BIOCHEMIA. Skrypt dla studentów medycyny opracowany na podstawie Biochemii Harpera. Michu Wrocław 2008 Wersja 1.0

Transkrypt

1 BIOCHEMIA Skrypt dla studentów medycyny opracowany na podstawie Biochemii Harpera Michu Wrocław 2008 Wersja 1.0

2 - 2 -

3 SPIS TREŚCI Rozdział I Aminokwasy, peptydy, białka 1. Aminokwasy a) budowa, b) nazewnictwo i wzory, c) klasyfikacja, d) funkcje, e) właściwości fizyczne, f) właściwości chemiczne reakcje aa, g) techniki rozdziału 2. Peptydy a) synteza i właściwości wiązania peptydowego, b) nazewnictwo, podział i funkcje peptydów, c) przykłady peptydów aktywnych biologicznie 3. Białka a) klasyfikacja, b) identyfikacja, c) poziomy organizacji i fałdowanie, d) rozdział i określanie struktury białek, e) związek budowy i funkcji białek fibrylarnych i globularnych Rozdział II Struktura i funkcje enzymów 1. Ogóle właściwości enzymów a) klasyfikacja i nazewnictwo, b) centrum katalityczne, c) koenzymy i witaminy będące ich prekursorami, d) swoistość działania enzymów, e) aktywność enzymów, jednostki aktywności, f) kompartmentacja komórkowa enzymów, g) izoenzymy, h) izolacja enzymów 2. Mechanizmy działania enzymów a) typy reakcji enzymatycznych przy dwóch substratach, b) mechanizm działania chymotrypsyny, c) mechanizm działania fruktozo-2,6-bisfosfatazy, d) mechanizm działania transaminaz, e) kataliza kwasowo zasadowa (k-z), f) enzymy wymagające atomów metali 3. Kinetyka reakcji enzymatycznych a) ogólne zasady kinetyki reakcji chemicznych, b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej, c) wpływ stęŝenia substratu na szybkość reakcji, d) zjawisko kooperatywności, e) inhibicja odwracalna i nieodwracalna 4. Regulacja aktywności enzymów a) regulacja ilości enzymu, b) regulacja aktywności katalitycznej enzymu 5. Znaczenie diagnostyczne pomiarów aktywności enzymów a) enzymy indykatorowe, ekskrecyjne i sekrecyjne, b) enzymy najczęściej oznaczane w praktyce klinicznej, c) panele enzymatyczne, d) diagnostyka enzymatyczna w onkologii Rozdział III Transport przez błony i utleniania biologiczne 1. Budowa i funkcje błon biologicznych a) skład błon, b) funkcje błon 2. Transport przez błony biologiczne klasy białek transportujących a) kanały jonowe, b) przenośniki transbłonowe translokazy, c) pompy jonowe, d) wymienniki 3. Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne a) klasyfikacja oksydoreduktaz, b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszące protony i elektrony 4. Transport atomów wodoru przez błonę mitochondrialną 5. Łańcuch oddechowy 6. Fosforylacja oksydacyjna 7. Reaktywne formy tlenu (RFT) 8. Utlenianie mikrosomalne 9. Cykl kwasów trójkarboksylowych (TCA) a) reakcje cyklu, b) bilans energetyczny cyklu, c) powiązania z innymi szlakami amfiboliczność cyklu, d) regulacja cyklu 10. Kompleks oksydazy α-ketokwasów Rozdział IV Węglowodany 1. Budowa chemiczna, właściwości i funkcje cukrów prostych i złoŝonych a) monosacharydy, b) disacharydy, c) polisacharydy 2. Trawienie węglowodanów i jego zaburzenia 3. Wchłanianie i transport węglowodanów a) transport aktywny i bierny, białka transportujące, b) zróŝnicowanie tkankowe transportu, c) rola insuliny, d) rola fosforylacji monosacharydów 4. Metabolizm glukozy - 3 -

4 a) glikoliza (szlak EMP), b) glukoneogeneza, c) szlak pentozofosforanowy (szlak WDH, PPP), d) niektóre zaburzenie przemian glukozy 5. Metabolizm glikogenu a) glikogenogeneza, b) glikogenoliza, c) regulacja glikogenogenezy i glikogenolizy, d) glikogenozy 6. Inne szlaki metabolizmu monosacharydów a) szlak kwasu uronowego, b) metabolizm fruktozy, c) metabolizm galaktozy 7. Metabolizm heteroglikanów a) aminocukry heksozoaminy, b) glikoproteiny, c) proteoglikany, d) mukopolisacharydozy 8. Regulacja przemiany węglowodanów a) zróŝnicowanie tkankowe przemiany węglowodanowej i integracyjna rola wątroby, b) kontrola stęŝenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu węglowodanów Rozdział IV Lipidy 1. Budowa chemiczna, podział i rola tłuszczów prostych i złoŝonych a) funkcje tłuszczów, b) podział lipidów, c) kwasy tłuszczowe, d) triglicerydy (TG), e) fosfolipidy, f) glikolipidy, g) steroidy, h) poliprenoidy 2. Trawienie i wchłanianie lipidów 3. Transport lipidów w chłonce i w osoczu a) budowa lipoprotein, b) transport lipidów w lipoproteinach osocza, c) zaburzenia transportu lipoproteinowego, d) rola wątroby w metabolizmie lipidów 4. Tkanka tłuszczowa rola w metabolizmie lipidów a) metabolizm adipocytów, b) regulacja, c) brunatna tkanka tłuszczowa 5. Utlenianie kwasów tłuszczowych a) lokalizacja komórkowa i tkankowa, b) aktywacja i transport KT do mitochondrium, c) β-oksydacja nasyconych KT, d) oksydacja nienasyconych KT, e) ketogeneza, f) zaburzenia oksydacji KT 6. Lipogeneza synteza kwasów tłuszczowych a) lokalizacja i transport substratów, b) przebieg lipogenezy, c) synteza nienasyconych KT, d) metabolizm eikozanoidów 7. Synteza trójglicerydów a) lokalizacja tkankowa i komórkowa, b) przebieg syntezy 8. Cholesterol a) biosynteza cholesterolu, b) trawienie i wchłanianie cholesterolu, c) równowaga cholesterolu i endocytoza LDL, d) wydalanie cholesterolu, e) miaŝdŝyca 9. Kwasy Ŝółciowe 10. Kalcyferole 11. Hormony sterydowe Rozdział VI Przemiana azotowa: aminokwasy, nukleotydy, porfiryny 1. Trawienie białek w przewodzie pokarmowym a) enzymy i ich specyficzność, b) transport azotu pomiędzy tkankami 2. Ogólna przemiana aminokwasów i metabolizm grupy aminowej a) transaminacja, b) dezaminacja, c) transport, d) eliminacja 3. Metabolizm poszczególnych aminokwasów a) Asp, b) Asn, c) Glu, d) Gln, e) Ala, f) Gly, g) Ser, h) Pro, i) Hyp, j) Arg, k) Orn, l) Cys, m) Phe, n) Tyr, o) Lys, p) Hyl, q) His, r) Thr, s) Met, t) Trp, u) Val, Leu i Ile 4. Przemiana nukleotydów a) trawienie kwasów nukleinowych w przewodzie pokarmowym, b) budowa nukleotydów, c) biosynteza nukleotydów purynowych, d) degradacja puryn, e) odzysk puryn, f) synteza nukleotydów pirymidynowych, g) degradacja pirymidyn, h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydów 5. Metabolizm porfiryn a) synteza hemu, b) rozkład hemu, c) zaburzenia metabolizmu porfiryn Rozdział VII Biochemia funkcjonalna tkanek 1. Endogenne regulatory procesów metabolicznych a) regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaźniki wtórne, b) eikozanoidy budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne 2. Gospodarka wapniowo fosforanowa w organizmie i jej regulacja a) rola wapnia oraz białek wiąŝących wapń, b) regulacja przemiany wapniowej, c) rola fosforanu nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powiązania z gospodarką wapniową 3. Gospodarka Ŝelazem w organizmie wchłanianie, regulacja, zaburzenia przemiany - 4 -

