Molekularne przełączniki

Transkrypt

1 Molekularne przełączniki - nie wszystkie procesy przebiegają w komórce równocześnie część działa cyklicznie, kontrolując zachowanie komórki i jej reakcje w zależności od różnorodnych sygnałów - takie białka, szczególnie często spotykane w obrębie szlaków przekazywania sygnałów, nazywane są molekularnymi przełącznikami - główną klasą MP są GTPazy (białka G), kontrolujące włączanie/wyłączanie większości procesów komórkowych

2 Białka G GNBP - guanine nucleotide binding protein GAP - GTPase activating protein GEF - guanine nucleotide exchange factor GDI - guanine nucleotide dissociation inhibitor GPR - G protein regulatory motif ATP - energia dla enzymatycznych reakcji metabolicznych, fosforylacji w regulacji wewnątrzkomórkowej i ruchu motorów molekularnych GTP - głównie używany w regulacji procesów z udziałem GNBP (z wyjątkiem dynaminy, septyny, tubuliny i czynnika elongacyjnego G)

3 Guanine nucleotide binding proteins Heterotrimeryczne białka G (100 kda) zbudowane z podjednostek, i outside-in signaling Monomeryczne białka G (20-29 kda) małe białka G, GNBP przekazywanie sygnałów wewnątrz komórki przełączniki molekularne

4 Nadrodzina Ras Rho reorganizacja cytoszkieletu, podziały komórek Ras podziały i różnicowanie komórek Rab transport pęcherzykowy i sekrecja Ran transport jądrowy, kontrola cyklu komórkowego Arf/Sar tworzenie pęcherzyków, aktywacja PLD

5 GTPazy z rodziny Rho Small GTP-binding proteins of the Rho subfamily (Rho, Rac, Cdc42) function to organize the actin cytoskeleton, including: filopodium extension, lamellipodium formation, generation of actin stress fibers, focal adhesions

6 Rho GTPases Cdc42 cells send out exploratory filopodia RhoA formation of actin stress fibers and focal adhesions, microtubule stabilization Rac1 extensions of broad sheet-like lamellipodia, destabilization of microtubules

7 signal G protein cycle R membrane GAP GTPase activating protein GDP GTP GAP GDP GD I Rho inactive GEF GDP GTP GEF guanine nucleotide exchange factor GTP Rho active GDI guanine nucleotide dissociation inhibitor effector proteins biological response

8 Rho GTPases amplification integration time control precision (No. of genes)

9 Struktura GNBP - minimalna domena G

10 Uniwersalny przełącznik wiązanie γ-fosforanu przez grupy NH łańcucha głównego zachowywanych ewolucyjnie reszt Thr35 i Gly60 uwolnienie grupy fosforanowej powoduje lokalną relaksację, przekładającą się na zmianę konformacyjną pętli switch I i II

11 Ruchliwość regionów przełącznikowych

12 Ruchliwość regionów przełącznikowych

13 G domain Vetter & Wittinghofer, 2000 Grupa gamma fosforanowa określa strukturę regionów przełącznikowych

14 Domena G Zmiany konformacyjne w białku Ran w czasie hydrolizy GTP do GDP

15 G i - niezależnie zwijająca się domena -helikalna Rho - dodatkowy 13 aa, -helikalny insert hgbp1 (human guanylate binding protein) - wiele dodatkowych elementów II rzęd. i C-terminalna domena typu coiled-coil Dodatkowe domeny w GNBP i ich lokalizacja względem domeny G Czynnik elongacyjny Tu (EF-Tu), czynnik inicjacyjny (IF2/eIF5B), czynnik elongacyjny G (EF-G) - mają odpowiednio dwie, trzy lub cztery dodatkowe domeny

16 Mnogość oddziaływań domeny G z efektorami Regiony przełącznikowe switch są zawsze przynajmniej częściowo zaangażowane w wiązanie efektora

17 Różne rodziny przełączników molekularnych podobieństwo struktury i funkcji Kinezyna Miozyna Małe białko G

18 Model for the motor actions of muscle myosin

19 Models for the motor actions of muscle kinesin

20 signal G protein cycle R membrane GAP GTPase activating protein GDP GTP GAP GDP GD I Rho inactive GEF GDP GTP GEF guanine nucleotide exchange factor GTP Rho active GDI guanine nucleotide dissociation inhibitor effector proteins biological response

