AUTOREFERAT. I. Roman Kotłowski

Transkrypt

1 Dr inż. Roman Kotłowski Katedra Mikrobiologii Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska G. Narutowicza 11/ Gdańsk Tel.: Fax: AUTOREFERAT I. Roman Kotłowski II. III. Posiadany stopień naukowy: doktor nauk technicznych w zakresie technologii chemicznej uzyskany na Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu Nazwa Zakładu Pracy Stanowisko Okres pracy Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra asystent Chemii Technologii i Biotechnologii Żywności Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra adiunkt Chemii Technologii i Biotechnologii Żywności Institute of Tropical Medicine in Antwerp, Marie-Curie Mycobacteriology Unit Fellow University of Manitoba, Research Department of Animal Science Associate Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Mikrobiologii adiunkt obecnie IV. Osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach naukowych i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595 ze zm.): cykl jednotematycznych publikacji. Wykaz opublikowanych prac naukowych lub twórczych prac zawodowych oraz informacja o osiągnięciach dydaktycznych, współpracy naukowej i popularyzacji nauki 1. Wykaz publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 ustawy A) Tytuł osiągnięcia naukowego: BADANIE ETIOLOGII CHORÓB LEŚNIOWSKIEGO-CROHNA ORAZ WRZODZIEJĄCEGO ZAPALENIA JELITA GRUBEGO. 1

2 B) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego: B1. Autor/autorzy, data wydania, tytuł, wydawca lub czasopismo, tom, strony. Kotłowski R, Bernstein CN, Sepehri S, Krause DO High prevalence of belonging to the B2+D phylogenetic group in inflammatory bowel disease. Gut. 56(5): IF= 10,015, liczba cytowań (WoS) = 142, punktacja MNiSW = 32 R, Bernstein CN, Sepehri S, Krause DO High prevalence of Escherichia coli Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu doświadczeń związanych z wyborem metody RISA- PCR (ang. Ribosomal Intergenic Spacer Analysis - Polymerase Chain Reaction) do identyfikacji większej (p<0,01) niż u ludzi zdrowych ilości pałeczek E. coli w wycinkach jelit po kolonoskopii, wykonaniu doświadczeń polegających na amplifikacji metodą PCR rejonu polimorficznego operonu rrn pomiędzy podjednostkami 16S i 23S rrna, których wyniki zamieszczone zostały na ryc. 1 oraz wyboru bakteryjnych genów kodujących toksyny oraz adhezyny do identyfikacji oraz zaprojektowania sekwencji starterowych oraz ich oznaczenia metodą PCR, wykonania testów PCR i sekwencjonowania DNA oraz interpretacji wyników badań przedstawionych w tabelach 2, 3, 4 i 5, wykazaniu że szczepy E. coli u chorych na choroby LC oraz WZJG w Kanadzie mogą pochodzić od ptaków (p<0,05), napisaniu wstępnej wersji rozdziałów dotyczących materiałów i metod oraz wyników do manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 40%. B2. Autor/autorzy, data wydania, tytuł, wydawca lub czasopismo, tom, strony. Kotłowski R, Bernstein CN,, Silverberg MS, Krause DO Population-based case-control control study of alpha 1-1 antitrypsin and SLC11A1 in Crohn's disease and ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 14(8): IF= 4,975, liczba cytowań (WoS) = 5, punktacja MNiSW = 32 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu doświadczeń związanych z wyborem celów molekularnych w analizie próbek krwi od pacjentów oraz ludzi zdrowych, wyboru metody identyfikacji mutacji zamieszczonej w tabeli 1 oraz przeprowadzenia wszystkich eksperymentów oraz ich analizy statystycznej z wyjątkiem oznaczania mutacji w genie nod2, których wyniki zamieszczone zostały w tabelach 2, 3 i 4 oraz napisaniu wstępnej wersji rozdziałów dotyczących materiałów i metod, wyników oraz streszczenia do manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 40%. B3. Autor/autorzy, data wydania, tytuł, wydawca lub czasopismo, tom, strony. Sepehri S, Kotłowski R, Bernstein CN, Krause DO Microbial diversity of inflamed and noninflamed gut biopsy tissues in inflammatory bowel disease. d Inflamm Bowel Dis. 13(6): IF= 4,705, liczba cytowań (WoS) = 59, punktacja MNiSW = 32 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu doświadczenia związanego z wyborem metody ARISA-PCR (ang. Automatic Ribosomal Intergenic Spacer Analysis PCR) w analizie próbek DNA po kolonoskopii od pacjentów oraz ludzi zdrowych z grupy kontrolnej, przeprowadzenia izolacji DNA oraz konsultacji w przygotowania manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 20%. B4. Autor/autorzy, data wydania, tytuł, wydawca lub czasopismo, tom, strony. Sepehri S, Kotłowski R, Bernstein CN, and Krause DO Phylogenetic analysis s of inflammatory bowel disease associated Escherichia coli and the FimH virulence determinant. Inflamm Bowel Dis. 15(11): IF= 4,643, liczba cytowań (WoS) = 19, punktacja MNiSW = 32 2