5 4. Biochemia krwi a) białka osocza i ich rola, b) struktura i funkcja erytrocytów, c) budowa i metabolizm leukocytów na przykładzie neutrofili, d) budowa i metabolizm trombocytów, e) hemostaza osoczowa 5. Biochemia wątroby a) rola tkanki wątrobowej, b) przemiana węglowodanowa, lipidowa i azotowa w wątrobie, c) wątroba jako gruczoł zewnątrzwydzielniczy, d) procesy biotransformacji i detoksykacji 6. Biochemia nerek a) funkcje i regulacja, b) skład i właściwości moczu w normie i w patologii 7. Biochemia mięśni a) budowa i charakterystyka białek mięśni, b) mechanizm skurczu mięśnia 8. Biochemia tkanki łącznej a) składniki tkanki łącznej, ich budowa i funkcja, b) synteza kolagenu reakcje i regulacja procesu, c) biochemia kości 9. Biochemia zmysłu wzroku a) rola i przemiany karotenoidów w organizmie człowieka, b) reakcje zachodzące w procesie fotorecepcji Rozdział VIII Kwasy nukleinowe i biosynteza białek 1. Budowa i właściwości kwasów nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny a) elementy składowe kwasów nukleinowych zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy, b) budowa przestrzenna i właściwości DNA, c) budowa, właściwości i klasyfikacja RNA, d) budowa chromatyny, e) chromatyna aktywna i nieaktywna, f) sekwencje powtarzające; mutacje dynamiczne; konwersja genu, g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych, h) gen i jego ekspresja; genom, i) transpozony; geny przekształcone, j) motywy funkcjonalne białek wiąŝących się z DNA 2. Replikacja i naprawa DNA; cykl komórkowy i jego regulacja a) inicjacja, b) elongacja, c) terminacja, d) regulacja replikacji i cykl komórkowy, e) naprawa DNA 3. Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje a) transkrypcja u Procariota, b) róŝnice w transkrypcji u Eucariota, c) geny podzielone; snrna; składanie mrna, d) modyfikacje potranskrypcyjne mrna; redagowanie RNA, e) transkrypcja genów trna i rrna 4. Translacja biosynteza białek a) kod genetyczny, b) budowa trna i aktywacja aa, c) budowa i funkcje rybosomów, d) etapy translacji, e) regulacja i inhibitory translacji, f) potranslacyjne modyfikacje białek 5. Mitochondrialne DNA (mtdna) - 5 -

6 - 6 -

7 ROZDZIAŁ I AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAŁKA 1. Aminokwasy a) budowa Aminokwasy (ang. aminoacids = aa), jak sama nazwa wskazuje, naleŝą do dwufunkcyjnych pochodnych węglowodorów, zawierających w cząsteczce grupę karboksylową oraz aminową. Ogólnie rzecz biorąc, względne połoŝenie obu tych grup moŝe być dowolne, jednak zdecydowanie największe znaczenie posiadają α-laminokwasy, ze względu na to, iŝ wchodzą w skład peptydów i białek. Określenie α-aminokwasy oznacza, iŝ obie główne grupy funkcyjne przyłączone są do tego samego, I-rzędowego atomu węgla; wynika stąd ich wzór ogólny postaci: H 2 N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla kaŝdego aa i decydującym o jego właściwościach. Aa mogą równieŝ ulegać w organizmie rozmaitym modyfikacjom, np. hydroksylacji (4-hydroksy-Pro, 5-hydroksy-Lys), karboksylacji (γ-karboksy-glu), metylacji, formylacji, acetylacji (N-Ac-Glu), prenylacji, fosforylacji i innym. b) nazewnictwo i wzory KaŜdy aa białkowy posiada nazwę systematyczną, wynikającą z jego budowy chemicznej, jak równieŝ zwyczajową. W praktyce posługuje się wyłącznie tymi drugimi, jak równieŝ ich skrótami trój- oraz jednoliterowymi. Nazwy zwyczajowe aa białkowych, ich skróty oraz wzory strukturalne przedstawia poniŝsza tabela. Lp. Nazwa zwyczajowa i skróty Wzór strukturalny 1. glicyna, Gly, G 2. alanina, Ala, A 3. walina, Val, V 4. leucyna, Leu, L 5. izoleucyna, Ile, I 6. seryna, Ser, S 7. treonina, Thr, T 8. cysteina, Cys, C - 7 -

8 9. metionina, Met, M 10. kwas asparaginowy, Asp, D 11. asparagina, Asn, N 12. kwas glutaminowy, Glu, E 13. glutamina, Gln, Q 14. arginina, Arg, R 15. lizyna, Lys, K 16. histydyna, His, H 17. fenyloalanina, Phe, F 18. tyrozyna, Tyr, Y 19. tryptofan, Trp, W 20. prolina, Pro, c) klasyfikacja Aa klasyfikuje się ze względu na rozmaite kryteria: Ze względu na udział w syntezie peptydów wyróŝnia się aa białkowe i niebiałkowe. KaŜdy aa białkowy posiada co najmniej jeden kodon kodujący go układ 3 nukleotydów w mrna; listę 20 aa białkowych zawiera powyŝsza tabela. Aa niebiałkowe nie są zawarte w informacji genetycznej, powstają zaś w wyniku modyfikacji aa białkowych. Dalsze kryteria klasyfikacji odnoszą się wyłącznie do aa białkowych

9 Ze względu na polarność rodnika (R) aa białkowe dzieli się na: aa z R niepolarnym: G, A, V, L, I, P, F, aa z R polarnym niejonizującym: S, T, Y, C, M, Q, N, W, aa z R polarnym jonizującym: kwaśne: D, E, zasadowe: K, R, H. Ze względu na budowę chemiczną R: aa z R alifatycznym: G, A, V, L, I, aa z R zawierającym grupę hydroksylową: S, T, Y, aa z R zawierającym atom siarki: C, M, aa z R zawierającym grupy kwasowe lub ich amidy: D, E, N, Q, aa z R zawierającym grupy zasadowe: K, R, H, aa z R zawierającym pierścień aromatyczny: F, Y, W, H, aa o charakterze iminokwasów: P. Ze względu na zdolność organizmu ludzkiego do ich syntezy, aa dzieli się na endo- i egzogenne. Aa endogenne są syntetyzowane przez ludzkie hepatocyty i nie wymagają dostarczania ich z pokarmem. NaleŜą do nich: G, A, P, S, Y, D, E, N, Q. Aa egzogenne (niezbędne, niezastąpione) nie są syntetyzowane w ludzkim ustroju, a ich obecność i odpowiednie stęŝenie w białkach spoŝywczych decyduje o ich wartości odŝywczej. Są to: V, L, I, F, T, M, W, K, R, H (histydyna jest niezbędna dla dzieci do lat 12, ale nie jest niezbędna dla dorosłych). Ze względu na produkty metabolizmu wyróŝnia się: aa glikogenne, metabolizowane do prekursorów węglowodanów oraz aa ketogenne, metabolizowane do ciał ketonowych. (patrz równieŝ punkt V-3) d) funkcje NajwaŜniejszą funkcją aa jest wzajemne łączenie się, w wyniku czego powstają cząsteczki o wyŝszych poziomach organizacji peptydy, polipeptydy oraz białka (tworzenie wiązania peptydowego omówione jest dalej). Ponadto aa biorą udział w takich procesach fizjologicznych jak: przekaźnictwo w układzie nerwowym (Gly, Glu, Asp, GABA), regulacja procesów wzrostu komórki (Phe i Tyr substraty do syntezy T 3/4 ), biosynteza zasad azotowych, porfiryn i mocznika (Orn, Cyt, Arg-bursztynian) oraz transdukcja sygnałów wewnątrzkomórkowych (odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr). e) właściwości fizyczne W warunkach naturalnych aa mają postać krystalicznych ciał stałych; nie absorbują światła widzialnego, dlatego są bezbarwne (moŝna je wybarwić i uwidocznić specjalnymi metodami, o czym później). Z wyjątkiem glicyny wszystkie α-aa wykazują czynność optyczna, tzn. ich roztwory skręcają płaszczyznę świata spolaryzowanego. Wykazują równieŝ izomerię optyczną, tworząc szeregi konfiguracyjne D i L. Składnikami białek są wyłącznie L-aa, co oznacza, iŝ numeracja podstawników przy chiralnym atomie węgla (Cα) wg kryterium masy rośnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Choć wykazano występowanie D-aa (Ser, Asp), w układzie nerwowym ssaków, to nie wchodzą one w skład peptydów i białek; ponadto D-aa występują w ścianach komórkowych niektórych bakterii (Ala, Glu) oraz w antybiotykach. Większość aa jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i tworzy roztwory, w których wykazuje charakter na ogół obojętny. Dzięki obecności w cząsteczce zarówno grupy karboksylowej o charakterze kwaśnym, jak i aminowej o charakterze zasadowym, aa mogą tworzyć wewnętrzne sole występować w postaci jonów obojnaczych (H 3 N + -CH(R)-COO - ) i tworzyć kryształy jonowe. Tłumaczy to polarną i krystaliczną strukturę aa, z czego wynikają wysokie temperatury topnienia (dalsze ogrzewanie prowadzi do rozkładu). MoŜliwe formy jonowe aa bez bocznych grup hydrolizujących przedstawione są poniŝej: R-CH(N (+) H 3 )-COOH K 1 R-CH(N (+) H 3 )-COO - K 2 R-CH(NH 2 )-COO - (I) ph < pi (II) pi (III) ph > pi Krzywa miareczkowania takiego aa składa się z dwóch sigmoidalnych części, rozdzielonych punktem izoelektrycznym: ph = pk 1 + log [II]/[I] dla ph < pi pk 2 + log [III]/[II] dla ph < pi Przez punkt izoelektryczny (pi) rozumiemy wartość ph, w której aa występuje niemal w całości w postaci jonu obojnaczego, nie wędruje w polu elektrycznym i cechuje się minimalną moŝliwą rozpuszczalnością w wodzie. pi to innymi słowy wartość ph w punkcie pomiędzy wartościami pk po obydwu stronach form izojonowych (jonu obojnaczego) stąd dla aa z R niepolarnym pi = ½ x (pk 1 + pk 2 )