21 Schemat działania białka GEF Seria szybkich i odwracalnych reakcji: - binarny kompleks GNBP-nukleotyd - trimeryczny kompleks GNBP-nukleotyd-GEF - binarny kompleks GNBP-GEF Równowaga jest przesuwana na korzyść związanego GDP czy GTP przez odpowiednie powinowactwo GDP i GTP do GNBP; stężenie nukleotydów; powinowactwo i stężenie dodatkowych białek (jak efektory które przesuwają równowagę w stronę formy związanej z GTP - strukturalnie białka GEF nie są spokrewnione i szczegóły zwalniania GDP są różne. Jest kilka mechanistycznych podobieństw: oddziaływanie ze switch I i II oraz dostarczenie reszt w obrębie pętli P. - nie jest jasne, jaka jest kolejność wydarzeń prowadzących do wymiany GDP/GTP, ani która cześć nukleotydu jest zwalniana pierwsza zasada czy fosforan

22 Białka GEF

23 GDI inhibitor dysocjacji nukleotydu - zupełnie różne sposoby zwinięcia poznanych GDI - wymagają do wiązania prenylowanego końca GNBP - kompleks GNBP-GDI tworzy rezerwuar komórkowy GNBP i pozwala na jego transport do różnych błon w obrębie komórki - stąd rola GDI jako inhibitora zdaje się być jedynie przypadkową konsekwencją Figure 7. Guanine nucleotide dissociation inhibitors. A. Rac2 RhoGDI (LyGDI) complex (PDB 1ds6). C- terminal immunoglobulin-like domain is designated LyC, N-terminal - LyN, linker recognized by ICE protease ICE. B. Surface and electrostatic potential of LyGDI. Positively charged (basic) regions in blue and negatively charged (acidic) ones in red. The hydrophobic cavity responsible for binding of the C- terminally attached isoprenyl moiety is also shown. The switch I (SwI) and switch II (SwII) regions are buried in the interaction site. C. RabGDI (PDB 1gnd). The GCD domain responsible for Rab binding is shown.

24 signal G protein cycle R membrane GDP GTP GDP GD I Rho GDP GAP GTPase activating protein GAP inactive GEF GTP GEF guanine nucleotide exchange factor GTP Rho active GDI guanine nucleotide dissociation inhibitor effector proteins biological response

25 Domena GAP GAP dostarcza reszt stabilizujących rejony przełącznikowe I i II, a głównie resztę Arg stabilizującą Gln-61 (Gln-63 w RhoA), powodując tym samym odpowiednią orientację cząsteczki wody do hydrolizy -fosforanu. W większości przypadków palec argininowy (arginine-finger) jest niezbędny, ale są również inne kluczowo ważne dla aktywności typu GAP reszty. Dla przykładu domena BH p85pi3-kinazy (BHPI3-K) zawiera zachowywaną Arg, wiąże się do Rho, ale nie posiada aktywności typu GAP. Wyjątek stanowią: Rap, PSF, hgbp-1septyna, dynamina gdzie zamiast Gln występuje Thr, His, reszta hydrofobowa

26 Mechanizm działania GAP GAP GTP GTPaza

27 Multifunctional GAP proteins

28 Domena GAP A. G iα1 GDP AlF 4 - RGS4 B. H-Ras GDP p120gap C. Rho GDP AlF 4 - RhoGAP

29 Domena GAP Nałożenie kompleksów białkowych: Ran RanBP1 RanGAP (czerwony) Rho RhoGAP (pomarańczowy) Ras RasGAP (zielony) G RGS (niebieski) Bardzo podobna architektura regionów switch I i II, podobna lokalizacja reszty glutaminy i nałożenie cis-arg z G, trans-arg z Ras i RhoGAP, oraz reszty tyrozyny z Ran.

30 Domena GAP RasGAP zółty, RhoGAP czerwony, RacExoS niebieski, G RGS

31 Toksyna ExoS z Pseudomonas aeruginosa inaktywuje Rho udając GAP

32 - Zwykle jedyną funkcją hydrolizy GTP przeprowadzanej przez małe białka G przy udziale GAPów jest zmiana stanu białka G z włączonego na wyłączony - Zdarzają się jednak przypadki, gdy wytworzona energia może być wykorzystana również w inny sposób w przypadku białka Ran hydroliza GTP jest siłą napędową dla transportu przez por jądrowy - W cytozolu RanGAP utrzymuje Ran prawie wyłącznie w formie nieaktywnej, natomiast w jądrze białko Ran nucleotide exchange factor (RCC1) umożliwia przejście z Ran GDP do Ran GTP. - Receptory importowe (importyny ) i eksportowe (eksportyny) w jądrze wiążą się z różnym powinowactwem do Ran GTP i Ran GDP, co umożliwia wymianę ładunku.

