TOKSYKOLOGIA MOLEKULARNA

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "TOKSYKOLOGIA MOLEKULARNA"

Transkrypt

1 Paweł BRZUZAN, Maciej WOŹNY, Michał K. ŁUCZYŃSKI TOKSYKOLOGIA MOLEKULARNA przewodnik do ćwiczeń Olsztyn 2007

2 Spis treści WSTĘP... 2 ROZDZIAŁ 1. GENOTOKSYCZNOŚĆ... 6 ĆWICZENIE 1.1. ELEKTROFOREZA POJEDYNCZYCH JĄDER KOMÓRKOWYCH W śelu AGAROZOWYM (SCGE)... 6 Zadanie Elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych erytrocytów pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) poddanych działaniu H 2 O Zadanie Mikroskopowa analiza obrazu komet metodą Gedika ĆWICZENIE 1.2. TEST MIKROJĄDROWY (MN) Zadanie Test mikrojądrowy (MN) ĆWICZENIE 1.3. TEST AMESA ROZDZIAŁ 2. DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA: POLIMORFIZM GENÓW KODUJĄCYCH BIAŁKA UCZESTNICZĄCE W METABOLIZMIE KSENOBIOTYKÓW ĆWICZENIE 2.1. UZYSKIWANIE DNA GENOMOWEGO Zadanie Uzyskiwanie DNA genomowego z cebulki włosa Zadanie Uzyskiwanie DNA z krwi obwodowej za pomocą zestawu odczynników Pronto (Izrael).. 29 Zadanie Ocena jakościowa i ilościowa wyizolowanego DNA za pomocą spektrofotometru Zadanie Ocena jakościowa wyizolowanego DNA za pomocą rozdziału w Ŝelu agarozowym ĆWICZENIE 2.2. AMPLIFIKACJA GENÓW GSTM1 I GSTT1 Z WYKORZYSTANIEM METODY AS-PCR (VANDEN HEUVEL, 1998) Zadanie Detekcja polimorfizmu genów GSTM1 i GSTT Zadanie Obliczanie frekwencji genów GSTT1 i GSTM1 w grupie studentów ROZDZIAŁ 3. EKSPRESJA GENÓW POD WPŁYWEM TOKSYCZNYCH SUBSTANCJI CHEMICZNYCH ĆWICZENIE 3.1. UZYSKIWANIE RNA Zadanie Uzyskiwanie całkowitego RNA z wątroby (nerki) przy pomocy zestawu odczynników Total RNA (A&A Biotechnology, Polska) ĆWICZENIE 3.2. ODWROTNA TRANSKRYPCJA ĆWICZENIE 3.3. POMIAR STOPNIA INDUKCJI GENÓW CYP1A (METODA PÓŁILOŚCIOWA) ĆWICZENIE 3.4. POMIAR STOPNIA INDUKCJI GENÓW CYP1A (METODA ILOŚCIOWA) ĆWICZENIE 3.3. ANALIZA EKSPRESJI GENÓW Z UśYCIEM TECHNOLOGII REAL-TIME PCR Zadanie Relatywna kwantyfikacja liczby transkryptów mrna Zadanie Absolutna kwantyfikacja transkryptów mrna ROZDZIAŁ 4. MACIERZE CDNA ĆWICZENIE 4.1. METODA SONDOWANIA MOLEKULARNEGO GENÓW AKTYWNYCH TRANSKYPCYJNIE POD WPŁYWEM SKAśENIA ŚRODOWISKA WODNEGO WYBRANYMI WIELOPIERŚCIENIOWYMI WĘGLOWODORAMI AROMATYCZNYMI (Z WYKORZYSTANIEM ZESTAWU DIG DNA LABELING AND DETECTION KIT FIRMY ROCHE) ZAŁĄCZNIKI ZAŁĄCZNIK 1. TEST U-MANNA WHITNEYA

3 Wstęp Od kilku lat zespół toksykologii Katedry Biotechnologii w Ochronie Środowiska realizuje projekty dotyczące reakcji wybranych gatunków ryb jako kryterium oceny stopnia toksyczności i genotoksyczności ksenobiotyków naleŝących do rozmaitych grup związków chemicznych: wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, farmaceutyków i związków wykazujących aktywność estrogenną. Ocena wpływu tych związków na populacje ryb nabiera szczególnego znaczenia w przypadku naraŝenia ekosystemu na stały dopływ zanieczyszczeń, tak jak się to dzieje na obszarach zindustrializowanych lub w pobliŝu nieprawidłowo zaprojektowanych składowisk odpadów komunalnych i przemysłowych. Badanie odpowiedzi biologicznej na poziomie populacji, za pomocą tak zwanych biowskaźników (bioindykatorów) jest bardzo trudne, moŝna natomiast badać indywidualną reakcję kaŝdego osobnika i to juŝ na poziomie molekularnym za pomocą odpowiednio dobranego systemu biomarkerów (Iha i in. 2000). W przypadku niektórych związków chemicznych studia te mają ułatwić wybór wskaźników do badania potencjalnej mutagenności i kancerogenności wody do picia. Liczymy na opracowanie optymalnych metod biologicznego monitorowania zmian jakości środowiska wodnego, wywołanych przez mieszaniny mikrozanieczyszczeń. UŜytecznym biomarkerem w ocenie własności genotoksycznych albo mutagennych danego zanieczyszczenia środowiska, badanym na poziomie molekularnym, moŝe być stopień uszkodzenia DNA (Shugart 1990). Substancje mutagenne mogą tworzyć w pojedynczej nici DNA tak zwane addukty, albo wywoływać jej pęknięcia. W wyniku zmian w sekwencji i organizacji DNA powstają aberracje chromosomowe (CA), które mogą dotyczyć ich struktury albo zmian liczbowych. Zmiany te mogą prowadzić poprzez transformację komórki do procesów nowotworowych. W badaniach powstawania uszkodzeń DNA pod wpływem substancji genotoksycznych stosuje się między innymi metodę kometową (Comet Assay, Mitchelmore i Chipman 1998), test mikrojądrowy (MN) (Carrasco i in. 1990) a takŝe test mutagenności Amesa (Ames i in 1975). Sposób wykonania ćwiczeń, zalety i ograniczenia kaŝdej z metod przedstawiono w Rozdziale 1. ZróŜnicowana wraŝliwość organizmów na działanie czynników toksycznych jest w wielu przypadkach wynikiem polimorfizmu genów kodujących białka uczestniczące w szlakach aktywacji metabolicznej i/albo detoksykacji. Badania materiału genetycznego pełnią wówczas rolę diagnostyczną pozwalają wskazać, które z osobników mogą być najbardziej 2

4 wraŝliwe na działanie określonych czynników. Rozdział 2 opisuje jedną z metod molekularnych umoŝliwiających wykrycie polimorfizmu genetycznego ludzkiej S-transferazy glutationowej (GST), enzymu uczestniczącego w fazie II biotransformacji. Odmienne podejście metodyczne umoŝliwia badanie zmian aktywności genów wywołanych działaniem toksycznych substancji chemicznych. Cytochromy P450 (Nelson i in. 1996), naleŝą do głównych składowych systemu obrony organizmu ryb przeciw wielu ksenobiotykom wykrywanym w środowisku wodnym, takim jak na przykład wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polichlorowane bifenyle (PCB), dioksyny czy furany. PoniewaŜ wzrost aktywności genów P450 następuje w odpowiedzi na pojawienie ksenobiotyku, badanie poziomu P450 w tkankach umoŝliwia określenie naraŝenia populacji na zanieczyszczenie ich środowiska. Jeszcze do niedawna, pomiar stopnia indukcji cytochromu P450 wymagał zastosowania technik hybrydyzacyjnych (Southern i Western blotting), testów z immunosorbentami (ELISA), albo testów aktywności enzymatycznej O- deetylazy etoksyrezorufiny (EROD). Metody te wprawdzie pozwalają na detekcję produktów ekspresji odpowiednich genów P450 (zarówno jako mrna albo polipeptyd), to jednak nie jest moŝliwe oszacowanie liczby ich transkryptów mrna. Obecnie, ilościowe badanie ekspresji odpowiednich genów P450 moŝliwe jest przez zastosowanie metody RT-PCR (ang. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), czyli kombinowanej metody z udziałem enzymu odwrotnej transkryptazy w połączeniu z techniką PCR (Rozdział 3; Vanden Heuvel 1998). W tym rozdziale podajemy teŝ praktyczne informacje na temat technologii Real-Time PCR i jej zastosowanie w analizach ekspresji genów (Higuchi i in. 1993). Ostatni rozdział poświęcamy zagadnieniom toksykogenomiki i sposobom konstruowania macierzy cdna, które pozwalają na kompleksowe badanie ekspresji genów w tkankach ryb pod wpływem substancji toksycznych (profilowanie genetyczne). Toksykogenomika pozwala na odkrywanie i badanie genów ulegających transkrypcji w poszczególnych typach komórek i tkanek organizmów naraŝonych na działanie toksykantów lub ich mieszanin. Jak dotychczas, analizy profilu ekspresji genetycznej, z uŝyciem setek sond molekularnych nanoszonych na płytki szklane (mikromacierzy i makromacierzy cdna), sprzęŝone z opisem zmian fenotypowych organizmów są najbardziej czułym i odpowiednim narzędziem w badaniach środowiskowych szkodliwego wpływu róŝnych ksenobiotyków, w tym takŝe WWA, na procesy Ŝyciowe organizmów. 3

