Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów do badań zjawiska mikrochimeryzmu in vitro 1

Transkrypt

1 Rocznik Studenckiego Ruchu Naukowego Uniwersytetu Warszawskiego tom 8, 2; Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów do badań zjawiska mikrochimeryzmu in vitro 1 Monika Niepokojczycka, Łukasz ugajski, Michał Zarzycki, nna Kowalik i Mariusz Kulińczak Koło Naukowe Immunologii Wydział iologii Mikrochimeryzm jest stanem, w którym w organizmie znajduje się niewielka pula komórek odmiennych genetycznie. MoŜe on powstawać naturalnie podczas ciąŝy lub sztucznie po transplantacji lub transfuzji krwi. Mechanizmy powstawania mikrochimeryzmu, a takŝe jego skutki dla organizmu nadal nie są całkowicie poznane. Wydaje się, Ŝe zjawisko to moŝe przyczynić się do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych lub teŝ prowadzi do wytworzenia tolerancji na przeszczepiony narząd. Doświadczenie przeprowadzone przez studentów z Koła Naukowego Immunologii miało na celu wybranie szczepów myszy oraz ustalenie optymalnych warunków mieszanej hodowli limfocytów, aby opracować model przydatny do badania zjawiska mikrochimeryzmu in vitro. W tym celu załoŝono hodowle in vitro limfocytów węzłów chłonnych pochodzących od trzech szczepów myszy, w dwóch wariantach proporcji ilościowych. Po 4 i 5 dniowej inkubacji określono odsetek limfocytów proliferujących i apoptotycznych za pomocą cytometru przepływowego. Wstęp W biologii terminem chimeryzm określa się stan, w którym organizm składa się z komórek róŝniących się genetycznie. Pojęcie to wywodzi się z greckiej mitologii, w której chimerą nazwane było stworzenie z głową lwa, ciałem kozy i ogonem węŝa. U zwierząt naturalne występowanie chimeryzmu jest wynikiem połączenia się lub wymieszania komórek dwóch zarodków we wczesnym rozwoju embrionalnym. 1 adania dofinansowane przez Radę Konsultacyjną ds. Studenckiego Ruchu Naukowego, projekt o sygnaturze 25/IV/8 pt. Mikrochimeryzm badania w hodowlach leukocytów in vitro

