Fermentacja etanolowa i produkcja alkoholi

Transkrypt

1 Fermentacja etanolowa i produkcja alkoholi Pojęcie fermentacja ma z biotechnologii dwa niezależne znaczenia: fermentacja sensu stricte rozumiana jako proces biochemicznego oddychania beztlenowego (w zasadzie sprowadza się do określenia sformułowanego po raz pierwszy już przez Pasteur a: fermentacja to życie bez tlenu ) oraz fermentacja sensu late oznaczająca dowolny bioproces zazwyczaj prowadzony w bioreaktorach (fermentorach) to znaczenie wynika z historycznych tradycji biotechnologii, zanim naukowo rozróżniono i scharakteryzowano procesy oddychania tlenowego i beztlenowego. W ścisłym, biochemicznym znaczeniu fermentacja służy wytworzeniu puli ATP w komórce dzięki rozkładowi związków organicznych bez wykorzystywania tlenu jako akceptora elektronów i wodoru. W fermentacjach produkty rozkładu są więc równocześnie donorami, jak i akceptorami wodoru, dzięki czemu zachodzi restytucja NAD + - jest to podstawowa zaleta fermentacji. Pierwszy etap fermentacji powstawanie pirogronianu u większości drobnoustrojów przebiega według schematu HMP lub EMP, a wyjątkowo u niektórych rodzajów bakterii (głównie u bakterii octowych) może przebiegać także wg. specyficznego szlaku Entnera-Doudoroffa (patrz: rysunek poniżej). W zależności od typu produktu końcowego produktu fermentacji, wydzielanego do środowiska, wyróżnia się następujące główne typy fermentacji: alkoholowe (produktami są etanol, butanol, izopropanol, butanodiol, a także aceton), mlekowa (kwas mlekowy i inne produkty), propionowa (kwas propionowy), masłowa (kwas masłowy), mrówkowa (kwas mrówkowy). 1

2 Fermentacja etanolowa i jej regulacja u drożdży Fermentacja etanolowa jest szczególnie rozpowszechnionym procesem biochemicznym wśród drobnoustrojów, zwłaszcza względnie beztlenowych. Przemysłowe wykorzystanie tej fermentacji ograniczone jest jednak głównie do drożdży z rodzaju Saccharomyces sp. Niewielkie ilości etanolu są także pozyskiwane w syntezie chemicznej (głównie z etanu), jednak dużo tańsze i wydajniejsze są metody biotechnologiczne. Wśród innych mikroorganizmów fermentacja etanolowa jest bardzo częstym rodzajem oddychania beztlenowego, jednak znaczenie praktyczne posiadają jedynie Gramujemne pałeczki Zymomonas mobilis oraz termofilna bakteria Thermoanaerobacter ethanolicus (optymalna temperatura wzrostu 65oC). Bakterie Zymomonas mobilis zostały wykorzystane do produkcji Tequili przez mieszkańców Meksyku. Alkohol ten powstaje w wyniku spontanicznej fermentacji soku agawy (Agave americana) naturalnego siedliska tej bakterii. Podstawowy schemat fermentacji etanolowej u drożdży, a także u innych mikroorganizmów jest następujący: C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 Produktami fermentacji są zatem etanol i dwutlenek węgla. Glukoza jest przekształcana do tych produktów w szlaku HMP. Taki proces zapewnia szybką regenerację NAD +, co stanowi istotę wszystkich typów fermentacji (patrz: rys. poniżej). U drożdży fermentacja etanolowa podlega mechanizmom regulacyjnym związanym z warunkami środowiskowymi, w jakich aktualnie znajduje się hodowla przede wszystkim obecności tlenu oraz poziomu glukozy i innych składników pokarmowych. Wynika to z faktu, iż są 2

