(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/01 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/36 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Szczepionki pierwotne/przypominające przeciw malarii () Pierwszeństwo: US P EP 0403 (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 07/27 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/03 (73) Uprawniony z patentu: Crucell Holland B.V., Leiden, NL GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rixensart, BE The Government of the United States, as represented by the Secretary of the Army, on behalf of the Walter Reed Army Institute of Research, Silver Spring, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MARIA GRAZIA PAU, Leiden, NL JAAP GOUDSMIT, Amsterdam, NL JOSEPH D. COHEN, Rixensart, BE PATRICE M. DUBOIS, Rixensart, BE V. ANN STEWART, Silver Spring, US DONALD HEPPNER, Silver Spring, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-197/VAL EP B1 Opis 1 2 DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy dziedziny medycyny. W szczególności wynalazek dotyczy nowych strategii szczepień pierwotnych/przypominających z zastosowaniem rekombinacyjnie wytwarzanych wektorów adenowirusowych i oczyszczonych białek w kontekście adiuwanta w celu profilaktyki malarii tropikalnej. TŁO WYNALAZKU [0002] Malaria stanowi obecnie jedno z najbardziej rozpowszechnionych zakaŝeń na obszarach zwrotnikowych i podzwrotnikowych na całym świecie. KaŜdego roku z powodu zakaŝenia malarią ginie do 2,7 miliona osób w krajach rozwijających się i nowo powstałych. Rozległe występowanie malarii i podwyŝszona zachorowalność są konsekwencjami wzrastającej liczby opornych na leki pasoŝytów i opornych na środki owadobójcze wektorów pasoŝytów. Inne czynniki obejmują zmiany środowiskowe i klimatyczne, niepokoje społeczne i zwiększoną mobilność populacji. [0003] Malarię wywołują przenoszone przez komary pierwotniaki pasoŝytnicze krwi nale- Ŝące do rodzaju Plasmodium. Za chorobę u człowieka odpowiadają cztery gatunki pierwotniaków Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. ovale i P. malariae); a wiele innych wywołuje chorobę u zwierząt, tak jak P. yoelii i P. berghei. P. falciparum odpowiada za większość zakaŝeń u ludzi i jest to rodzaj najbardziej śmiercionośny. PasoŜyty malarii mają cykl Ŝyciowy złoŝony z czterech oddzielnych stadiów. KaŜde z tych stadiów jest w stanie wywoływać specyficzne odpowiedzi immunologiczne skierowane przeciw pasoŝytowi i odpowiednio występują specyficzne dla stadiów antygeny, a zatem naturalnie wywołana malaria nie chroni przed ponownym zakaŝeniem. [0004] PasoŜyty malarii są przenoszone do człowieka przez kilka rodzajów samic komarów Anopheles. ZakaŜone komary wstrzykują pasoŝyta malarii w postaci sporozoitów do krwioobiegu ssaka. Sporozoity pozostają kilka minut w krąŝeniu zanim zaatakują hepatocyty. W tym stadium pasoŝyt znajduje się w środowisku zewnątrzkomórkowym i jest wystawiony na atak przeciwciał, głównie skierowanych na białko circumsporozoitowe (ang. circumsporozoite protein, CS), główny składnik powierzchni sporozoitu. Po dotarciu do wątroby, pasoŝyt namnaŝa się i rozwija w schizonta. W czasie tego stadium atakujący pasoŝyt będzie ulegał rozmnaŝaniu bezpłciowemu, wytwarzając do 000 potomnych merozoitów na zakaŝoną komórkę. Podczas tego wewnątrzkomórkowego stadium pasoŝyta,

3 główną rolę w odpowiedzi immunologicznej u gospodarza odgrywają limfocyty T, zwłaszcza limfocyty T CD8+ (Romero i in. 1989). Po około jednym tygodniu od zakaŝenia wątroby, tysiące merozoitów jest uwalnianych do krwioobiegu i wnika do czerwonych krwinek (RBC), stając się celem dla odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez przeciwciała i dla cytokin wydzielanych przez komórki T. Po zaatakowaniu erytrocytów, merozoity ulegają kilku etapom namnaŝania, przekształcając się w trofozoity i schizonty, które pękają z wytworzeniem nowej generacji merozoitów, które następnie zakaŝają nowe RBC. Stadium erytrocytarne jest związane z jawną chorobą kliniczną. Mniejsza liczba trofozoitów moŝe rozwinąć się w męskie lub Ŝeńskie gametocyty, które stanowią płciowe stadium pasoŝyta. Gdy podatne komary spoŝyją gametocyty, zapłodnienie tych gamet prowadzi do utworzenia zygoty i dalszego przekształcenia w ookinety, następnie w oocysty, a ostatecznie w sporozoity, które migrują do gruczołu ślinowego zamykając cykl. [000] Dwoma głównymi gałęziami odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec patogenu występującymi po wniknięciu pasoŝyta do organizmu są odpowiedź komórkowa i humoralna. Jedna gałąź, którą stanowi odpowiedź komórkowa, dotyczy komórek T CD8+ i CD4+, które biorą udział w odpowiedzi immunologicznej. Cytotoksyczne limfocyty T (CTL) eksprymują CD8 i są zdolne do specyficznego uśmiercania zakaŝonych komórek eksprymujących antygeny patogenowe na swojej powierzchni. Komórki T CD4+ lub komórki T pomocnicze podtrzymują rozwój CTL, wytwarzają róŝne cytokiny, a takŝe pomagają w wywoływaniu podziału komórek B i wytwarzaniu przez nie przeciwciał specyficznych wobec antygenów. Podczas odpowiedzi humoralnej, komórki B specyficzne wobec szczególnego antygenu są aktywowane, namnaŝają się, róŝnicują i wytwarzają przeciwciała specyficzne wobec antygenu. [0006] Obie gałęzi odpowiedzi immunologicznej są waŝne dla ochrony przed zakaŝeniem malarią. Po przemieszczeniu się do wątroby zakaźnych sporozoitów i ich wniknięciu do hepatocytów, sporozoity stają się patogenami wewnątrzkomórkowymi, które spędzają niewiele czasu poza zakaŝonymi komórkami. W tym stadium szczególnie waŝne są komórki T CD8+ i komórki T CD4+, poniewaŝ te komórki T i ich produkty w postaci cytokin, takie jak interferon γ (IFN-γ), uczestniczą w uśmiercaniu zakaŝonych hepatocytów gospodarza. Stwierdzono, Ŝe usuwanie wewnątrzkomórkowych pasoŝytów wątroby w mysim modelu malarii zaleŝy od odpowiedzi komórek T CD8+ skierowanych przeciw peptydom eksprymowanym przez pasoŝyty w stadium wątrobowym (Hoffman i Doolan, 00). Utrata komórek T CD8+ moŝe zmniejszać ochronę przed prowokacjami sporozoitami, a adoptywny transfer komórek T CD8+ do zwierząt, które nie miały wcześniej kontaktu z tym pasoŝytem, nadaje im ochronę.