5 Celem przewodnika jest zapoznanie studentów ochrony środowiska z niektórymi zagadnieniami charakterystycznymi dla współczesnej toksykologii molekularnej i diagnostyki DNA. Mamy nadzieję, Ŝe robocze wydanie przewodnika będzie przydatne, a wszelkie uwagi przyjmiemy z wdzięcznością. Autorzy Piśmiennictwo: Ames B. N., J. McCann, E. Yamasaki,1975. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research, 31,347. Carrasco, K. R., Tilbury, K. L., and Myers, M. S. (1990). Assessment of the piscine micronucleus test as an in situ biological indicator of chemical contaminant effects. Can. J. Fish Aquat. Sci. 47: Higuchi, R., C. Fockler, G. Dollinger, R. Watson Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11: Jha A.N., Cheung V.V., Foulkes M..E., Hill S.J., Depledge M.H., Detection of genotoxins in the marine environment: adoption and evaluation of an integrated approach using the embryo-larval stages of the marine mussel, Mytilus edulis, Mutation Research 464: Mitchelmore, C.L., Chipman, J.K DNA strand breakage in aquatic organisms and the potential value of the comet assay in environmental monitoring. Mut. Res. 399: Nelson, D., Koymans, L., Kamataki, T., Stegeman, J., Feyereisen, R., Waxaman, D., Waterman, M., Gotoh, O., Coon, M., Estabrook, R., Gunslaus, I., Nebert, D P450 subfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Pharmacogenetics 6: Shugart L Biological monitoring:testing for genotoxicity. In: Biomarkers of environmental contamination (J.F. McCarthy and L.R. Shugart, eds.) s , Lewis, Chelsea. Vanden Heuvel, J.P PCR Protocols in Molecular Toxicology. CRC Press, New York, s

6 1. Genotoksyczność 5

7 Rozdział 1. Genotoksyczność Genotoksyczność rozumiemy jako zdolność do wywoływania przez określone czynniki względnie trwałych zmian w materiale genetycznym. Czynniki takie mogą mieć charakter chemiczny, na przykład wolne rodniki, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, metale cięŝkie lub fizyczny - promieniowanie UV, promieniowanie X. Pęknięcia DNA mogą mieć charakter pierwotny lub wtórny. Pierwotne pęknięcia wywoływane są bezpośrednio działaniem czynników fragmentujących nici DNA (powodowane przez: promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe czy tak zwane radiometryki), mogą zachodzić równieŝ na skutek działania reaktywnych form tlenu. Pęknięcia wtórne powstają w czasie trwania procesów naprawczych DNA prowadzonych przez enzymy naprawcze (szczególnie podczas naprawy uszkodzenia DNA polegającej na wycinaniu zasad azotowych - BER; base excision repair). Powoduje to powstawanie zmian w sekwencji i organizacji DNA, co z kolei moŝe doprowadzić do zmian w strukturze i liczbie chromosomów i/albo sprzyjać transformacji komórek, której skutkiem jest najczęściej powstanie nowotworu. Ćwiczenie 1.1. Elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych w Ŝelu agarozowym (SCGE) Jedną z metod badania stopnia uszkodzenia DNA wywołanego działaniem czynnika genotoksycznego jest elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych w Ŝelu agarozowym (SCGE single cell gel electrophoresis), popularnie nazywana metodą kometową (Comet Assay) z powodu charakterystycznego obrazu uzyskiwanego w mikroskopie fluorescencyjnym. Pierwszymi badaczami, którzy oceniali uszkodzenia DNA w pojedynczych komórkach byli Rydberg i Johanson (1978). Jednak właściwa metoda testu kometowego wprowadzona została w 1984 przez Östlinga i Johansona. Autorzy ci wykazali, Ŝe zawartość DNA w ogonie komety i jego długość są funkcją pochłoniętej przez komórkę dawki promieniowania; upraszczając, im większa dawka promieniowania tym dłuŝszy ogon komety. W metodzie kometowej bada się pojedyncze komórki; mogą to być komórki wątroby, krwi albo nabłonka, jedynym warunkiem jest by miały one jądra zawierające DNA. Wygodnym obiektem do badań tą metodą są erytrocyty ryb, poniewaŝ mają one jądra 6

8 komórkowe, są bardzo liczne (stanowią nawet 97% wszystkich elementów morfotycznych krwi ryby) i co bardzo waŝne, dokładnie poznane są ich cechy biochemiczne i fizjologiczne. Analiza komet jest metodą względnie prostą, łatwą do wykonania, a uzyskane wyniki są powtarzalne. Metoda ta jest obecnie ciągle udoskonalana; powstają modyfikacje z zastosowaniem przeciwciał albo hybrydyzacji z sondami molekularnymi (FISH), które pozwalają na szybkie i wybiórcze określenie charakteru zmian w obrębie jądrowego DNA. Zadanie Elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych erytrocytów pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) poddanych działaniu H 2 O 2 Nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) jest źródłem tak zwanych wolnych rodników, które są bardzo reaktywne chemicznie i choć naturalnie występują w małych ilościach w kaŝdej Ŝywej komórce, to w sytuacjach patologicznych, jaką jest stres oksydatywny, są wysoce genotoksyczne. Komórki (erytrocyty) przeznaczone do badania (Rys.1A) poddaje się działaniu czynnika genotoksycznego (Rys.1B). Komórki zawiesza się następnie w roztworze agarozy (Rys.1C) i nanosi cienką warstwą na szkiełka mikroskopowe (Rys 1D), po czym poddaje się je działaniu pola elektrycznego prądu stałego (Rys.1E). PoniewaŜ kwas deoksyrybonukleinowy zawarty w jądrach komórkowych ma ładunek ujemny (-), wędruje w polu elektrycznym w kierunku bieguna dodatniego (+). Podczas elektroforezy w Ŝelu agarozowym, DNA i jego fragmenty powstałe na skutek działania czynnika genotoksycznego są rozdzielane w postępie odwrotnie proporcjonalnym do ich mas cząsteczkowych; najbliŝej wędruje wysokocząsteczkowy (nieuszkodzony) DNA, najdalej natomiast jego najkrótsze fragmenty (Rys.1F). Po przeprowadzeniu elektroforezy preparaty wybarwia się barwnikiem fluorescencyjnym i umieszcza pod mikroskopem wyposaŝonym w odpowiednie źródło światła i zestaw filtrów. Obraz otrzymywany spod mikroskopu przenosi się za pomocą kamery do komputera i korzystając z odpowiednich programów zliczających liczbę i wygląd poszczególnych komet, szacuje rozmiary uszkodzeń DNA jądrowego. 7

9 Wykonanie Dzień przed doświadczeniem przygotować: łaźnie - piaskową i wodną pipety automatyczne szkiełka pokryte agarozą 1% NMP komorę Bürkera opisane probówki typu eppendorf schłodzić w lodówce wodę na bufor do elektroforezy schłodzić w lodówce kominek W dniu doświadczenia przygotować: bufor do lizy pojemnik z lodem Rysunek 1. Schemat metody SCGE (szczegóły w tekście). 8

10 Część I. Doświadczenie (patrz rysunek poniŝej) 1. Pobrać krew z Ŝyły ogonowej pstrąga tęczowego. 2. Krew rozcieńczyć w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) w stosunku 5 µl krwi na 1 ml PBS. 3. Sprawdzić liczbę komórek w komorze Bürkera aby osiągnąć odpowiednią liczbę komórek w jednostce objętości (konsultować z prowadzącym ćwiczenia). 4. Opcjonalnie wykonać test Ŝywotności komórek (CFDA). 5. Wymieszać 100 µl rozcieńczonego preparatu ze 100 µl genotoksykanta (H 2 O 2 ) w odpowiednim stęŝeniu i pozostawić na 5 min (ekspozycja). 6. Przenieść po 10 µl do nowych probówek. 9

