, Taylor-Jones JM, Peterson CA, McGehee RE, Jr. (2002) p130/ p107 expression distinguishes adipogenic potential in primary myoblasts based on age. Biochem Biophys Res Commun 296: Wada MR, Inagawa-Ogashiwa M, Shimizu S, Yasumoto S, Hashimoto N (2002) Generation of different fates from multipotent muscle stem cells. Development 129: Starkey JD, Yamamoto M, Yamamoto S, Goldhamer DJ (2011) Skeletal muscle satellite cells are committed to myogenesis and do not spontaneously adopt nonmyogenic fates. J Histochem Cytochem 59: Ban A, Yamanouchi K, Matsuwaki T, Nishihara M (2008) In vivo gene transfer of PPAR gamma is insufficient to induce adipogenesis in skeletal muscle. J Vet Med Sci 70: Komaki M, Asakura A, Rudnicki MA, Sodek J, Cheifetz S (2004) MyoD enhances BMP7-induced osteogenic differentiation of myogenic cell cultures. J Cell Sci 117: Kawai M, Bessho K, Maruyama H, Miyazaki J, Yamamoto T (2006) Simultaneous gene transfer of bone morphogenetic protein (BMP) -2 and BMP-7 by in vivo electroporation induces rapid bone formation and BMP-4 expression. BMC Musculoskelet Disord 7: Lounev VY, Ramachandran R, Wosczyna MN, Yamamoto M, Maidment AD, Shore EM, Glaser DL, Goldhamer DJ, Kaplan FS (2009) Identification of progenitor cells that contribute to heterotopic skeletogenesis. J Bone Joint Surg Am 91: Seidel M, Borczynska A, Rozwadowska N, Kurpisz M (2009) Cell-based therapy for heart failure: skeletal myoblasts. Cell Transplant 18: Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, Jones TR, Reedy MC, Hutcheson KA, Glower DD, Kraus WE (1998) Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat Med 4: Reinecke H, Poppa V, Murry CE (2002) Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J Mol Cell Cardiol 34: Asakura A, Seale P, Girgis-Gabardo A, Rudnicki MA (2002) Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol 159: Bachrach E, Perez AL, Choi YH, Illigens BM, Jun SJ, del Nido P, McGowan FX, Li S, Flint A, Chamberlain J, Kunkel LM (2006) Muscle engraftment of myogenic progenitor cells following intraarterial transplantation. Muscle Nerve 34: Tanaka KK, Hall JK, Troy AA, Cornelison DD, Majka SM, Olwin BB (2009) Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell 4: Minasi MG, Riminucci M, De Angelis L, Borello U, Berarducci B, Innocenzi A, Caprioli A, Sirabella D, Baiocchi M, De Maria R, Boratto R, Jaffredo T, Broccoli V, Bianco P, Cossu G (2002) The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development 129: Sampaolesi M, Torrente Y, Innocenzi A, Tonlorenzi R, D Antona G, Pellegrino MA, Barresi R, Bresolin N, De Angelis MG, Campbell KP, Bottinelli R, Cossu G (2003) Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science 301: Sampaolesi M, Blot S, D Antona G, Granger N, Tonlorenzi R, Innocenzi A, Mognol P, Thibaud JL, Galvez BG, Barthelemy I, Perani L, Mantero S, Guttinger M, Pansarasa O, Rinaldi C, Cusella De Angelis MG, Torrente Y, Bordignon C, Bottinelli R, Cossu G (2006) Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 444: Postępy Biochemii 59 (2)

14 105. Dellavalle A, Sampaolesi M, Tonlorenzi R, Tagliafico E, Sacchetti B, Perani L, Innocenzi A, Galvez BG, Messina G, Morosetti R, Li S, Belicchi M, Peretti G, Chamberlain JS, Wright WE, Torrente Y, Ferrari S, Bianco P, Cossu G (2007) Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol 9: Crisan M, Yap S, Casteilla L, Chen CW, Corselli M, Park TS, Andriolo G, Sun B, Zheng B, Zhang L, Norotte C, Teng PN, Traas J, Schugar R, Deasy BM, Badylak S, Buhring HJ, Giacobino JP, Lazzari L, Huard J, Peault B (2008) A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell 3: Dellavalle A, Maroli G, Covarello D, Azzoni E, Innocenzi A, Perani L, Antonini S, Sambasivan R, Brunelli S, Tajbakhsh S, Cossu G (2011) Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun 2: Tamaki T, Akatsuka A, Ando K, Nakamura Y, Matsuzawa H, Hotta T, Roy RR, Edgerton VR (2002) Identification of myogenic-endothelial progenitor cells in the interstitial spaces of skeletal muscle. J Cell Biol 157: Tamaki T, Uchiyama Y, Okada Y, Ishikawa T, Sato M, Akatsuka A, Asahara T (2005) Functional recovery of damaged skeletal muscle through synchronized vasculogenesis, myogenesis, and neurogenesis by muscle-derived stem cells. Circulation 112: Zheng B, Cao B, Crisan M, Sun B, Li G, Logar A, Yap S, Pollett JB, Drowley L, Cassino T, Gharaibeh B, Deasy BM, Huard J, Peault B (2007) Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotechnol 25: Torrente Y, Belicchi M, Sampaolesi M, Pisati F, Meregalli M, D Antona G, Tonlorenzi R, Porretti L, Gavina M, Mamchaoui K, Pellegrino MA, Furling D, Mouly