4 [0007] Gdy zakaŝenie malarią osiąga stadium erytrocytarne, w którym merozoity namna- Ŝają się w RBC, występują równieŝ merozoity krąŝące swobodnie w krwioobiegu. PoniewaŜ erytrocyt nie eksprymuje cząsteczek MHC ani klasy I, ani II wymaganych do pokrewnego oddziaływania z komórkami T, uwaŝa się, Ŝe najistotniejsze w tym stadium są odpowiedzi przeciwciał. Podsumowując, moŝliwe podejścia do szczepionek przeciw malarii byłyby najkorzystniejsze, gdyby wywoływały silną komórkową odpowiedź immunologiczną, jak równieŝ silną humoralną odpowiedź immunologiczną w celu zahamowania róŝnych stadiów, w których pasoŝyt występuje w organizmie człowieka. [0008] Obecne podejścia do opracowywania szczepionek przeciw malarii moŝna sklasyfikować według opisanych powyŝej róŝnych stadiów rozwojowych pasoŝyta. MoŜna rozróŝnić trzy typy moŝliwych szczepionek: - Szczepionki przederytrocytarne, które są skierowane przeciw sporozoitom i/lub zaka- Ŝonym schizontami hepatocytom. Historycznie, podejście to zdominowały strategie oparte na (CS). PoniewaŜ faza przederytrocytarna zakaŝenia jest bezobjawowa, szczepionka przederytrocytarna powinna idealnie nadawać całkowitą odporność, w której pośredniczy humoralna i komórkowa odpowiedź immunologiczna, i całkowicie zapobiegać utajonemu zakaŝeniu malarią. - Szczepionki przeciw bezpłciowemu stadium w krwi, które są skierowane przeciw zakaŝonym RBC albo przeciw samym merozoitom, są przeznaczone do minimalizowania nasilenia objawów klinicznych. Szczepionki te powinny zmniejszać zachorowalność i śmiertelność i słuŝą do zapobiegania wnikaniu pasoŝyta i/lub jego rozwoju w erytrocytach. - Szczepionki blokujące przenoszenie, które są przeznaczone do hamowania rozwoju pasoŝyta w komarze stanowiącym gospodarza. Tego typu szczepionka powinna sprzyjać zmniejszeniu wskaźnika zakaŝeń malarią w populacji. [0009] Ostatecznie opracowywanie połączonych szczepionek przeciw malarii nakierowanych na wiele stadiów cyklu Ŝyciowego pasoŝyta moŝna realizować dąŝąc do tak zwanych szczepionek wieloskładnikowych i/lub przeciw wielu stadiom. [00] Obecnie nie ma dostępnej w handlu szczepionki przeciw malarii, chociaŝ opracowywanie szczepionek przeciw malarii rozpoczęto ponad lat temu. Immunizacja gryzoni, naczelnych innych niŝ ludzie oraz ludzi atenuowanymi przez napromieniowanie sporozoitami nadawała odporność na późniejszą prowokację Ŝywymi sporozoitami (Nussenzweig i in. 1967; Clyde i in. 1973). Jednak do tej pory koszt i brak układu hodowlanego do realizacji na duŝą skalę wytwarzania napromienionych sporozoitów nie pozwoliły na rozpowszechnienie zastosowania takich szczepionek (Luke i in. 03).

5 [0011] Dotychczas najbardziej obiecujące szczepionki eksperymentalne badane na ludziach opierały się na niewielkiej liczbie antygenów powierzchniowych sporozoitów. Białko CS stanowi jedyny antygen P. falciparum, dla którego wykazano, Ŝe konsekwentnie zapobiega malarii, gdy jest stosowane jako podstawa aktywnej immunizacji ludzi przeciw zakaŝeniu przenoszonemu przez komary, jednak na poziomach, które często są niewystarczalne. Teoretyczna analiza wskazała, Ŝe zasięg szczepienia, jak równieŝ skuteczność szczepionek powinny wynosić powyŝej 8% albo w przeciwnym przypadku na obszarach endemicznych mogą pozostać bardziej wirulentne mutanty (Gandon i in. 01). [0012] Jednym sposobem wywoływania odpowiedzi immunologicznej u ssaków jest podawanie zakaźnego wektora, który niesie kwas nukleinowy kodujący antygen w swoim genomie. Jednym z takich nośników jest rekombinowany adenowirus, któremu nadano defekt replikacji przez usunięcie regionów w genomie, które normalnie są istotne dla replikacji, takich jak region E1. W dziedzinie znane są przykłady rekombinowanych adenowirusów zawierających geny kodujące antygeny (WO 96/39178). Przykładowo wykazano, Ŝe jeśli składniki antygenowe pochodzące z HIV są dostarczane przez rekombinowane adenowirusy, to powodują odpowiedź immunologiczną (WO 01/02607; WO 02/280; US ). W przypadku malarii opracowano szczepionki oparte na rekombinowanym adenowirusie. Wektory te eksprymują całe białko CS z P. yoelii, jednego z mysich modeli malarii, i wykazano, Ŝe wektory te są zdolne do wywoływania całkowitej odporności u myszy w odpowiedzi na jedną dawkę immunizującą (Bruña-Romero i in. 01). Wykazano, Ŝe w tej ochronie wywoływanej adenowirusem pośredniczą głównie komórki T CD8+. [0013] PoniewaŜ u duŝego procentu osobników istnieje wcześniejsza odporność na ogólnie stosowane wektory adenowirusowe, takie jak adenowirus serotypu (Ad), w dziedzinie opracowano nowe technologie, w których rekombinowane adenowirusy z defektem replikacji oparto o serotypy, które napotykały istniejącą wcześniej odporność w postaci przeciwciał neutralizujących tylko u niewielkiego procentu zdrowych osobników. Serotypy te są ogólnie określane jako serotypy neutralizowane w niskim stopniu albo jako rzadkie serotypy. Stwierdzono, Ŝe szczególnie uŝyteczne były Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad3, Ad48, Ad49 i Ad0 (WO 00/70071; WO 02/4066; WO 04/037294; WO 04/083418; Vogels i in. 03). [0014] Szczepionkę opartą na DNA zawierającą plazmid eksprymujący białko CS z P. falciparum opracowano w Vical, Inc. San Diego, CA, USA i Naval Medical Research Center (Horn i in. 199). Badania na mysim modelu wykazały wywoływanie odpowiedzi CTL i przeciwciał specyficznych wobec antygenu po immunizacji plazmidowym DNA (Doolan i in. 1998). Jednak do tej pory jedyne zastosowanie szczepionek DNA okazało się subop-

6 1 2 3 tymalne do wywoływania ochronnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi. W przypadku stosowania szczepionki DNA stwierdzono, Ŝe zaszczepieni ochotnicy nie wykształcili przeciwciał przeciw białku CS, co stwierdzono w pośrednim teście fluorescencyjnym przeciwciał (IFAT) wobec suszonych na powietrzu sporozoitów i w ELISA wobec rekombinowanych i syntetycznych peptydów (Wang i in. 01), chociaŝ ich odpowiedzi CTL były znaczące. [001] Natomiast, podejście do szczepionek przeciw malarii z RTS,S (oczyszczone białko) (Gordon i in. 199; US 6662; WO 93/12) moŝe wywoływać silną odpowiedź przeciwciał na białko CS (Kester i in. 01; Stoute i in i 1998), przy czym jest takŝe silnym czynnikiem wywołującym odporność komórkową typu Th1 i humoralną. Co najwaŝniejsze, szczepionka ta w sposób powtarzalny chroni w przybliŝeniu połowę biorców. JednakŜe ochrona wywoływana przez RTS,S jest krótkotrwała (Stoute i in. 1998). Immunizacja RTS,S wywołuje przeciwciała przeciw CS i zaleŝne od komórek T CD4+ odpowiedzi IFN-γ, ale słabe, zaleŝne od komórek T CD8+ odpowiedzi CTL lub IFN-γ (Lalvani i in. 1999). JednakŜe wykazano, Ŝe te wywoływane minimalne odpowiedzi CD8+ korelują z ochroną w próbach na ludziach (Sun i in. 03). Polepszanie w sposób racjonalny zatem będzie się skupiać na wzmocnieniu wywoływania odpowiedzi komórek T CD8+ na CS wywoływanych przez RTS,S. [0016] Stoute i in. The Journal of Infectious Disease, 1998, tom 178, strony i Garçon i in. Expert Review of Vaccines, kwiecień 03, tom 2, nr 2, strony ujawnili skuteczność eksperymentalnej szczepionki przeciw sporozoitowi malarii z RTS,S, formułowanej w emulsji typu olej w wodzie z dodatkiem immunostymulatorów, monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny QS2. [0017] W WO 04/0187 ujawniono rekombinowany adenowirus z defektem replikacji, zawierający heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen CS z Plasmodium do stosowania jako szczepionka. [0018] Dotychczas nie sprostano wyzwaniu opracowania szczepionki przeciw malarii tropikalnej o skuteczności ochronnej wynoszącej co najmniej 8%. Zadanie jest szczególnie trudne, poniewaŝ w przeciwieństwie do innych częstych chorób śmiertelnych, takich jak odra lub ospa, wcześniejsze naraŝenie na malarię i rozwinięcie naturalnej odporności nie chroni przed późniejszym zakaŝeniem malarią. Spośród wszystkich przebadanych do dzisiaj szczepionek eksperymentalnych i strategii dostarczania szczepionek, tylko RTS,S konsekwentnie zapewniało pewien poziom ochrony. Inne przebadane szczepionki eksperymentalne były albo niewystarczająco immunogenne, albo immunogenne, ale niewystarczająco ochronne. W tym zgłoszeniu opisano zaplanowane połączenie preparatów szczepio-