11 Część II. Elektroforeza 1. Do kaŝdej probówki dodać 65 µl rozgrzanej agarozy LMP 0,5%, wymieszać przez pipetowanie. 2. Szybko nałoŝyć warstwę mieszaniny agarozy LMP z komórkami na oznaczone szkiełko pokryte 1% agarozą. 3. Szkiełka schłodzić na płycie z lodem. 4. NałoŜyć na szkiełka druga warstwę agarozy LMP. 5. Powtórzyć krok Przygotowane preparaty umieścić w kominku z buforem lizującym na 1 godzinę. 7. Po lizie umieścić preparaty w aparacie do elektroforezy, zalać buforem i pozostawić w nim na 20 min (Uwaga bufor do elektroforezy jest silnie zasadowy!). 8. Włączyć aparat do elektroforezy, czas 15 min. 9. Po skończeniu elektroforezy przenieść preparaty na kratkę i neutralizować przez 3 krotne polanie kaŝdego szkiełka, co 5 min. buforem (0,4 Tris, ph=7,5). 10. Preparaty wybarwić roztworem EtBr (20 µl/ml Uwaga! Bromek etydyny jest silnym kancerogenem!), rozprowadzając ostroŝnie pipetą 50 µl na kaŝdym. Nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Zadanie Mikroskopowa analiza obrazu komet metodą Gedika Wybarwiając preparaty uzyskane metodą SCGE posługujemy się z reguły bromkiem etydyny. MoŜna równieŝ stosować inne metody wizualizacji np. barwienie azotanem srebra, pozwalające na obserwację preparatów w świetle białym. Przy ocenie skali uszkodzenia materiału genetycznego moŝna posłuŝyć się komputerową analizą obrazu wykorzystując specjalistyczne oprogramowanie. Inny prosty sposób analizy obrazów komet, opierający się na klasyfikacji uszkodzeń DNA jądrowego w komórce do pięciu klas (patrz niŝej), zaproponował Gedik i wsp. (1992). Wykonanie 1. Analizę mikroskopową wykonujemy w świetle UV, zliczając po 50 komórek z kaŝdego szkiełka. Korzystając ze skali Gedika poniŝej uzupełnij tabelę. 2. Oblicz frekwencję komórek w poszczególnych zakresach uszkodzeń dla róŝnych stęŝeń genotoksykanta. Opisz swoje wnioski i obserwacje. 10

12 Stopień uszkodzenia DNA w jądrze komórki W próbie kontrolnej Dla dawki 50 µm H2O2 Dla dawki 500 µm H2O2 N L M H T 11

13 Skala Gedika N - brak uszkodzeń uszkodzenia Mniej niŝ 5% DNA w ogonie komety L - małe uszkodzenia 5% do 25% DNA w ogonie komety M - średnie uszkodzenia 20% do 40% DNA w ogonie komety H - duŝe uszkodzenia 40% do 95% DNA w ogonie komety T - całkowite uszkodzenia Ponad 95% DNA w ogonie komety 12

14 Piśmiennictwo: Gedik, C.M., Ewen, S.W., Colins, A.R Single cell gel electrophoresis applied to the analysis of UV-C damage and its repair in human cells. Int. J. Radiat. Biol., s. 62. Rojas, E., Lopez, M.C., Valverde, M Single cell gel electrophoresis assay: methodology and aplications. J. Chrom. B, 722:

15 Ćwiczenie 1.2. Test mikrojądrowy (MN) Test mikrojądrowy jest prostą i powszechnie stosowaną metodą słuŝącą do przyŝyciowego określania uszkodzeń chromosomów pod wpływem róŝnych czynników. Mikrojądra mogą być łatwo identyfikowane we wszystkich komórkach posiadających jądro komórkowe. Dotyczy to np. erytrocytów takich zwierząt jak ryby, płazy i ptaki, komórek nabłonka skrzeli ryb i małŝy, a takŝe komórek hemolimfy małŝy i innych bezkręgowców. W przypadku ssaków, ze względu na brak jąder w erytrocytach, mikrojądra analizuje się w leukocytach. Mikrojądra to chromatynowe struktury wewnątrz cytoplazmy, przypominające małe, dodatkowe jądra w komórce. Formują się one z chromosomów opóźnionych i utraconych podczas anafazy podziału mitotycznego komórki lub z acentrycznych fragmentów chromatynowych. (części chromosomów nie zawierające centromeru). Powstawanie mikrojąder jest zatem związane z chromosomowymi aberracjami liczbowymi (ubytek jednego lub kilku chromosomów z jądra komórkowego) oraz strukturalnymi (ubytek fragmentu jednego lub kilku chromosomów). Utracone podczas podziału komórki chromosomy lub ich fragmenty tworzą w cytoplazmie charakterystyczne, okrągłe struktury. Barwią się one odczynnikiem Giemzy w identyczny sposób jak jądro komórkowe (a inaczej niŝ cytoplazma), poniewaŝ są zbudowane z tego samego materiału co jądro, czyli z chromatyny jądrowej. Struktury te, zwane mikrojądrami, pojawiają się w komórkach na skutek oddziaływania czynników fizycznych (np. temperatura) lub chemicznych (związki o działaniu mutagennym i kancerogennym, na przykład policykliczne węglowodory aromatyczne). Test mikrojądrowy umoŝliwia analizowanie genotoksyczności zarówno określonych związków chemicznych, jak i mieszanin substancji o nieznanym lub bardzo złoŝonym składzie (Carrasco i in. 1990), na przykład wody zanieczyszczonej odpadami chemicznymi czy odcieków z wysypiska śmieci. 14

16 Zadanie Test mikrojądrowy (MN) Wykonanie 1. Pobieranie krwi. Miejscem, z którego pobiera się krew, moŝe być tętnica, Ŝyła ogonowa lub serce. Krew z tętnicy lub Ŝyły ogonowej najłatwiej pobrać za pomocą strzykawki, wbijając igłę za płetwą odbytową. 2. Wykonanie rozmazu Na szkiełko podstawowe nanosimy krople krwi, po czym rozprowadzamy ją szkiełkiem nakrywkowym. 3. Rozmaz utrwala się w metanolu przez 5 min. 4. Barwienie roztworem Giemzy (rozcieńczenie 1:9) przez 20 min. 5. Płukanie w buforze fosfranowym (ph 6,8) przez 10 min. 6. Wysuszony preparat oglądamy pod mikroskopem, zliczając 2000 erytrocytów. Za mikrojądra (Rys. 2) uznajemy struktury, spełniające następujące warunki: wybarwione w taki sam sposób jak jądro komórkowe, regularne, kuliste struktury nie połączone z jądrem, struktury, stanowiące mniej niŝ 1/3 objętości jądra komórkowego. Rysunek 2. Mikroskopowy obraz mikrojądra w erytrocycie pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) Piśmiennictwo: Carrasco, K. R., Tilbury, K. L., and Myers, M. S. (1990). Assessment of the piscine micronucleus test as an in situ biological indicator of chemical contaminant effects. Can. J. Fish Aquat. Sci. 47:

