(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPPLITA PLKA (12) TŁUMACZEIE PATETU EURPEJKIEG (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2009/41 EP B1 (13) T3 (1) Int. Cl. A61K31/3 A61K31/67 A61K31/18 A61P2/28 ( ) ( ) ( ) ( ) (4) Tytuł wynalazku: Zastosowanie o-atp lub BBG, antagonistów P2X7, do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego (30) Pierwszeństwo: E (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/19 (4) złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 03/20 (73) Uprawniony z patentu: UIVERIDAD DEL PAI VAC-EUKAL ERRIK UIBERITATEA, Leioa, E (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 MATUTE ALMAU Carlos, LEIA, E ALBERDI ALF Elena, GETX, E DMERCQ GARCIA Maria, BILBA, E PEREZ AMARTI Alberto, PELAA, E PEREZ CERDA Fernando, BILBA, E TRRE MARTIEZ Iratxe, AMURRI, E ACEZ GMEZ Maria Victoria, GETX, E (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol p. z o.o. rzecz. pat. Kiciak Krzysztof Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. przeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 pis wynalazku DZIEDZIA WYALAZKU [0001] iniejszy wynalazek dotyczy dziedziny stwardnienia rozsianego, jak również zastosowania substancji antagonistycznych wobec receptorów P2X7 obecnych w oligodendrocytach, do leczenia wspomnianych chorób, a także kompozycji, które mogą zawierać wspomniane antagonisty. TŁ WYALAZKU [0002] twardnienie rozsiane (M) stanowi najbardziej powszechną chorobę demielinującą układu nerwowego. a świecie dotyka ona półtora miliona ludzi, zaś jej objawy pojawiają się ogólnie u młodych dorosłych, a zatem jej następstwa są bardzo poważne zarówno w aspektach osobistych, jak i ekonomiczno-społecznych. [0003] Uważa się, że podatność na M jest skutkiem nieznanych czynników genetycznych i środowiskowych. Częstość występowania choroby leży między 0 a 0 osób na 0000 mieszkańców obszarów wysokiego ryzyka, które są zlokalizowane głównie w północnej części półkuli północnej, w Europie i Ameryce. Ryzyko zapadnięcia na M jest zwiększone -20-krotnie u krewnych w pierwszym stopniu pokrewieństwa pacjentów, a współwystępowanie między bliźniakami jednojajowymi (jednakowymi genetycznie) jest zwiększone o 30%-0%, zaś u bliźniaków dwujajowych wzrasta tylko do 2%-%. Podatność genetyczna nie jest scharakteryzowana. Dotychczas zebrane dowody mogą świadczyć, że polega ona na jakimś polimorfizmie genów, które kodują ludzkie antygeny leukocytów (LA), glikoproteinę mieliny oligodendrocytów (MG), oraz innych genów z chromosomów i 1. [0004] Badacze M zgadzają się co do tego, że ma ono dwie fazy, początkową fazę zapalną o naturze autoimmunologicznej, i drugą fazę postępującego zwyrodnienia nerwów. W pierwszej aktywowane limfocyty T przekraczają barierę krew-mózg, a kiedy już znajdą się w ośrodkowym układzie nerwowym, uwalniają cytokiny prozapalne, które wyzwalają kaskadę immunologiczną, która kończy się zniszczeniem mieliny i śmiercią oligodendrocytów. Wiedza o pewnych szczegółach procesu autoimmunologicznego stała się przydatna do opracowania środków o charakterze immunomodulacyjnym, których skuteczności terapeutyczne są bardzo skromne. ie stworzono jednak leku, który opóźniałby lub zatrzymywałby postęp fazy zwyrodnienia nerwów tej choroby, która podąża drogą postępującego pogorszenia stanu neurologicznego i utraty czynności, a którą cechuje pojawienie się ciężkich demielinujących zmian chorobowych w substancji białej z masową utratą oligodendrocytów, atrofią i ciężkim uszkodzeniem aksonów. Dotychczas opisano różne cele dla interwencji podczas fazy zapalnej stwardnienia rozsianego (Zamvil i teinman, 2003, euron 38, ). Między nimi znajdują się te, które są skierowane na zmniejszenia zapalenia układu nerwowego, rozpoczynanego przez aktywację leukocytów T swoistych wobec mieliny, które sprzyjają reakcji autoimmunologicznej szczególnie przeciwko składnikom mieliny, wnikają do tkanku ośrodkowego układu nerwowego i są uwalniane w cytokinach prozapalnych, takich jak interferon γ i czynnik martwicy nowotworów α. Immunomodulator interferon β, zatwierdzony do leczenia hamującego-nawracającego stwardnienia rozsianego, zapobiega także oddziaływaniom komórkowym, 1