7 6 nek przeznaczone do wykorzystania optymalnej immunogenności serologicznej podejścia białko/adiuwant wraz z doskonałym wywoływaniem odpowiedzi komórkowych zapewnionym przez rekombinowane wektory adenowirusowe z defektem replikacji KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0019] Figura 1. Heterologiczne tryby szczepienia pierwotnego/przypominającego, a następnie pomiar odpowiedzi komórek T w analizach IFN-γ ELISPOT, związanej z C-końcem CS. Odpowiedzi zmierzono dwa tygodnie po końcowym szczepieniu przypominającym. Poziome słupki przedstawiają średnie geometryczne. Figura 2. Odpowiedź komórek T zmierzona w analizach IFN-γ ELISPOT, związana z C-końcem CS. Odpowiedź zmierzono trzy miesiące po końcowym szczepieniu przypominającym. Poziome słupki przedstawiają średnie geometryczne. Figura 3. Odpowiedź przeciwciał zmierzona w teście ELISA, związana z regionem powtórzeń CS, dwa tygodnie po szczepieniu przypominającym. Poziome słupki przedstawiają średnie geometryczne. Figura 4. Odpowiedź przeciwciał zmierzona w teście ELISA, związana z regionem powtórzeń CS, trzy miesiące po szczepieniu przypominającym. Poziome słupki przedstawiają średnie geometryczne. Figura. Odpowiedź komórek T w doświadczeniach ze szczepieniem pierwotnym rekombinowanym wektorem Ad3-CS i szczepieniem przypominającym RTS,S lub Ad3-CS, zmierzona w IFN-γ ELISpot po dwóch tygodniach (z lewej) lub po trzech miesiącach (z prawej). Homologiczny tryb szczepienia pierwotnego/przypominającego /przypominającego RTS,S/RTS,S/RTS,S stosowano jako odniesienie. Figura 6. Odpowiedź przeciwciał w doświadczeniach ze szczepieniem pierwotnym rekombinowanym wektorem Ad3-CS i szczepieniem przypominającym RTS,S lub Ad3-CS, zmierzona w teście ELISA po dwóch tygodniach (z lewej) lub po trzech miesiącach (z prawej). Homologiczny tryb szczepienia pierwotnego/przypominającego /przypominającego RTS,S/RTS,S/RTS,S stosowano jako odniesienie. Figura 7. Odpowiedź komórek T w doświadczeniach ze szczepieniem przypominającym rekombinowanym wektorem Ad3-CS i szczepieniem pierwotnym RTS,S lub Ad-CS, zmierzona po dwóch tygodniach (z lewej) lub po trzech miesiącach (z prawej). Homologiczny tryb szczepienia pierwotnego/przypominającego/przypominającego RTS,S/RTS,S/RTS,S stosowano jako odniesienie. Figura 8. Odpowiedź przeciwciał w doświadczeniach ze szczepieniem przypominającym rekombinowanym wektorem Ad3-CS i szczepieniem pierwotnym RTS,S lub

8 Ad-CS, zmierzona po dwóch tygodniach (z lewej) lub po trzech miesiącach (z prawej). Homologiczny tryb szczepienia pierwotnego/przypominającego/przypominającego RTS,S/RTS,S/RTS,S stosowano jako odniesienie. Figura 9. Odpowiedź komórek T zmierzona w analizach IFN-γ ELISPOT, związana z N-końcem CS, dwa tygodnie po szczepieniu przypominającym. Poziome słupki przedstawiają średnie geometryczne. Figura. Odpowiedź komórek T zmierzona w analizach IFN-γ ELISPOT, związana z N-końcem CS, trzy miesiące po szczepieniu przypominającym. Poziome słupki przedstawiają średnie geometryczne. Figura 11. Odpowiedź komórek T wobec N-końca w doświadczeniach ze szczepieniem pierwotnym rekombinowanym wektorem Ad3-CS i szczepieniem przypominającym RTS,S lub Ad3-CS, zmierzona po dwóch tygodniach (z lewej) lub po trzech miesiącach (z prawej). Homologiczny tryb szczepienia pierwotnego/przypominającego/przypominającego RTS,S/RTS,S/RTS,S stosowano jako odniesienie. Figura 12. Odpowiedź komórek T wobec N-końca w doświadczeniach ze szczepieniem przypominającym rekombinowanym wektorem Ad3-CS i szczepieniem pierwotnym RTS,S lub Ad-CS, zmierzona po dwóch tygodniach (z lewej) lub po trzech miesiącach (z prawej). Homologiczny tryb szczepienia pierwotnego/przypominającego/przypominającego RTS,S/RTS,S/RTS,S stosowano jako odniesienie. STRESZCZENIE WYNALAZKU [00] Wynalazek dotyczy zestawu części zawierającego rekombinowany adenowirus z defektem replikacji w odpowiedniej zaróbce, który to adenowirus zawiera heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen circumsporozoitowy (CS) z pasoŝyta wywołującego malarię; i adiuwantowany antygen białkowy, korzystnie takŝe z pasoŝyta wywołującego malarię; przy czym ten rekombinowany adenowirus jest wybrany z grupy obejmującej ludzki adenowirus serotypu 11, 24, 26, 34, 3, 48, 49 i 0. Korzystny antygen białkowy obejmuje RTS,S. Korzystnie pasoŝytem wywołującym malarię jest Plasmodium falciparum. [0021] W innej postaci wynalazek dotyczy takŝe zastosowania rekombinowanego adenowirusa z defektem replikacji, zawierającego heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen CS z pasoŝyta wywołującego malarię, i adiuwantowanego antygenu białkowego, korzystnie z pasoŝyta wywołującego malarię, takiego jak Plasmodium falciparum, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki malarii, przy czym tego rekombinowanego adenowirusa stanowi małpi adenowirus lub ludzki adenowirus serotypu 11, 24, 26, 34, 3, 48, 49 lub 0.