3 Z uwagi, iż niniejsza publikacja jest w dużej mierze konsekwencją wyników uzyskanych w publikacji nr 1, w której po raz pierwszy wykazano związek pomiędzy charakterystyczną sekwencją genu fimh oraz pochodzeniem szczepów E. coli od ptaków w związku z czym mój wkład w powstanie tej pracy polegał na określeniu celu dalszych badań dotyczących pochodzenia szczepów E. coli u pacjentów z chorobami Leśniowskiego-Crohna oraz wrzodziejącego zapalenia jelit na podstawie przeprowadzonych wcześniej analiz komputerowych uzyskanych sekwencji genu fimh z bazami danych w Genbanku NCBI w celu ustalenia źródła/eł zakażenia szczepami E. coli z grupy AIEC (ang. Adherent Invasive E. coli) u chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna oraz wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Mój udział procentowy szacuję na 20%. OMÓWIENIE CELU NAUKOWEGO PRAC I OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW Wstęp Choroby Leśniowskiego-Crohna (LC) oraz wrzodziejące zapalenie jelita grubego (WZJG) są najczęściej występującymi chorobami w grupie schorzeń zaliczanych do nieswoistego zapalenia jelit (NZJ). Jedną z cech wspólnych chorób LC oraz WZJG jest nieustalona jak dotąd przyczyna zachorowań. Zapadalność na chorobę LC w krajach Unii Europejskiej wynosi 5 przypadków na 100 tys. mieszkańców na rok natomiast na chorobę WZJG ok. 10 przypadków na 100 tys. mieszkańców Europy rocznie (Bartnik W. Przegląd Gastroenterolog. 2007; 2 (5)). Z uwagi na częste występowanie mutacji w genach uczestniczących w odpowiedzi immunologicznej (Khor i in. Nature. 2011, 474(7351):307-17) u pacjentów z chorobami LC oraz WZJG, zmiany genetyczne wpływają między innymi na zaburzoną odpowiedź organizmu na obecność chorobotwórczych bakterii, wyrażoną zbyt niskim poziomem ekspresji inhibitorów elastazy leukocytów takich jak antytrypsyna czy białko SLPI (ang. Secretory Leukocyte Protease Inhibitor), czego efektem może być przedłużający się stan zapalny jelit (Thuraisingam i in. J. Invest. Dermatol. 2006, 126(4): ) będący wynikiem nadmiernej aktywnosci elastazy leukocytów. W CELU BADANIA ETIOLOGII CHORÓB LC ORAZ WZJG PRZEPROWADZONO NASTĘPUJĄCE EKSPERYMENTY 1. Badania mikrobiologiczne próbek wycinków jelit chorych na LC, WZJG oraz grupy kontrolnej. W badanych próbkach wycinków jelit od pacjentów z chorobą LC (n=13), WZJG (n=19) oraz grupie kontrolnej (n=15) najczęściej potwierdzano obecność bakterii z gatunków E. coli, Klebsiella sp. Enterococcus sp. Escherichia fergussoni oraz enterotoksycznych szczepów Bacteroides fragilis. Statystycznie istotne różnice w liczbie próbek zawierających szczepy E. coli pomiędzy próbkami kontrolnymi (47%), oraz próbkami od pacjentów z chorobami LC (64%) oraz WZJG (67%) stosując metody hodowlane świadczą o znaczeniu pałeczek okrężnicy w etiologii obu chorób. Istotnym nowatorskim odkryciem jakiego dokonano podczas badań bezpośrednich próbek wycinków jelit było potwierdzenie obecności prążka DNA wielkości ok. 450 pz charakterystycznego dla E. coli w przypadku próbek pochodzących jedynie od pacjentów (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 1). W badaniach wykorzystano bezpośrednią metodę detekcji bakteryjnego DNA z wycinków jelit PCR-RISA 3

4 (ang. Polymerase Chain Reaction - Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Obecność charakterystycznego prążka DNA potwierdzono w przypadku 47% próbek pochodzących od pacjentów z chorobą LC oraz WZJG. Uzyskany wynik może mieć znaczenie diagnostyczne polegające na możliwości potwierdzania nadmiernej kolonizacji lub wręcz infekcji ściany komórkowej jelit chorobotwórczymi szczepami E. coli u pacjentów chorych na WZJG lub chorobę LC. Ponadto, w badaniach stwierdzono większą (p<0,07) obecność adhezyn u pacjentów z NZJ w porównaniu do grupy kontrolnej świadcząca o zwiększeniu ryzyka inwazji i translokacji szczepów AIEC (Adherent Invasive E. coli) do ściany komórkowej jelit. 2. Badanie wzajemnych proporcji występowania gatunków bakterii w grupie pacjentów z chorobą LC (n=10), WZJG (n=15) oraz w grupie kontrolnej (n=16). W badaniach z wykorzystaniem metody ARISA (Automatic Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) wykazano zmienną liczbę gatunków bakterii, w zależności od pochodzenia próbek. Najmniejszą liczbę gatunków bakterii stwierdzono w próbkach pochodzących od pacjentów z chorobą LC w porównaniu do próbek pochodzących od pacjentów z WZJG i grupy kontrolnej. Ponadto, kolejnym odkryciem było stwierdzenie obecności mniejszej liczby gatunków bakterii w próbkach od pacjentów pochodzących z miejsc występowania stanu zapalnego w porównaniu z próbkami pobranymi z miejsc, w których stan zapalny nie występował. Badania przeprowadzono zarówno z udziałem pacjentów chorych na chorobę LC oraz WZJG. Uzyskane nowatorskie wyniki świadczą o istotnej roli bakterii w etiologii powstawania stanu zapalnego w chorobach LC oraz WZJG. W kolejnych badaniach z wykorzystaniem metody t-rflp (ang. Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), która pozwala na identyfikację gatunkową bakterii wykazano statystycznie istotną różnicę w składzie mikroflory występującej u chorych na chorobę LC w porównaniu do grupy kontrolnej. Stwierdzono 13-krotny wzrost udziału bakterii z rodzaju Clostridium sp. w ogólnej liczbie drobnoustrojów u pacjentów z chorobą LC. Jednocześnie, odnotowano procentowy spadek udziału bakterii z rodzaju Bacteroides z 55,6% w grupie kontrolnej do 41% w grupie chorych na chorobę LC (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 2). Po raz pierwszy uzyskane wyniki świadczą o większej dominacji szczepów z rodzaju Clostridium w jelicie grubym pacjentów z chorobą LC w porównaniu z grupą kontrolną oraz grupą pacjentów z WZJG. Większą dominację bakterii z rodzaju Clostridium sp. w próbkach od pacjentów z chorobą LC można wyjaśnić zmniejszoną ilością tlenu dostarczanego wraz z krwią do błony śluzowej jelita grubego na skutek np. nadmiernego obumierania enterocytów w wyniku apoptozy zainicjowanej np. przez patogenne szczepy E. coli, E. fergussonii, Klebsiella sp. i Enterococcus sp. (Bassotti G. J Crohns Colitis. 2009, 3(4):264-70). 3. Badania genetyczne próbek krwi pobranych od pacjentów z LC (n=100), WZJG (n=99) oraz grupy kontrolnej (n=100) na obecność mutacji w genach nod2, aat i slc11a1. W kolejnych badaniach punktowych mutacji w obrębie genu aat kodującego antytrypsynę wykazano statystycznie istotną obecność alleli S i Z u 18% pacjentów z chorobą LC (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 3). Wyniki tych badań wskazują na możliwość wystąpienia stanu zapalnego u pacjentów, u których zidentyfikowano allel S lub Z na skutek nadmiernej aktywności elastazy neutrofilów degradującej nie tylko chorobotwórcze bakterie ale również enterocyty jak i inne komórki nabłonkowej jelit. Podobną funkcję spełnia białko SLC11A1, które również chroni komórki gospodarza przed nadmierną aktywnością elastazy leukocytów poprzez regulację ekspresji białka SLPI - inhibitora elastazy leukocytów 4