17 Ćwiczenie 1.3. Test Amesa Najczęściej stosowanym krótkoterminowym testem bakteryjnym jest test Amesa, który określa poziom mutacji powrotnych z histydynowej auksotrofii do prototrofii w wielu specjalnie skonstruowanych mutantach szczepu Salmonella typhimurium LT 2 (Ames,1975). Szczepy te posiadają rfa mutację powodującą przepuszczalność błony komórkowej w wyniku zmiany jej składników lipoproteinowych. Do badań stosowane są szczepy S. typhimurium: TA 97, TA 98, TA 100, TA 102, TA 104, TA 1535, TA Wymienione szczepy pozwalają określić zmiany w DNA w wyniku indukcyjnego działania badanego związku (Maron i Ames 1983). Skonstruowano wiele szczepów testowych, które zawierają róŝne mutacje w operonie histydyny. Badania prowadzone w ostatnich latach pogłębiły znajomość nie tylko charakteru pierwotnych mutacji, ale równieŝ dróg, które prowadzą do rewersji. W rutynowych badaniach przesiewowych autorzy testu początkowo zalecali uŝywanie pięciu szczepów: TA 1535, TA 1537, TA 1538, TA 98 i TA 100. Obecnie zalecany jest zestaw składający się z czterech szczepów: TA 97 (wraŝliwy na czynniki utleniające), TA 98, TA 100, i TA 102 (wraŝliwy na większą liczbę mutagenów niŝ szczep TA 1537), który umoŝliwia wykrycie szerokiego spektrum mutagenów przy zastosowaniu mniejszej liczby szczepów testowych. Mimo to, ze względów technicznych częściej stosuje się zestaw pierwotny. Jednym z powodów jest to, Ŝe szczep TA 102 wykazuje duŝą zmienność liczby kolonii rewertantów spontanicznych (niestabilny plazmid paq1), a powolny wzrost kolonii rewertantów szczepu TA 97 utrudnia liczenie kolonii po standardowej 48 godzinnej inkubacji (MielŜyńska i in. 1998). Stosowanie odpowiednio zmutowanych szczepów bakterii umoŝliwia dostosowanie systemu do określonych typów mutagenów poddawanych badaniom. Nowe szczepy Salmonella typhimurium: YG 1012, YG 1021, YG1024 oraz NM 2009 są wraŝliwe na działanie heterocyklicznych amin aromatycznych oraz ich pochodnych, a szczepy TA 98NR i TA 98/1-DNP6 pozwalają na wykrywanie aktywności mutagennej nitrowych i aminowych pochodnych węglowodorów aromatycznych. Szczepy TA 97 i TA 98 są wraŝliwe na działanie mutagenów wywołujących zmianę fazy odczytu, a szczepy TA 100 na mutacje typu zmiany zasad lub par zasad nukleotydu G-C lub A-T. Szczepy S. typhimurium TA 102 i TA 104 w miejscu zapisu rewersji zawierają mutacje ochre (kodon stop ). Odmiany tych mutantów są bardziej wraŝliwe na działanie związków utleniających, takich jak aldehydy i ketony. Ponadto 16

18 szczep TA 102 pozwala dodatkowo wykryć związki chemiczne powodujące powstawanie wiązań krzyŝowych w DNA (Traczewska 2002). Schemat standardowego testu Amesa przedstawia Rysunek 3. Szczepy bakterii (mutanty), uŝywane w teście nie mają zdolności syntezowania histydyny, stąd nie są one zdolne do wzrostu na poŝywce pozbawionej promutagenu (mutagenu aktywowanego frakcją S-9). Po poddaniu takich szczepów bakterii działaniu mutagenu wraz z systemem aktywującym (frakcja mikrosomalna S-9) obserwuje się występowanie mutacji w komórkach bakterii. Rewertanty posiadają juŝ zdolność syntezowania histydyny, a więc mogą się rozmnaŝać. Licząc kolonie rewertantów na szalkach Petriego z poŝywką i odnosząc liczbę kolonii rewertantów do grupy kontrolnej (liczba rewertantów spontanicznych), nie zawierającej promutagenu, moŝna oszacować aktywność mutagenną danych połączeń badanych związków (Łuczyński i in. 2007). Więcej na temat aktywacji metabolicznej WWA w rozdziale 2. 17

19 Rysunek 3. Schemat standardowego testu Amesa (Pirogowicz 2006) 18

20 Wykonanie 1. Przygotowanie poŝywek: A. Bulion odŝywczy, B. Agar odŝywczy, C. Agar minimalny, D. Top agar, 2. Przygotowanie płynnej hodowli (hodowla Overnight), 3. Przygotowanie mieszaniny S9, 4. Sprawdzenie genotypu testowych szczepów: 4.1. Mutacje w operonie histydynowym, 4.2. Sprawdzenie obecności plazmidu pkm101, 4.3. Delecje uvrb, Pasmo testowych szczepów w kontakcie z ampicyliną Bakterie naświetlane promieniami UV Hodowla z fioletem krystalicznym 5. Kontrole mutacji spontanicznych: kontrola wpływu rozpuszczalnika i mutagenów na poziom mutacji spontanicznych, 6. Procedura testu Amesa (kroki poprzedzające rozpoczęcie eksperymentu): 6.1. Zaszczepić kolonie Salmonella godzin przed rozpoczęciem eksperymentu, 6.2. Sporządzić odpowiednie rozcieńczenia badanych związków w DMSO, 6.3. Oznakować i rozłoŝyć 90 szalek Petriego z poŝywką agarozową oraz taką samą liczbę sterylnych probówek: 60 płytek dla badanych pochodnych (trzy powtórzenia dla dwóch szczepów i dwóch związków o stęŝeniu 100 µl/płytkę bez S9; 100, 10, 1, 0,1 µl/płytkę z frakcją S9), po 3 płytki dla SR, BaP, NQNO, 0, O A (A-ampicylina) szczepu TA98 i taką samą liczbę dla szczepu TA100, 7. Stopić wierzchnią warstwę agarową z dodatkiem 0,05 M histydyny i biotyny i przechowywać w temperaturze o C, 8. Do szklanych probówek przechowywanych w temperaturze 43 o C dodać w następującym porządku: 10 µl roztworu badanego mutagenu, 2,5 ml przygotowanego agaru powierzchniowego top agaru, zawierającego śladowe ilości roztworu L histydyny i biotyny, 0,10 ml przygotowanej wcześniej kultury szczepu Salmonella, 0,5 ml frakcji aktywującej (S-9) lub buforu fosforanowego w zaleŝności od wariantu aktywacji, 9. Zawartość probówek wymieszać opalić w płomieniu palnika zewnętrzne ściany probówek i wylać ich zawartość na przygotowane wcześniej szalki Petriego z poŝywką agarozową, następnie rozprowadzić równomiernie i odstawić do zastygnięcia, 10. Po stwardnieniu wierzchniej warstwy agarozowej (2-3 min), szalki odwrócić i umieścić w inkubatorze o temp. 37 o C na 48 godzin, 19

21 11. Zliczyć kolonie rewertantów i przedstawić jako: liczba kolonii rewertantów na płytkę (Uzupełnić tabele poniŝej). 12. Opracowanie uzyskanych wyników: W badaniach nad oceną aktywności mutagennej stosuje się metodę najmniejszych kwadratów, która obejmuje analizę regresji oraz analizę wariancji. Do przeprowadzenia prawidłowej analizy statycznej konieczne są wyniki przynajmniej dla dwóch dawek i kontroli negatywnej oraz dwukrotnych powtórzeń dla tych samych dawek W ocenie dopasowania danych do modelu liniowego naleŝy posłuŝyć się współczynnikiem determinacji R 2 oraz prawdopodobieństwem ryzyka błędu p dla przyjętego poziomu ufności α=0,05 przeprowadzonej analizy wariancji. Na podstawie parametrów równania zaleŝności liniowej naleŝy obliczyć przewidywaną liczbę kolonii rewertantów (LRI) oraz liczbę rewertantów netto (LRN) indukowaną przez 1 µg badanej substancji. Wielkość efektu mutagennego dla omawianych związków przedstawia się równieŝ w postaci względnej miary efektu mutagennego, tzw. aktywności mutagennej (AM). Jest to iloraz liczby rewertantów netto (LNR= LRI-KN) i liczby rewertantów w odpowiedniej kontroli negatywnej (AM= LNR/KN). Odjęcie liczby rewertantów otrzymanych w odpowiedniej kontroli negatywnej pozwala na porównanie wyników uzyskanych w róŝnych doświadczeniach. 20

22 Uzupełnij poniŝsze tabele: I II III SR 0 0A NQNO B[a]P Wyniki szczep TA98 StęŜenie X µg/płytkę 0,1 Data I II III Wyniki szczep TA100 StęŜenie X µg/płytkę 0,1 Data I II III SR - spontaniczne rewertanty 0 - kontrola negatywna 0A - kontrola negatywna z aktywacją (+S9) NQNO - kontrola pozytywna (mutagen bezpośredni) B[a]P - kontrola pozytywna (mutagen pośredni (+S9)) 21

23 W tabelach przedstaw wyniki testu Amesa (liczba rewertantów indukowanych) dla testowanych dawek badanych związków. Oblicz i uzupełnij wartości aktywności mutagennej (AM) dla poszczególnych stęŝeń badanych pochodnych. Tabela. Wartości liczby rewertantów indukowanych oraz aktywności mutagennej badanego związku. Testowany TA98 TA100 szczep Miara LRI AM LRI AM Dawka [µg/płytkę] 0 0, Tabela. Zakres wartości efektu mutagennego dla bakterii uŝywanych w teście Amesa. Szczepy: Efekt mutagenny TA98, TA100, AM Słaby Silny AM 2 Piśmiennictwo: Ames B. N., J. McCann, E. Yamasaki,1975. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research, 31,347. Łuczyński M.K., M. Góra, D. MielŜyńska, P. Brzuzan, S. Tejs, P. Pirogowicz, M. Łuczyński, Preliminary evaluation of mutagenic activity of two amino derivatives of cyclopenta[c]phenanthrene. Environmental Biotechnology 3, Maron D. M., B. N. Ames, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, 113, 173. MielŜyńska D., E. Siwińska, A. Bubak, Genotoksyczność 13 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w wybranych systemach in vitro, IMPiZŚ, Sosnowiec. Pirogowicz P., Ocena aktywności mutagennej dwóch amino pochodnych cyklopenta[c]fenantrenu metodą testu Amesa. Katedra Biotechnologii w Ochronie Środowiska, Wydział Ochrony Środowiska i Rybactwa, Uniwersytet Warmińsko- Mazurski w Olsztynie. Traczewska T. M., Biomonitoring mutagenności mikrozanieczyszczeń wody do picia, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej. 22