3 względnymi beztlenowcami i w warunkach tlenowych przeważa u nich katabolizm tlenowy cukrów, a nie fermentacja. W takich warunkach dominuje również intensywny wzrost hodowli drożdży. Aby zapewnić wysoką wydajność procesu fermentacji etanolowej konieczne jest więc środowisko beztlenowe, a tlen generalnie silnie hamuje przebieg fermentacji jest to tzw. efekt Pasteur a (hamowanie aktywności enzymów glikolitycznych oraz hamowanie transportu aktywnego glukozy do komórek). W warunkach niedoboru tlenu drożdże rozpoczynają intensywną fermentację, natomiast niemal całkowicie zahamowany zostaje wzrost. Efekt Pasteur a nie dotyczy wyłącznie drożdży, lecz jest charakterystyczny dla większości typowych anaerobów fakultatywnych. Niewielka zawartość tlenu w środowisku (na poziomie około 0,05%) jest jednak niezbędna, aby drożdże mogły prawidłowo funkcjonować oraz rozpocząć fermentację. Ten paradoksalny wpływ niewielkiej ilości tlenu na przebieg fermentacji nosi nazwę odwrotnego efektu Pasteur a. Natomiast efekt Crabtree to zjawisko występujące w warunkach tlenowych i polega na silnym hamowaniu oddychania tlenowego drożdży pod wpływem wysokiego stężenia glukozy w środowisku (powyżej 1-2 g/l). W takich warunkach następuje hamowanie enzymów cyklu Krebsa i łańcucha oddechowego, a metabolizm drożdży jest nastawiony na szybkie, lecz mało wydajne beztlenowe zużywanie glukozy (szybka regeneracja NAD + ). Zastosowanie drożdży w piekarnictwie i produkcji piwa Wykorzystanie drożdży do produkcji pieczywa oraz piwa i wina stanowi najstarszą w dziejach ludzkiej cywilizacji biotechnologię. Spontaniczną fermentację z udziałem dzikich drożdży wykorzystywali do produkcji piwa oraz pieczywa starożytni Sumerowie i Babilończycy, a następnie Egipcjanie. Najstarsze ślady wytwarzania wina pochodzą ze starożytnej Gruzji. W produkcji pieczywa stosowane są drobnoustroje prowadzące fermentację alkoholową (głównie drożdże S. cerevisiae), mlekową oraz mieszaną etanolowo-mlekową (bakterie mlekowe). Produkcja pieczywa prowadzona jest w 3 etapach: przygotowanie ciasta, wyrastanie ciasta, wypiek pieczywa. Ciasto w piekarnictwie otrzymywane jest z mąki zmieszanej w odpowiedniej proporcji z wodą, dodatkowymi substancjami (sól, mleko, oliwa, środki spulchniające, substancje smakowozapachowe) oraz zaczynem drożdżowym lub bakteryjno-drożdżowym (zakwas). W wyniku fermentacji mlekowej następuje zakwaszenie ciasta. Odbywa się ono przy udziale bakterii z rodzaju Lactobacillus sp., (najczęściej gatunki: L. plantarum, L. brevis, L. casei). Fermentacja etanolowa prowadzi natomiast do powstawania dwutlenku węgla, co nadaje ciastu porowatą strukturę. Fermentacja etanolowa jest głównym procesem wykorzystywanym w produkcji pieczywa na mące pszennej. W przypadku mąki z innych rodzajów zbóż (głównie żyta) przed dodaniem drożdży 3