3 które prowadzą do wnikania aktywowanych limfocytów T przez śródbłonek naczyń. Inne sposoby leczenia w fazie testów klinicznych skierowane są na zatrzymanie aktywności cytokin prozapalnych i/lub przyspieszenie aktywności cytokin przeciwzapalnych. iedawne badanie (Youssef i in., 2002, ature 420, 78-84) wykazało, że lek atorwastatyna, stosowany do leczenia hipercholesterolemii, stanowi także mocny immunomodulator, który zapobiega lub cofa przewlekłe doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) drogą zwiększania wydzielania cytokin przeciwzapalnych i hamowania wytwarzania cytokin prozapalnych. Receptory purynergiczne stanowią typ receptora błonowego aktywowany przez puryny pozakomórkowe, takie jak ADP i ATP, i który pośredniczy w różnych działaniach biologicznych, takich jak modulacja aktywności neuronalnej, uwalnianie neurotransmiterów, glikogenoliza, kurczliwość ścian naczyniowych, albo pewne procesy immunologiczne, itp. Receptory purynergiczne klasyfikuje się w dwóch dużych grupach o nazwach P1, dla których aktywacja zachodzi za pośrednictwem adenozyny, oraz P2, dla których ligandami endogennymi są puryny ATP i ADP oraz pirymidyny UTP i UDP. Receptory P1 przekazują sygnał do wnętrza komórki przez białka G, i zależnie od ich charakteru cząsteczkowego, biochemicznego lub farmakologicznego dzielone są na cztery podgrupy: A1, A2A, A2B i A3. Z kolei P2 dzielone są na jonotropowe (P2X) i metabotropowe (P2Y) (Barnard i in., 1997; Ralevic i Burnstock, 1998). [000] W ostatnich latach wykazano, że receptory purynergiczne, poza udziałem w przekazywaniu sygnałów typowych dla neurotransmisji, pośredniczą także w działaniu na komórki glejowe (Rathbone i in., 1999). W rzeczywistości, wyrażanie receptorów purynergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym nie jest ograniczone tylko do neuronów, ale także obejmuje glej (Dunn i in., 2001; Franke i in., 2001a; tevens i in., 2002). W szczególności, przekazywanie sygnałów purynergicznych w astrocytach i mikrogleju działa jako środek komunikacji glej-glej i glej-neuron (Fields i tevens, 2000). Także niektóre bardzo niedawne badania wykazują obecność receptorów funkcyjnych w oligodendrocytach in vitro (tevens i in., 2002), co wskazuje na odpowiedni udział w funkcjach typowych dla tego typu komórek. W szczególności, tevens i in. (2002) pokazują, że adenozyna uwalniania z aksonów wskutek aktywności elektrycznej hamuje proliferację prekursorów gleju skąpodrzewiastego, stymuluje ich różnicowanie i sprzyja tworzeniu mieliny. [0006] Przekazywanie sygnału przez receptory purynergiczne jest także ważna dla żywotności komórek w odpowiedzi na procesy patologiczne w mózgu (przegląd w publikacji Abbracchio i Burnstock, 1998). Tak więc, są one zaangażowane w odpowiedzi glejowej na uszkodzenie nerwu (Franks i in., 2001b; James i Butt, 2001), i w odpowiedzi naprawy ośrodkowego układu nerwowego przy pomocy wytwarzania czynników trofowych w astrocytach (Ciccarelli i in., 2001). Z kolei, obecność ektonukleotydaz, które rozkładają ATP na adenozynę, stanowi element ochrony nerwów w niedokrwieniu (Braun i in., 1998), podczas gdy ATP powoduje śmierć komórek glejowych (onda i Kohsaka, 2001). [0007] Wiedza o zaangażowaniu układu purynergicznego w stwardnieniu rozsianym jest bardzo ograniczona. Te informacje wskazują, że istnieją zmiany aktywności '-nukleotydazy, enzymu, który rozkłada ATP na adenozynę. Ta aktywność jest wyższa w hodowanych przez kilka dni komórkach jednojądrzastych krwi u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (Armstrong i in., 1988). Z kolei obszary ośrodkowego układu nerwowego, gdzie powstają zmiany chorobowe typowe dla stwardnienia rozsianego, 2

4 mają niższą aktywność nukleotydazy (Ansari i in., 1978), co może dawać wyższe stężenia ATP pozakomórkowego i zwiększoną aktywację receptorów purynergicznych P2. [0008] owość niniejszego wynalazku polega na dokonanym przez część twórców odkryciu, że podawanie określonej ilości pewnych antagonistów receptorów P2X7, wybranych spośród BBG lub utlenionego ATP (dalej o-atp), selektywnego inhibitora receptorów P2X7, powoduje ustępowanie objawów choroby. TREZCZEIE WYALAZKU [0009] Problem do rozwiązania przez niniejszy wynalazek stanowi otrzymanie szeregu związków do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego [00] Rozwiązanie przedstawione w niniejszym dokumencie opiera się na zdolności receptorów purynergicznych P2X7 do zatrzymywania rozwoju wyżej wymienionej choroby w badaniach in vivo jak również in vitro. Wynalazek jest zilustrowany w przykładzie, gdzie opisano przeprowadzone przez twórców badania, w których z jednej strony wykazano, że oligodendrocyty w hodowlach wyrażają na swojej powierzchni receptory P2X7, a z drugiej, że ich aktywacja przy użyciu ATP powoduje wzrost stężenia wapnia w cytosolu i, jeżeli stymulacja jest przedłużana, na koniec powoduje śmierć komórek. Podobnie, opisano badania, w których wykazano w modelach in vivo i in vitro stwardnienia rozsianego, że leczenie antagonistami receptorów purynergicznych P2X7 spowalnia rozwój choroby. Zatem, jeden aspekt wynalazku odnosi się do zastosowania antagonistów receptorów P2X7, wybranych spośród BBG lub o-atp, do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego. ZWIĘZŁY PI FIGUR [0011] Figura 1 pokazuje właściwości elektrofizjologiczne receptorów P2X w hodowanych oligodendrocytach. Aktywacja wyżej wymienionych receptorów daje prąd wejściowy, który może zostać zwiększony pod nieobecność jonów dwuwartościowych. Krzywe dawka-odpowiedź dla naturalnego antygenu endogennego, ATP, oraz jego analogów, takich jak BzATP, wskazują, że właściwości odpowiedzi są podobne do właściwości odpowiedzi rekombinowanych receptorów P2X7 wyrażanych w układach heterologicznych. Figura 2 pokazuje, że zarówno ATP jak i BzATP dają podwyższony wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego, któremu zapobiega obecność PPAD, antagonisty P2X i P2Y o szerokim zakresie działania, a także eliminowanie wapnia ze środowiska pozakomórkowego. Widać też, że odpowiedzi zwiększają się w obecności propofolu i są hamowane przez o-atp, selektywnego antagonistę receptorów P2X7. Figura 3 pokazuje, że stosowanie ATP lub BzATP przez 1 minut powoduje śmierć oligodendrocytów w hodowli. Śmierć zależy od wapnia, gdyż jego eliminacja z pożywek hodowlanych prowadzi do niewywoływania jej. Antagonista o szerokim zakresie działania, PPAD, ma zdolność zapobiegania jej, jeżeli jest podawany jednocześnie z agonistami. 3