24 2. Diagnostyka molekularna: polimorfizm genów kodujących białka uczestniczące w metabolizmie ksenobiotyków 23

25 Rozdział 2. Diagnostyka molekularna: polimorfizm genów kodujących białka uczestniczące w metabolizmie ksenobiotyków Przykładami genów, w których określono korelację pomiędzy zmiennością budowy a zwiększonym ryzykiem wystąpienia chorób nowotworowych u człowieka są geny kodujące białka z grupy S-transferaz glutationowych (GST). Białka te są dobrze poznane pod względem budowy i funkcji. Cytozolowe oraz membranowe formy GST kodowane są przez dwie odmienne rodziny genów. Obecnie znanych jest osiem odrębnych klas cytozolowych enzymu GST, które oznaczono jako: Alfa (α), Kappa (κ), M (µ), Omega (ω), Pi (π), Sigma (σ), Theta (θ) oraz Zeta (ζ). Enzymy te katalizują sprzęganie zredukowanego glutationu (GSH) z róŝnymi ksenobiotykami mającymi elektrofilowy charakter. Na schemacie 1 przedstawiono przykładową reakcję katalizowaną przez enzym: O + GSH HO SG HO HO OH OH Enzymy klasy M (GSTM) biorą udział w detoksykacji róŝnorodnych elektrofilowych ksenobiotyków, a w szczególności ich reaktywnych metabolitów. Jednym z lepiej poznanych enzymów tej grupy jest GSTM 1. Białko to zbudowane jest z 217 aminokwasów i ma masę daltonów (Da). Głównym miejscem występowania S-transferazy glutationowej typu M jest cytozol komórek wątroby. Enzym ten pełni waŝną rolę w II fazie detoksykacji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA). U człowieka gen kodujący GSTM1 jest zlokalizowany razem z innymi genami kodującymi transferazy typu M na chromosomie 1p13.3 (rysunek poniŝej) i ma wielkość 5924 par zasad (pz). 24

26 Jak dotąd wyróŝniono dwa enzymy klasy θ (GSTT): GSTT1 i GSTT2. Enzym GSTT1 zbudowany jest z 239 aminokwasów (27204 Da). NajwyŜszą aktywność enzymatyczną tego enzymu stwierdza się w erytrocytach, komórkach wątroby i nabłonku płuc. Enzym bierze udział w dezaktywacji tlenku etylenu, epoksybutanów oraz halometanów. Uczestniczy tez w metabolizmie ksenobiotyków (II faza) w tym wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) występujących w dymie papierosowym. W genomie człowieka geny kodujące obie formy (GSTT1 i GSTT2) zlokalizowane są w odległości około pz od siebie i mają podobną strukturę; geny są skomponowane z pięciu eksonów, a ich sekwencje są rozdzielone intronami. Gen kodujący S-transferazę glutationową GSTT1 ma wielkość 8,092 pz i zmapowany został na chromosomie 22q Polimorfizm obu opisanych powyŝej genów polega na występowaniu dwu form (tak zwanych alleli). Produktem ekspresji allelu prawidłowego (GST+) jest funkcjonalne białko enzymatyczne. W allelu nieprawidłowym (GST-) występuje mutacja polegającą na delecji fragmentu sekwencji w obrębie jednego z eksonów kodujących białko produktem ekspresji tego genu jest białko które nie wykazuje aktywności enzymatycznej. Osoby, u których stwierdzono mutację w obrębie genów GSTM1 i GSTT1, co oznacza brak w organizmie obu form enzymów, są w większym stopniu naraŝone na wystąpienie róŝnych form nowotworów. Dane z wielu krajów wskazują, Ŝe znaczna część populacji moŝe być obciąŝona zmutowanymi genami transferazy glutationowej M. Przeprowadzone w Stanach Zjednoczonych Ameryki badania polimorfizmu genów GSTM1 wykazały, Ŝe 23-43% mieszkańców o rodowodzie afrykańskim ma allel GSTM1(-). W innych grupach frekwencje allelu GSTM1(-) miały następujące wartości: Azjaci 32-53, Latynosi 40-53, natomiast Europejczycy 35-62%. W Ameryce Południowej badania wykazały występowanie delecji na poziomie 21% u Chilijczyków, 55% u Brazylijczyków pochodzenia Kaukaskiego, 33% u czarnych Brazylijczyków i 20% u Indian Amazońskich. Spośród narodów europejskich delecję przenosi 46% Francuzów, 53 % Włochów, 44% Węgrów i 50% Słowaków. Stosunkowo wysoki poziom obecności w populacji uszkodzonego genu stwierdza się u 25

27 mieszkańców wysp Pacyfiku i Malezji, nawet do 100%. Badania z innych krajów azjatyckich wskazują, Ŝe średnio co drugi mieszkaniec Chin, Korei i Japonii ma delecję w genie GSTM1. Mutację polegającą na delecji fragmentu genu GSTT1 [GSTT1( -)] stwierdza się znacznie rzadziej niŝ delecję w genie GSTM1; 15-31% Amerykanów pochodzenia Europejskiego, 22-29% pochodzenia Afrykańskiego i 10-12% pochodzenia Hiszpańskiego jest nosicielami tej delecji. W Europie, 21% Włochów i 28% Słowaków przenosi zmutowaną kopię GSTT1. W Ameryce Południowej frekwencja zmutowanego genu jest niŝsza; allel GSTT1(-) stwierdza się u 19% Brazylijczyków o pochodzeniu Europejskim i Afrykańskim a tylko u 11% mieszkańców Amazonii. Natomiast w Azji stwierdza się najwyŝszy poziom mutacji genu GSTT1; 53% Chińczyków, 38% Malezyjczyków i 42-46% Koreańczyków jest nosicielami tej delecji. Ćwiczenie 2.1. Uzyskiwanie DNA genomowego Badanie polimorfizmu DNA wymaga uzyskania odpowiedniej jego ilości, stąd pierwszym etapem analizy jest izolacja DNA. Proces izolacji naleŝy przeprowadzać bardzo starannie. W diagnostyce ludzi i zwierząt (ssaków) jako źródło DNA genomowego wykorzystuje się najczęściej komórki krwi (głównie leukocyty). DNA genomowe uzyskuje się równieŝ z innych tkanek lub komórek: plemników komórek nabłonkowych wycinków tkanek, preparatów mikroskopowych naskórka włosów hodowli bakteryjnych ikry ryb 26

28 DNA moŝna izolować równieŝ z innych materiałów nie będących tkankami. moczu, kału, mleka, śliny osadu czynnego tak zwanych materiałów archiwalnych fragmentów kostnych ze stanowisk archeologicznych, zasuszonych łusek, preparatów zakonserwowanych w roztworach alkoholu lub formaldehydu Izolacja DNA polega na rozbiciu komórek i oddzieleniu DNA od związanych z nim struktur komórkowych, białek oraz RNA. Izolację DNA przeprowadza się w kilku etapach: 1. Liza komórek i jąder komórkowych - etap ten ma na celu uwolnienie ze struktur komórkowych jąder lub innych organelli komórkowych (mitochondriów lub plastydów) zawierających materiał genetyczny, a następnie zniszczenie błon komórkowych i uwolnienie DNA do roztworu. W zaleŝności od potrzeb stosuje się w tym celu czynnik fizyczny (szok termiczny lub osmotyczny), mechaniczny (rozcieranie) lub najczęściej chemiczny (lizostatyna, lizozym, detergenty: SDS, DTT, Tween, Triton X-100). W tym etapie izolacji stosuje się często enzym proteolityczny Proteinazę K. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe materiał z którego zamierzamy izolować DNA często wymaga wstępnego opracowania (płukanie w buforach, homogenizacja tkanek, odwirowanie niepoŝądanych frakcji itp.). 2. Ekstrakcja DNA ma na celu oddzielenie kwasów nukleinowych od białek. W klasycznej procedurze izolacji stosuje się do tego kolejno wytrząsanie z fenolem, chloroformem i alkoholem izoamylowym (Sambrook i wsp. 1989). 3. Precypitacja DNA - wytrącanie DNA, odbywa się najczęściej z uŝyciem roztworu izopropanolu albo etanolu w obecności octanu amonu, octanu potasu lub octanu sodu. W ostatnich latach popularne stały się gotowe zestawy do izolacji DNA oparte na złoŝach krzemionkowych lub jonowymiennych, w ich wypadku procedura izolacji jest skrócona nawet do 20 minut a otrzymane DNA charakteryzuje się duŝą czystością. Uzyskane DNA zawiesza się w wodzie wolnej od nukleaz lub buforach, na przykład TE (10 mm Tris- HCl, 1 mm EDTA ph 8.0), po czym określa jego czystość i ilość w roztworze. Zawiesinę DNA moŝna przechowywać w temperaturze pokojowej w czasie do 1 tygodnia, w lodówce (4-8 C) kilka miesięcy, a zamroŝone (-20 do -80 C) nawet przez lata. 27