4 przeprowadzane jest ukwaszanie ciasta będące wynikiem fermentacji mlekowej przeprowadzanej najczęściej przez naturalną mikroflorę mąki (fermentacja samoczynna). Podobny proces ma miejsce w przypadku przygotowania zakwasu na żurek. Surowcami wykorzystywanymi w przemyśle piwowarskim są słód (obecnie zwykle jęczmienny), woda, drożdże piwowarskie oraz chmiel. Dodatkowo, na etapie dojrzewania piwa, mogą być stosowane dodatkowe środki np. enzymy, stabilizatory. Otrzymywanie słodu polega na namoczeniu ziarna zbóż, następnie jego skiełkowaniu (łącznie 5-7 dni) oraz wysuszeniu. Oprócz dominujących obecnie w piwowarstwie słodów jęczmiennych niektóre typy piwa są tradycyjnie wytwarzane na słodzie żytnim (głównie w Europie Północnej np. w Finlandii; w Rosji na jego bazie wytwarza się także kwas chlebowy), owsianym, ryżowym (np. japońska sake), kukurydzianym oraz na mieszankach słodów z różnych zbóż. Etymologia romańskiej nazwy piwa (hiszpański: cerveza, portugalski: cerveja, starofrancuski: cervoise) jest związana właśnie ze słowem oznaczającym także zboża wywodzącym się od rzymskiej bogini urodzaju Ceres, której w czasie święta cerialia ofiarowywano snopki zbóż. Celem procesu słodowania jest uaktywnienie enzymów amylolitycznych w ziarnach, w wyniku czego następuje rozkład skrobi do maltozy, glukozy oraz maltodekstryn (drożdże nie wytwarzają amylaz). Ponadto uaktywniają się enzymy proteolityczne dzięki czemu z białek uwolniona zostaje dość duża ilość wolnych aminokwasów będących stymulatorami wzrostu drożdży. Proces suszenia ma znaczący wpływ na parametry organoleptyczne słodu. W zależności od temperatury i czasu suszenia i/lub prażenia otrzymać można słody jęczmienne jasne (tzw. pilzneńskie) lub ciemne (tzw. monachijskie), a także słody karmelowe i inne. W wyniku gotowania słodu z wodą (zacierania) powstaje bezpośredni substrat fermentacji piwnej tzw. brzeczka. Etapem poprzedzającym otrzymywanie brzeczki jest mielenie słodu w specjalnych urządzeniach (śrutownikach). Zacieranie słodu jest procesem ekstrakcji słodu oraz przyspieszenia procesów amylolitycznych, w wyniku czego powstaje brzeczka stanowiąca bezpośrednią pożywkę dla drożdży piwnych. Proces zacierania prowadzony jest do momentu całkowitego zaniku skrobi w brzeczce (negatywny wynik próby jodowej). Zacieranie prowadzone jest zwykle przez kilka godzin przy najczęściej wzrastającej temperaturze (do około 75 C). Istotny wpływ na przebieg zacierania ma też odczyn powinien być kwaśny (ph=5,0-5,5). Typowy skład brzeczki 12 Blg: maltoza 44%, dekstryny 31%, maltotrioza 11%, glukoza 9%, sacharoza 3%, fruktoza 2% oraz wolne aminokwasy ( mg/100 cm 3 ). Przecedzona brzeczka jest następnie gotowana (ok. 2 h) w celu jej dezynfekcji, zagęszczenia i inaktywacji enzymów. Na etapie gotowania jest również dodawany chmiel służący jedynie jako przyprawa, a nie zasadniczy składnik piwa (zaledwie około 200 g chmielu na 100 litrów piwa). Do chmielenia brzeczki wykorzystywane są kwiatostany żeńskie (tzw. szyszki ) chmielu zwyczajnego (Humulus lupulus, rodzina Cannabaceae) zawierające żywice i olejek eteryczny o dużej zawartości substancji 4

5 goryczowych. W zależności od odmiany, a także warunków klimatycznych, chmiel może mieć bardziej goryczkowy lub bardziej aromatyczny. Gotowe szyszki chmielowe są dostępne w postaci suszu lub skoncentrowanych granulatów. Wprowadzenie chmielenia, a także ogólny rozwój browarnictwa i selekcję czystych odmian drożdży, zawdzięczamy średniowiecznym mnichom (około XII wieku). W czasach starożytnych piwo produkowano metodą spontanicznej fermentacji i nie stosowano dodatku chmielu zamiast tego dodawano czasami zioła np. gałązki rozmarynu. Wydajność fermentacji zależy od stosowanego szczepu drożdży. Do fermentacji piwnej wykorzystywane są drożdże różnych ras nalężących ogólnie do dwóch grup: drożdży fermentacji górnej (S. cerevisiae ssp. cerevisiae) lub drożdży fermentacji dolnej (S. cerevisiae ssp. uvarum var. carlsbergensis). W zależności od doboru szczepu drożdży fermentację piwną właściwą (główną) prowadzi się w temperaturze C (fermentacja górna) lub w temperaturach poniżej 10 C (fermentacja dolna). Drożdże fermentacji dolnej (tzw. drożdże denne) to wyselekcjonowane szczepy drożdży o naturalnie niskich zdolnościach do oddychania tlenowego i wzrostu, za to posiadające wysoki potencjał fermentacyjny stąd występują głównie przy dnie kadzi fermentacyjnych. Ten typ drożdży obecnie dominuje w przemyśle browarniczym: większość otrzymywanych piw jest zaliczana do tzw. typu pilsner czyli piw kontynentalnych (także piwa typu lager, bock czyli polski koźlak, porter bałtycki i inne). Wyjątkiem są piwa dominujące w Wielkiej Brytanii - piwa typu ale, a także porter, otrzymywane z wykorzystaniem drożdży fermentacji górnej. Drożdże fermentacji górnej są jednak wykorzystywane przede wszystkim w produkcji pieczywa oraz w winiarstwie. Do tzw. drożdży dzikich występujących naturalnie w tych samych środowiskach, co szczepy drożdży wykorzystywane najczęściej w winiarstwie i piwowarstwie, zalicza się głównie drożdże z rodzajów: Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Dekkera, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Torulospora, Zygosaccharomyces. Większość z nich uważa się obecnie za przyczynę psucia się piwa lub wina w warunkach nieodpowiedniego zabezpieczenia. Drożdże z rodzaju Brettanomyces są jednak naturalnym składnikiem przyczyniającym się do powstawania belgijskiego piwa typu lambic (fermentacja spontaniczna). Gotowe piwo jest rozlewane do pojedynczych butelek lub poddawane leżakowaniu w zbiornikach fermentacyjnych. Leżakowanie piwa prowadzi do jego dojrzewania, w czasie którego zachodzi jeszcze fermentacja końcowa. Końcowym etapem produkcji jest nasycanie piwa dwutlenkiem węgla (karbonizacja). 5