5 (Thuraisingam i in. J. Invest. Dermatol. 2006, 126(4): ). Mutacje w sekwencjach promotorowej oraz terminatorowej genu slc11a1 powodujące obniżenie poziomu ekspresji białka SLC11A1 mogą być przyczyną utrzymywania się stanu zapalnego z powodu nadmiernej aktywności elastazy leukocytów oraz nadmiernego wzrostu drobnoustrojów na skutek zmniejszenia się ilości przeciwbakteryjnego białka SLPI. W badaniach próbek krwi potwierdzono metodą elektroforezy kapilarnej istnienie pierwszych trzech spośród siedmiu alleli sekwencji promotorowej genu slc11a1 (Tab. 1). Elementem nowości było wykazanie statystycznie istotnych różnic pomiędzy allelem 1 w obrębie sekwencji promotorowej genu slc11a1 u pacjentów z chorobą WZJG w porównaniu do grupy kontrolnej oraz grupy pacjentów z chorobą LC. Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono statystycznie istotną obecność allelu 3 w sekwencji promotorowej genu slc11a1 u pacjentów z chorobą LC w porównaniu do grupy kontrolnej (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 3). Uzyskane wyniki świadczą o istotnym znaczeniu alleli 1 i 3 w etiologii chorób odpowiednio WZJG oraz LC. Tab.1 Allele sekwencji promotorowej genu slc11a1 Allele bp t(gt)5ac(gt)5ac(gt)11ggcaga(g)6 Allele bp t(gt)5ac(gt)5ac(gt)10ggcaga(g)6 Allele bp t(gt)5ac(gt)5ac(gt)9ggcaga(g)6 Allele bp t(gt)5ac(gt)9ggcaga(g)6 Allele bp t(gt)4ac(gt)5ac(gt)10ggcaga(g)6 Allele bp t(gt)5ac(gt)5ac(gt)4at(gt)4ggcaga(g)7 Allele bp t(gt)5ac(gt)5at(gt)11ggcaga(g)6 Kolejnym genem który badano był gen nod2. Białko Nod2 odpowiedzialne jest za rozpoznawanie dipeptydu muramylowego bakterii, a w konsekwencji za indukcję ekspresji cytokin prozapalnych, peptydów antybakteryjnych oraz defensyn w odpowiedzi na infekcje bakteryjne. Mutacje w sekwencji genu nod2 sprzyjają rozwojowi bakterii z powodu zaburzenia prawidłowej odpowiedzi immunologicznej. W przeprowadzonych badaniach potwierdzono statystycznie istotną obecność mutacji w sekwencji genu nod2 pacjentów z chorobą LC w porównaniu z chorymi na WZJG oraz grupą kontrolną (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 3). 4. Badania genetyczne szczepów E. coli izolowanych od pacjentów z chorobą LC, WZJG oraz grupy kontrolnej. W badaniach genetycznych po raz pierwszy wykazano, iż większa liczba szczepów E. coli izolowanych od pacjentów z chorobą LC oraz WZJG posiadała geny kodujące toksyny SPATE (ang. Serine Protease Autotransporters) (p<0,07) w porównaniu do grupy kontrolnej. Ponadto, po raz pierwszy u pacjentów z chorobami LC oraz WZJG potwierdzono większą ilość (p = 0,56) fimbrii typów Dr, S i P, adhezyny AIDA-I oraz antygenu 43 w porównaniu do grupy kontrolnej. Obecnosć toksyn SPATE umożliwia bakteriom mukolityczną i proteolityczną degradację śluzu wyściełającego jelita, a przez to mogą łatwiej dotrzeć a nastepnie związać się dzięki fimbriom i adhezynie AIDA-I z odpowiednimi receptorami 5