9 [0022] Wynalazek ujawnia pewne korzystne tryby szczepienia pierwotnego-przypominającego, w których korzystnie rekombinowanego adenowirusa z defektem replikacji stosuje się jako kompozycję do szczepienia pierwotnego, a adiuwantowany antygen białkowy stosuje się jako kompozycję do szczepienia przypominającego. [0023] Wynalazek dotyczy takŝe sposobu szczepienia ssaka przeciw zakaŝeniu malarią obejmującego etapy szczepienia pierwotnego tego ssaka rekombinowanym adenowirusem z defektem replikacji w odpowiedniej zaróbce, który to adenowirus zawiera heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen CS z pasoŝyta wywołującego malarię; i szczepienia przypominającego tego ssaka adiuwantowanym antygenem białkowym, korzystnie RTS,S. OPIS SZCZEGÓŁOWY [0024] Niniejszy wynalazek dotyczy zestawu części zawierającego rekombinowany adenowirus z defektem replikacji w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce, który to adenowirus zawiera heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen circumsporozoitowy (CS) z pasoŝyta wywołującego malarię; i adiuwantowany antygen białkowy; przy czym ten rekombinowany adenowirus jest wybrany z grupy obejmującej ludzki adenowirus serotypu 11, 24, 26, 34, 3, 48, 49 i 0. Korzystnie tego rekombinowanego adenowirusa stanowi ludzki adenowirus serotypu 3. Korzystny jest równieŝ zestaw według wynalazku, w którym ten antygen białkowy zawiera białko CS, lub jego immunogenny fragment, z paso- Ŝyta wywołującego malarię. Ten antygen białkowy zawiera korzystnie białko hybrydowe białka CS lub jego immunogennego fragmentu, połączonych z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg), w postaci cząstek lipoproteinowych z HbsAg. W kolejnej korzystnej postaci antygen białkowy obejmuje RTS,S. RównieŜ korzystnie ten antygen białkowy jest adiuwantowany QS21 i 3D-MPL, korzystnie w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol. [002] ChociaŜ w dziedzinie wiadomo, Ŝe róŝne pasoŝyty wywołują malarię u ludzi, jedną postać niniejszego wynalazku stanowi zestaw części według wynalazku, w którym tym pasoŝytem wywołującym malarię jest Plasmodium falciparum. [0026] Dla właściwych odpowiedzi immunologicznych korzystnie ten heterologiczny kwas nukleinowy ma zoptymalizowane kodony w celu zwiększonego wytwarzania kodowanego białka u ssaka, korzystnie u człowieka. Rekombinowany adenowirus moŝe występować w mieszaninie z adiuwantem. [0027] Przeciętni fachowcy w dziedzinie świetnie zdają sobie sprawę z przydatności małpich adenowirusów do stosowania w terapii genowej lub szczepionkach dla ludzi. Poza tym stwierdzono, Ŝe inne adenowirusy inne niŝ ludzkie, takie jak psie i bydlęce adenowirusy zakaŝają ludzkie komórki in vitro, a zatem są przydatne do zastosowań u ludzi, ponie-

10 waŝ ich seroprewalencja jest niska w próbkach od ludzi. Zatem wynalazek dotyczy takŝe zestawu części zawierającego rekombinowany małpi, psi lub bydlęcy adenowirus z defektem replikacji w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce, który to adenowirus zawiera heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen circumsporozoitowy (CS) z Plasmodium falciparum o zoptymalizowanych kodonach; i adiuwantowany antygen białkowy obejmujący RTS,S, przy czym korzystnie ten antygen białkowy jest adiuwantowany QS21 i 3D- MPL, korzystnie w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol. [0028] W niniejszym wynalazku ujawnia się, Ŝe pewne tryby szczepienia pierwotnegoprzypominającego zapewniają nieoczekiwane i wyraźne wyniki w odniesieniu do odpowiedzi immunologicznych, jeŝeli róŝne składniki ujawnionego zestawu części podaje się w pewnej kolejności. Zatem wynalazek dotyczy takŝe zestawu części według wynalazku, w którym ten rekombinowany adenowirus z defektem replikacji stanowi kompozycję do szczepienia pierwotnego, a ten adiuwantowany antygen białkowy stanowi kompozycję do szczepienia przypominającego. Odpowiedź immunologiczna wyzwalana pojedynczym podaniem szczepionki (szczepienie pierwotne) często nie jest wystarczająco silna i/lub trwała, aby zapewnić skuteczną ochronę. Powtórzone podanie (szczepienie przypominające) moŝe istotnie zwiększyć odpowiedzi, humoralną i komórkową, na antygeny szczepionkowe (np. patrz Estcourt i in. 02). [0029] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania rekombinowanego adenowirusa z defektem replikacji, zawierającego heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen CS z pasoŝyta wywołującego malarię, i adiuwantowanego antygenu białkowego do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki malarii, przy czym tego rekombinowanego adenowirusa stanowi małpi, psi, bydlęcy adenowirus lub ludzki adenowirus serotypu 11, 24, 26, 34, 3, 48, 49 lub 0, przy czym korzystnie ten rekombinowany adenowirus z defektem replikacji stosuje się jako kompozycję do szczepienia pierwotnego, a ten adiuwantowany antygen białkowy stosuje się jako kompozycję do szczepienia przypominającego. Według jednej postaci wynalazku, dotyczy to zastosowania według wynalazku, w którym antygen białkowy zawiera białko CS, lub jego immunogenny fragment, z pasoŝyta wywołującego malarię, korzystnie Plasmodium falciparum. Ten antygen białkowy korzystnie zawiera białko hybrydowe białka CS lub jego immunogennego fragmentu, połączonych z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg), w postaci cząstek lipoproteinowych z HbsAg. RTS,S stanowi korzystny adiuwantowany antygen białkowy, a korzystnym adiuwantem jest QS21 i 3D-MPL, korzystnie w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol. [00] Dla optymalnej ekspresji, a następnie optymalnych odpowiedzi immunologicznych

11 1 2 3 u ssaków, korzystnie u ludzi, heterologiczny kwas nukleinowy stosowany w niniejszym wynalazku ma zoptymalizowane kodony w celu zwiększonego wytwarzania kodowanego białka u ssaka, korzystnie u człowieka. [0031] W jeszcze innej postaci niniejszy wynalazek dotyczy sposobu szczepienia ssaka przeciw zakaŝeniu malarią, obejmującego etapy szczepienia pierwotnego tego ssaka rekombinowanym adenowirusem z defektem replikacji w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce, który to adenowirus zawiera heterologiczny kwas nukleinowy kodujący antygen CS z pasoŝyta wywołującego malarię; i szczepienia przypominającego tego ssaka adiuwantowanym antygenem białkowym zawierającym białko hybrydowe białka CS lub jego immunogennego fragmentu, połączonych z HbsAg, w postaci cząstek lipoproteinowych z HbsAg. Antygen białkowy korzystnie obejmuje RTS,S, przy czym korzystnym adiuwantem jest QS21 i 3D-MPL, korzystnie w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol, podczas gdy korzystnym pasoŝytem wywołującym malarię jest Plasmodium falciparum. [0032] Korzystne adenowirusy stosowane do wytwarzania rekombinowanego adenowirusa i stosowane w sposobach według niniejszego wynalazku mogą stanowić ludzkie adenowirusy lub adenowirusy inne niŝ ludzkie, takie jak małpie, psie i bydlęce adenowirusy, poniewaŝ wysoce korzystne jest stosowanie adenowirusów, które nie napotkają istniejącej wcześniej odporności u gospodarza (będącego człowiekiem), któremu ma być podawany rekombinowany wirus. Małpie adenowirusy i pewne serotypy ludzkich adenowirusów są bardzo odpowiednie w tym celu, jak to ujawniono w niniejszym opisie. Korzystne ludzkie adenowirusy stosowane w sposobach, zastosowaniach i w zestawie części według wynalazku stanowią ludzkie adenowirusy serotypów 11, 24, 26, 34, 3, 48, 49 i 0. [0033] Wynalazek dotyczy takŝe sposobu szczepienia ssaka przeciw zakaŝeniu malarią z zastosowaniem zestawu części według wynalazku. Gdy zestaw części według wynalazku stosuje się do szczepienia ssaka przeciw zakaŝeniu malarią z zastosowaniem ujawnionego tutaj korzystnego trybu szczepienia pierwotnego/przypominającego, korzystnie po szczepieniu przypominającym wykonuje się jedno lub większą liczbę kolejnych szczepień przypominających. [0034] Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania rekombinowanego adenowirusa jako nośnika co najmniej jednego antygenu malarii i stosowanego w heterologicznym połączeniu z jednym adiuwantowanym białkiem w trybie szczepienia pierwotnego/przypominającego. Nieoczekiwanie stwierdzono, Ŝe połączenie wektora wirusowego i adiuwantowanego białka w heterologicznym trybie szczepienia pierwotnego/przypominającego zapewnia lepszą odpowiedź immunologiczną u naczelnych w odniesieniu do początkowych odpowiedzi komórek T i trwałości odpowiedzi immunologicz-