V, Butler-Browne GS, Bottinelli R, Cossu G, Bresolin N (2004) Human circulating AC133(+) stem cells restore dystrophin expression and ameliorate function in dystrophic skeletal muscle. J Clin Invest 114: Benchaouir R, Meregalli M, Farini A, D Antona G, Belicchi M, Goyenvalle A, Battistelli M, Bresolin N, Bottinelli R, Garcia L, Torrente Y (2007) Restoration of human dystrophin following transplantation of exon-skipping-engineered DMD patient stem cells into dystrophic mice. Cell Stem Cell 1: Mitchell KJ, Pannerec A, Cadot B, Parlakian A, Besson V, Gomes ER, Marazzi G, Sassoon DA (2010) Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nature cell biology 12: Relaix F, Weng X, Marazzi G, Yang E, Copeland N, Jenkins N, Spence SE, Sassoon D (1996) Pw1, a novel zinc finger gene implicated in the myogenic and neuronal lineages. Dev Biol 177: Nicolas N, Marazzi G, Kelley K, Sassoon D (2005) Embryonic deregulation of muscle stress signaling pathways leads to altered postnatal stem cell behavior and a failure in postnatal muscle growth. Dev Biol 281: Williams JT, Southerland SS, Souza J, Calcutt AF, Cartledge RG (1999) Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Am Surg 65: Grabowska I, Brzoska E, Gawrysiak A, Streminska W, Moraczewski J, Polanski Z, Hoser G, Kawiak J, Machaj EK, Pojda Z, Ciemerych MA (2012) Restricted myogenic potential of mesenchymal stromal cells isolatedfrom umbilical cord. Cell Transplant 21: de la Garza-Rodea AS, van der Velde-van Dijke I, Boersma H, Goncalves MA, van Bekkum DW, de Vries AA, Knaan-Shanzer S (2012) Myogenic properties of human mesenchymal stem cells derived from three different sources. Cell Transplant 21: Archacka K, Moraczewski, J, Grabowska I (2009) Udział niemięśniowych komórek macierzystych w regeneracji mięśni szkieletowych. Post Biol Kom 37: Bosnakovski D, Xu Z, Li W, Thet S, Cleaver O, Perlingeiro RC, Kyba M (2008) Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells 26: Beauchamp JR, Heslop L, Yu DS, Tajbakhsh S, Kelly RG, Wernig A, Buckingham ME, Partridge TA, Zammit PS (2000) Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cell Biol 151: Irintchev A, Zeschnigk M, Starzinski-Powitz A, Wernig A (1994) Expression pattern of M-cadherin in normal, denervated, and regenerating mouse muscles. Dev Dyn 199: Cornelison DD, Wold BJ (1997) Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Dev Biol 191: Cornelison DD, Filla MS, Stanley HM, Rapraeger AC, Olwin BB (2001) Syndecan-3 and syndecan-4 specifically mark skeletal muscle satellite cells and are implicated in satellite cell maintenance and muscle regeneration. Dev Biol 239: Blanco-Bose WE, Yao CC, Kramer RH, Blau HM (2001) Purification of mouse primary myoblasts based on alpha 7 integrin expression. Exp Cell Res 265: Gnocchi VF, White RB, Ono Y, Ellis JA, Zammit PS (2009) Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One 4: e Sherwood RI, Christensen JL, Weissman IL, Wagers AJ (2004) Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells 22: Brzoska E, Kowalewska M, Markowska A, Kowalski K, Archacka K, Zimowska M, Grabowska I, Czerwinska AM, Gora M, Streminska W, Janczyk-Ilach K, Ciemerych MA (2012) The Sdf-1 (CXCL12) improves skeletal muscle regeneration via the mobilization of Cxcr4 and CD34 expressing cells. Biol Cell 104: Volonte D, Liu Y, Galbiati F (2005) The modulation of caveolin-1 expression controls satellite cell activation during muscle repair. FA- SEB J 19: Are satellite cells stem cells? Karolina Archacka, Kamil Kowalski, Edyta Brzóska * Department of Cytology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Miecznikowa St., Warsaw, Poland * edbrzoska@biol.uw.edu.pl Key words: satellite cells, stem cells, muscle regeneration, myogenesis Abstract Satellite cells, localized in the niche between the membrane of muscle fiber and basal lamina that surrounds it, serve as a source of myoblasts that are necessary for both growth and regeneration of skeletal muscle. Apart from their ability to convert into myoblasts, satellite cells are also able to self-renew, thus, they meet requirements for tissue specific, unipotent stem cells. Recently conducted research revealed that population of satellite cells is heterogeneous. The article summarizes current information on biology and characteristics of satellite cells, and also describes models concerning mechanisms of self-renewal and differentiation of satellite cells. Experiments regarding in vitro differentiation of satellite cells into other cell types are also discussed. Moreover, other population of stem cells localized in the muscle are described in this review