5 Figura 4 pokazuje, że przy pomocy selektywnego antagonisty P2X7, o-atp, można zapobiec śmierci gleju skąpodrzewiastego powodowanej przez ATP. Figura pokazuje wyrażanie in situ receptorów P2X w oligodendrocytach nerwu wzrokowego przy pomocy technik immunohistochemicznych stosujących przeciwciała swoiste. Zaobserwowano, że receptory P2X2, P2X4 i P2X7 (zielone) występują bardzo obficie w oligodendrocytach (czerwonych) nerwu wzrokowego. Barwa żółta wskazuje zachodzenie obu barw na siebie, a więc wyżej wymienione receptory są obficie wyrażane w oligodendrocytach. W taki sam sposób jasne jest, że nie są one wyrażane bardzo licznie w astrocytach. Figura 6 pokazuje jak powolny wlew (1 μl/godzinę) BzATP (0 mm) powoduje zmiany chorobowe w nerwie wzrokowym, w którym można zauważyć uszkodzenie tkanki z astroglejozą i mikroglejozą, jak również zanik mieliny w uszkodzonym obszarze i rozpadanie się aksonów. Figura 7 pokazuje, że szczury, u których indukowano EAE, mają ciężkie objawy neurologiczne, które obejmują porażenie kończyn, a nawet śmierć. Jednak leczenie przy użyciu o-atp przed wystąpieniem objawów powoduje niemal całkowity zanik objawów. 1 Figura 8 pokazuje jak po dwunastu dniach od wywołania EAE, podawanie o-atp powoduje zniknięcie objawów neurologicznych powodowanych przez chorobę. Figura 9 pokazuje, że przy EAE nie zmieniają się znacznie poziomy receptorów P2X2, jednak drastycznie spadają poziomy receptorów P2X7. Wskazuje to, że następuje utrata komórek, które je wyrażają, głównie oligodendrocytów ZCZEGÓŁWY PI WYALAZKU [0012] Pierwszy aspekt wynalazku odnosi się do zastosowania antagonistów receptorów purynergicznych P2X7 do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego. Autoimmunizacja wymaga aktywacji precyzyjnej kaskady procesów w komórkach układu immunologicznego. Jedna część tych komórek, makrofagi i limfocyty, wyraża receptory P2X1, P2X2, P2X i P2X7, i aktywacja tych ostatnich powoduje uwalnianie cytokin prozapalnych takich jak czynnik martwicy nowotworów α (TF-α) oraz IL-1β, jak również apoptozę przez mechanizmy, które wciąż nie zostały scharakteryzowane (Burnstock, 2002, Arteriorscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, ). Jednak dokładne funkcje, w których pośredniczą receptory P2X w układzie immunologicznym, wciąż nie są dobrze zrozumiane. Właśnie to wyrażanie receptorów P2X w komórkach układu immunologicznego sprawia, że zastosowanie antagonistów receptorów P2X jest przydatne do leczenia chorób autoimmunologicznych. [0013] Wśród antagonistów receptorów P2X są takie, które nazywa się antagonistami o szerokim zakresie działania dzięki faktowi, że mogą się one wiązać do kilku różnych spośród rodziny receptorów P2X, chociaż przy różnych powinowactwach wobec każdego z nich; oraz inne, które są selektywne wobec grupy receptorów z rodziny P2X. 3 [0014] astępujące wzory przedstawiają niektóre z tych antagonistów receptorów P2X o szerokim zakresie działania. Tylko związki o wzorze VII i IX stanowią część niniejszego wynalazku. 4

6 Me C P 3 a 2 a 3 a (I) C Me P 3 a 2 a a 3 (II) a 3 a a 3 a Me Me a 3 a (III) a Me a 3 2 Me 2 a a (IV)

7 a 3 a a 3 a a a (V) a 3 a 3 a a 3 a a (VI) C 2 C 3 C 2 - C 3 C C 3 C 3 C 2 C 2 C 2 C 3 a a a a 3 a a 3 a a a (VIII) 6