10 JeŜeli chodzi o aa z rodnikiem polarnym i jonizującym, sytuacja przedstawia się odmiennie dla kwasów oraz zasad. W przypadku kwasu najpierw tracony jest proton z własnej reszty karboksylowej, następnie z grupy bocznej, a na samym końcu z własnej grupy aminowej; wobec tego pi oblicza się podobnie jak dla aa z R niepolarnym, czyli: pi = ½ x (pk 1 + pk 2 ). Natomiast w przypadku zasady najpierw tracony jest proton z reszty karboksylowej, następnie z grupy bocznej, a ostatecznie z własnej grupy aminowej; wyraŝenie opisujące pi przyjmuje zatem postać: pi = ½ x (pk 2 + pk 3 ). f) właściwości chemiczne reakcje aa Aa posiadają kilka grup funkcyjnych α-aminową, α-karboksylową oraz reaktywne grupy w obrębie R (niektóre aa) dzięki czemu mogą ulegać wielu rozmaitym przemianom. Reakcje grupy karboksylowej: dysocjacja i tworzenie soli (aa + zasada): H 2 N-CH(R)-COOH OH - H 2 N-CH(R)-COO - H 2 N-CH(R)-COOH + NaOH H 2 N-CH(R)-COONa (sól sodowa aa) tworzenie estrów (aa + alkohol): H 2 N-CH(R)-COOH + R 1 -OH H 2 N-CH(R)-CO-O-R 1 tworzenie amidów tworzenie bezwodników kwasowych dekarboksylacja (pod wpływem ogrzewania lub enzymatycznie): H 2 N-CH(R)-COOH T, -CO 2 R-CH 2 -NH 2 Reakcje grupy aminowej: dysocjacja i tworzenie soli: H 2 N-CH(R)-COOH H + H 3 N + -CH(R)-COOH H 2 N-CH(R)-COOH + HCl Cl - H 3 N + -CH(R)-COOH = HCl. H 2 N-CH(R)-COOH (chlorowodorek aa) estryfikacja, acylacja, N-formylacja dezaminacja (gł. enzymatyczna): H 2 N-CH(R)-COOH R-CO-COOH (ketokwas) Grupa hydroksylowa (Ser, Thr, Tyr) estryfikacja Grupa sulfhydrylowa (Cys): utlenianie do cystyny: 2 Cys-SH -2H Cys-S-S-Cys do kwasu cysteinowego (przez silne utleniacze, np. kwas nadmrówkowy): Cys HCOOOH HO 2 S-CH 2 -CH(NH 2 )-COOH alkalizacja JeŜeli grupa aminowa znajduje się w dalekim połoŝeniu w stosunku do grupy karboksylowej (tj. przy C 4 -C 6 ), wówczas w wyniku ogrzewania następuje wewnętrzna cyklizacja i powstają cykliczne amidy laktamy. Np. kwas 6-aminoheksanowy tworzy kaprolaktam, będący surowcem do produkcji poliamidów. Jak wcześniej wspomniano, aa mają postać bezbarwnych ciał stałych. MoŜna jej jednak wybarwić poprzez reakcję z ninhydryną. Jest to reakcja charakterystyczna aa, pozwalająca na ich identyfikację. Jej produktami są aldehydy poch. od aa oraz złoŝony barwnik, którego anion posiada intensywnie purpurową barwę. Reakcja powstawania i charakterystyka wiązania peptydowego patrz punkt I-2-a

11 g) techniki rozdziału Skład mieszaniny aa, np. pochodzącej z hydrolizy peptydu, moŝna określić za pomocą chromatografii lub elektroforezy. Istotą chromatografii jest rozdział składników między fazą stacjonarną a ruchomą, spowodowany ich silniejszym wiązaniem się z jedną z tych faz. Istnieje kilka rodzajów chromatografii. Chromatografia bibułowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdyŝ nie wymaga specjalnego sprzętu. Kroplę roztworu zawierającą aa nanosi się na pasek bibuły (stąd nazwa), który następnie umieszcza się w szczelnym naczyniu, tak iŝ koniec paska styka się z rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wędruje wzdłuŝ paska, wciągany przez higroskopijną strukturę bibuły. Po przepływie rozpuszczalnika do końca pasek suszy się oraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny powstają w ten sposób purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwością chromatograficzną, zaleŝy od jego względnej polarności aa z R niepolarnymi i długimi wędrują na pasku dalej niŝ aa z R krótszymi lub polarnymi. Dla kaŝdego aa moŝna wyznaczyć jego względną ruchliwość (R f ), definiowaną jako stosunek odległości przebytej przez dany aa do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika. Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli się na podziałową (partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjną (adsorption TLC = ATLC). W PTLC wykorzystuje się rozdział składników mieszaniny pomiędzy fazę stacjonarną oraz ciekłą ruchomą, które dodatkowo róŝnią się polarnością. W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, zaś rozpuszczalnik zawiera zarówno składniki polarne, jak i mało polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nośnikiem zmienia się skład rozpuszczalnika, gdyŝ jego bardziej polarne składniki wiąŝą się z polarnymi grupami hydroksylowymi celulozy wskutek tego przesuwające się czoło rozpuszczalnika staje się stopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC słabiej polarne składniki mieszaniny wędrują więc dalej od polarnych podobnej wielkości. W PTLC w fazie odwróconej polarność faz oraz szybkość wędrówki składników próby są odwrotne niŝ powyŝej faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swoją polarność. Dlatego polarne składniki mieszaniny wędrują z czołem rozpuszczalnika, a mniej polarne pozostają z tyłu. W ATLC wykorzystuje się adsorpcję składników próby na praŝonym Ŝelu krzemionkowym. Faza ruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane składniki, współzawodniczące o miejsce wiązania na Ŝelu składniki słabiej związane wymywane są w pierwszej kolejności. Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypełnionej ściśliwym złoŝem, w warunkach wykluczających stosowanie wysokich ciśnień; ogranicza to maksymalną szybkość przepływu rozpuszczalnika, a tym samym szybkość całego procesu chromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej, wypełnionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi cząsteczkami nieściśliwego wymiennika jonowego, sita molekularnego lub złoŝa stosowanego w chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Bywa równieŝ określana jako wysokociśnieniowa, gdyŝ wartości uŝywanych ciśnień osiągają wartości 5 10 tys. psi. Do jej zalet naleŝy znaczne skrócenie czasu rozdziału, co ogranicza dyfuzję boczną i zapewnia lepszy rozdział składników próby. Rozdział aa metodą HPLC uwzględnia ich reakcję z odczynnikiem umoŝliwiających ich identyfikację i ocenę ilościową. Reakcję tą przeprowadza się albo przed (precolumn) albo po (post-column) właściwej chromatografii. Przy barwieniu post-column uŝywa się znanej juŝ ninhydryny, która tworzy barwne związki indygowe (pochłaniające promieniowanie z zakresu światła widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column uŝywa się odczynnika określanego skrótem AQC, który wykazuje zdolność fluorescencji aa identyfikuje się więc przez oświetlenie lampą UV. Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) słuŝy do rozdzielania mieszanin amfolitów, czyli cząsteczek, których wypadkowy ładunek zaleŝy od ph otoczenia. Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Próbki nanosi się na nośnik zwilŝony buforem o odpowiednim ph i następnie umieszcza w polu elektrycznym. Wówczas kationy wędrują do katody, a aniony do anody, przy czym szybkość wędrówki składników zaleŝy od ich ładunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy cząsteczkowej (odwrotnie proporcjonalnie). Po zakończeniu rozdziału produkty uwidacznia (wybarwia) się odpowiednim odczynnikiem. Rozdział aa prowadzi się na bibule lub cienkowarstwowej płytce pokrytej sproszkowaną celulozą, a wybarwia roztworem ninhydryny. Rozdział polipeptydów i białek prowadzi się na usieciowanym Ŝelu poliakrylamidowym (PAG)