6 błony śluzowej jelit. Przeprowadzona analiza sekwencji aminokwasowej fimbrii typu I FimH potwierdziła statystycznie istotną (p<0,05) różnicę pomiędzy izolatami od pacjentów w porównaniu ze szczepami izolowanymi z grupy kontrolnej. Cechą charakterystyczną większości izolowanych szczepów E. coli od pacjentów jest obecność czterech aminokwasów Ala27, Ser70, Asn78 oraz Ala119 w obrębie sekwencji białka FimH (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 1 i 4). Na podstawie homologii sekwencji genu fimh badanych izolatów z sekwencjami w Genbanku (NCBI) ustalono iż badane izolaty bakteryjne należą do grupy E. coli typu APEC (Avian Pathogenic E. coli) (Publikacja rozprawy habilitacyjnej nr 1). Uzyskany wynik świadczy o tym, iż ptaki mogą być źródłem patogennych szczepów E. coli wywołujących nieswoiste przewlekłe zakażenia przewodu pokarmowego u ludzi. Obecność charakterystycznych aminokwasów w sekwencji białka FimH szczepów E. coli izolowanych od pacjentów z chorobami LC oraz WZJG, jak i w sekwencjach białka FimH K. pneumonia oraz K. oxytoca świadczy o dużym stopniu homologii domeny adhezyjnej białka FimH w obrębie gatunków gram-ujemnych bakterii najczęściej izolowanych od pacjentów z chorobami LC oraz WZJG. Podsumowując, należy wyróżnić następujące odkrycia uzyskane w ramach prezentowanych wyników będących przedmiotem rozprawy habilitacyjnej: 1. Wykazanie przydatności łatwego do wykonania testu RISA-PCR w diagnostyce zakażeń szczepami AIEC u chorych z NZJ oraz oznaczenie obecności szczepów AIEC u 45% pacjentów z chorobami NZJ (n=19). Ponadto, stwierdzono większą ilość (p<0,07) adhezyn w szczepach E. coli izolowanych od pacjentów świadczącą o istotnej roli czynników odpowiedzialnych za wiązanie się bakterii do odpowiednich receptorów w komórkach gospodarza w etiologii choroby Leśniowskiego-Crohna oraz wrzodziejącego zapalenia jelita grubego. Istotnym aspektem w etiopatogenezie obu chorób jest potwierdzona w ramach prowadzonych badań większa ilość bakterii z grupy AIEC zarówno metodami hodowlanymi (niektóre próbki po kolonoskopii z grupy kontrolnej o zbliżonej wielkości nie zawierały bakterii E. coli w odróżnieniu od próbek pochodzących od pacjentów) jak i metodą RISA- PCR. Uzyskane wyniki świadczą, iż wzmożona kolonizacja komórek nabłonkowych jelit jest bardzo istotnym (p<0,01) parametrem stanu chorobowego. Kolejnym odkryciem było znalezienie homologii genu fimh szczepów AIEC ze sekwencją genu fimh szczepów APEC izolowanych od ptaków. 2. Wykazanie zmiany składu mikroflory na korzyść bakterii beztlenowych u chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna wskazującą na potencjalny mechanizm powstawania choroby Leśniowskiego-Crohna wynikający ze zmniejszenia zawartości tlenu w komórkach nabłonkowych jelit. W efekcie maleje liczba bakterii z rodzaju Bacteroides spp. które tolerują stężenie tlenu 0.05% (Nature 2004, 29;427(6973):441-4), a zwiększa się liczba bakterii bezwzględnie beztlenowych z rodzaju Clostridium spp. Uzyskany wynik może wskazywać na obumieranie komórek nabłonkowych jelit, do których nie jest dostarczany tlen pochodzący z krwi u osób z chorobą Leśniowskiego-Crohna, co może mieć znaczenie w ułatwionej inwazji oraz translokacji bakterii do ściany komórkowej jelit oraz etiologii powstawania stanu zapalnego. Natomiast, wartości składu mikroflory w przypadku próbek wycinków jelit 6

7 pochodzących od chorych na wrzodziejące zapalenie jelita grubego wskazują na pośredni etap pomiędzy składem procentowym mikroflory dla próbek pochodzących od chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna oraz grupy kontrolnej. 3. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów z udziałem około 300 próbek krwi (po 100 dla każdej z chorób oraz grupy kontrolnej) stwierdzono statystycznie istotną obecność allelu 1 i 3 w sekwencji promotorowej genu slc11a1 u pacjentów odpowiednio z chorobą WZJG oraz LC w porównaniu do grupy kontrolnej. Poziom ekspresji białka SLC11A1 ma istotne znaczenie w ochronie komórek jelit przed nadmierną aktywnością elastazy leukocytów oraz wiązaniu kationów dwuwartościowych metali współzawodnicząc z bakteriami, które wykorzystują kationy metali dwuwartościowych w swoim metabolizmie. 4. Wykazanie, iż substytucje aminokwasowe N91S i S99N w białku fimbrii FimH są najbardziej charakterystyczne dla szczepów AIEC izolowanych od pacjentów z chorobami NZJ. Powyższe substytucje mogą stanowić podstawę testu diagnostycznego szczepów AIEC u chorych na NZJ oraz stanowić bardzo specyficzny cel molekularny do zaprojektowania szczepionki przeciwko tym bakteriom. 7