8 [001] astępujące wzory przedstawiają selektywne antagonisty receptorów P2X: 2 P P P C 2 CC C C ( xa ) (IX) Me (X) Me C P(a) 2 a a 2 (XI) 7

9 2 Cl (XII) [0016] Związki poprzednio przedstawione wzorami strukturalnymi to: PPAD (sól tetrasodowa kwasu pirydoksalofosforano-6-azofenylo-2',4'-disulfonowego) (I) izoppad (sól tetrasodowa pirydoksalofosforano-6-azofenylo-1',4'-disulfonowego) (II) uramina (sól heksasodowa kwasu 8,8'-[karbonylobis[imino-3,1-fenylenokarbonyloimino(4-metylo-3,1- fenyleno)karbonyloimino]]bisnaftaleno-1,3,-trisulfonowego) (III) błękit Evansa (sól tetrasodowa kwasu 6,6'-[(3,3'-dimetylo[1,1'-bifenylo]-4,4'-diylo)bis[4-amino-- hydroksy-1,3-naftalenodisulfonowego]) (IV) F023 (sól heksasodowa kwasu 8,8'-[karbonylobis[imino-3,1-fenylenokarbonyloimino]bis-1,3,-naftalenotrisulfonowego] (V) F279 [sól heksasodowa kwasu (8,8'-[karbonylobis(imino-4,1-fenylenokarbonyloimino-4,1-fenylenokarbonyloimino))bis(1,3,-naftalenotrisulfonowego] (VI) CBB-G (błękit brylantowy Coomassie G) (VII) F449 (sól oktasodowa kwasu 4,4',4",4"'-(karbonylobis(imino-,1,3-benzenotriilobis(karbonyloimino)))- tetrakis-benzeno-1,3-disulfonowego) (VIII) o-atp (sól sodowa adenozyno--trifosforanu, utleniona nadjodanem) (IX) K-62 (ester kwasu 4-[(2)-2-[(-izochinolinylosulfonylo)metyloamino]-3-okso-3-(4-fenylo-1-piperazynylo)propylo]fenyloizochinolinosulfonowego) (X) PPD (sól tetrasodowa pirydoksalo-'-fosforano-6-(2'-naftylazo-6'-nitro-4',8'-disulfonianu) (XI) RB2 (kwas 1-amino-4-[[4-[[4-chloro-6-[[3 (lub 4)-sulfofenylo]amino]-1,3,-triazyn-2-ylo]amino]-3-sulfofenylo]amino]-9,-dihydro-9,-diokso-2-antracenosulfonowy) (XII) [0017] Poza tymi wymienionymi wcześniej istnieją inne antagonisty o szerokim zakresie działania takie jak MR2220 (cykliczny pirydoksyno-α4,-monofosforano-6-azo-fenylo-2','-disulfonian), Ip1 (sól pentapotasowa P 1,P -diinozyno--pentafosforanu) o TP-ATP (sól mono-litowa 2',3'--2,4,6-trinitrofenyloadenozyno-'-trifosforanu), jak również selektywne, takie jak, na przykład, MA (-(,-heksametyleno)- amiloryd). [0018] IC 0 dla niektórych z powyższych związków w odniesieniu do różnych podgrup receptorów PX2 zestawiono w Tabeli 1. 8

10 Tabela 1- IC 0 antagonistów P2X w odniesieniu do każdego z podtypów receptorów P2X Podtypy P2X P2X1 P2X2 P2X3 P2X4 P2X P2X6 P2X7 Antagonisty: IC 0 (μm) PPAD: 1- PPAD: 2 PPAD: 1 PPAD: 27, PPAD: 2,6 PPAD: > 0 uramina: 1- uramina: 1- uramina: 3 uramina: 178 F023: 0,21 F023: 63 F023: 29 F023: > 0 uramina: 4 uramina: > 0 PPAD: 4,2 uramina: 4 F279: 002 F279: 0,77 F279: 1,6 F279: > 30 F279: 2,8 Błękit Evansa: izoppad: 1- Błękit Evansa: RB-2: 1 Błękit Evansa: izoppad: 1 Ip1: 0,003 Ip1: 3 MR2220: MR2220: 8 F449: 0,01 PPD: 0,01 TP-ATP: 0,001 TP-ATP: 1 F449: <0,006 TP-ATP: 0,001 Błękit Evansa: Błękit Evansa: Błękit Evansa: K-62: 0,01 Błękit Evansa: MA: 4, o-atp BBG: > BBG: 0,01 TP-ATP: 1 TP-ATP: > 30 [0019] W korzystnym wariancie wykonania, jeden z wyżej wymienionych antagonistów stanowi selektywny antagonista receptorów P2X7, o-atp. W badaniach, które przeprowadzili twórcy (patrz przykład dalej), wykazano, że ten związek jest szczególnie przydatny do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego dzięki względnej ważności obecności receptorów P2X7 w oligodendrocytach w porównaniu z innymi receptorami P2X. [0020] Korzystny inhibitor o szerokim zakresie działania stanowi BBG. Korzystny wariant wykonania rozważa kompozycję farmaceutyczną, która zawiera co najmniej o-atp, selektywnego antagonistę receptorów P2X7. [0021] W następującym przykładzie opisano szczegółowo przeprowadzone przez twórców badania, które ilustrują podstawę wynalazku. 9