6 Winiarstwo i przemysł gorzelniczy Do fermentowanych napojów winiarskich zaliczane są między innymi wina gronowe, wina owocowe, napoje winopochodne, wina musujące oraz miody pitne. W zależności od rodzaju napoju do nastawu (bezpośredni substrat fermentacji winnej) wykorzystywane są mieszaniny owoców, moszczu, soku, koncentratu owocowego lub miodu pszczelego z wodą i dodatkami (np. substancjami słodzącymi, regulatorami kwasowości itp.). Dodatek cukrów jest zwykle niezbędny, gdyż większość owoców zawiera ich zbyt mało (wyjątkiem są winogrona), aby uzyskać minimalną moc wina. Moszcze owocowe są przed użyciem poddawane siarkowaniu (sulfitowaniu), czyli wprowadzeniu niewielkich ilości dwutlenku siarki w celu eliminacji rodzimej mikroflory. Po przeprowadzeniu fermentacji wina są poddawane klarowaniu i stabilizacji. Do fermentacji winnej wykorzystywane są tzw. drożdże szlachetne. Natomiast dzikie szczepy drożdże stanowiące naturalną mikroflorę owoców są obecnie niepożądane. Dzikie drożdże są natomiast odpowiedzialne za powstawanie win przygotowanych z udziałem fermentacji samorzutnej. Do dzikich drożdży zalicza się głównie szczepy należące do rodzaju Kloeckera i Torulospora, a w mniejszym stopniu także Candida, Hansenula, Pichia. Do fermentacji z dodatkiem czystych kultur są stosowane szczepy należące do gatunku S. cerevisiae lub S. bayanus. Fermentację winiarską rozpoczyna się w temperaturze C, gdyż w trakcie fermentacji temperatura wina wzrasta. Najczęściej fermentacja winiarska przebiega w 3 fazach: zafermentowanie, fermentacja główna (burzliwa) oraz dofermentowanie. Podstawowe wyposażenie wytwórni wina: A kadź do wyciskania soku z winogron, B - wirówka, C fermentory. 6