8 Dr inż. Roman Kotłowski V. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH 1. Wykaz innych (nie wchodzących w skład osiągnięcia wymienionego w pkt 1) opublikowanych prac naukowych oraz wskaźniki dokonań naukowych A) Publikacje naukowe w czasopismach znajdujących się w bazie Journal Citation Reports (JRC). Cytowania według Web of Science. Wykaz dorobku naukowego i dydaktycznego L.p. Publikacje po doktoracie IF MNiSW Cyt. 1 Szweda P, Schielmann M, Kotlowski R, Gorczyca G, Zalewska M, Milewski S Peptidoglycan hydrolases-potential weapons against Staphylococcus aureus. Appl Microbiol Biotechnol. 96(5): , Indywidualny wkład 10%, udział w określeniu celu badań. 2 Chiers K, Deschaght P, De Baere T, Dabrowski S, Kotlowski R, De Clercq D, Ducatelle R, Vaneechoutte M Isolation and identification of Mycobacterium avium subspecies silvaticum from a horse. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 35(4): Indywidualny wkład - 10%, określenie celu badań oraz wybór enzymu restrykcyjnego HhaI kluczowego w identyfikacji gatunku M. avium subsp. silvaticum za pomocą techniki PCR-RFLP. 3 Szweda P, Kotłowski R, Lacka I, Synowiecki J Protective effect of lysostaphin from Staphylococcus simulans against growth of Staphylococcus aureus in milk and some other food products. J. Food Safety 27: Indywidualny wkład 25%, udział w zdobyciu środków finansowych na badania. 4 Kochanowski R, Kotłowski R, Szweda P Expression and intein-mediated purification of novel staphylokinase SakSTAR with reduced immunogenicity and antiplatelet and antithrombin activation. Appl Biochem Biotechnol. 141(2-3): Indywidualny wkład 50%, udział w określeniu ogólnego celu badań. 5 Sajduda A, Dziadek J, Kotłowski R, Portaels F Evaluation of multiple genetic markers for typing drug- resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Poland. Diagn Microbiol Infect Dis. 55(1): Indywidualny wkład 5%, udział w analizie wyników genotypowania szczepów M. tuberculosis. 6 Kochanowski R, Kotłowski R, Szweda P Novel method of expression and purification of hirudin based on pbad TOPO, ptyb12 vectors and gene synthesis. Protein Expr Purif. 50(1): Indywidualny wkład 50%, teoretyczne opracowanie nowej metody syntezy genów. Udział w eksperymencie dotyczącym syntezy genu kodującego hirudynę w wektorze pbad TOPO. 7 Ablordey A, Kotłowski R, Swings J, Portaels F PCR amplification with primers based on IS2404 and GC- rich repeated sequence reveals polymorphism in Mycobacterium ulcerans. J Clin Microbiol. Jan;43(1): Indywidualny wkład 25%, pomoc w zaprojektowaniu eksperymentów z udziałem nowej metody genotypowania bakterii Mycobacterium ulcerans. 8 Szweda P, Kotłowski R, Kur J New effective sources of the Staphylococcus simulans lysostaphin. J Biotechnol. 4;117(2): Indywidualny wkład - 25%, teoretyczne opracowanie metody otrzymywania białek rekombinantowych identycznych z naturalnymi. Zaprojektowanie sekwencji starterowych do klonowania lizostafyny wraz z sekwencją kodującą czteroaminokwasową sekwencję rozpoznania dla proteazy Factor Xa. 9 Kotłowski R, Martin A, Ablordey A, Chemlal K, Fonteyne PA, Portaels F One-tube cell lysis and DNA extraction procedure for PCR-based detection of Mycobacterium ulcerans in aquatic insects, molluscs and fish. J Med Microbiol. 53(Pt 9): Indywidualny wkład 45%, opracowanie nowej metody izolacji DNA z prątków i częściowe napisanie manuskryptu. 10 Kotłowski R, Shamputa IC, El Aila NA, Sajduda A, Rigouts L, van Deun A, Portaels F PCRbased genotyping of Mycobacterium tuberculosis with new GC-rich repeated sequences and IS6110 inverted repeats used as primers. J Clin Microbiol. 42(1): Indywidualny wkład - 30%, opracowanie nowej metody genotypowania prątków gruźlicy. Napisanie manuskryptu. 11 Alsallami AA, Kotłowski R Selection of primers for specific detection of Clostridium botulinum types B and E neurotoxin genes using PCR method. Int J Food Microbiol. 28;69(3): Indywidualny wkład - 50%, udział w opracowaniu metody identyfikacji genów kodujących neurotoksyny C. botulinum. Udział w wykonaniu części doświadczalnej pracy. Napisanie manuskryptu. 12 Szweda P, Pladzyk R, Kotłowski R, Kur J. Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. Protein Expr Purif , , , , , , , , , , ,

9 Aug;22(3): Indywidualny wkład - 25%, udział w opracowaniu metody otrzymywania oraz oczyszczania lizostafyny z udziałem domeny fuzyjnej CBD (ang. Chitin Binding Domain). 13 Paziak-Domańska B, Bogusławska E, Wieckowska-Szakiel M, Kotłowski R, Rózalska B, Chmiela M, Kur J, Dabrowski W, Rudnicka W. Evaluation of the API test, phosphatidylinositol-specific phospholipase C activity and PCR method in identification of Listeria monocytogenes in meat foods. FEMS Microbiol Lett. 1999, Feb 15;171(2): Indywidualny wkład 10%, oznaczenia gatunku Listeria monocytogenes techniką PCR. 14. Kotlowski R., Myjak, P., Kur, J Specific detection of Amanita phalloides mycelium and spores by PCR amplification of the gpd (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene fragment. J. Food Biochem. 24/3, Indywidualny wkład - 30%, opracowanie gatunkowo specyficznej metody identyfikacji muchomora sromotnikowego metodą PCR. 1, , Sumarycznie 29, B) Udzielone patenty międzynarodowe i krajowe Brak C) Wynalazki oraz wzory użytkowe i przemysłowe, które uzyskały ochronę i zostały wystawione na międzynarodowych lub krajowych wystawach lub targach Brak D) Monografie, publikacje naukowe w czasopismach międzynarodowych lub krajowych innych niż znajdujące się w bazie, o której mowa w punktach 1 i 2: L.p. Publikacje po doktoracie MNiSW Cyt. 1. Nowak-Zaleska A, Krawczyk B, Kotłowski R, Mikucka A, Gospodarek E Amplification of a 9 1 single-locus variable-number direct repeats with restriction fragment length polymorphism (DR- PCR/RFLP) for genetic typing of Acinetobacter baumannii strains. Pol J Microbiol.57(1):11-7. Indywidualny wkład 10%, wybór celu molekularnego do różnicowania szczepów gatunku Acinetobacter baumannii. 3. Kotlowski R, Szweda, P Krajewski W Bednarska N. Species-specific detection of the toxic mushrooms Amanita virosa and Amanita verna by PCR amplification of the gpd gene fragment. Eurofoodtox V Conference "Food Safety - a Challenge for Processing of Food of Plant Origin", Pol J of Food Nutr Sci, 2002, Vol Indywidualny wkład - 50%, opracowanie metod wykrywania białych odmian muchomora sromotnikowego. Napisanie manuskryptu. Przed doktoratem 4. Wieckowska M, Kotłowski R, Kur J, Rudnicka W. [Use of PCR methods for identification of Listeria monocytogenes in milk]. Med Dosw Mikrobiol. 1998;50(3-4): Indywidualny wkład 25%, wykonanie części doświadczeń związanych z oznaczeniem czułości wykrywania Listeria monocytogenes w próbkach wody i mleka. 5. Kotłowski R, Kaczmarek, M., Kur, J., Rudnicka, W. Differentiation of Listeria monocytogenes on the basis of hemolytic and phosphatidylinositol specific phospholipase C activity and by PCR method (1996) Pol. J. Food Nutr. Sci., 3, pp Indywidualny wkład 25%, opracowanie metody identyfikacji gatunku bakterii Listeria monocytogenes. 6. Sikorski ZE, Kotłowski R. Gorące wędzenie ryb w łagodnych warunkach. Przemysł Spożywczy 1998, 52, 7. s.34. Indywidualny wkład - 18%, wykonanie doświadczeń opisanych w publikacji. Suma:

10 E) Opracowania zbiorowe, katalogi zbiorów, dokumentacja prac badawczych, ekspertyz, utworów i dzieł artystycznych Skrypty dydaktyczne 1. Krawczyk B, Kotłowski R, Stojowska K, Szemiako K. Diagnostyka Molekularna z zastosowaniem techniki PCR. Ćwiczenia Laboratoryjne. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk ISBN Indywidualny wkład - 10%, opracowanie trzech ćwiczeń laboratoryjnych. 2. Krawczyk B, Kotłowski R, Stojowska K, Szemiako K. Podstawy Techniki PCR. Ćwiczenia Laboratoryjne. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk ISBN Indywidualny wkład - 5%, opracowanie dwóch ćwiczeń laboratoryjnych oraz udział przy projektowaniu sekwencji starterowych w metodzie oznaczania płci techniką PCR. Rozdziały w książkach 3. Sadowska M., Kotłowski R. Fizykochemiczne właściwości kolagenu ryb, świń i bydła W: Żelatyna. Właś-ciwości - Technologia - Użytkowanie. Pr. zbior. pod red. A. Rutkowskiego. Konin: Polska Izba Dodatków do Żywności, s , 2 rys. 5 tab. bib- liogr. 6 poz. Indywidualny wkład 25%, udział w zaprojektowaniu nowej metody gatunkowo-specyficznego wykrywania kolagenu z użyciem specyficznych przeciwciał. F) Sumaryczny impact factor według listy Journal Citation Reports (JCR), zgodnie z rokiem opublikowania wszystkie publikacje: IF=53,851 Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego: IF=24,338 G) Liczba cytowań publikacji według bazy Web of Science (WoS): 402 Bez autocytowań (WoS): 388 H) Indeks Hirscha według bazy Web of Science (WoS): 9 I) Kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi oraz udział w takich projektach 1. Zastosowanie amplifikacji DNA genu hly do identyfikowania Listeria monocytogenes w wędzonych rybach (promotorski), Rok rozpoczęcia Komitet Badań Naukowych. Główny wykonawca. 5 P06G Otrzymywanie i modyfikacje kolagenu skór ryb, Rok rozpoczęcia Komitet Badań Naukowych. Główny wykonawca, 5 P06G Badania nad właściwościami przeciwrakotwórczymi wykazywanymi przez wybrane składniki żywności będące tradycyjnym elementem polskiej diety. Rok rozpoczęcia Komitet Badań Naukowych. Główny wykonawca. 2 P06T Genetical characterization of the putative hemolysins/cytolysins of Mycobacterium avium. Rok rozpoczęcia Projekt finansowany w ramach stypendium: Individual Marie Curie Fellowship przez EU. Główny Wykonawca. MCFI Otrzymanie lizostafyny oraz lizostafyny połączonej z diwercyną w drożdżowych układach ekspresyjnych. Możliwość wykorzystania otrzymywanych białek rekombinantowych do poprawy mikrobiologicznej jakości produktów żywnościowych. Rok rozpoczęcia Komitet Badań Naukowych. Kierownik Projektu. 2 P06T

11 6. Genotypowanie szczepów Acinetobacter baumannii w oparciu o polimorfizm prostych powtórzeń typu DR. Rok rozpoczęcia Komitet Badań Naukowych. Główny wykonawca. 2 P05D Microbial etiology of Inflammatory Bowel Disease Grant finansowany przez fundację Crohn s and Colitis Foundation of Canada. Główny wykonawca. 8. Role of Bacteroides spp. and Escherichia coli in inflammatory bowel disease Grant finansowany przez fundację Crohn s and Colitis Foundation of Canada. Główny Wykonawca. J) Międzynarodowe i krajowe nagrody za działalność naukową albo artystyczną 1. Nagroda za wyróżniającą się pracę magisterską r. Przyznana przez Stowarzyszenie Inżynierów i Techników Przemysłu Chemicznego. 2. Nagroda indywidualna II stopnia r. Przyznana przez J.M. Pana Rektora Politechniki Gdańskiej za szczególne osiągnięcia w działalności naukowej r. Za wyróżniającą się pracę doktorską. 3. Individual Marie Curie Fellowship na prowadzenie badań w Prince Leopold Institute of Tropical Medicine w Antwerpii w ramach dwuletniego projektu r. Przyznana przez EU. Finansowanie projektu naukowego. 4. Nagroda Zespołowa III stopnia przyznana przez J. M. Pana Rektora Politechniki Gdańskiej za wyróżniającą działalność dydaktyczna r. Udział w przygotowaniu dwóch skryptów dydaktycznych. K) Wygłoszenie referatów na międzynarodowych i krajowych konferencjach tematycznych 1. Kotłowski R, Kur J czerwca Łączne zastosowanie techniki PCR oraz RFLP do wykrywania Listeria monocytogenes w próbkach żywności. W: Referaty. XXVII Sesja Naukowa Komitetu Technologii i Chemii Żywności PAN ''Postępy w technologii, przechowalnictwie i ocenie jakości żywności''. s , 4 rys. bibliogr. 11 poz. Szczecin. 2. Kotłowski R, Czaplicka I, Kur J Detection of Salmonella in powdered eggs, sweets stuffing and sweets by combining of the sample enrichment incubation with the PCR assay. W: Eggs and egg products quality. Proceedings of the VII European Symposium on the Quality of Eggs and Egg Products. Sess. E4-28 s , 2 rys. bibliogr. 19 poz. Poznań. 3. Kotłowski R, Tylingo R, Kur J września Szybka metoda wykrywania Clostridium tyrobutyricum, Clostridium sporogenes i Clostridium perfingens techniką PCR w mleku i serach. W: Streszczenia referatów i doniesień naukowych. s XXIX Sesja Naukowa Komitetu Technologii i Chemii Żywności PAN. Procesy technologiczne a jakość żywności. Olsztyn. 11