11 PRZYKŁAD I- PRCEDURY DŚWIADCZALE odowle oligodendrocytów [0022] odowle komórkowe nerwu wzrokowego noworodka szczura (P12) prowadzono zgodnie z ustalonymi procedurami, które dostosowano i wprowadzono do laboratorium zgodnie z niedawnym opisem (Matute i in., 1997, Proc. atl. Acad. ci. UA 94, ). Pomiary elektrofizjologiczne w oligodendrocytach in vitro 1 20 [0023] Pomiary elektrofizjologiczne wykonywano na hodowlach 2- do -dniowych, i zgodnie z zaleceniami podanymi w poprzednich pracach (Patneau i in. 1994, euron 12: ). Komórki mierzono w komorze, która umożliwiała zmienianie środowiska pozakomórkowgo przy pomocy stałego przepływu (0,-1 ml/min). Elektrody rejestrujące stanowiły kapilary szklane, które zawierały określone roztwory zgodne ze stężeniami jonów w cytoplazmie. Badanie odpowiedzi za pośrednictwem receptorów purynergicznych prowadzono techniką "whole-cell plaster-clamp", mierząc prądy wytwarzane przez zewnętrzne nanoszenie selektywnych agonistów i antagonistów wyżej wymienionych receptorów. Pomiar poziomów wapnia w cytosolu w hodowlach oligodendrocytów [0024] tężenie wapnia w cytosolu określano sposobem Grynkiewicza i in. (198; J. Biol. Chem. 260, ). ligodendrocyty traktowano przy użyciu mm Fura-2/AM, a następnie przemywano i obserwowano pod mikroskopem inwersyjnym Zeissa wyposażonym w monochromator, obiektyw imersyjny 40X, wysokorozdzielczą kamerę cyfrową rca, i oprogramowanie AquaCosmos (amamatsu Photonics). Badano zmiany poziomów wapnia w cytosolu w odpowiedzi na agonisty i antagonisty, w obecności i pod nieobecność wapnia pozakomórkowego. Kalibrację przeprowadzono na koniec badań przy pomocy kolejnego nanoszenia jonomycyny i EGTA, i stężenie wapnia szacowano stosując pomiar stosunku dla 340/380 nm. Doświadczenia na wydzielonym nerwie wzrokowym 2 30 [002] d młodych dorosłych szczurów pobierano nerwy, i perfundowano przez 30 min w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (acf) nasyconym tlenem przez barbotowanie 9% tlenu i % C 2, w warunkach porównywalnych do opisanych dla oligodendrocytów w hodowli (Fern i Möller, 2000, J. eurosci. 20:34-42). astępnie inkubowano je z agonistami i antagonistami receptorów purynergicznych na różny okres czasu. Później, nerwy perfundowano przez 1 do 24 godzin przy użyciu normalnego acf nasyconego tlenem. Po upływie tego czasu oceniano uszkodzenie histologicznie, jak twórcy opisali dla in vivo (Matute, 1998, Proc. atl. Acad. ci. UA 9: ), i analizowano zmiany biochemiczne, które leżą u podstaw tego uszkodzenia. Metody immunochemiczne w hodowlach oligodendrocytów, nerwu wzrokowego i tkanki nerwowej zwierząt doświadczalnych 3 [0026] Do badania obecności znaczników linii gleju skąpodrzewiastego, składników mieliny, astrocytów i mikrogleju stosowano handlowe przeciwciała. Techniki obejmowały immunocytochemię, immunohisto-

12 chemię i odbitki immunologiczne (Western blot), które wszystkie są opisane szczegółowo (patrz na przykład, Domercq i in., 1999, Eur. J. eurosci. 11, ) anoszenie substancji na nerw wzrokowy in vivo [0027] Doświadczenia na nerwie wzrokowym przeprowadzono na królikach (rasy nowozelandzki biały) które, dzięki swojej wielkości, pozwalają na lepsze manipulacje w chirurgii doświadczalnej. tosowana była procedura taka jak opisano poprzednio (Matute, 1998, Proc. atl. Acad. ci. 9, ). Agonisty receptorów purynergicznych nanoszono przy użyciu mikropomp osmotycznych, które uwalniały małe ilości substancji rozpuszczonej przez ustalony czas. Później wpływ tego nanoszenia na nerw oceniano przy pomocy zestawu znaczników oligodendrocytów i ich bezpośrednich przodków, mieliny, całości aksonów, astroglejozy i mikroglejozy. Wprowadzenie doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) 1 [0028] Użyto szczurów rasy Lewis, które immunizowano podskórnie zasadowym białkiem mieliny w tylne łapy (0 mikrogramów/zwierzę w 0 mikrolitrach) i adiuwantem Freunda z, mg/ml mykobakterii gruźlicy 37Ra. Rdzeń kręgowy ekstrahowano, gdy zwierzęta miały objawy choroby (12-14 dni po immunizacji) i przy użyciu technik immunochemicznych (immunoblot i immunohistochemicznych) analizowano wyrażanie receptorów purynergicznych. II- WYIKI Charakterystyka prądów przy udziale receptorów P2X w oligodendrocytach [0029] ATP (1 mm) indukuje prąd wejściowy, który nie ulega odczuleniu w większości badanych oligodendrocytów (77,3 % ± 7,9; n = 47; Fig. 1a). Analog ATP, 2',3'--(4-benzoilo-4-benzoilo) (BzATP, 0 μm), który stanowi antagonistę receptorów P2X o szerokim zakresie działania, lecz o wyższym powinowactwie wobec receptora P2X7 (Ralevic & Burnstock, 1998), także indukował podobne odpowiedzi (Fig. 1a). Z drugiej strony, α,β-metyleno-atp (α,β-me-atp, 0 μm), selektywny agonista P2X1, P2X3 i heteromerów P2X2/3, nie wytwarzał prądów w oligodendrocytach. Zaobserwowano, że amplituda prądów wytwarzanych przez ATP i BzATP zależy od stężenia odpowiedniego agonisty (Fig. 1a) (EC 0 = 8,77 mm i 0,2 mm, odpowiednio). Podobnie, można ocenić, że nieobecność Mg 2+ i Ca 2+, które zwiększają stężenie ATP 4-, postaci aktywnej receptorów P2X, zwiększa odpowiedzi 4--krotnie (Fig. 1a). [0030] Z kolei PPAD, antagonista o szerokim zakresie działania (0 μm), zupełnie blokował prądy indukowane przez ATP (Fig. 1). atomiast utleniony ATP (o-atp), preferencyjny antagonista receptorów P2X7, częściowo blokuje prądy ATP. Z kolei, Cu 2+ (1 mm), który stanowi selektywny inhibitor receptorów P2X7 (Virginio i in., 1997), zmniejsza prądy ATP, zaś propofol (60 μm), czynnik wzmacniający receptory P2X4, nie zmienia tych prądów. Te wyniki wskazują, że receptory P2X obecne w oligodendrocytach mają elektrofizjologiczne właściwości zgodne z przeważającym występowaniem podjednostki P2X7. Aktywacja receptorów P2X zwiększa poziomy Ca 2+ w cytosolu [0031] [Ca2+] i monitorowano po naniesieniu ATP i BzATP w celu scharakteryzowania skutków aktywacji receptorów P2X na oligodendrocytach. Te komórki odpowiadają na ATP ( μm) gwałtownym wzrostem 11