29 Zadanie Uzyskiwanie DNA genomowego z cebulki włosa Przedstawiony poniŝej sposób uzyskiwania DNA naleŝy do dość nietypowych. Zaletą jest szybkość, prostota i dostępność materiału, a uzyskana ilość DNA jest wystarczającą do przeprowadzenia czterech reakcji PCR. Wykonanie 1. Pojedyncze włosy wraz z cebulkami umieszczamy w probówkach PCR 0.2 ml jak na rysunku poniŝej. 2. Umieszczamy w probówce bufor do lizy (objętości 20 µl na 1 próbę) o składzie: Proteinaza K ( U/ml) 1 µl Bufor PCR (ph 8.0) 2 µl wolna od nukleaz H 2 O 17 µl 3. Reakcje trawienia przeprowadzamy w termocyklerze przy następującym profilu termicznym: 65 C, 90 min trawienie 85 C, 15 min inaktywacja enzymu 4 C schłodzenie produktu reakcji 28

30 Zadanie Uzyskiwanie DNA z krwi obwodowej za pomocą zestawu odczynników Pronto (Izrael) W ofercie większości firm biotechnologicznych są gotowe zestawy odczynników do izolacji DNA/RNA (tak zwanych kitów). Zaletami tego typu zestawów jest prostota i oszczędność czasu oraz duŝa powtarzalność gwarantowana przez producenta. Kity są najczęściej dostosowane do konkretnego rodzaju materiału na przykład krwi ludzkiej albo śliny, niekiedy jednak mają szeroki zakres stosowania. Wykorzystany w tym zadaniu zestaw został stworzony z myślą o izolacji DNA z krwi obwodowej człowieka. Wykonanie 1. Krew w probówkach z EDTA naleŝy wstrząsać przez 15 min. 2. W probówce zmieszać 200 µl krwi z 600 µl roztworu A, krótko wstrząsnąć. Wirować 20 sekund z prędkością obr/min. 3. Wylać płyn uwaŝając, aby nie pozbyć się płytki osadu z dna probówki. 4. Rozpuścić płytkę przez pipetowanie w 100 µl roztworu A, następnie dodać 500 µl roztworu A, krótko wstrząsnąć. Wirować 20 sekund z prędkością obr/min. 5. OstroŜnie wylać płyn bez wzruszania płytki osadu. 6. Powtórzyć krok 4 i Przygotować roztwór B przez zmieszanie roztworu B1 i B2 w ilości odpowiednio 45 µl i 5 µl na próbkę. 8. Przy uŝyciu pipety rozetrzeć płytkę w 50 µl świeŝo przygotowanego roztworu B. 9. Inkubować w 65 C przez 1 godzinę. Po inkubacji krótko zwirować. 10. Przekłuć wieczko probówki, inkubować 10 minut w 95 C. Po inkubacji krótko zwirować. 11. Przenieść roztwór DNA do nowej probówki. 29

31 Zadanie Ocena jakościowa i ilościowa wyizolowanego DNA za pomocą spektrofotometru Przy spektrometrycznej ocenie ilości DNA wykorzystuje się właściwość budujących kwasy nukleinowe zasad azotowych, które absorbują światło o długości 260 nm. Zawartość DNA w roztworze wody liczy się ze wzoru: A 260 x 50 x R = ilość DNA µg/ml gdzie: 50 stała wynikająca z tego, Ŝe 1 jednostka absorbancji równa jest 50 µg dupleksu DNA R rozcieńczenie Czystość wyizolowanego DNA (zawartość białek) ocenia się korzystając z właściwości białek, które wykazują maksimum absorbancji dla światła o długości fali 280 nm. Czystość wylicza się ze wzoru: A 260 /A 280 = czystość DNA wynik: =1,8 oznacza 100% czystości preparatu <1,8 oznacza obecność w preparacie białek Wykonanie 1. Ustawić spektrofotometr na pomiar dwuniciowego DNA w µg/µl przy współczynniku rozcieńczenia 20. Filtr 260 nm. 2. Do kuwety pomiarowej dodać 70 µl wody redestylowanej, umieścić kuwetę wewnątrz komory pomiarowej, wyzerować spektrometr ( Reference ), wyjąć kuwetę i usunąć z niej wodę pipetą. 3. Do probówki 1,5 ml typu Eppendorf dodać 66,5 µl wody redestylowanej oraz 3,5 µl zawiesiny DNA µl zawiesiny z punktu 3 delikatnie nanieść do kuwety i dokonać pomiaru zawartości ( Test ). 5. Usunąć kuwetę, przemyć tryskawką, zostawić do wyschnięcia na ręczniku papierowym. 30

32 Zadanie Ocena jakościowa wyizolowanego DNA za pomocą rozdziału w Ŝelu agarozowym Zawartość białka nie jest jedynym czynnikiem opisującym jakość wyizolowanego DNA. Matryca DNA moŝe zostać uszkodzona na skutek nieprawidłowego lub zbyt długiego przechowywania prób a takŝe samej procedury izolacji. W przypadku wątpliwości niezbędna staje się ocena wizualna preparatu, której dokonać moŝna poprzez rozdział elektroforetyczny w Ŝelu agarozowym w obecności bromku etydyny (barwnik wykazujący powinowactwo do dwuniciowej cząsteczki DNA, fluoryzujący w świetle o długości fali 302 nm). Pośrednio, moŝna teŝ poprzez porównanie z próbką o znanej zawartości DNA, określić ilość DNA w badanej próbie mierząc róŝnice w intensywności fluorescencji. Stosuje się do tego specjalistyczne oprogramowanie do analizy obrazu. Wykonanie!!!Uwaga!!! Wykorzystywany w poniŝszej procedurze bromek etydyny ma silne działanie toksyczne i mutagenne! Promieniowanie UV jest szkodliwe dla wzroku - na włączony transiluminator moŝna patrzeć tylko przez maskę lub szybę! 1. Przygotować formę do wylania Ŝelu agarozowego i umieścić ją w zacisku. 2. Odmierzyć agarozę NMP odpowiednio do uzyskania zamierzonego stęŝenia Ŝelu. W celu uzyskania 50 ml 1,5% Ŝelu naleŝy odmierzyć 0,75 g agarozy. 3. Wlać do kolby odpowiednią ilość buforu TBE (Tris, kwas borny, EDTA, ph 8,5). 4. Zawartość kolby podgrzewać ostroŝnie, mieszając, w kuchence mikrofalowej do momentu uzyskania jednorodnego płynu (bez bąbelków i fragmentów nierozpuszczonej agarozy). 5. Dodać roztworu 10 µl bromku etydyny (EtBr, 1 mg/ml). Delikatnie wymieszać i pozostawić na kilka minut. 6. Powoli, tak aby nie powstały bąble powietrza, wlać odpowiednią objętość agarozy do formy. śel powinien mieć wysokość 5-8 mm. 7. Umieścić grzebień w Ŝelu. 8. Po zastygnięciu (ok. 10 min.) moŝna delikatnie wyciągnąć grzebień z Ŝelu i wyjąć formę z zacisków. 9. Umieścić formę z Ŝelem w aparacie do elektroforezy. śel powinien się znajdować pod powierzchnią buforu, jednak najlepiej nie głębiej niŝ 1-2mm. 10. Przygotować zawiesinę matrycy DNA. Na kawałek parafilmu nanieść bufor obciąŝający (SBX) po około 1,5-3,0 µl w tylu punktach ile prób zamierzamy rozdzielać. Dodać kolejno wyizolowane DNA w ilości 6-10 µl i wymieszać przez pipetowanie. Uwaga! Nie zanurzać tej samej pipety w róŝnych probówkach! 11. Nanieść DNA z buforem do studzienek w Ŝelu. 12. Ustawić aparat na V, czas rozdziału min. 13. Po rozdziale Ŝel wyjąć ostroŝnie z aparatu i umieścić na transiluminatorze. 14. Wykonać zdjęcie w świetle UV. 31