12 Do rozdziału oligomerów nukleotydowych uŝywa się agarozy i PAG, do wybarwiania produktów słuŝy zaś bromek etydyny (identyfikacja w świetle UV). 2. Peptydy a) synteza i właściwości wiązania peptydowego Tworzenie wiązania peptydowego jest najistotniejszą reakcją aa z biologicznego punktu widzenia. Polega ono na kondensacji dwóch aa, a dokładniej na reakcji grupy karboksylowej jednego aa z grupa aminową drugiego aa, czemu towarzyszy eliminacja cząsteczki wody:...-cooh + H 2 N-... -H 2 O...-CO-NH-... Stała równowagi powyŝszej reakcji jest przesunięta na korzyść hydrolizy wiązania peptydowego. Jego powstanie musi być zatem poprzedzone aktywacją grupy karboksylowej laboratoryjnie osiąga się to przez przekształcenie aa w chlorek kwasowy, zaś w organizmach Ŝywych aa ulega kondensacji z ATP, tworząc aktywny aminoacyloadenylan (patrz punkt VIII-4-b). Wiązanie peptydowe moŝe występować w formie ketonowej (-CO-NH-), bądź enolowej (-CO (-) =N (+) H-), które wzajemnie w siebie przechodzą (zjawisko to określane jest jako tautomeria keto-enolowa). Stabilizacja rezonansowa wiązania peptydowego nadaje mu charakter częściowo (ok. 40%) wiązania podwójnego. Ma to daleko idące konsekwencje wiąŝe się bowiem ze skróceniem długości i usztywnieniem wiązania oraz zablokowaniem wokół niego rotacji przyległych atomów. Sprawia to, iŝ wszystkie 4 atomy tworzące wiązanie (C, O, N, H) znajdują się w jednej płaszczyźnie (tzn. są koplanarne) i pozbawione są moŝliwości wzajemnego ruchu. To z kolei umoŝliwia występowanie izomerii geometrycznej względem atomu tlenu: cis (Z) i trans (E), przy czym fizjologicznie wyraźnie dominuje ta druga. Rotacja moŝe odbywać się jedynie wokół wiązań C α -C oraz N-C α. Charakter tej rotacji opisują ilościowo tzw. kąty torsyjne: φ (C α -C) i ψ (N-C α ). Mają one określone wartości dla uporządkowanych struktur II-rzędowych (por. dalej). Wiązanie peptydowe nie posiada ładunku w Ŝadnym istotnym fizjologicznie ph. Pomimo to peptydy są w fizjologicznym ph obdarzone ładunkiem elektrycznym dzięki ładunkom ich grup końcowych (karboksylowej i aminowej) oraz polarnych grup R. Wartość tego ładunku zaleŝy od wartości pk i otoczenia grup dysocjujących oraz od ph otoczenia. Podobnie jak kaŝdemu aa moŝna przyporządkować pi, tak kaŝdemu peptydowi odpowiada punkt izojonowy wartość ph, przy której liczba protonów związanych z grupami zasadowymi jest równa liczbie protonów odszczepionych przez grupy kwasowe (wyrównanie liczby ładunków). Własność ta dotyczy czystych peptydów, a wartość jest dla danego związku stała i charakterystyczna. Wiązanie peptydowe nie absorbuje promieniowania z zakresu widzialnego, toteŝ nie nadaje zawierającym je związkom barwy. Pochłania natomiast promieniowanie UV z zakresu λ = nm. Obecność wiązania peptydowego, począwszy od trójpeptydów, moŝna wykazać za pomocą reakcji biuretowej. Nazwa ta pochodzi od biuretu (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ) najprostszego związku dającego pozytywny wynik wspomnianej reakcji. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CuSO 4 ) wynik pozytywny objawia się intensywnie fioletowym zabarwieniem. b) nazewnictwo, podział i funkcje peptydów W kaŝdym peptydzie wyróŝniamy dwa końce aminowy (N) oraz karboksylowy (C), zaleŝnie od rodzaju występującej na nim wolnej grupy funkcyjnej. Jeśli chodzi o nazewnictwo, obowiązuje zasada podawania kolejności aa od N-końca do C-końca. Peptydy traktuje się jako acyloaminokwasy, więc końcówkę nazwy aa, którego grupa karboksylowa jest podstawiona, zmienia się na -ylo. Jedynie aa znajdujący się na C-końcu z wolną grupą karboksylową zachowuje niezmienioną nazwę. Np. Ile-Cys-Gly to izoleucylo-cysteinylo-glicyna. Wiele naturalnych peptydów zawiera zmodyfikowane aa lub nietypowe wiązania. Ze względu na ilość reszt aa wchodzących w skład peptydu, wyróŝniamy: oligopeptydy (3-10; 3 trójpeptydy, 4 tetrapeptydy itd.), polipeptydy (10-100) oraz białka (>100). Zgodnie z innym kryterium (masy) peptydy o masie <10 kda określane są jako polipeptydy, zaś o masach większych jako białka. Peptydy pełnią rozmaite funkcje biologiczne: hormony, np. TRH, ADH, OT neuroprzekaźniki i neuromodulatory, np. enkefaliny, endorfiny, PS, neurotensyna, somatostatyna toksyny, np. mikrocystyny i nodularyny syntetyzowane przez cyjanobakterie antybiotyki, np. walinomycyna, gramicydyna A i S, bleomycyna antyoksydanty, np. GSH