13 podstawowego [Ca2+] i (20 ± 6 nm) w cytosolu do 1200 ± 468 nm (Fig. 2a). Te odpowiedzi są hamowane w obecności PPAD (0 μm) i pod nieobecność Ca 2+ w roztworze do inkubacji. Te wyniki wskazują, że wzrosty [Ca2+] i są skutkiem wchodzenia Ca 2+ przez błonę plazmatyczną, a nie skutkiem uwalniania go z depozytów wewnątrzkomórkowych. [0032] Bz-ATP (0,01-1 mm) także aktywuje wchodzenie Ca 2+ do oligodendrocytów w sposób zależny od dawki (Fig. 2b, d). Ten efekt znika pod nieobecność pozakomórkowego Ca 2+ i jest blokowany przez PPAD (Fig. 2b, d). Te wyniki sugerują, że receptory P2X, które zawierają podjednostkę P2X7, stanowią główne mediatory odpowiedzi na ATP. Zgodnie z tym poglądem, o-atp, selektywny agonista P2X7 (1 mm) (Fernandez i in., 2001), zmniejsza wzrost [Ca 2+ ] indukowany przez Bz-ATP o 63 ± 8 (Fig. 2d, e). Z kolei propofol (60 μm), który wyzwala odpowiedzi za pośrednictwem P2X4 (Tomioka i in., 2000), sprzyja wzrostowi [Ca2+] i wytwarzanemu przez 0,1 i 1 mm ATP odpowiednio w 60% ± 22 i 77% ± 34 (Fig. 2c, d). Zatem natywne receptory P2X, które zawierają P2X4, także przyczyniają się do indukowanego przez ATP wchodzenia wapnia do oligodendrocytów. Aktywacja receptorów P2X indukuje zależną od Ca 2+ śmierć gleju skąpodrzewiastego 1 20 [0033] We wszystkich testowanych stężeniach ATP (0,01-1 mm), u 1-27% oligodendrocytów następowała śmierć, która jest hamowana w obecności 0 μm PPAD i po usunięciu Ca 2+ z pożywki do hodowli (Fig. 3a). W taki sam sposób agonista Bz-ATP powodował toksyczność podobną do ATP (Fig. 3b). Inne agonisty receptorów purynergicznych takie jak ATP-γ-, który stanowi analog bardziej trwały niż ATP, oraz α,β-meatp, są także toksyczne dla oligodendrocytów, co wyklucza możliwość, że metabolity ATP mogą być środkami powodującymi toksyczność po aktywowaniu receptorów różnych od P2X. W sumie testy toksyczności pokazały, że oligodendrocyty są wrażliwe na aktywację receptorów P2X przez ATP i jego analogi. ligodendrocyty wyrażają receptory P2X w oligodendrocytach in vitro i in situ 2 [0034] Analiza immunohistochemiczna wyrażania receptorów P2X przy użyciu swoistych przeciwciał w hodowlach zróżnicowanych oligodendrocytów (GalC+/MBP+) pokazuje, że te komórki mają głównie podjednostki P2X2, P2X4 i P2X7 (patrz Tabela 2). Tabela 2. Wyrażanie receptorów P2X w hodowlach oligodendrocytów. Podjednostka P2x 1 P2x 2 P2x 3 P2x 4 P2x P2x 6 P2x 7 Wyrażanie +/ /- +/ [003] Ten profil wyrażania jest spójny z właściwościami elektrofizjologicznymi i charakterystyką toksyczności obserwowaną w tych hodowlach. Także, rozmieszczenie podjednostek obserwowane in vitro także odpowiada temu, które obserwuje się in situ w nerwie wzrokowym (Tabela 3) przy pomocy podwójnego znaczenia podjednostek i przeciwciał swoistych wobec linii komórkowych gleju skąpodrzewiastego i astrogleju (Fig. ). 12