12 nych. W szczególności stwierdzono, Ŝe szczepienie pierwotne ssaka wektorem wirusowym niosącym kwas nukleinowy kodujący antygen, a następnie kolejne szczepienie przypominające, albo w pojedynczym, albo w wielu wstrzyknięciach adiuwantowanego antygenu białkowego zapewnia lepsze wyniki pod względem oceny jakościowej i/lub ilościowej odpowiedzi immunologicznych. Korzystne wektory wirusowe stanowią wektory adenowirusowe, korzystniej ludzkie wektory adenowirusowe, a jeszcze korzystniej ludzkie wektory adenowirusowe, które napotkają niskie poziomy aktywności neutralizującej u ssaków jako gospodarzy, którym są podawane. Bardzo korzystnymi serotypami adenowirusów są 11, 24, 26, 34, 3, 48, 49 i 0. [003] Według jednej korzystnej postaci, antygen białkowy i antygen kodowany przez wektor wirusowy stanowią antygeny malarii, korzystniej białko circumsporozoitowe (CS) z Plasmodium falciparum, lub jego immunogenne pochodne i/lub fragmenty. Jako jeden przykład tej koncepcji, polipeptyd jest kodowany przez wektor wirusowy zawierający kwas nukleinowy kodujący białko CS z P. falciparum, w tym część N-końcową, region powtórzeń w części centralnej i część C-końcową (z delecją 14 najbardziej C-końcowych aminokwasów: sekwencji kotwiczącej GPI), zaś antygen białkowy zawiera konstrukt RTS,S, w którym brakuje regionu N-końcowego. [0036] Adiuwantowany antygen białkowy do stosowania w dowolnym lub wszystkich aspektach wynalazku moŝe zawierać białko CS z P. falciparum, lub jego immunogenny fragment, które mogą być w postaci białka fuzyjnego. Przykładowo antygen moŝe zawierać białko hybrydowe białka CS lub immunogennego fragmentu, połączonych z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), które to białko hybrydowe moŝe być eksprymowane w prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarzach i moŝe mieć postać cząstek lipoproteinowych. Białko fuzyjne moŝe zawierać przykładowo zasadniczo całą część C-końcową białka CS, cztery lub większą liczbę powtórzeń tandemowych regionu immunodominującego i antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Przykładowo białko hybrydowe zawiera sekwencję zawierającą co najmniej 160 aminokwasów, która jest zasadniczo homologiczna z częścią C-końcową białka CS i moŝe być pozbawiona końcowych aminokwasów z C-końca białka CS, przykładowo ostatnich do 12 aminokwasów. Białko hybrydowe moŝe być w postaci mieszanych cząstek lipoproteinowych, przykładowo z HBsAg. [0037] W szczególności dostarcza się białko hybrydowe ujawnione w WO 93/12, oznaczone tam jako RTS*, ale nazywane tutaj jako RTS, które moŝe być w postaci mieszanych cząstek lipoproteinowych z HBsAg, oznaczonych w tutaj jako RTS,S. Stosunek białko hybrydowe: antygen S w tych mieszanych cząstkach wynosi przykładowo 1:4.

13 [0038] Białko hybrydowe oznaczone tutaj jako RTS wytworzono z zastosowaniem sekwencji genu białka CS z P. falciparum NF4 (klon 3D7; Caspers i in. 1989) i zawiera ono zasadniczo cały region 7 do 39 białka CS z P. falciparum NF4. Część sekwencji białka CS z NF4 (3D7) włączoną w RTS stanowi następująca sekwencja 189 aminokwasów: DPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNKNNQG NGQGHNMPND PNRNVDENAN ANSAVKNNNN EEPSDKHIKE YLNKIQNSLS TEWSPCSVTC GNGIQVRIKP GSANKPKDEL DYANDIEKKI CKMEKCSSVF NVVNSSIGL (SEQ ID NO: 1). [0039] W szczególności RTS to: Reszta metioniny kodowana przez nukleotydy 9-61 pochodzące z sekwencji genu TDH3 Sacchromyces cerevisiae (nukleotydy 1-8 w tej ramce odczytu tworzą sam promotor TDH3). (Musti i in. 1983). Trzy aminokwasy: Met Ala Pro, pochodzące z sekwencji nukleotydowej (62-70) wytworzonej w procedurze klonowania stosowanej do konstrukcji genu hybrydowego. Obszar 189 aminokwasów (podanych powyŝej, SEQ ID NO:1), kodowanych przez odpowiadające aminokwasom 7 do 39 białka CS ze szczepu NF4 P. falciparum (klon 3D7; Caspers i in. 1989). Aminokwas (Gly) kodowany przez nukleotydy 1638 do 1640, wytworzone w procedurze klonowania stosowanej do konstrukcji genu hybrydowego. Cztery aminokwasy, Pro Val Thr Asn, kodowane przez nukleotydy 1641 do 162, i odpowiadające czterem resztom z końca karboksylowego białka pres2 wirusa zapalenia wątroby typu B (serotypu adw) (Valenzuela i in. 1979). Obszar 226 aminokwasów, kodowanych przez nukleotydy 163 do 23, i określających białko S wirusa zapalenia wątroby typu B (serotypu adw) (Valenzuela i in. 1979). [0040] RTS moŝe być w postaci mieszanych cząstek RTS,S, w których stosunek RTS:S wynosi przykładowo 1:4. [0041] ChociaŜ wynalazek nie jest ograniczony w Ŝaden sposób do antygenów malarii, zostanie on obecnie opisany bardzo szczegółowo w odniesieniu do zastosowania wektorów wirusowych kodujących antygen malarii w połączeniu z adiuwantowanym antygenem białkowym malarii. Fachowcy w dziedzinie będą w stanie zmodyfikować dostarczone tutaj ogólne informacje z zastosowaniem róŝnych insertów antygenowych i odpowiednich antygenów białkowych z innych czynników patogennych, obejmujących pasoŝyty, bakterie, wirusy, droŝdŝe, lub nawet własne antygeny, w tym, ale nie wyłącznie, antygenów nowotworowych (np. PSA, gp0, CEA, MUC1, Her2/neu) i tym podobnych). [0042] Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego wektora adenowirusowego z de-