33 Regulacja białek GAP - jest przynajmniej 140 ludzkich małych białek G - około 160 ludzkich genów koduje białka GAP. Stanowi to 0,5% genomu - drugorzędowa rola białek G w cyklu? -regulacja aktywności białek GAP (fosforylacja, oddziaływanie białkobiałko, białko-lipid, lokalizacja komórkowa, proteoliza) - białka GAP mogą być efektorami dla GTPaz integracja sygnałów

34 Regulacja poprzez oddziaływanie z białkami -aktywność p190-b RhoGAP jest stymulowana oddziaływaniem z Rnd3 kaskadowe oddziaływanie GTPaz mediowane przez białka GAP, podobnie jak w przypadkach opisanych dla białek GEF - wewnątrzcząsteczkowo: poprzez domenę P (w p120 RasGAP)

35 Regulacja poprzez fosforylację

36 Regulacja białek GAP

37 Tubulina - struktura oznacza funkcje dla biochemika jest to biochemiczna rola białka, dla genetyka funkcje wyznacza fenotyp mutanta, dla fizjologa spojrzenie na funkcje jest jeszcze szersze - (a) wiązanie monomerów (b) tworzenie protofilamentów (c) wiązanie motorów białkowych (d) siła napędowa wici (e) sieć autostrad komórkowych

38 Rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne - miejsca wiążące ligandy i centra aktywne są tworzone w trakcie zwijania białka poprzez nieidealne pakowanie się łańcuchów bocznych Wiązanie substratu (MAPKK-2) do czynnika L toksyny wąglika (anthrax toxin lethal factor) - regiony te tworzą mikrośrodowiska, które znacznie różnią się od otaczającego rozpuszczalnika (jeśli reszty budujące kieszeń są hydrofobowe, jej wnętrze przypomina rozpuszczalnik organiczny i może ona wiązać np. lipidy) - kompromis energetyczny kumulacji reszt o tych samych własnościach (np. przy tworzeniu naładowanych łatek)

39 Rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne - wyspecjalizowane mikrośrodowiska miejsc wiążących są podstawą zdolności katalitycznych enzymów - silne pole elektrostatyczne jest tworzone poprzez bliskość Arg/Lys i Glu/Asp. W roztworze wodnym lub strukturze białka powstanie mostek solny, ale w pewnych mikrośrodowiskach wymiana protonu między nimi jest niekorzystna Centrum aktywne racemazy ze związanym substratem bliskość reszt Lys164 i 166 obniża ich powinowactwo do protonu

40 Białka są cząstkami elastycznymi - najszybsze ruchy to wibracje atomów i rotacja grup metylowych - tranzycje z jednego rodzaju zwinięcia do drugiego zachodzą niezwykle rzadko - fluktuacje konformacyjne w strukturze domen zachodzą jedynie lokalnie (ligandy mogą powodować lokalne uporządkowanie, zwinięcie się fragmentu białka)

41 Izomeraza triozofosforanowa - 8 reszt 10Å - po związaniu liganda, pętla na dwóch zawiasach zamyka miejsce wiązania i wchodzi z nim w interakcje, jednocześnie osłaniając ligand od rozpuszczalnika - ruchy pozostałej części białka są dużo mniejsze ( rigid-body movement )

42 -białka nazwano cząsteczkami półciekłymi ruch atomów większy niż w ciałach stałych (np. NaCl), ale mniejszy niż w wodzie Mioglobina kaszalota zacieniowana zgodnie ze stopniem elastyczności -im ciemniejsze zacieniowanie, tym bardziej sztywny atom -powierzchnia nie jest jednakowo dynamiczna -grupy metylowe i reszty aromatyczne wykazują ruchy kolektywne

43 Aminotransferaza Asp forma zamknięta i otwarta -ruchy indukowane wiązaniem liganda o najwyższej wadze funkcjonalnej -rearanżacja pojedynczej reszty vs. ruch całej domeny siłą sprawczą dla induced fit jest mostek solny między Arg domeny mobilnej a grupą karboksylową liganda (Asp) -indukowane dopasowanie związanie substratu powoduje przejście z formy nieaktywnej w aktywną (w tym przypadku z 10 o przesunięciem mniejszej domeny w kierunku głównej części cząsteczki)