7 Wina są podatne na rozwój chorób wywołanych zakażeniem drobnoustrojami niepożądanymi, co prowadzi do obniżenia jakości gotowego produktu. Choroby wina są spowodowane rozwojem bądź drobnoustrojów tlenowych (tzw. octowanie wina rozwój bakterii z rodzaju Acetobacter - lub kożuchowanie wina rozwój drożdży dzikich), bądź też beztlenowców (głównie bakterie prowadzące fermentację mlekową, rzadziej mannitolową lub masłową). W gorzelnictwie wykorzystywane są szczepy drożdży o najwyższej tolerancji na etanol sięgającej nawet 20%, a standardowo co najmniej 10%-14% (drożdże browarnicze do 6%, winiarskie do 15%). Większość szczepów gorzelnianych należy do gatunku S. cerevisiae. Pierwotnym produktem gorzelniczym jest spirytus surowy (nieoczyszczony) tzw. okowita. Surowce gorzelnicze mogą zawierać skrobię lub cukry proste. Spośród surowców skrobiowych najczęściej wykorzystywane są: ziarna zbóż (zależnie od regionu: żyto, pszenica, jęczmień, kukurydza, ryż); zawierają 70-80% skrobi; ziemniaki (15-25% skrobi), słonecznik bulwiasty. Surowce skrobiowe nie mogą być bezpośrednio wykorzystane do fermentacji (podobnie jak w przypadku produkcji piwa), lecz w pierwszym etapie produkcji podlegają mieleniu i zacieraniu (enzymatyczna hydroliza skrobi). Przetworzenie skrobi w cukry proste może być przeprowadzone za pomocą kwaśnej hydrolizy lub hydrolizy enzymatycznej (proces enzymatyczny jest znacznie częściej stosowany). Enzymatyczna hydroliza skrobi opiera się na zastosowaniu enzymów hydrolizujących wiązania glikozydowe w skrobi (amylaz) powodując jej przekształcenie do maltozy i glukozy. Efekt enzymatycznej hydrolizy skrobi zależy od składu enzymatycznego stosowanego preparatu, temperatury i czasu prowadzenia procesu. Surowce zawierające głównie mono- i disacharydy to melasa (odpad przemysłu cukrowniczego), serwatka (odpad z mleczarstwa), sok z trzciny cukrowej, sok z buraków cukrowych, ług posiarczynowy (produkt odpadowy przemysłu drzewnego). Surowce należące do tej grupy nadają się do bezpośredniego wykorzystania w fermentacji etanolowej. Właściwa fermentacja etanolowa trwa 2-3 doby i jest prowadzona w temperaturze ok. 30 C i środowisku o ph=4,0-4,5. Otrzymany produkt pierwotny musi zostać poddany prostej destylacji lub rektyfikacji. Destylacja jest procesem down-stream polegającym na oddzieleniu etanolu od pozostałych składników zacieru pofermentacyjnego. Rektyfikacja (destylacja frakcyjna) z fizycznego punktu widzenia jest procesem destylacji kaskadowej (wielopoziomowej), w którym każdy stopień procesu jest zasilany produktem (destylatem) poprzedniego. Jednak z technologicznego punktu widzenia rektyfikacja jest procesem, w którym mieszanina ciekła jest rozdzielana na frakcje o różnej (zwykle zbliżonej) lotności. W warunkach przemysłowych prowadzona jest w specjalnych kolumnach rektyfikacyjnych. Rektyfikacja jest o wiele wydajniejsza 7

8 niż destylacja prosta. W wyniku oczyszczania zacieru pofermentacyjnego metodą rektyfikacji można uzyskać etanol o maksymalnym stężeniu 97,2% objętościowych (czyli 95,6% wagowych). Spirytus surowy (ok. 88% obj. alkoholu) zawiera do 0,5% fuzli. Fuzle są naturalnymi produktami każdej fermentacji prowadzonej przez drożdże; pochodzą głównie z przemian aminokwasów (leucyny, izoleucyny, waliny). Stanowią mieszaninę alkoholi (propanol, butanol, pentanol), estrów, kwasów tłuszczowych (mrówkowy, octowy, masłowy), furfurolu, terpenów. Mają nieprzyjemny smak i duszący zapach. Normy dopuszczają zawartość jedynie 1-2 mg fuzli w jednym litrze rektyfikatu (o mocy 95-96% obj.) przeznaczonego do celów farmaceutycznych lub spożywczych. Dalsze odwodnienie mieszaniny alkoholowo-wodnej na skalę przemysłową prowadzi się metodą destylacji azeotropowej przy użyciu benzenu i benzyny (etanol 99%). Do produkcji wódek wykorzystywany jest zarówno spirytus surowy lub rektyfikowany, jak również spirytusy winne, owocowe oraz dodatkowe składniki (zioła, owoce, przyprawy). Wódki czyste produkuje się poprzez odpowiednie rozcieńczenie spirytusu rektyfikowanego wodą, natomiast wódki gatunkowe sporządzanego są z różnych typów spirytusów oraz dodatkowo zawierają składniki smakowo-zapachowe, ewentualnie także barwniki. W wódkach gatunkowych zazwyczaj wykorzystywany jest spirytus rektyfikowany pochodzący w całości lub częściowo z fermentacji moszczu owocowego (spirytusy winne) lub rzadziej brzeczki zbożowej. Najczęściej produkowane wódki tego typu to: śliwowice, wiśniówki, calvados (z cydrów jabłkowych), koniaki i brandy (z moszczu winogron) oraz whisky (ze słodów zbożowych: jęczmienia, żyta, pszenicy, kukurydzy). Takie alkohole są także wykorzystywane jako dodatek do innych napojów etanolowych np. sherry (hiszp. jerez) czyli wina wzmacnianego poprzez dodatek brandy. 8