14 fektem replikacji zawierającego heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą antygen z Plasmodium falciparum. W korzystnej postaci ten wektor wirusowy stanowi adenowirus pochodzący z serotypu wybranego z grupy obejmującej: Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad3, Ad48, Ad49 i Ad0. Taki wybór ludzkich adenowirusów został podyktowany tym, Ŝe zastosowanie adenowirusów ogólnie jako wektorów szczepionkowych jest zazwyczaj hamowane przez fakt regularnego zakaŝania ludzi adenowirusami typu dzikiego, które powodują łagodne lub bezobjawowe choroby, takie jak przeziębienie. Odpowiedzi immunologiczne wytwarzane podczas takiego zakaŝenia macierzystym serotypem typu dzikiego mogą negatywnie wpływać na skuteczność serotypu rekombinowanego adenowirusa, gdy stosuje się go jako późniejszy rekombinowany wektor szczepionkowy, tak jak w szczepionce przeciw malarii, w której stosuje się adenowirusy. Rozpowszechnienie róŝnych serotypów adenowirusów w światowej populacji ludzi róŝni się na róŝnych obszarach geograficznych. Ogólnie, korzystne serotypy napotykają niską aktywność neutralizującą u gospodarzy w większej części świata, co przedstawiono w kilku doniesieniach w dziedzinie. [0043] Wynalazcy niniejszego wynalazku wytworzyli obecnie nowe połączenie pomiędzy rekombinowanym adenowirusem a oczyszczonym białkiem w sekwencyjnym schemacie szczepień, określanym jako heterologiczne szczepienie pierwotne/przypominające, który to schemat wykorzystuje róŝne odpowiedzi immunologiczne, wywoływane przez róŝne składniki szczepionki pierwotnej/przypominającej. Na wybór rekombinowanego wektora ma wpływ to, Ŝeby napotykał on aktywność neutralizującą u niewielkiego procentu populacji ludzi potrzebujących szczepienia. Nieoczekiwanie połączenie przenoszonego przez adenowirus antygenu i adiuwantowanego antygenu białkowego zapewnia znaczącą poprawę odpowiedzi immunologicznych w stosunku do tych obserwowanych w przypadku stosowania którejkolwiek ze szczepionek samodzielnie. Zwiększenie odporności ilustruje wykrycie in vitro odpowiedzi immunologicznych wywołanych in vivo u makaków rezus, jak tutaj ujawniono. [0044] W innej postaci rekombinowany adenowirus z defektem replikacji stanowi małpi adenowirus, taki jak wyizolowany z szympansa. Odpowiednie przykłady obejmują C68 (znany takŝe jako Pan 9; US ) oraz Pan, 6 i 7 (WO 03/046124). [004] W jednym szczególnym aspekcie wynalazku rekombinowany wektor wirusowy z defektem replikacji zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko CS lub jego immunogenną część lub fragment. Korzystnie ta heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego ma zoptymalizowane kodony dla podwyŝszonej ekspresji u ssaka, korzystnie u człowieka. Optymalizacja kodonów opiera się na wymaganej zawartości aminokwasów, ogólnym optymalnym wykorzystaniu kodonów u danego ssaka i szeregu aspektów, któ-

15 rych naleŝy unikać aby zapewnić prawidłową ekspresję. Takie aspekty mogą stanowić miejsca donorowe lub akceptorowe splicingu, kodony stop, miejsca Chi, obszary poli(a), sekwencje bogate w GC i AT, wewnętrzne kasety TATA i tak dalej. Sposoby optymalizacji kodonów dla ssaków jako gospodarzy są dobrze znane fachowcom i moŝna je znaleźć w wielu pozycjach literaturowych z biologii molekularnej. [0046] W korzystnej postaci wynalazek dotyczy rekombinowanego wektora adenowirusowego z defektem replikacji według wynalazku, przy czym zawartość adeniny i tyminy w tym heterologicznym kwasie nukleinowym, w porównaniu do zawartości cytozyny i guaniny, wynosi poniŝej 87%, korzystnie poniŝej 80%, korzystniej poniŝej 9%, a najkorzystniej wynosi około 4%. Wynalazek dostarcza w jednej postaci rekombinowany wektor adenowirusowy z defektem replikacji, przy czym białko CS stanowi dowolne z białek CS ujawnionych w WO 04/0187, najkorzystniej białko CS z P. falciparum lub jego immunogenny fragment. [0047] Wytwarzanie rekombinowanych wektorów adenowirusowych niosących heterologiczne geny jest dobrze znane w dziedzinie i zazwyczaj obejmuje zastosowanie pakującej linii komórkowej, konstruktów adapterowych i kosmidów oraz delecji co najmniej funkcjonalnej części regionu E1 z genomu adenowirusa (patrz równieŝ poniŝej, układy pakujące i korzystne linie komórkowe). [0048] Wynalazek dotyczy takŝe zestawów zawierających jako składniki z jednej strony rekombinowany wektor adenowirusowy, który napotyka niską aktywność neutralizującą u gospodarza, a z drugiej strony oczyszczone białko, przy czym korzystnie oczyszczone białko dostarcza się w mieszaninie z adiuwantem. Korzystny adiuwant stanowi QS21 i 3D- MPL, korzystnie w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol. Składniki stosuje się w heterologicznej strategii dostarczania szczepionki pierwotnej/przypominającej, w której korzystnie najpierw podaje się rekombinowany wektor adenowirusowy jako środek do szczepienia pierwotnego, a następnie oczyszczone białko jako środek do szczepienia przypominającego, które to szczepienie przypominające moŝna powtarzać więcej niŝ raz. Składniki utrzymuje się zazwyczaj w farmaceutycznie dopuszczalnych nośnikach. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki są dobrze znane w dziedzinie i szeroko stosowane w du- Ŝym zakresie produktów terapeutycznych. Korzystnie stosuje się nośniki dopasowane do szczepionek. Korzystniejsze są szczepionki zawierające ponadto adiuwant. Adiuwanty są znane w dziedzinie z tego, Ŝe dodatkowo zwiększają odpowiedź immunologiczną na stosowany antygen. Wynalazek dotyczy równieŝ zastosowania zestawu według wynalazku w postępowaniu terapeutycznym, profilaktycznym lub diagnostycznym względem malarii. [0049] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu leczenia zakaŝenia malarią u ssaka lub pro-