44 Różna elastyczność/sztywność białek w zależności od ich funkcji i pochodzenia (białka termofilne) Różnice w temperaturowej zależności aktywności dehydrogenazy 3- fosforanu D-gliceraldehydu (GAPDH) z dwóch organizmów są pochodną ich sztywności

45 Elastyczność białek Ścisłe dopasowanie pomiędzy białkiem i ligandem (Kinaza białkowa A z analogiem peptydowym) klucz zamek indukowane dopasowanie (induced fit) By związać ligand, białko musi być zdolne do utworzenia miejsca wiążącego o odpowiedniej dla partnera stereochemii, konfiguracji ładunków i potencjale grup tworzących HB Białko otula ligand dzięki swej naturalnej elastyczności

46 Dopasowanie białka do różnych ligandów -elastyczność białek zapewnia możliwość dopasowania konformacyjnego do wiązanego liganda (pod warunkiem, że dojdzie do utworzenia wystarczająco wielu korzystnych oddziaływań, przewyższających energetyczny koszt dopasowania strukturalnego) proteaza HIV w kompleksie z trzema różnymi inhibitorami powodującymi zamknięcie klapy (a) haloperidol (b) crixivan (c) peptydowy analog substratu

47 Zmiany konformacyjne wymuszone związaniem liganda AMP Przykład dużej zmiany konformacyjnej (kinaza adenylanowa) AMP+ATP

48 Miejsca wiązania makrocząsteczek wklęsłe, wypukłe lub płaskie -oddziaływanie poprzez jedną dużą powierzchnię zagrzebania (setki Å 2 ) lub kilka oddzielonych obszarów -trudne do przewidzenia (setki kontaktów) -ścisłe dopasowanie, wiele punktów kontaktu -najczęściej ligand wiązany jest przez wystające pętle lub w obrębie dużego zagłębienia (dodatkowe dopasowanie kształtu), ale zdarzają się też całkiem płaskie interfejsy oddziaływania Kompleks hgh z dwoma cząsteczkami receptora, dwie niezależne powierzchnie oddziaływania hgh z dwiema identycznymi cząsteczkami receptora

49 Miejsca wiązania wystające helisy i pętle Dwa kompleksy białko-dna (a) represor genu toksyny dyfterytu (rozpoznanie przez helisa-zwrot-helisa) (b) czynnik transkrypcyjny Gal4 (rozpoznanie przez pętlę stabilizowaną przez Zn)

50 Wiązanie liganda we wnętrzu kieszeni białka -elastyczność białek pozwala znaleźć się w ich wnętrzu bardzo dużym ligandom -miejsce wiązania liganda często można zidentyfikować jako jamkę w strukturze wolnego białka cyt P450 ze związanym substratem

51 Położenie miejsc wiążących Dimeryczna dehydrogenaza bakteryjna 3-izopropylomaleinianu Miejsca katalityczne często występują na styku domen strukturalnych i/lub podjednostek

52 Słabe oddziaływania prowadzą do łatwej wymiany partnerów w ścieżce sygnalizacyjnej (partner swapping) STAT signal transducer and activator of transcription

53 Wymiana domen w białku kapsydu wirusa papilloma służy stabilizacji trimeru (domain swapping)

54 Wiązanie liganda poprzez oddziaływania hydrofobowe i HB: siła i/lub specyficzność -wkład w energię wiązania dzięki siłom niekierunkowym (oddziaływania hydrofobowe) -wkład w specyficzne rozpoznanie dzięki siłom kierunkowym (HBs)

55 Białka strukturalne - komórka jest tworem silnie ustrukturyzowanym a zarazem dynamicznym - nadanie i utrzymanie kształtu komórek i organelli, a także jego zmiany w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne, zależą od białek strukturalnych - kształt samego tylko rybosomu zależy od ponad 100 różnych białek - wiele struktur tworzonych przez białka ma charakter tymczasowy, np. skrzepy krwi, włókna naprężeniowe

56 Oddziaływania w białkach strukturalnych -rusztowania wyłącznie białkowe (α - kolagen, β - jedwab, elastyna, keratyna, wirusy) lub mieszane (chrząstka) -często cross-linking łańcuchów białkowych (kolagen, elastyna)

57 Białka - szkielety, rusztowania i łączniki Białka strukturalne o aktywności katalitycznej (miozyna II) polimeryzacja/depolimeryzacja, ruch białek względem siebie Białko będące rusztowaniem - Ste5p (scaffold protein)