14 Tabela 3. Rozmieszczenie receptorów P2X w oligodendrocytach w nerwie wzrokowym szczura Podjednostka P2X1 P2X2 P2X3 P2X4 P2X P2X6 P2X7 Rozmieszczenie Te wyniki histochemiczne potwierdzono metodą Western blot (immunoprzeniesienia). ATP zabija oligodendrocyty in situ 1 [0036] W celu określenia, czy ATP jest toksyczny dla oligodendrocytów w preparacie tkanki nerwowej bez dysocjacji, całe nerwy wzrokowe pobrane od dorosłych szczurów perfundowano sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym z ATP (0 μm) przez 3 h. W tych warunkach uzyskano ponad trzykrotny wzrost liczby komórek, które wykazywały kondensację jądrową, w porównaniu z nerwami kontrolnymi perfundowanymi bez ATP (Fig. ). Zniszczone komórki znajdują się na osi podłużnej nerwu i stanowią część międzypęczkowych rzędów oligodendrocytów. tymulacja przy użyciu ATP w obecności PPAD ( μm) zapobiega śmierci oligodendrocytów. [0037] astępnie, agonisty ATP-γ- i BzATP wlewano na nerw wzrokowy, stosując pompy osmotyczne, które uwalniały bardzo małe ilości substancji rozpuszczonej przez 3 dni. Badanie histologiczne nerwów 7 dnia po rozpoczęciu nanoszenia wykazało uszkodzenie tkanki w obszarze ograniczonym do bliskości kaniuli (Fig. 6). Ta strefa miała także intensywną gliozę, brak mieliny i zniszczenie aksonów (Fig. 6). W sumie te wyniki wskazują, że aktywacja P2X zabija oligodendrocyty in situ i że zmiany chorobowe in vivo mają właściwości typowe dla płytek stwardnienia rozsianego. Blokowanie P2X7 polepsza objawy ruchowe ostrego i przewlekłego EAE [0038] Badano działania antagonisty o szerokim zakresie działania PPAD i bardziej selektywnego o- ATP przy wyłączaniu i włączaniu przebiegu EAE indukowanego przez immunizację szczurów rasy Lewis zasadowym białkiem mieliny. zczury immunizowane wykazywały oznaki niedoborów ruchowych około dni po wstrzyknięciu i osiągały maksimum w 14 dniu (Fig. 7). Leczenie przy pomocy PPAD (30 mg/kg, dwa razy dziennie) od 7 do 14 dni po wstrzyknięciu nie polepszyło objawów lub przebiegu choroby. Z drugiej strony stosowanie o-atp (1 i mg/kg, co 12 h) przez ten sam okres zmniejszyło lub zapobiegło wystąpieniu objawów typowych dla EAE (Fig. 7). [0039] Później, oceniano skuteczność o-atp przy polepszaniu objawów EAE w modelu przewlekłymnawracającym-ustępującym. W tym celu szczury DA immunizowano syngenicznym rdzeniem kręgowym, przy czym po 7-9 dniach od wstrzyknięcia obserwowano wystąpienie ciężkich niedoborów neurologicznych, które swój pierwszy szczyt osiągnęły około 11 dnia. Leczenie przy pomocy o-atp (2, mg/kg, co 12 h), kiedy ustaliło się maksimum natężenia objawów, zmniejszyło objawy, a także wyeliminowało objawy typowe dla fazy przewlekłej (Fig. 8). [0040] W celu zrozumienia mechanizmu działania, przez który o-atp polepsza prognozę EAE, stosując metodę Western blot oceniano poziomy receptorów P2X7, na które działa korzystna postać tego leku w rdzeniu kręgowym lędźwiowo-krzyżowym, obszarze najbardziej dotkniętym w tej chorobie doświadczalnej. Twórcy wynalazku stwierdzili, że poziomy tej podjednostki były zmniejszone o połowę u zwierząt poddanych EAE, i że te poziomy wracały do poziomów kontrolnych u tych zwierząt z EAE, które 13