13 c) przykłady peptydów aktywnych biologicznie Nie tylko wielkocząsteczkowe białka o skomplikowanej i wielorzędowej strukturze, ale proste oligopetydy, złoŝone ze stosunkowo niewielkiej liczby aa, mogą pełnić w organizmie waŝne i niezastąpione funkcje. Omówione zostaną wg liczby reszt aa. Istotnymi biologicznie dwupeptydami są: karnozyna, homokarnozyna i anseryna. Karnozyna, czyli N α -(β-alanylo)histydyna, w znacznych ilościach występuje w mięśniach szkieletowych wyŝszych kręgowców i człowieka. Wzmaga aktywność ATP-azy miozynowej oraz chelatuje jony Cu 2+ i pobudza pobieranie związków miedzi. Homokarnozyna, czyli N α -(4-aminobutyrylo)histydyna, jest dwupeptydem ośrodkowego układu nerwowego, występującym w tkance mózgowej, którego funkcja nie jest znana. Anseryna, czyli π-metylokarnozyna lub N α -(3-aminopropionylo)-π-metylohistydyna, występuje w mięśniach szkieletowych wyŝszych kręgowców, które odznaczają się szybką czynnością skurczową, np. mięśnie kończyn królika lub mięśnie piersiowe ptaków. Brak anseryny w mięśniach człowieka. U niŝszych kręgowców, np. u ryb kostnoszkieletowych występuje ona w znacznych ilościach, w porównaniu ze śladową ilością karnozyny. Aktywnym trójpeptydem jest tyreoliberyna (TRH) produkowana przez podwzgórze stanowi czynnik uwalniający tyreotropinę z przedniego płata przysadki. Jej pełna nazwa to: piroglutamylohistydyloprolinoamid. Składa się z reszt aminokwasowych Glu, His i Pro, przy czym N- końcowy kwas glutaminowy ulega wewnętrznej cyklizacji o kwasu piroglutaminowego, zaś C-końcowa grupa karboksylowa proliny występuje jako amid kwasowy. Innym aktywnym trójpeptydem, pełniącym rolę biologicznego układu redox, jest glutation, czyli γ- glutamylocysteinyloglicyna. Zawiera on reszty Glu, Cys i Gly, przy czym Glu łączy się z Cys wiązaniem nie-α-peptydowym wiązanie peptydowe tworzy nie grupa karboksylowa przy asymetrycznym C 1, lecz przy C 3. Glutation występuje w komórkach w stosunkowo duŝych ilościach rzędu 5 mm. Obecny jest w postaci dwóch form utlenionej i zredukowanej, przy czym tej drugiej jest zazwyczaj około 500 razy więcej. Glutation pełni rolę buforującą stanowiąc bufor hydrosulfidowy. Pełni równieŝ role odtruwającą, poniewaŝ jest przeciwutleniaczem reagującym z nadtlenkiem wodoru i nadtlenkami organicznymi, unieszkodliwiając te uboczne i toksyczne produkty metabolizmu

14 Do aktywnych pięciopeptydów zaliczamy enkefalinę metioninową i leucynową. Pierwsza ma postać: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, druga zaś: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu róŝnią się zatem jedynie C-końcowym aminokwasem, uwzględnionym w nazwie. Wraz z endorfinami (α, β, γ) grupą polipeptydów o resztach aminokwasowych stanowią one naturalne peptydy opioidowe, przeciwbólowe, o działaniu podobnym do morfiny, lecz silniejszym razy. Aktywnym ośmiopeptydem jest angiotensyna II (hipertensyna), powstająca z osoczowego angiotensynogenu pod wpływem reniny wydzielanej w nerkach, a następnie pod wpływem działania enzymu konwertującego. Skutkiem działania reniny na angiotensynogen jest powstanie dziesięciopepetydu angiotensyny I, z której pod wpływem wspomnianego enzymu powstaje angiotensyna II. Ma ona strukturę: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Angiotensyna zwęŝa naczynia krwionośne i jest najsilniejszym czynnikiem podwyŝszającym ciśnienie krwi. Pobudza korę nadnerczy do syntezy aldosteronu, który zwiększa resorpcję zwrotną jonu Na + w nerkach, przeciwdziałając ich utracie z moczem. Bradykinina to dziewięciopeptyd rozszerzający naczynia krwionośne i obniŝający ciśnienie krwi, działa zatem antagonistycznie do angiotensyny II. Odpowiedzialna jest równieŝ za uczucie bólu towarzyszące zranieniu skory. Ma postać: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Bradykinina stanowi typowa kininę powstającą ze specjalnych białek, kininogenów, naleŝących do α 2 -globulin osocza pod wpływem swoistych enzymów proteolitycznych, zwanych kalikreinami. Dzięwięciopeptydami wykazującymi aktywność klasycznych hormonów są wazopresyna i oksytocyna, produkowane w podwzgórzu, a magazynowane w tylnym płacie przysadki. Mają prawie identyczną sekwencje aminokwasową, róŝnią się jedynie dwoma aminokwasami, dlatego hormony te wywołują pewne wspólne efekty biologiczne. Wazopresyna czyli hormon antydiuretyczny (ADH) zwiększa wchłanianie zwrotne wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobór ADH prowadzi do moczówki prostej. Oksytocyna stymuluje skurcze mięśni gładkich macicy (przez co rozpoczyna akcję porodową) i gruczołu sutkowego. Niektóre peptydy wykazują aktywność biologiczną antybiotyków. Antybiotyki peptydowe mają bardzo charakterystyczną cykliczna strukturę i mogą zawierać D-aminokwasy

15 Penicylina jest produkowana przez pleśń Penicillium, gdzie powstaje z Val i Cys, które tworzą 4- członowy pierścień β-laktamowy i 5-członowy pierścień tiazolidynowy. Do pierwszego z nich przyłączana jest wiązaniem peptydowym zmienna grupa kwasowa (R), która moŝe być róŝna i przez to wyróŝniamy róŝne rodzaje penicylin. Penicylina poprzez reaktywny pierścień β-laktamowy zawierający wiązanie peptydowe nieodwracalnie hamuje transpeptydazę glikopeptydową kluczowy enzym w syntezie ścian komórkowych bakterii. W praktyce najczęściej uŝywa się penicyliny G. Symbol Nazwa penicyliny Wzór R F pentylopenicylina -CH 2 -CH=CH-CH 2 -CH 3 G benzylopenicylina -CH 2 -C 6 H 5 K heptylopenicylina -(CH 2 ) 6 -CH 3 V fenoksymetylopenicylna -CH 2 -O-C 6 H 5 X hydroksybenzylopenicylina -CH 2 -C 6 H 4 -OH Aktynomycyna D pochodzi ze szczepu Streptomyces. W swej strukturze zawiera grupę barwnikową (kwas fenoksazonodikarboksyowy), która połączona jest wiązaniami peptydowymi z dwoma pięciopeptydami. Końcowe grupy karboksylowe obu pięciopeptydów tworzą makrocykliczne pierścienie laktonowe. W pięciopeptydach występuje D-Val. Aktynomycyna D jest specyficznym inhibitorem syntezy RNA, czyli transkrypcji, zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych, dlatego często jest wykorzystywana w badaniach biochemicznych. Aktynomycyna D wiąŝe się specyficznie z 2-niciowym DNA, uniemoŝliwiając jego uŝycie jako matrycy w syntezie RNA. ObniŜenie stęŝenia mrna prowadzi do hamowania syntezy białka. Pierścień fenoksazonowy aktynomycyny interkaluje, czyli wślizguje się pomiędzy pary zasad CG w 2-niciowym DNA, natomiast cykliczne polipeptydy wystają jeden ponad, a drugi pod pierścieniem fenoksazonowym Symetria aktynomycyny D dokładnie odpowiada symetrii specyficznej sekwencji zasad CG. Ponadto aktynomycyna D ma działanie cytostatyczne, czyli hamuje podział komórek, w tym komórek szybko dzielących się, dlatego znalazła zastosowanie w leczeniu niektórych nowotworów. Walinomycyna ma strukturę cykliczną, utworzoną z aminokwasów i hydroksykwasów połączonych na przemian wiązaniami estrowymi i peptydowymi. Składa się z trzykrotnie powtórzonego elementu, w skład którego wchodzą reszty L-mleczanu (Lac), L-waliny, D-hydroksyizowalerianu (Hiv) i D-waliny. Walinomycyna jest jonoforowym antybiotykiem nośnikowym, pod wpływem którego błony biologiczne stają się przepuszczalne dla jonu K +. Organizmy znajdujące się pod wpływem