2 4 Monika Niepokojczycka i in. O mikrochimeryzmie mówi się, gdy w organizmie znajduje się niewielka pula komórek obcych genetycznie. Stan ten moŝe powstać w sposób naturalny podczas ciąŝy, kiedy komórki płodu migrują do organizmu matki i odwrotnie. adania nad kobietami posiadającymi dorosłe dzieci wykazały, Ŝe nawet 6-7% matek ma w swoim ciele komórki płodu przez dłuŝej niŝ 5 lat od wydania dziecka na świat oraz podobny odsetek dzieci posiada komórki pochodzące od matki. Jest kilka hipotez dotyczących długotrwałych konsekwencji obecności komórek płodu w organizmie matki: 1) komórki płodu nie odgrywają Ŝadnej roli, 2) aktywność komórek płodu kieruje się przeciwko organizmowi matki, 3) obecność komórek płodu jest pomocna, gdyŝ mogą one brać udział w naprawie zniszczonych tkanek matki. Wykazano, Ŝe komórki płodu mają zdolność do zasiedlania uszkodzonych organów matki, jednakŝe wpływ obecności komórek płodu nie został do tej pory jednoznacznie wyjaśniony (Fast, 26). Mikrochimeryzm moŝe powstać takŝe po transplantacji lub transfuzji krwi. Mikrochimeryzm po przeszczepie został po raz pierwszy opisany w 1969 roku u pacjentów, którzy otrzymali wątrobę od dawcy przeciwnej płci. Hepatocyty i komórki wyściełające naczynia krwionośne posiadały materiał genetyczny dawcy, natomiast makrofagi pochodziły od biorcy narządu. Wykazano, Ŝe w przeszczepionym narządzie znajdowały się komórki hematopoetyczne, które następnie zasiedliły organizm biorcy. Kolejne badania, tym razem na szczurach wykazały, Ŝe komórki pochodzące z wątroby dawcy zasiedlają zarówno narządy limfoidalne jak i nielimfoidalne biorcy. Przypuszczano, Ŝe zjawisko to moŝe leŝeć u podstaw tworzenia i utrzymywania tolerancji na przeszczepioną wątrobę, jak i inne przeszczepione narządy pochodzące od tego samego dawcy. Sądzono, Ŝe wątroba jest pod tym względem wyjątkowym narządem, aŝ do 1991 roku kiedy komórki układu odpornościowego dawcy wykryto w narządach limfoidalnych po przeszczepie jelita (u człowieka, szczura i świni). Pomimo występującego mikrochimeryzmu nie zaobserwowano objawów choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (ang. graft versus host disease GVHD). Obserwowany stan moŝna wytłumaczyć faktem, Ŝe współistnienie obok siebie populacji komórek biorcy i dawcy, powoduje w kaŝdej z tych populacji klonalną ekspansję (proliferację) limfocytów zdolnych do niszczenia drugiej populacji i równocześnie klonalną delecję (apoptoza) komórek drugiej populacji, co zapewnia stan dynamicznej równowagi pomiędzy odpowiedzią typu GVHD oraz odrzuceniem przeszczepu (Starzl i in., 1992). Jak dotąd nie ustalono czy mikrochimeryzm jest niezbędny do osiągnięcia stanu tolerancji, czy jest jedynie wskaźnikiem wykształcenia się stanu tolerancji na przeszczep (Fast, 26). Mikrochimeryzm jest przedmiotem zainteresowania wielu badaczy jako: 1) moŝliwa przyczyna chorób autoimmunizacyjnych 2) sposób na indukcję tolerancji immunologicznej 3) wskaźnik ryzyka rozwinięcia się GVHD

3 Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów 5 4) sposób na poprawę stanu pacjenta lub wyleczenie chorób genetycznych lub nabytych 5) sposób diagnozowania zaburzeń genetycznych płodu 6) metoda monitorowania potencjalnie nadchodzącego odrzucenia przeszczepu (Utter i in., 27). Niektórzy badacze uwaŝają, Ŝe poziom zgodności MHC (ang. Major Histocompatibility Complex, geny głównego układu zgodności tkankowej) ma związek z powstaniem i utrzymaniem się mikrochimeryzmu oraz jest decydującym czynnikiem ryzyka w powstaniu chorób autoimmunizacyjnych (Nikbin i in., 27). Ludzkie antygeny MHC, znane pod nazwą HL (ang. Human Leukocyte ntigen), są glikoproteinami obecnymi na powierzchni błony komórkowej i charakteryzują się bardzo wysokim polimorfizmem w populacji ludzkiej (Tiercy i in., 22). Ten wysoki polimorfizm czyni kaŝdy organizm (z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych) unikalnym pod względem MHC i umoŝliwia rozpoznawanie swoich komórek od obcych, co z kolei umoŝliwia walkę z patogenami (Caballero i in., 26). Cząsteczki MHC biorą udział w prezentacji peptydów pochodzących z degradacji białek patogenów 1/ limfocytom T cytotoksycznym o fenotypie CD8 + 2/ limfocytom T pomocniczym o fenotypie CD4 +. Kompleksy MHC-peptyd są rozpoznawane przez róŝnorodne TCR (ang. T Cell Receptor). TCR moŝe takŝe rozpoznać allogeniczne MHC jako cząsteczkę obcą. Szacuje się Ŝe 1-% limfocytów w krwi obwodowej człowieka jest w stanie rozpoznać podany allo-hl, co jest znaczącą barierą w przeszczepach narządów oraz szpiku kostnego (Tiercy i in., 22). Po przeszczepie narządu, MHC obecne na komórkach dawcy są rozpoznawane jako obce przez komórki układu odpornościowego biorcy, co wywołuje reakcję allogeniczną i powoduje odrzucenie przeszczepu, jeśli nie zostanie wytworzona immunosupresja (Caballero i in., 26). W przypadku przeszczepu szpiku kostnego nowo powstałe komórki układu odpornościowego mogą rozpoznać HL biorcy jako obce i wtedy rozwija się GVHD (Tiercy i in., 22). Przebieg doświadczenia Celem doświadczenia przeprowadzonego przez studentów było znalezienie optymalnych warunków hodowli limfocytów wyizolowanych z węzłów chłonnych myszy róŝniących się w zakresie MHC, tak aby zaobserwować powstanie stanu mikrochimeryzmu in vitro. Do doświadczenia wybrano trzy szczepy myszy róŝniące się pod względem MHC: C3H, C oraz F1 pochodzący ze skrzyŝowania szczepu C z C57L/6, a więc częściowo zgodny pod względem MHC z szczepem C. Zakładano hodowle komórek pochodzących z dwóch szczepów, tak aby proporcje pomiędzy limfocytami kaŝdego ze szczepów myszy wynosiły odpowiednio: 1:1 i 1:9. Limfocyty pochodzące z jednego ze szczepów znajdującego się