12 4. Kotłowski R, Więckowska M, Kur J czerwca 1996 r. Szybka i prosta metoda izolacji DNA z próbek surowego mleka do bezpośredniej detekcji Listeria monocytogenes techniką PCR. Rocz. Wojskowy Instytut Higieny t. 33 supl. 1 s. 4. XII Konferencja Naukowa ''Diagnostyka mikrobiologiczna''. Puławy. 5. Kotłowski R. 3 października 2013 r. Zastosowanie mikromacierzy w badaniu etiologii chorób Leśniowskiego-Crohna i wrzodzieja cego zapalenia jelita grubego. Zebranie Członków Oddziału Gdańskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Gdańsk. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH a) Opracowanie metody wykrywania Listeria monocytogenes metodą PCR. Bakterie z gatunku L. monocytogenes stosunkowo rzadko wywołują zakażenia u ludzi. Niemniej odsetek przypadków śmiertelnych w obrębie osób zakażonych wynosi od 25 do 30% (Schuchat et al. 1991). Celem pracy było opracowanie gatunkowo-specyficznej metody wykrywania gatunku L. monocytogenes. Do zaprojektowania sekwencji starterowych w metodzie PCR specyficznej dla gatunku L. monocytogenes wybrano gen hlya kodujący hemolizynę (Kotłowski i in. 1996). Metodę wykorzystano do identyfikacji gatunku L. monocytogenes spośród izolatów pochodzących z próbek mięsa oraz wędlin (Kotłowski i in. 1999). Schuchat, A., Swaminathan, B. and Broome, C.V. (1991) Epidemiology of human listeriosis. Clin. Microbiol. Res. 4, Kotłowski R, Kaczmarek, M., Kur, J., Rudnicka, W. Differentiation of Listeria monocytogenes on the basis of hemolytic and phosphatidylinositol specific phospholipase C activity and by PCR method (1996) Pol. J. Food Nutr. Sci., 3, pp Paziak-Domańska B, Bogusławska E, Wieckowska-Szakiel M, Kotłowski R, Rózalska B, Chmiela M, Kur J, Dabrowski W, Rudnicka W. Evaluation of the API test, phosphatidylinositol-specific phospholipase C activity and PCR method in identification of Listeria monocytogenes in meat foods. FEMS Microbiol Lett. 1999, Feb 15;171(2): b) Opracowanie metody detekcji oraz identyfikacji gatunków grzybów kapeluszowych metodą PCR. Trujące grzyby kapeluszowe są przyczyną zatruć pokarmowych u ludzi. Mikroskopowa analiza zarodników nie zawsze pozwala na ustalenie przyczyny zatruć grzybami z uwagi na między gatunkowe podobieństwo zarodników. Diagnostyka oparta na analizie materiału genetycznego pozwala na gatunkową identyfikację zarówno strzępek grzyba jak i zarodników. W badaniach wybrano gen gpd kodujący dehydrogenazę aldehydu 3- fosfoglicerynowego do gatunkowo specyficznej identyfikacji gatunków grzybów wywołujących zatrucia pokarmowe (Kotłowski i in. 2000, Kotłowski i in. 2002). Proponowana metoda może być przydatna w diagnostyce zatruć grzybami kapeluszowymi. 12

13 Kotlowski R., Myjak, P., Kur, J. Specific detection of Amanita phalloides mycelium and spores by PCR amplification of the gpd (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene fragment. J. Food Biochem., 2000, vol. 24/3, Kotlowski R, Szweda, P Krajewski W Bednarska N. Species-specific detection of the toxic mushrooms Amanita virosa and Amanita verna by PCR amplification of the gpd gene fragment. Eurofoodtox V Conference "Food Safety - a Challenge for Processing of Food of Plant Origin", Pol J of Food Nutr Sci, 2002, Vol c) Opracowanie uniwersalnej metody syntezy genów. Izolacja genów ze źródeł naturalnych nie zawsze jest możliwa z uwagi na koszty pozyskania materiału genetycznego rzadko występujących zwierząt czy roślin. W celu poszukiwania nowych lub ulepszonych enzymów o znaczeniu ekonomicznym modyfikacja sekwencji genów pochodzenia naturalnego jak i synteza nieznanych w naturze genów stwarza nowe możliwości w badaniach naukowych oraz aplikacyjnych. Z tego względu zaproponowano metodę otrzymywania genów o dowolnej sekwencji nukleotydowej. Metoda polega na chemicznej syntezie oligonukleotydów zawierających komplementarne sekwencje z końca 3 o długości około pz oraz wykorzystaniu reakcji PCR w celu syntezy nici komplementarnych do syntetycznych oligonukleotydów (Rys. 1). Metody chemicznej syntezy oligonukleotydów pozwalają na uzyskanie pojedynczego oligonukleotydu wielkości ponad 100 par zasad. Połączenie dwóch oligonukleotydów pozwala na uzyskanie syntetycznego produktu PCR wielkości około 200 pz (Kochanowski i in. 2006). I II PCR III IV PCR Rys. 1 Metoda syntezy genów. Sekwencje starterów oznaczono strzałkami. Kochanowski R, Kotłowski R, Kolodziejska I, Watkowska D. Chemical synthesis of hirudin gene and construction of plasmid for expression of recombinant protein. XXV conference of the Polish Society of Microbiology, Bydgoszcz, october Kochanowski R, Kotłowski R, Szweda P. Novel method of expression and purification of hirudin based on pbad TOPO, ptyb12 vectors and gene synthesis. Protein Expr Purif Nov;50(1): d) Opracowanie metody otrzymywania białek identycznych z naturalnymi. Opracowano metodę otrzymywania natywnych białek rekombinantowych przy wykorzystaniu miejsca restrykcyjnego rozpoznawanego przez proteazę Factor Xa. Metoda polega na oczyszczaniu białka fuzyjnego zawierającego domenę polihistydynową przy wykorzystaniu chromatografii metalo-powinowadstwa oraz zastosowaniu proteazy Factor Xa rozpoznającą sekwencję aminokwasową Ile-(Glu lub Asp)-Gly-Arg (Rys. 2). Przydatność metody 13