33 Ćwiczenie 2.2. Amplifikacja genów GSTM1 i GSTT1 z wykorzystaniem metody AS- PCR (Vanden Heuvel, 1998) Jednym z przełomowych wynalazków, dzięki którym nastąpił w ostatnich latach szybki rozwój biologii molekularnej jest łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), wykorzystującej jedno z najpowszechniejszych w przyrodzie zjawisk replikację DNA. Proces ten moŝna przeprowadzić in vitro powielając (amplifikując) określony odcinek DNA (lub RNA) przez wielokrotne poddawanie mieszaniny enzymów i substratów reakcji zmieniającej się cyklicznie temperaturze, zgodnie z 3-częściowym profilem: 1. Denaturacja matrycy (94-98 C, sek.) 2. Przyłączanie starterów w określonym miejscu matrycy 3. (40-70 C, sek.) 4. Elongacja na ograniczonych starterami odcinkach matrycy nowych nici przez termostabilną polimerazę DNA (72 C, 5-60 sek.). Na ćwiczeniach zostanie zaprezentowana animacja przebiegu reakcji PCR. Mieszanina reakcyjna składa się z 6 podstawowych składników: 1. Matrycy DNA- próbki DNA uzyskanej w wyniku izolacji (patrz Ćwiczenie 1.1). 2. Starterów reakcji PCR - krótkich (do 40 pz), sztucznie syntezowanych odcinków jednoniciowego DNA, komplementarnych do obu końców badanego fragmentu matrycy. 3. Polimerazy DNA - najczęściej Polimerazy DNA Taq która katalizuje reakcję syntezy nowej nici DNA. 4. Trifosforanów deoksynukleozydów (datp, dctp, dgtp, dttp) - wysokoenergetycznych nukleotydów stanowiących cegiełki słuŝące do budowy nowych łańcuchów DNA. 5. Buforu reakcji PCR - zapewniającego odpowiednie środowisko dla działania polimerazy DNA i przyłączania starterów. 6. Jonów metali dwuwartościowych najczęściej Mg 2+, katalizujących działanie polimerazy DNA. 32

34 Znanych jest wiele modyfikacji metody PCR, jedną z nich jest AS-PCR (ang. Allele Specific PCR). ZałoŜeniem tej metody jest wykrywanie w genomie osobnika obecności lub braku jednego z alleli. Uzyskuje się to przez takie zaprojektowanie starterów reakcji, aby miejsce róŝnicujące oba allele znalazło się w obrębie sekwencji komplementarnej przynajmniej do jednego z pary starterów - w takim przypadku amplifikacja nie powiedzie się. Czasem jednak reakcja PCR nie zachodzi z powodu złej jakości matrycy DNA, co moŝe być mylnie zinterpretowane jako brak odpowiedniego allelu genu. Dlatego w praktyce amplifikuje się dodatkowy odcinek DNA marker jakości matrycy DNA (szczegóły w zadaniach poniŝej). Zadanie Detekcja polimorfizmu genów GSTM1 i GSTT1 W zadaniu poddane zostaną analizie polimorfizmu jednocześnie 2 loci genetyczne GSTM1 i GSTT1 (Chen i in. 1997). Technika, w której stosuje się jednocześnie (w jednej probówce) kilka par starterów do powielenia kilku specyficznych fragmentów DNA nosi nazwę multiplex PCR. Jako marker jakości matrycy DNA zastosowano locus β-globina produkt amplifikacji PCR tego locus powinien być obecny we wszystkich próbach. Rysunek 4 przedstawia miejsca przyłączania starterów reakcji PCR do matrycy DNA oraz wzory prąŝków powstałych po rozdziale elektroforetycznym produktów PCR uzyskanych od 8 pacjentów (zdjęcie). Pacjenci 2, 4 i 8 mają obie kopie genów (zapisujemy to GSTT1+ oraz GSTM1+), u pacjentów 1, 5 i 7 stwierdza się tylko allel genu GSTT1 (GSTT1+ i GSTM1-), natomiast u pacjenta 3 tylko allel GSTM1 (GSTT1- i GSTM1+). Pacjent numer 6 nie ma obu alleli (GSTT1- i GSTM1-). M oznacza wzorzec masowy DNA. 33

35 Rysunek 4. Schemat amplifikacji PCR fragmentów genów GSTM1 i GSTT1 (Chen i in. 1997). Szczegóły metodyczne w tekście. Wykonanie 1. W probówce 0,5 ml wykonaj mieszaninę reakcyjną o następującym składzie (objętość końcowa jednej próby wraz z matrycą 20 µl): Bufor reakcyjny PCR z MgCl2 2 µl Mieszanina dntp (10 mm) 1 µl starter GSTM1 F 0,5 µl starter GSTM1 R 0,5 µl starter GSTT1 F 0,5 µl starter GSTT1 R 0,5 µl starter β-globina F 0,5 µl staretr β-globina R 0,5 µl Polimeraza Taq 0,5 U Woda wolna od nukleaz - do uzyskania odpowiedniej objętości (dodaj 5% na straty podczas przenoszenia) 2. Rozdzielić mieszaninę do probówek PCR 0,2 ml. 3. Dodać matryce w ilości 5 µl. Pozostawić próbę kontrolną. 4. Wstawić próby do termocyklera zaprogramowanego na następujący profil: 94 C, 4 min. wstępna denaturacja matrycy 94 C, 10 sek. denaturacja 62 C - 30 sek. przyłączanie starterów 72 C - 45 sek elongacja 72 C 4 min. końcowa elongacja 4 C schłodzenie produktu reakcji x Po schłodzeniu próby wykonać rozdział elektroforetyczny i zdjęcie jak w zadaniu

36 Zadanie Obliczanie frekwencji genów GSTT1 i GSTM1 w grupie studentów Wykonanie 1. Analizując obrazy Ŝeli agarozowych z zadania uzupełnij tabelę. Lp. GSTM1+ GSTT1+ Suma Frekwencja F [%] 35

37 Frekwencję allelu obliczamy ze wzoru: F GST [%] = n GST 100 N gdzie: F gst [%] frekwencja danego allelu GST w % n gst liczba osobników z danym allelem GST N całkowita liczba przebadanych 2. Korzystając z danych w tabeli oblicz frekwencję alleli GSTM1- oraz GSTT1- w badanej grupie studentów 3 roku ochrony środowiska. 3. Oblicz frekwencję kaŝdego z moŝliwych do otrzymania w badaniu genotypów (GSTM1+/GSTT1+, GSTM1-/GSTT1+, GSTM1+/GSTT1- oraz GSTM1-/GSTT1-). 4. Jakie zalecenia moŝna dać osobie, u której badanie dało negatywny wynik w obu loci? Piśmiennictwo: Chen, C-L., Liu, Q., Pui, C-H., Rivera, G.K., Sandlund, J.T., Ribeiro, R., Evans, W.E., Relling, M.V Higher frequency of Glutathione S-transferase deletions in black children, with acute lymphoblastic leukemia. Blood, 89 (5): Łuczyński, M., Brzuzan, P., Jankun, M Genetyka ryb. Zeszyt 1, Wyd. IRS, s. 76. Sambrook, J., Fritsch, E.,F., Maniatis, T Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. Vanden Heuvel, J.,P PCR protocols in molecular toxicology. CRC Press, New York. 36