4 6 Monika Niepokojczycka i in. w mniejszości w hodowli (oznaczonego na wykresach ryc. 1-6 literą z ) wyznakowano uprzednio CFSE (ang. 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester, Sigma). Związek ten po wniknięciu do Ŝywej komórki powoduje emisję zielonej fluorescencji, a podczas podziałów komórki intensywność fluorescencji zmniejsza się barwnik jest dzielony między dwie potomne komórki. Zastosowano następujące warunki hodowli: 1) hodowle kontrolne w podłoŝu hodowlanym bez stymulatorów RPMI 164 z glutamax-i (Gibco), uzupełnione HEPES (Invitrogen), FS (Gibco), 2-merkaptoetanol i penicyliną/streptomycyną (Invitrogen) umoŝliwiające pomiar spontanicznej proliferacji; 2) hodowle umoŝliwiające długotrwałe przeŝycie limfocytów T in vitro, w podłoŝu hodowlanym z dodatkiem IL-2 (interleukina 2, 2 U/ml, PeproTech). IL-2 zapobiega apoptozie limfocytów, równocześnie w zastosowanym stęŝeniu, nie powoduje ich proliferacji; 3) hodowle w podłoŝu z dodatkiem IL-2 (2 U/ml) oraz przeciwciał anty-cd3 (1 µg/ml, D Pharmingen). Takie warunki hodowli limfocytów imitują warunki aktywacji antygenowej przez receptor TCR i umoŝliwiają określenie maksymalnej zdolności do proliferacji obu populacji hodowanych limfocytów. Po 4 i 5 dniach hodowli część komórek wyznakowano aneksyną V (D Pharmingen), aby określić odsetek komórek apoptotycznych. Kinetykę proliferacji i apoptozy komórek mierzono za pomocą cytometru przepływowego FCSCalibur (D iosciences), do analizy wyników uŝyto programu CellQuest. Na wykresach przedstawione są średnie wyniki dla poszczególnych pomiarów wraz z odchyleniem standardowym. Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z zezwoleniem LKE nr 844/28. Wyniki Obserwowano intensywność reakcji allogenicznej zachodzącej pomiędzy limfocytami pozyskanymi z róŝniących się pod względem MHC szczepów myszy, jej miarą jest zarówno proliferacja jak i apoptoza (ryc. 1-6). Wnioski 1. Wśród wybranych do badań szczepów myszy najsłabszą odpowiedź allogeniczną obserwowano w hodowlach komórek szczepów myszy C i F1 oraz C i C3H, reakcja była niezaleŝna od proporcji ilościowej pomiędzy komórkami pochodzącymi z obu szczepów myszy. 2. Hodowle limfocytów pozyskanych z myszy C i F1 oraz C i C3H z dodatkiem IL-2 (2 U/ml) mogą zostać uŝyte w przyszłości do badań nad zjawiskiem mikrochimeryzmu in vitro. 3. Po upływie 4 dni hodowle limfocytów pozyskanych z myszy C i F1 oraz C i C3H i stymulowanych IL-2 naleŝy przenosić do nowego