15 potraktowano o-atp (Fig. 9). Te wyniki wskazują, że leczenie przy pomocy o-atp chroni przed umieraniem te komórki, które wyrażają P2X7, a zatem oligodendrocyty, które stanowią główny typ komórek, które wyrażają tę podjednostkę w rdzeniu kręgowym. III- DYKUJA [0041] Pokazane poprzednio wyniki pokazały po raz pierwszy, że oligodendrocyty mają receptory P2X. Podobnie podane są w szczegółach elektrofizjologiczne, farmakologiczne i cząsteczkowe właściwości tych receptorów, jak również ich zwiększona przepuszczalność dla wapnia. Ta ostatnia właściwość powoduje, że oligodendrocyty mogą być wrażliwe na intensywny i/lub długotrwały bodziec za pośrednictwem tych receptorów, jak wykazano dla glutamergicznych receptorów w tej populacji komórek (Matute i in., 2001, Trends eurosci. 24, ). Wrażliwość oligodendrocytów na sygnały przenoszone za pośrednictwem receptorów P2X stanowi jedną z przyczyn zniszczenia tkanki nerwowej, która leży u podstaw choroby doświadczalnej, EAE, modelu stwardnienia rozsianego. a koniec, blokowanie receptorów P2X7 aż do wyłączenia choroby drastycznie zmniejsza objawy neurologiczne w ostrej EAE, i poprawia wynik i prognozę w przewlekłej EAE, kiedy objawy się ustaliły. [0042] pisany niniejszym wynalazek stanowi środek do leczenia stwardnienia rozsianego, choroby, na którą nie ma skutecznych sposobów leczenia, które spowalniałoby lub zatrzymywało jej postęp. Drogi interwencji, które spowodowały opracowanie leków w fazie testów klinicznych lub do stosowania jako leki do leczenia stwardnienia rozsianego mają mechanizmy działania, które regulują funkcjonowanie układu immunologicznego. Fakt, że blokowanie P2X7 może zapobiegać objawom ostrego EAE, modelu M, który naśladuje fazę zapalną/autoimmunologiczną choroby, wskazuje, że te leki mogą w rzeczywistości być mocnymi środkami immunomodulującymi, które mogą zapobiegać autoimmunizacji, co wyłącza M i inne choroby. a koniec, antagonisty receptorów P2X7, będąc środkami chroniącymi przed śmiercią oligodendrocyty, populację komórek, która doznaje największego zniszczenia w M, mają wielki potencjał terapeutyczny w fazie zwyrodnienia nerwów tej choroby, fazie, która ciągnie się przez całe dziesięciolecia i w której pacjenci cierpią na postępujące pogorszenie, które przebiega z zaburzeniami ruchowymi i czuciowymi, powodując inwalidztwo. DŚIKI [0043] Abbracchio, M. P. i Burnstock, G. (1998) Purinergic signalling: pathophysiological roles. Jpn. J. Pharmacol. 78: Ansari KA, Rand A, Loch JA (1978) Biochemical and immunological studies with human optic and olfactory tracts J. europathol. Exp. eural 37: Armstrong MA, hah, awkins A, Bell AL, Roberts D (1988) Reduction of monocyte '-nucleotidase activity by gamma-interferon in multiple. Ann eural 24: Barnard, E. A., imon, J. i Webb, T. E. (1997). ucleotide receptors in the nervous system. An abundant component using diverse signal transduction mechanisms. Mol. eurobiol. 1: Braun,., Zhu, Y., Krieglstein, J., Clumsee, C. i Zimmermann,. (1998). Upregulation of the enzyme chain hydrolysing extracellular ATP after transient forebrain ischemia in the rat. J. eurosci. 18:

16 Ciccarelli, R. Ballerini, P., abatino, G., Rathbone, M. P., D'nofrio, M.. Caciagli, F. i Iorio, P. (2001). Involvement of astrocytes in purine-mediated reparative processes in the brain. Int. J. Dev. eurosci. 19: Dunn, P.M., Zhong, Y. i Burnstock, G. (2001). P2X receptors in peripheral neurons. Prog. eurobiol. 6: Fields, R.D. i tevens, B. (2000). ATP: an extracellular signalling molecule between neurons and glia. Trends eurosci. 23: Franke,., Grosche, J., chädlich,., Krügel, U., Allgaier, C. i Illes, P. (2001a). P2X receptor expression on astrocytes in the nucleus accumbens of rats. euroscience 8: Franke,., Krugel, U., chmidt, R., Grosche, J., Reichenback, A. i Illes, P. (2001b). P2 receptor-types involved in astrogliosis in vivo. Brit. J. Pharmacol. 134: onda,. i Kohsaka,. (2001). Regulation of microglial cell function by ATP. ihon hinke 21: James, G. i Butt, A. M. (2001). Changes in P2Y and P2X purinoceptors in reactive glia following axonal degeneration in the rat optic nerve. eurosci. Lett. 212: Matute C, Alberdi E, Domercq M, Pérez-Cerdá F, Pérez-amartin A i anchez-gomez MV (2001) The link between excitotoxicity and demyelinating diseases. Trends eurosci. 24, Matute C, Alberdi E, Ibarretxe G i ánchez-gómez MV (2002) Excitotoxicity in glial cells. Eur. J. Pharmacol 447: Queiroz, G., Gebicke-aerter, P. J., chobert, A., tarke, K. i von Kugelgen, I. (1997). Release of ATP from cultured rat astrocytes elicited by glutamate receptor activation. euroscience 78: Ralevic, V. i Burnstock, G. (1998) Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 0: Rathbone, M. P., Meddlemiss, P. J., Gysbers, J. W., Andrew, C., erman, M. A., Reed, J. K., Ciccarelli, R. Di Iorio, P. i Caciagli, F. (1999). Trophic effects of purines in neurons and glia. Prog. eurobiol. 9: tevens, B, Porta,., aak, L. L., Gallo, V. i Fields, R. D. (2002) Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CM in response to action potentials. euron 36: Zamvil,.. i teinman L. (2003) Diverse targets for intervention during inflammatory and neurodegenerative phases of multiple sclerosis. euron 38, Zastrzeżenia patentowe 3 1. Zastosowanie o-atp lub BBG, antagonisty receptorów purynergicznych P2X7, do wytwarzania leku do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego, u ssaków, włącznie z człowiekiem. 1

17 16

18 17

19 18

20 19

21 20

22 21

23 22

24 23

25 24