14 potwierdzono podczas otrzymywania lizostafyny bez domen fuzyjnych w celu uzyskania białka identycznego z naturalnym (Szweda i in. 2005). Miejsce restrykcyjne proteazy Starter 1 promotor 6xHis Factor Xa lizostafyna Plazmid pbadlys Starter 2 Rys. 2 Metoda otrzymywania natywnych białek przy wykorzystaniu proteazy Factor Xa Szweda P, Kotłowski R, Kur J. New effective sources of the Staphylococcus simulans lysostaphin. J Biotechnol May 4;117(2): e) Opracowanie metody różnicowania genetycznego prątków gruźlicy. Opracowano prostą w wykonaniu, tanią i nową metodę genotypowania Mycobacterium tuberculosis. Metoda polega na amplifikacji genomowego DNA M. tuberculosis uprzednio trawionego endonukleazą restrykcyjną PvuII przy wykorzystaniu techniki PCR (Kotłowski i in. 2004). Celem amplifikacji są rejony DNA pomiędzy sekwencjami elementu insercyjnego IS6110 oraz rejonami komplementarnymi do jednej z dwóch sekwencji DNA najbardziej powtarzających się w genomach M. tuberculosis. Metodę zastosowano do badania genetycznego podobieństwa 77 wielolekoopornych szczepów M. tuberculosis izolowanych na terenie Polski (Sajduda i in. 2006) oraz do różnicowania genetycznego szczepów M. tuberculosis w obrębie spoligotypu H charakterystycznego dla województwa kujawsko-pomorskiego (Augustynowicz-Kopeć i Zwolska 2007). Ponadto, metodę w zmodyfikowanej wersji wykorzystano również do genotypowania szczepów M. ulcerans (Ablordey i in. 2005). Modyfikacja polegała na pominięciu etapu enzymatycznego trawienia genomów przy wykorzystaniu endonukleazy PvuII oraz wykorzystaniu sekwencji insercyjnej IS2404 w miejsce sekwencji insercyjnej IS6110. Zaletą opracowanej metody jest możliwość różnicowania szczepów o tym samym wzorze uzyskanym w metodzie Spoligotyping oraz metodzie IS6110-RFLP (Sajduda i in. 2006). Kotłowski R, Shamputa IC, El Aila NA, Sajduda A, Rigouts L, van Deun A, Portaels F. PCR-based genotyping of Mycobacterium tuberculosis with new GC-rich repeated sequences and IS6110 inverted repeats used as primers. J Clin Microbiol Jan;42(1): Sajduda A, Dziadek J, Kotłowski R, Portaels F. Evaluation of multiple genetic markers for typing drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Poland. Diagn Microbiol Infect Dis May;55(1): Augustynowicz-Kopeć i Zwolska Gruźlica wywołana prątkami o oporności XDR w Polsce. Badania mikrobiologiczne i molekularne. Pneumonol. Alergol. Pol. 2007; 75: Ablordey A, Kotłowski R, Swings J, Portaels F. PCR amplification with primers based on IS2404 and GC- rich repeated sequence reveals polymorphism in Mycobacterium ulcerans. J Clin Microbiol Jan;43(1):

15 f) Opracowanie metody izolacji DNA bakterii z rodzaju Mycobacterium z próbek klinicznych oraz środowiskowych Zoptymalizowano wzajemne proporcje chloroformu, soli sodowej siarczanu dodecylu sodu, sarkozylu oraz rodanku guanidyny w roztworze do izolacji DNA w celu przeprowadzenia wydajnej lizy komórek oraz ekstrakcji DNA bezpośrednio z bakterii, próbek klinicznych i środowiskowych. W metodzie zastosowano metodę oczyszczania DNA na kolumienkach ze złożem krzemionkowym. Skuteczność proponowanej metody potwierdzono na próbkach biopsji po kolonoskopii pobranych od osób z chorobami LC, WZJG oraz grupy kontrolnej (Kotłowski i in. 2007). Ponadto, metodę wykorzystano do wydajnej ekstrakcji DNA Mycobacterium ulcerans z próbek wodnych insektów, które przenoszą prątki M. ulcerans ze środowiska do organizmu człowieka w wyniku ukąszenia (Kotłowski i in. 2004) jak również z M. avium oraz M. tuberculosis. Kotłowski R, Bernstein CN, Sepehri S, Krause DO. High prevalence of Escherichia coli belonging to the B2+D phylogenetic group in inflammatory bowel disease. Gut May;56(5): Kotłowski R, Martin A, Ablordey A, Chemlal K, Fonteyne PA, Portaels F. One-tube cell lysis and DNA extraction procedure for PCR-based detection of Mycobacterium ulcerans in aquatic insects, molluscs and fish. J Med Microbiol Sep;53(Pt 9): g) Identyfikacja gatunku Mycobacterium avium subsp. silvaticum na podstawie analizy PCR-RFLP genu kodującego alfa antygen. Po raz pierwszy opracowano metodę identyfikacji Mycobacterium avium subsp. silvaticum na podstawie analizy sekwencji DNA alfa antygenu. Zastosowanie enzymu HhaI do trawienia produktu PCR z uzyskanego z udziałem starterów specyficznych wobec genu kodującego alfa antygen pozwoliło na identyfikację Mycobacterium avium subsp. silvaticum (Chiers et al., 2012). Opracowana nowa metoda pozwala na prowadzenie badań epidemiologicznych bezpośrednio z próbek pochodzących od zwierząt bez konieczności izolacji czystych kultur bakteryjnych. Chiers K, Deschaght P, De Baere T, Dabrowski S, Kotlowski R, De Clercq D, Ducatelle R, Vaneechoutte M. Isolation and identification of Mycobacterium avium subspecies silvaticum from a horse. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2012; 35 (4), pp