16 antybiotyków jonoforowych pozbawione są moŝliwości kontroli nad wymianą składników z otoczeniem. Walinomycyna koordynacyjnie wiąŝe jon K + z 6 atomami tlenu reszt walin centralnej przestrzeni cząsteczki i jako nośnik przenosi je na drugą stronę błony. Gramicydyna S jest cyklicznym dziesięciopeptydem, w strukturze którego występują 2 reszty D- fenyloalaniny. Gramicydyna A jest równieŝ polipepetydowym antybiotykiem jonoforowym, zbudowanym z 15 naprzemiennie występujących reszt L- i D-aminokwasowych, który na N-końcu posiada grupę formylową. Przyjmuje strukturę β-helisy. Poprzez N-formylowe końce dwa takie polipeptydy łączą się, tworząc dimeryczny, funkcjonalny kanał jonowy dla kationów jednowartościowych, np. Na +, lecz nie dla dwuwartościowych. Kanał ten spontanicznie otwiera się i zamyka, przepuszczając w ciągu sekundy ponad 10 7 kationów. Por tego kanału wyścielony jest polarnymi grupami karboksylowymi peptydu, a hydrofobowe łańcuchy boczne ustawione są na obwodzie kanału. UłoŜenie to umoŝliwiają zestawione naprzemiennie reszty L i D-aminokwasowe. 3. Białka a) klasyfikacja Ze względu na kształt cząsteczki i rozpuszczalność w wodzie białka dzieli się na: globularne o współczynnikach osiowych 3-4, a więc w przybliŝeniu kuliste, dobrze rozp. w wodzie, fibrylarne o współczynnikach osiowych > 10 (kształt wydłuŝony), nierozpuszczalne w wodzie. Ze względu na stan skupienia dzieli się białka na: stałe (kolagen, elastyna), półpłynne (cytoplazmatyczne) oraz płynne (białka osocza). Ze względu na budowę cząsteczki obecność dodatkowych składników na: białka proste (proteiny) zbudowane wyłącznie z aa i nie posiadające dodatkowych elementów, m. in.: albuminy, globuliny, histony, protaminy, skleroproteiny, białka złoŝone (proteidy) zawierające dodatkowe składniki niebiałkowe, np. cząsteczki węglowodanów (glikoproteiny), lipidów (lipoproteiny), resztę kwasu fosforowego (fosfoproteiny), atom metalu (metaloproteiny), cząsteczkę barwnika (chromoproteiny) lub związane z kwasem nukleinowym (nukleoproteiny). Ze względu na pełnione w organizmie funkcje: enzymatyczne np. dehydrogenaza mleczanowa (LDH), transaminaza asparaginianowa (AspAT), cyklooksygenaza (COX), hormonalne np. hormony przedniego płata przysadki (GH, PRL, ACTH, TSH, FSH, LH), hormony trzustki (insulina, glukagon), parathormon (PTH), strukturalne np. kolagen, elastyna, keratyna, transportowe np. transferryna, hemoglobina (HGB), ceruloplazmina (CER), transkobalamina (TC), zapasowe np. mioglobina, ferrytyna, odpornościowe np. immunoglobuliny, białka układu dopełniacza (C), białka ostrej fazy, kurczliwe lub pośrednio biorące udział w ruchu np. aktyna, miozyna, tropomiozyna, troponina, toksyny np. tęŝcowa (tetanospazmina i tetanolizyna), botulinowa, toksyna cholery. Białka pokarmowe dzieli się ze względu na przydatność dla organizmu na: pełnowartościowe zawierające aa egzogenne oraz niepełnowartościowe złoŝone z aa endogennych

17 b) identyfikacja Obecność białka w środowisku moŝna wykazać za pomocą kilku reakcji: Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos Ŝółty, proteina białko) polega na działaniu na próbę stęŝonym kwasem azotowym (HNO 3 ). JeŜeli w próbie tej znajduje się białko zawierające aa aromatyczne, to ulegną one reakcji nitrowania, dając produkty dysocjujące do Ŝółto-pomarańczowego anionu, np.: Tyr + HNO 3 T, -H 2 O 3-nitrozotyrozyna Reakcja biuretowa bierze swoją nazwę od biuretu (dwumocznika: H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ) najprostszego związku dającego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecności wiązania peptydowego, począwszy od trójpeptydów wzwyŝ. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CuSO 4 ). JeŜeli w próbie znajduje się związek zawierający dwa sąsiadujące wiązania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) połączenie kompleksowe o intensywnie fioletowym zabarwieniu. NaleŜy jednak zaznaczyć, iŝ pozytywne miano nie potwierdza obecności w próbie związków aminokwasowych. Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie białek zawierających wiązania dwusiaczkowe (S-S). Przeprowadza się ją w środowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli ołowiu, np. octanu. Pod wpływem wysokiego ph następuje rozpad wspomnianych wiązań z uwolnieniem anionu wodorosiarczkowego: Cys-S-S-Cys + H 2 O + OH - 2 CH 3 COCOOH + 2 NH 3 + HS - + S, który łączy się z kationem ołowiu, prowadząc do strącenia czarnego osadu siarczku ołowiu: Pb(CH 3 COO) 2 + HS - CH 3 COOH + CH 3 COO - + PbS. c) poziomy organizacji i fałdowanie Białka naleŝą do najbardziej złoŝonych związków chemicznych występujących w przyrodzie. Ich budowa wykazuje pewne poziomy organizacji, stąd dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojęcie struktury I, II, III i IV-rzędowej. Metody laboratoryjne określania kolejnych struktur nieznanych białek opisane zostaną dalej. Przez strukturę I-rzędową rozumiemy liczbę, budowę i kolejność (sekwencję) połączonych ze sobą reszt aa tworzących dane białko, wraz ze wskazaniem miejsc występowania wiązań dwusiarczkowych (S-S). Struktura I-rzędowa opisuje więc konfigurację peptydu. Przez konfigurację rozumiemy powiązania geometryczne między danym zbiorem atomów, których zmiana wiąŝe się z zerwaniem i ponownym uformowaniem wiązań kowalencyjnych. Struktura II-rzędowa określa sposób skręcenia łańcucha polipeptydowego, czyli jego konformację. Konformacja to trójwymiarowa architektura cząsteczki, inaczej przestrzenne powiązania między atomami; moŝe ona ulec zmianie przez reorganizację stabilizujących ją wiązań niekowalencyjnych (wiązania kowalencyjne zostają zachowane por. wyŝej). Cząsteczka białka o określonej konfiguracji (strukturze I-rz.), wobec moŝliwości swobodnej rotacji wokół duŝej części (ok. 2/3) wiązań głównego łańcucha polipeptydowego, moŝe posiadać nieproporcjonalnie duŝą liczbę moŝliwych konformacji, choć zwykle tylko niektóre z nich umoŝliwiają cząsteczce pełnienie funkcji biologicznych. Liczba ta ograniczona jest częściowo podwójnym charakterem wiązania peptydowego, jak równieŝ rodzajem i kształtem grup bocznych (R) aa. Kąty rotacji φ i ψ muszą więc przyjmować takie kombinacje wartości, aby wykluczyć przestrzenne konflikty między poszczególnymi atomami cząsteczki, a ich znajomość pozwala na jednoznaczne określenie konformacji wszystkich atomów gł. łańcucha polipeptydowego. Dozwolone wartości obejmują konformacje regularne α-helisę, β-kartkę, zwrot β, superhelisę kolagenu oraz nieregularne pętle i zwoje. Ogólnie rzecz biorąc, kaŝda helisa (zwój) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skręcający się równomiernie wokół kaŝdego atomu Cα. Istnieją róŝne typy helis, róŝniące się między sobą rozmiarami i kierunkiem skrętu. Budowę helisy opisuje się więc przez podanie: liczby reszt aa przypadających na jeden skręt (n) oraz skoku śruby (p) lub odległości między sąsiednimi skrętami. Helisy polipeptydowe zabudowane z aa chiralnych są równieŝ chiralne, tzn. prawo- bądź lewoskrętne, przy czym w naturalnych białkach występują niemal wyłącznie te pierwsze. Taki kierunek skrętu zdeterminowany jest przez fakt budowy cząsteczki z enancjomerów L: w wyniku przyciągania się atomów wiązania peptydowego lŝejsza grupa N-H zbliŝa się w stronę cięŝszej grupy C-O właśnie w prawo. α-helisa cechuje się korzystnymi wartościami kątów rotacji oraz układem stabilizujących wiązań wodorowych. Zawiera zazwyczaj 4 50 (śr. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm. RównowaŜne atomy z sąsiednich reszt łańcucha głównego oddalone są o 0,15 nm (mierzone wzdłuŝ osi). Grupy R skierowane są na zewnątrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. We wnętrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dzięki maksymalnej liczbie wiązań wodorowych jest to konformacja o najniŝszej energii i tym samym największej stabilności, dlatego formuje się ona