5 Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów 7 podłoŝa równocześnie zwiększając objętość hodowli, tak aby utrzymać optymalną gęstość komórek % komórek proliferujących % komórek proliferujących Ryc. 1. Proliferacja limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu szczepów 1:1; 4 dni hodowli; 5 dni hodowli

6 8 Monika Niepokojczycka i in % komórek proliferujących % komórek proliferujących Ryc. 2. Proliferacja limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu szczepów 1:9; 4 dni hodowli; 5 dni hodowli

7 Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów 9 % komórek apoptotycznych znakowanych CFSE % komórek apoptotycznych znakowanych CFSE Ryc. 3. poptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu szczepów 1:1; 4 dni hodowli; 5 dni hodowli

8 1 Monika Niepokojczycka i in. % komórek apoptotycznych znakowanych CFSE % komórek apoptotycznych nieznakowanych CFSE Ryc. 4. poptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych nieznakowanych CFSE (n) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu szczepów 1:1; 4 dni hodowli; 5 dni hodowli

9 Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów 111 % komórek apoptotycznych znakowanych CFSE % komórek apoptotycznych znakowanych CFSE Ryc. 5. poptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu szczepów 1:9; 4 dni hodowli; 5 dni hodowli

10 112 Monika Niepokojczycka i in. % komórek apoptotycznych nieznakowanych CFSE % komórek apoptotycznych nieznakowanych CFSE Ryc. 6. poptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych nieznakowanych CFSE (n) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu szczepów 1:9; 4 dni hodowli; 5 dni hodowli

11 Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów 113 Podziękowania utorzy serdecznie dziękują dr Ewie Kozłowskiej za pomoc w przygotowaniu i przeprowadzeniu doświadczeń oraz opracowaniu artykułu. Literatura: CLLERO., FERNNDEZ N., LVDO R., RVO M. J., MIRND J. M., LONSO. 26. Tolerogenic response: allorecognition pathways. Transplant Immunology, 17 (1) FST L. D. 26. Microchimerism: a lasting legacy of transfusion? Transfusion, 46 (11) NIKIN., TLEIN F., MOHYEDDIN M. 27. Chimerism: a new look. Urology Journal, 4 (1) STRZL T.E., DEMETRIS. J., MURSE N., ILDSTD S., RICORDI C., TRUCCO M Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet, 27; 339 (889) TIERCY J. M., inni 22, Molecular basis of HL polymorphism: implications in clinical transplantation. Transplant Immunology, 9 (2-4) UTTER G. H., REED W. F., LEE T.H., USCH M. P. 27. Transfusion-associated microchimerism. Vox Sanguinis, 93 (3) Summary Microchimerism is a state when a small population of non-self cells is present in the body of an individual. This phenomenon could occur naturally during pregnancy or artificially after transplantation and blood transfusion. The origin and effects of the microchimerism are still unknown. Some researchers consider that it could take part in development of autoimmunity, while others think it may be crucial for tolerance after organ transplantation. Experiments performed by Students' Society for Immunology were focused on assessing optimal conditions of culture of 3 different mouse strains to develop an in vitro model of microchimerism phenomenon. In experiments three mouse strains, three culture conditions and two cell to cell ratios were used. fter incubation percentage of proliferating and apoptotic cells were measured using flow cytometry.