16 filaktyki zakaŝenia malarią u ssaka, który to sposób obejmuje (w dowolnej kolejności lub jednocześnie) etapy podawania rekombinowanego adenowirusa niosącego antygen z P. falciparum; i podawania co najmniej jednego oczyszczonego białka P. falciparum, przy czym to białko jest zmieszane z adiuwantem. Korzystnie rekombinowany adenowirus jest wybrany z grupy obejmującej Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad3, Ad48, Ad49 i Ad0, podczas gdy równieŝ korzystnie rekombinowany adenowirus niesie gen kodujący białko CS lub jego immunogenny fragment. Korzystne oczyszczone białko stosowane w połączeniu z rekombinowanym adenowirusem stanowi RTS,S, a korzystnym adiuwantem jest QS21 i 3D-MPL, korzystnie w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol. [000] Siłą napędową powodującą rozwinięcie odpowiedzi immunologicznych są cytokiny, szereg zidentyfikowanych białek informacyjnych, które słuŝą do wspomagania komórek układu immunologicznego i sterują ostateczną odpowiedzią immunologiczną w stronę odpowiedzi Th1 albo Th2. Zatem wysokie poziomy cytokin typu Thl wykazują tendencję do sprzyjania wywoływaniu komórkowych odpowiedzi immunologicznych na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 wykazują tendencję do sprzyjania w wywoływaniu humoralnych odpowiedzi immunologicznych na antygen. WaŜne aby pamiętać, Ŝe rozróŝnienie odpowiedzi immunologicznych typu Th1 i Th2 nie jest zupełne. W rzeczywistości osobnik podtrzymuje odpowiedź immunologiczną, którą opisuje się jako przewaŝająco Th1 lub przewaŝająco Th2. JednakŜe często dogodnie jest rozwaŝać rodziny cytokin w kategoriach opisanych dla klonów mysich komórek T CD4+ przez Mosmann i Coffman (1989). Tradycyjnie, odpowiedzi typu Th1 wiąŝe się z wytwarzaniem cytokin INF-γ i IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny, często bezpośrednio związane z wywoływaniem odpowiedzi immunologicznych typu Th1, nie są wytwarzane przez komórki T, tak jak IL-12. W przeciwieństwie do tego, odpowiedzi typu Th2 wiąŝe się z wydzielaniem IL- 4, IL-, IL-6, IL- i czynnika martwicy nowotworu (TNF-ss). [001] Odpowiednie adiuwanty do stosowania w wynalazku obejmują sole glinu, takie jak Ŝel z wodorotlenku glinu (ałun) lub fosforan glinu, ale moŝe je równieŝ stanowić sól wapnia, Ŝelaza, cynku, lub mogą stanowić nierozpuszczalną zawiesinę acylowanej tyrozyny lub acylowanych cukrów, kationowo lub anionowo derywatyzowanych polisacharydów, polifosfazenów, lub liposomy typu montanide. [002] W preparacie szczepionek do stosowania w wynalazku, w kontekście wektora adenowirusowego, adiuwant moŝe, ale nie musi, być podawany. W przypadku białkowego składnika połączenia, kompozycję adiuwanta moŝna wybrać tak, aby wywoływała preferencyjną odpowiedź Th1. Ponadto wywoływane mogą być takŝe inne odpowiedzi, w tym inne odpowiedzi humoralne.

17 [003] Pewne adiuwanty szczepionkowe są szczególnie odpowiednie stymulacji odpowiedzi cytokin typu Th1 albo Th2. Tradycyjnie najlepsze wskaźniki równowagi Th1:Th2 odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu lub zakaŝeniu obejmują bezpośredni pomiar wytwarzania cytokin Th1 lub Th2 przez limfocyty T in vitro po ponownej stymulacji antygenem i/lub pomiar stosunku IgG1:IgG2a specyficznej wobec antygenu odpowiedzi przeciwciał. Zatem adiuwantem typu Th1 jest taki, który stymuluje izolowane populacje komórek T do wytwarzania wysokich poziomów cytokin typu Th1 po ponownej stymulacji antygenem in vitro i wywołuje specyficzne wobec antygenu odpowiedzi immunoglobulin związane z izotypem typu Th1. Przykładowo immunostymulatory typu Th1, które moŝna formułować w celu wytworzenia adiuwantów odpowiednich do stosowania w niniejszym wynalazku, mogą obejmować monofosforylolipid A, w szczególności 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL). 3D-MPL jest dobrze znanym adiuwantem wytwarzanym przez Ribi Immunochem, Montana. Z chemicznego punktu widzenia, jest on często dostarczany w postaci mieszaniny 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A z 4, lub 6 acylowanymi łańcuchami. MoŜna go oczyszczać i wytwarzać sposobami podanymi w GB 21224B, w którym to dokumencie ujawniono takŝe wytwarzanie difosforylolipidu A i jego 3-O-deacylowanej odmiany. Zostały opisane inne oczyszczone i syntetyczne lipopolisacharydy (opis patentowy US , EP B1, EP B1). W jednej postaci 3D-MPL jest w formie preparatu w postaci cząstek o małej wielkości cząstek, poniŝej 0,2 µm średnicy, a sposób jego wytwarzania ujawniono w EP [004] Saponiny stanowią kolejny przykład immunostymulatorów Th1, które moŝna stosować z wynalazkiem. Saponiny są dobrze znanymi adiuwantami. Przykładowo Quil A (pochodząca z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) i jej frakcje opisano w patencie US 0740 i EP B1. Jako silne adiuwanty ogólnoustrojowe opisano hemolityczne saponiny QS21 i QS17 (frakcje Quil A oczyszczone metodą HPLC), a sposób ich wytwarzania ujawniono w patencie US 0740 i EP B1. W tych dokumentach opisano takŝe zastosowanie QS7 (niehemolitycznej frakcji Quil-A), która słuŝy jako silny adiuwant do szczepionek ogólnoustrojowych. Znane są równieŝ połączenia QS21 i polisorbatu lub cyklodekstryny (WO 99/008). Układ adiuwantowy w postaci cząstek zawierający frakcje Quil A, takie jak QS21 i QS7, opisano w WO 96/33739 i WO 96/ [00] Jeszcze innym przykładem immunostymulatora jest immunostymulujący oligonukleotyd zawierający niemetylowane dinukleotydy CpG ( CpG ). CpG to skrót dla motywów dinukleotydowych cytozyna-guanozyna obecnych w DNA. CpG jest znany w dziedzinie jako adiuwant po podaniu zarówno drogą ogólnoustrojową, jak i śluzówkową (WO 96/02, EP 0468). Historycznie obserwowano, Ŝe frakcje DNA prątka Calmette a-

18 Guerina (BCG) mogą wywierać działanie przeciwnowotworowe. W dalszych badaniach wykazano, Ŝe syntetyczne oligonukleotydy pochodzące z sekwencji genów BCG są zdolne do wywoływania działań immunostymulujących (zarówno in vitro, jak i in vivo). Autorzy tych badań wywnioskowali, Ŝe aktywność tę niosły pewne sekwencje palindromowe, obejmujące centralny motyw CG. Szczegółowa analiza wykazała, Ŝe motyw CG musi występować w pewnym kontekście sekwencji i Ŝe takie sekwencje są częste w bakteryjnym DNA, ale rzadkie w DNA kręgowców. Immunostimulującą sekwencję stanowi często: puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna; przy czym motyw CG nie jest metylowany, ale znane są inne niemetylowane sekwencje CpG będące immunostymulującymi i moŝna je stosować w niniejszym wynalazku. [006] Palindromowe sekwencje mogą występować w pewnych kombinacjach sześciu nukleotydów. W tym samym oligonukleotydzie moŝe występować szereg tych motywów, zarówno w postaci powtórzeń jednego motywu, jak i jako kombinacja róŝnych motywów. Obecność oligonukleotydów zawierających jedną lub większą liczbę tych sekwencji immunostymulujących moŝe aktywować róŝne podzestawy immunologiczne, w tym komórki NK (wytwarzające interferon y i wykazujące aktywność cytolityczną) i makrofagi. Wykazano, Ŝe inne niemetylowane sekwencje zwierające CpG, niezawierające tej sekwencji konsensusowej równieŝ są immunomodulujące. Gdy jest formułowany w szczepionki, CpG zazwyczaj podaje się w postaci wolnej w roztworze wraz z wolnym antygenem (WO 96/02, 68) lub kowalencyjnie sprzęŝony z antygenem (WO 98/16247) albo jest formułowany z nośnikiem, takim jak wodorotlenek glinu (antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby). [007] Takie immunostymulatory, jak opisane powyŝej, moŝna formułować wraz z nośnikami, takimi jak przykładowo liposomy, emulsje typu olej w wodzie i/lub sole metali, w tym sole glinu (takie jak wodorotlenek glinu). Przykładowo 3D-MPL moŝna formułować z wodorotlenkiem glinu (EP ) lub emulsjami typu olej w wodzie (WO 9/172); QS21 moŝna korzystnie formułować z liposomami zawierającymi cholesterol (WO 96/33739), emulsjami typu olej w wodzie (WO 9/172) lub ałunem (WO 98/1287); CpG moŝna formułować z ałunem lub z innymi nośnikami kationowymi. [008] MoŜna takŝe stosować połączenia immunostymulatorów, takie jak połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny (WO 94/0013; WO 9/172; WO 96/33739; WO 98/6414; WO 98/03; WO 99/126; WO 99/11241) lub połączenie QS21 i 3D- MPL ujawnione w WO 94/0013. Alternatywnie w niniejszym wynalazku moŝna takŝe stosować połączenie CpG z saponiną, taką jak QS21. Zatem odpowiednie układy adiuwantowe obejmują przykładowo połączenie monofosforylolipidu A, takiego jak 3D-MPL,