18 spontanicznie. Wiązania wodorowe występują między atomem N wiązania peptydowego oraz atomem O wchodzącym w skład czwartego kolejnego wiązania peptydowego tego samego łańcucha (wiązania wewnątrzłańcuchowe); mają one optymalną odległość 0,28 nm. Dodatkową funkcję pełnią wiązania van der Waalsa (por. dalej), zwłaszcza działające poprzecznie do osi helisy, pomiędzy ciasno upakowanymi atomami jej rdzenia. Jedynie peptydowy atom N proliny nie moŝe uformować wiązania wodorowego, dlatego aa ten pasuje jedynie do 1. obrotu helisy w innym miejscu wytwarza on zgięcie. α-helisy występują zwykle na powierzchni cząsteczek białek, chociaŝ mogą być równieŝ częściowo lub całkowicie schowane w ich wnętrzu. Szczególny przypadek stanowią helisy amfipatyczne, w których aa polarne i niepolarne zmieniają się ze sobą co 3 4 reszty w ten sposób mogą one kontaktować się ze środowiskiem polarnym z jednej strony, a z niepolarnym z drugiej. Helisy amfipatyczne występują m. in. w: lipoproteinach osocza, hormonach, toksynach, antybiotykach, glikoproteinach wirusa HIV oraz w kinazie białkowej regulowanej kalmoduliną. Struktura β nazywana jest inaczej β-kartką, β-harmonijką lub pofałdowanym arkuszem. Nazwy te odnoszą się do jej kształtu, obserwowanego wzdłuŝ krawędzi Cα i związane z nimi R występują naprzemiennie nieco powyŝej i poniŝej płaszczyzny głównego łańcucha polipeptydowegom który jest niemal w pełni rozciągnięty. β-kartka posiada powtarzające się co do wartości kąty φ i ψ oraz jest stabilizowana maksymalną ilością wiązań wodorowych. Te jednak, w przeciwieństwie do α-helisy, mają charakter międzyłańcuchowy występują między atomami N i O wiązań peptydowych sąsiadujących pasm łańcuchów peptydowych; w ich tworzenie zaangaŝowane są odcinki o długości 5 10 aa z róŝnych regionów struktury I-rz. Struktury β mogą być równoległe lub antyrównoległe (przeciwrównoległe, przeciwbieŝne); w pierwszym przypadku sąsiednie łańcuchy peptydowe biegną w tym samym kierunku, w drugim zaś w przeciwnym. Z wyjątkiem pasm granicznych tworzą się wszystkie moŝliwe wiązania wodorowe. W strukturze antyrównoległej pary wiązań wodorowych występują na przemian raz blisko, a raz daleko od siebie, a zorientowane są mniej więcej prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Z kolei w strukturze równoległej wiązania wodorowe są rozmieszczone równomiernie, ale leŝą względem siebie ukośnie i w zmiennych kierunkach. Powszechne są regiony połączenia struktur równoległych i antyrównoległych, wiele łańcuchów moŝe teŝ występować w obrębie jednej kartki (chociaŝ struktury równoległe złoŝone z < 5 łańcuchów są nieco mniej stabilne i przez to rzadko spotykane). Niemal wszystkie pasma harmonijki β są zwinięte prawoskrętnie, tworząc centralny rdzeń wielu białek globularnych. Zwrot β (zagięcie β, β-skręt) to układ umoŝliwiający zmianę kierunku przebiegu struktury β, często łączący końce dwóch przyległych pasm antyrównoległych. Zwrot β umoŝliwiający zmianę kierunku łańcucha o 180 o składa się z 4 aa, z czego pierwszy tworzy wiązania wodorowe z czwartym. Ponadto często zawiera glicynę z powodu niewielkiego rozmiaru oraz prolinę gdyŝ ok. 6 % jej wiązań peptydowych posiada konfigurację cis. Jest to struktura regularna, często obecna na powierzchni białek. W typowym białku globularnym jedynie ok. połowa aa wchodzi w skład struktur α i β, podczas gdy reszta występuje w postaci struktur nieregularnych, tj. pętli i zwojów. Szczególnie dotyczy to obu końców (N i C) oraz reszt R lizyny. Obszary pętli warunkują głównie właściwości powierzchni cząsteczek białek. Bezładna struktura wiąŝe się z giętkością i łatwością dopasowania, przy czym wiele obszarów bezładnych ulega organizacji pod wpływem specyficznych ligandów; z tego powodu regiony nieregularne często występują w miejscach interakcji cząsteczek białek z innymi cząsteczkami (ligandami), np. w centrach katalitycznych enzymów, czy na powierzchni białek odpornościowych, gdzie kształtują obszary oddziaływania przeciwciała z antygenem. Pętle o kształcie spinki do włosów spinają sąsiadujące antyrównoległe struktury β. Struktury II-rz. mogą tworzyć motywy naddrugorządowe, np. klucz grecki pojedynczy i podwójny, motyw βαβ czy β-spinkę (antyrównoległe pasma β zespolone krótką pętlą). Struktura III-rz. określa przestrzenne powiązania między elementami struktury II-rz. (helisami, kartkami, innymi), jak równieŝ wzajemne oddziaływania między domenami, sposoby fałdowania oraz oddziaływania stabilizujące takie ułoŝenie. Struktura III-rz. stabilizowana jest przez róŝnorodne rodzaje wiązań niekowalencyjnych: wiązania wodorowe wytwarzane przez polarne R aa oddziaływania hydrofobowe występują pomiędzy niepolarnymi R aa oddziaływania elektrostatyczne ( mostki solne ) tworzą się między przeciwnie naładowanymi grupami, np. końcami N i C peptydów bądź R polarnymi jonizującymi (np. Lys i Asp) siły van der Waalsa są bardzo słabe i działają jedynie na niewielkie odległości, równe sumie promieni van der Waalsa atomów pomiędzy którymi występują Białka mogą być dodatkowo stabilizowane kowalencyjnymi wiązaniami dwusiarczkowymi (S-S); rozwiązanie takie występuje w niektórych enzymach (np. rybonukleaza), hormonach (np. insulina) czy białkach strukturalnych (keratyna)