19 wraz z solą glinu. Inna postać łączy monofosforylolipid A i pochodną saponiny, tak jak połączenie QS21 i 3D-MPL ujawnione w WO 94/0013, albo mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest wygaszana w liposomach zawierających cholesterol (DQ), jak ujawniono w WO 96/ Jeszcze inne preparaty adiuwanta obejmujące QS21, 3D-MPL oraz tokoferol w emulsji typu olej w wodzie opisano w WO 9/172. W innej postaci oligonukleotydy CpG stosuje się same lub wraz z solą glinu. [009] Odpowiedni adiuwant do stosowania w niniejszym wynalazku stanowi adiuwant preferencyjnie stymulujący Th1, przykładowo adiuwant zawierający saponinę, taką jak QS21, lub pochodną monofosforylolipidu A, taką jak 3D-MPL, albo adiuwant zawierający obie te substancje ewentualnie wraz z liposomami zawierającymi cholesterol. Połączenie QS21 i 3D-MPL w preparacie z liposomami zawierającymi cholesterol opisano przykładowo WO 96/ [0060] Korzyści z niniejszego wynalazku są wielostronne. Rekombinowane wirusy, takie jak rekombinowane adenowirusy, moŝna wytwarzać w bardzo wysokich mianach z zastosowaniem komórek, które uwaŝa się za bezpieczne i które mogą rosnąć w zawiesinie w bardzo wysokich objętościach z zastosowaniem poŝywki niezawierającej Ŝadnych składników pochodzących od człowieka lub zwierząt. Ponadto wiadomo, Ŝe rekombinowane adenowirusy wywołują powaŝną odpowiedź immunologiczną przeciw białku kodowanemu przez heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego w genomie adenowirusa. Niniejszy wynalazek łączy te cechy wektora niosącego gen circumsporozoitowy P. falciparum z zastosowaniem adiuwantowanego białka do wzmacniania odpowiedzi. Ponadto w genie zoptymalizowano kodony w celu uzyskania poziomu ekspresji odpowiedniego dla otrzymywania właściwej odpowiedzi immunologicznej u ludzi. Niniejszy wynalazek dostarcza szczepionkę przeciw zakaŝeniom malarią, w której wykorzystuje się adenowirusy, które nie napotykają wysokich mian przeciwciał neutralizujących. Szczególnie korzystne adenowirusy w tym celu są serotypu 11 i 3 (Ad11 i Ad3, patrz WO 00/70071 i WO 02/4066). [0061] Zawartość kwasu nukleinowego róŝni się bardzo między patogenem wywołującym malarię, takim jak P. falciparum, i danym gospodarzem, takim jak Homo sapiens. Wynalazek dostarcza kwasy nukleinowe o zoptymalizowanych kodonach, zapewniające wyŝsze poziomy ekspresji u ssaków, takich jak ludzie. [0062] Zastosowanie róŝnych substancji do ujawnionych tutaj trybów szczepienia pierwotnego/przypominającego dostarcza sposób szczepienia zapewniający właściwe odpowiedzi immunologiczne zarówno gałęzi komórkowej, jak i humoralnej układu immunologicznego. Obejmuje to komórki T CD8+, komórki T CD4+ i przeciwciała. śadna z tych szczepionek samodzielnie nie wywołuje trwałej odpowiedzi immunologicznej, która po-

20 woduje wytworzenie optymalnych poziomów specyficznych wobec antygenu komórek T CD8+, komórek T CD4+ i przeciwciał. Ponadto kolejność, w jakiej podawane są róŝne składniki moŝe zmieniać te odpowiedzi immunologiczne i moŝe przyczyniać się do róŝnych okresów moŝliwej ochrony przed przyszłymi zakaŝeniami. Sposoby i zestawy według niniejszego wynalazku umoŝliwiają wywoływanie odpowiedzi immunologicznej, która chroni przed wszystkimi z róŝnych stadiów cyklu Ŝyciowego pasoŝyta u ludzi, od wolno krąŝących sporozoitów i merozoitów do zakaŝonych hepatocytów i RBC. Ponadto zapewnia podtrzymywaną ochronę przed zakaŝeniami malarią przez długotrwały okres czasu. [0063] W korzystnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania rekombinowanych adenowirusów, które mają defekt replikacji ze względu na usunięcie co najmniej części regionu E1 w genomie adenowirusa, poniewaŝ region E1 jest wymagany do procesów replikacji, transkrypcji, translacji i pakowania nowo wytworzonych adenowirusów. Wektory z delecją E1 ogólnie wytwarza się w liniach komórkowych, które dopełniają funkcje wydeletowanego E1. Takie linie komórkowe i ich zastosowanie do wytwarzania rekombinowanych wirusów opisano szeroko i są dobrze znane w dziedzinie. Korzystnie komórki PER.C6, reprezentowane przez komórki zdeponowane pod nr ECACC w European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) w Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR, Wielka Brytania), lub ich pochodne stosuje się w celu zapobiegania rozmnaŝaniu adenowirusów zdolnych do replikacji (skrót rca od replication competent adenoviruses ). W kolejnej korzystnej postaci stosuje się komórki, które wspierają wzrost rekombinowanych adenowirusów innych niŝ te pochodzące z adenowirusa serotypu (Ad). Odesłanie czyni się do publikacji WO 97/00326, WO 01/094, WO 01/0771, WO 00/70071, WO 02/4066 i WO 99/132, odnośnie sposobów i środków do uzyskiwania adenowirusowych roztworów wyjściowych wolnych od rca w przypadku Ad, a takŝe w przypadku innych serotypów adenowirusa, takich jak rekombinowany Ad3 z defektem replikacji, który moŝna wytwarzać w komórkach HER unieśmiertelnionych E1 z Ad3, lub w komórkach PER.C6 ponadto zawierających geny E1 z Ad3 w celu zapewnienia właściwego dopełnienia dla adenowirusów typu B. [0064] NaleŜy przy tym zauwaŝyć, Ŝe w opublikowanych dokumentach WO 00/029, WO 02/247, WO 00/70071 i WO 02/4066, Ad0 pomyłkowo nazwano Ad1. Serotyp Ad1, do którego się odnoszono we wspomnianych publikacjach jest taki sam jak serotyp Ad0 w publikacji De Jong i in. (1999), w której nazwano go adenowirusem grupy B. Dla jasności stosowane tutaj określenie Ad0 oznacza serotyp Ad0 grupy B, jak wspomnieli De Jong i in. (1999). [006] Szczepionki według niniejszego wynalazku zazwyczaj stosuje się w układach