19 Struktury II-rz. i motywy naddrugorzędowe, zwłaszcza w duŝych białkach, mogą być zorganizowane w połączone ze sobą fragmenty, zwane domenami. Domena to lokalna, zwarta, globularna, potencjalnie niezaleŝne jednostka fałdowania białka, związana z nim jednak wiązaniami kowalencyjnymi. Domena reprezentuje zwarty genetycznie segment, np. domeny w Ig, dehydrogenazach czy globinach; ponadto interesujące jest, iŝ sekwencje aa charakterystyczne dla danej domeny moŝna spotkać w innych, podobnych domenach tego samego białka lub w innych białkach. Domeny często nadają białkom w których występują zdolność pełnienia specyficznych funkcji, np. wiązania swoistych ligandów (nukleotydów, polisacharydów). Przestrzeń między domenami wyznacza często centrum aktywne białka, a powierzchnia kontaktu między nimi jest miejscem przenoszenia mechanizmów allosterycznych. Zaburzenia struktury II/III-rz. białek stanowią istotę chorób prionowych (TSE) zmiany w konformacji białek powodują zastąpienie α-helisy przez β-kartkę oraz wystąpienie oporności na proteolizę enzymatyczną. Struktura IV-rz. określona jest w przypadku białek oligomerycznych, tj. złoŝonych z 2 łańcuchów polipeptydowych zwanych protomerami lub podjednostkami połączonych siłami niekowalencyjnymi. Opisuje ona sposób ułoŝenia w przestrzeni kilku wzajemnie ze sobą oddziaływujących łańcuchów. Cechuje się ponadto największą złoŝonością, a zarazem jest najsłabiej poznana. Ze względu na liczbę podjednostek wyróŝniamy odpowiednio di-, tri-, tetramery itd. Homooligomery składają się z kilku identycznych podjednostek, podczas gdy heterooligomery z róŝnych; róŝne protomery białek heterooligomerycznych pełnią zazwyczaj specyficzne funkcje, np. katalityczne, regulacyjne czy rozpoznające ligandy. Właściwości chemiczno-biologiczne białek podjednostkowych zaleŝą od przestrzennej orientacji ich podjednostek. W odpowiednich warunkach moŝna pozbawić białko struktur wyŝszych rzędów. Denaturacja polega na zniszczeniu wiązań niekowalencyjnych białka, a tym samym na trwałej utracie jego struktury II, III i IV-rz. oraz aktywności biologicznej. Do denaturacji dochodzi pod wpływem tzw. czynników denaturujących, do których zaliczamy: wysoką temperaturę, silnie polarne (kwaśne lub zasadowe) środowisko oraz określone substancje: alkohol, formalina, rozpuszczalne sole metali cięŝkich (głównie ołowiu, rtęci i srebra), SDS. W przeciwieństwie do denaturacji, koagulacja (wysolenie) polega na odwracalnej utracie postaci białka pod wpływem działania soli metali lekkich, np. NaCl, NH 4 Cl. Sole te, dzięki właściwościom higroskopijnym, wiąŝą i pozbawiają białko pewnej ilości wody, wskutek czego naturalny półpłynny zol białkowy zmienia postać na półstały Ŝel. Dodanie do skoagulowanego białka wody powoduje przywrócenie mu pierwotnej konsystencji, co nazywa się peptyzacją. Natywne białka nie mają postaci prostych łańcuchów, lecz są w skomplikowany sposób zwinięte lub inaczej mówiąc sfałdowane. Fałdowanie białek nie odbywa się na drodze prób i błędów, o czym świadczy chociaŝby paradoks Levinthala czas przypadkowego poszukiwania odpowiedniej struktury sfałdowania nawet w przypadku niewielkiego peptydu byłby teoretycznie dłuŝszy niŝ szacowany wiek wszechświata. Oczywiste jest zatem, iŝ fałdowanie białek to nieprzypadkowy i wysoce zorganizowany proces. Proces fałdowania składa się z kilku faz: formowania krótkich fragmentów struktury i ich wzrostu uformowania domen (w białkach wielodomenowych połączonych w tzw. stopioną globulę) zmian konformacyjnych nadających strukturę III-rz. osiągnięcia natywnej struktury (na tym kończy się fałdowanie białek monomerycznych) ew. łączenia podjednostek i formowania oligomerów. Łańcuchy polipeptydowe wielu zdenaturowanych białek spontanicznie (bez zewnętrznej interwencji, same z siebie ) zwijają się powtórnie w warunkach in vitro, łącznie z przywróceniem aktywności biologicznej, choć trwa to o wiele dłuŝej niŝ w warunkach in vivo; zjawisko to określa się mianem renaturacji. In vivo procesy fałdowania przebiegają o wiele szybciej i są wyraźnie ukierunkowane, m. in. dzięki obecności specyficznych enzymów: izomeraza dwusiarczkowa białek (ang. protein disulphide isomerase PDI) ułatwia przetasowanie wiązań dwusiarczkowych (S-S) przez zwiększenie szybkości wzajemnej wymiany mostków S-S, izomeraza peptydylo-prolinowa cis-trans (ang. peptidil-proline isomerase PPI) katalizuje izomeryzację wiązań peptydowych X-Pro z formy trans do cis (przekształceniu ulega ok. 10 % wiązań), chaperony (białka opiekuńcze, m. in. tzw. białka szoku cieplnego ang. heat shock protein = Hsp) przyspieszają proces fałdowania przez zapewnienie białku ochronnego środowiska oraz preferencje przemian powstrzymujących niewłaściwe interakcje między powierzchniami komplementarnymi i ułatwiających właściwe interakcje

20 d) rozdział i określanie struktury białek Aby móc badać strukturę białek, naleŝy je wpierw wyizolować w stanie czystym, tzn. pozbawić zanieczyszczeń i oddzielić od innych białek. Do najczęściej stosowanych technik oczyszczania i izolacji białek naleŝą: Chromatografia jonowymienna i HVE stosowane są do aa i polipeptydów; podstawą rozdziału jest ładunek elektryczny. Filtracja Ŝelowa z uŝyciem wysokich stęŝeń (1-4M) kwasu mrówkowego lub octowego stosowana do wielkocząsteczkowych hydrofobowych peptydów; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie i wymywanie peptydów z porów sita molekularnego (Sephadex). HPLC w odwróconym układzie faz (niepolarny nośnik + polarny rozpuszczalnik) stosowana j.w., czasem w połączeniu z poprzednio omówiona metodą do oczyszczania złoŝonych mieszanin peptydów, otrzymywanych przez częściowe trawienie białek. HVE na sitach molekularnych (sączenie molekularne) technicznie przeprowadza się na skrobii, agarozie lub Ŝelu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje się do polipeptydów i polinukleotydów. Próbkę w buforze nanosi się na płytkę lub do rurki, rozdziela elektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje peptydy błękitem brylantowym Coomassie lub solami srebra, zaś polinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje się odmianę tej metody w warunkach denaturujących (mocznik, SDS) łańcuch peptydowy ulega wówczas rozprostowaniu, dodatkowo wiąŝąc na powierzchni ładunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkości (właściwie do ilości wiązań peptydowych), więc rozdział elektroforetyczny opiera się tu pośrednio na masie cząsteczkowej. Metodę PAGE-SDS stosuje się więc do określania masy cząsteczkowe białek przez porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwościami wzorców o znanych masach. Po uzyskaniu czystego białka moŝna przystąpić do stopniowego określania jego struktury. Wiele białek składa się z 2 łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki dwusiarczkowe, które muszą być rozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwór badanego białka traktuje się czynnikami denaturującymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), które rozbijają wiązania wodorowe i niektóre niekowalencyjne oraz czynnikami redukującymi lub utleniającymi, które pozbawiają peptydy mostków dwusiarczkowych czynniki utleniające, np. kwas nadmrówkowy (HCOOOH), utleniają reszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SO 3 - ), natomiast czynniki redukujące, np. 2-merkaptoetanol, redukują je do cysteiny (Cys-SH). Polipeptydy wielkocząsteczkowe rozbija się, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o długości aa. Do tego celu uŝywa się następujących odczynników (w nawiasach podano rodzaj rozbijanego wiązania): bromocyjan CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X), hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), łagodna hydroliza kwaśna (Asp-Pro). Przed rozpoczęciem sekwencjonowania białka określa się jego skład aminokwasowy poprzez poddanie go kwaśnej hydrolizie (6M HCl, 11 oc, 1-4 doby), a następnie rozdzielenie i identyfikację wolnych aa metodą HPLC, chromatografii jonowymiennej bądź elektroforetyczną. Wadą takiego postępowania jest zniszczenie struktury wielu aa przez agresywne środowisko całkowicie niszczone są Trp i Cys, częściowo Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wiązania Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazują oporność na ten rodzaj hydrolizy. Aby tego uniknąć, wykonuje się kilka zabiegów: Cys utlenia się do kwasu cysteinowego opornego na działanie kwaśnego środowiska, obecność Trp oznacza się po hydrolizie zasadowej (która za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys), określa się tempo spadku poziomów Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje się do czasu 0, obecność aa rozgałęzionych oznacza się po 96 h hydrolizy, obecność aa kwaśnych oraz ich amidów określa się łącznie jako Glx (Glu + Gln) i Asx (Asp + Asn). Po określeniu procentowego udziału poszczególnych aa w budowie badanego białka, moŝna przystąpić do jego sekwencjonowania, czyli określenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod: Najstarsze metody sekwencjnowania opierają się na przeprowadzeniu N-końcowego aa peptydu w określoną pochodną, hydrolizę peptydu oraz identyfikację powstałej pochodnej aa. Taka jest m. in. idea metody Sangera uŝywa się w niej odczynnika Sangera DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzenu), który reaguje wyłącznie z N-końcowymi resztami aa, po czym prowadzi się hydrolizę i identyfikację. Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikację N-końcowych reszt aa peptydów w postaci pochodnych. Wykorzystuje się tu odczynnik Edmana fenyloizotiocyjanian, który reagując z końcem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy, który w środowisku kwaśnym i obecności niehydroksylowych rozpuszczalników (np. nitrometanu) rozpada się na fenylotiohydantoinową pochodną aa oraz peptyd skrócony o jeden N-końcowy aa. W przeciwieństwie do metody Sangera, po usunięciu N-końcowego aa peptyd pozostaje niezmieniony