38 3. Ekspresja genów pod wpływem toksycznych substancji chemicznych 37

39 Rozdział 3. chemicznych Ekspresja genów pod wpływem toksycznych substancji Wiele ksenobiotyków wywołuje zmiany aktywności genów na drodze aktywacji specyficznych czynników transkrypcyjnych wewnątrzkomórkowych białek receptorowych. Takie zróŝnicowane wyraŝanie się genów via receptor w odpowiedzi na określony czynnik chemiczny moŝe mieć charakter adaptacji (na przykład indukcja monooksygenaz metabolizujących określony ksenobiotyk), ale moŝe prowadzić takŝe do efektów toksycznych. Wiele róŝnych związków chemicznych moŝe indukować ekspresję genów, wśród nich do najgroźniejszych naleŝą wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) oraz dioksyny, a zarazem najbardziej rozpowszechnione zanieczyszczenia występujące w środowisku. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne indukują ekspresję genów kodujących polipeptydy hemoproteidu, cytochromu P450, a w większości zbadanych przypadków mediatorem molekularnym ekspresji jest receptor węglowodorów aromatycznych AhR (Rys. 5). System detoksykacji z udziałem cytochromu P450 jest dobrze poznany, a jego obecność stwierdza się u bakterii, roślin i zwierząt. Aktywność enzymatyczną cytochromu P450 łączy się między innymi z metabolizmem steroidów, prostaglandyn oraz niektórych ksenobiotyków (Nelson i in. 1996). Cytochrom P450, występuje w wielu róŝnych formach, które mają odmienne, ale zachodzące na siebie specyficzności substratowe, a do najlepiej zbadanych naleŝą formy cytochromu P4501A, CYP1A (Stegeman i in. 2001). Mechanizm indukcji genu CYP1A1, kodującego CYP1A, został dokładnie poznany u wielu gatunków ryb w tym u pstrąga tęczowego, Oncorhynchus mykiss (Cao i in 2000). CYP1A1 ulega ekspresji w obecności takich ksenobiotyków jak WWA, PCB, dioksyny, furany po wcześniejszym związaniu z receptorem Ah; pojawienie się większej ilości cytochromu P450 prowadzi do szybszej biotransformacji. W normalnych warunkach ma to znaczenie obronne i umoŝliwia szybsze pozbycie się ksenobiotyku, który wywołał indukcję. PoniewaŜ ekspresja CYP1A następuje w odpowiedzi na pojawienie się rozmaitych ksenobiotyków, badanie poziomu P450 w tkankach umoŝliwia określenie naraŝenia populacji na zanieczyszczenie ich środowiska. Przypuszcza się, Ŝe u osobników z podwyŝszonym poziomem P4501A moŝe być większy stopień uszkodzeń DNA spowodowany kancerogenami i mutagenami środowiskowymi; benzo[a]piren i inne WWA są aktywowane przez indukowaną formę P4501A, co determinuje albo nasila ich mutagenne bądź teŝ rakotwórcze 38

40 działanie (Burczynski i Pennig 2000). Prawidłowy szlak metaboliczny, będący mechanizmem obronnym organizmu wobec obecności WWA prowadzi poprzez utlenianie K-regionu cząsteczki (Jerina i Daly 1974) (Schemat 2). Metabolity takie charakteryzują się w większości przypadków niŝszą toksycznością i są łatwiejsze do usunięcia z organizmu. W przypadku węglowodorów posiadających tak zwany bay region lub fjord region istnieje moŝliwość błędu we wspomnianym mechanizmie obronnym, co prowadzi do utleniania niewłaściwego pierścienia aromatycznego cząsteczki. Powstające w ten sposób epoksydiole, posiadające pierścień epoksydowy w bay region molekuły charakteryzują się właściwościami mutagennymi, wynikającymi z ich zdolności do łączenia się z DNA (Schemat 2). Rysunek 5. Uproszczony model regulacji ekspresji genetycznej przez receptor węglowodorów arylowych AhR u ssaków. W większości komórek AhR występuje jako nieaktywny kompleks z białkami opiekuńczymi typu HSP90 (HSP90 chaperon) oraz białkiem fuzyjnym XAP2 (XAP2 fusion protein). Po przyłączeniu się ligandu molekularnego (np. dioksyny lub WWA) kompleks wędruje do jądra komórkowego. W regulacji ekspresji genetycznej uczestniczy dimer złoŝony z AhR oraz jądrowego białka translokującego (ARNT; ang. AhR nuclear translocator). Dimer ten rozpoznaje w DNA specyficzne motywy sekwencji XRE (ang. xenobiotic response elements) w miejscu promotorowym genów tak zwanej baterii genetycznej Ah (naleŝą do niej równieŝ geny CYP1A) i daje sygnał do rozpoczęcia procesu transkrypcji. Jeszcze do niedawna, pomiar stopnia indukcji cytochromu P4501A u ryb wymagał zastosowania technik hybrydyzacyjnych (Southern i Western blotting), testów z immunosorbentami (ELISA), albo testów aktywności enzymatycznej O-deetylazy 39

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności

Bardziej szczegółowo

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności

Bardziej szczegółowo

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR Ćwiczenie 11 METODA RT-PCR Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych: bromek etydyny T+ EDTA Xi etanol, 96% F kwas octowy, 96% C -merkaptoetanol N, T Tris Xi UWAGI WSTĘPNE Praca z kwasami

Bardziej szczegółowo

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna Podstawy

Biologia Molekularna Podstawy Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina

Bardziej szczegółowo

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 100 ml, 250 ml, 500 ml Nr kat. 038-100, 038-250, 038-500 Nietosyczny roztwór wodny do przechowywania i zabezpieczania różnego rodzaju tkanek

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość

Bardziej szczegółowo

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość* Poznao, 6 lutego 2012 r. Zapytanie ofertowe nr 001 /2012 dotyczące zakupu odczynników chemicznych do izolacji DNA i reakcji PCR GENESIS Polska Sp. z o.o Ul. Za Cytadelą 19, 61-659 Poznao NIP 778 13 56

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA

Bardziej szczegółowo

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

Mikrosatelitarne sekwencje DNA Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012

Bardziej szczegółowo

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9 Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 9 Wykrywanie jakościowe kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi Roundup Ready metodą PCR M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

Bardziej szczegółowo

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 20 izolacji Nr kat. 895-20D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp.

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym,

Bardziej szczegółowo

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie Nazwa modułu: Genetyka molekularna Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3 Wydział: Elektrotechniki, Automatyki, Informatyki i Inżynierii Biomedycznej Kierunek: Inżynieria Biomedyczna

Bardziej szczegółowo

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Agnieszka Gładysz Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Akademia Medyczna Prof.

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Wprowadzenie: Większość lądowych organizmów kręgowych część jonów amonowych NH + 4, produktu rozpadu białek, wykorzystuje w biosyntezie

Bardziej szczegółowo

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

PCR. Aleksandra Sałagacka

PCR. Aleksandra Sałagacka PCR Aleksandra Sałagacka Reakcja PCR naśladuje proces replikacji DNA in vitro pozwala na amplifikację określonego krótkiego (kilkadziesiąt kilka tys.pz) fragmentu DNA obecnie najważniejsze narzędzie biologii

Bardziej szczegółowo

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu Protokół pochodzi ze strony molekularnie.wordpress.com Kopiowanie i rozpowszechnianie wyłącznie w całości, z zachowaniem praw autorskich zgodnie z zasadami licencji GNU Dziękuję za uszanowanie mojej pracy,

Bardziej szczegółowo

Rozwój metod dozymetrii biologicznej oraz biofizycznych markerów i indykatorów wpływu promieniowania na organizmy żywe

Rozwój metod dozymetrii biologicznej oraz biofizycznych markerów i indykatorów wpływu promieniowania na organizmy żywe Rozwój metod dozymetrii biologicznej oraz biofizycznych markerów i indykatorów wpływu promieniowania na organizmy żywe Marcin Kruszewski Centrum Radiobiologii i Dozymetrii Biologicznej Instytut Chemii

Bardziej szczegółowo

Tematyka zajęć z biologii

Tematyka zajęć z biologii Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania

Bardziej szczegółowo

MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ

MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ Puławy 2013 Opracowanie: Prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, mgr inż. Kinga Urbaniak,

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA.

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SPIS TREŚCI: 1. Wprowadzenie. 2. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. 3. Karty pracy. 1. Karta

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Ćwiczenie 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Część doświadczalna obejmuje: - sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy - oznaczanie aktywności

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO

ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO CZĘŚĆ TEORETYCZNA Metody badań i cechy w oparciu o które przeprowadzana jest klasyfikacja i identyfikacja mikroorganizmówh Struktura

Bardziej szczegółowo

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych

Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych

Bardziej szczegółowo

AmpliTest TBEV (Real Time PCR)

AmpliTest TBEV (Real Time PCR) AmpliTest TBEV (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla TBEV (Tick-borne encephalitis virus) techniką Real Time PCR Nr kat.: RV03-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość pojedynczej

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

ALGALTOXKIT F Procedura testu

ALGALTOXKIT F Procedura testu ALGALTOXKIT F Procedura testu 1 PRZYGOTOWANIE STANDARDOWEJ POŻYWKI A B C D - KOLBKA MIAROWA (1 litr) - FIOLKI Z ROZTWORAMI POŻYWEK A (2 fiolki), B, C, D - DESTYLOWANA (lub dejonizowana) WODA 2 A PRZENIEŚĆ

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS Zagadnienia teoretyczne. Spektrofotometria jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące

Bardziej szczegółowo

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego

Bardziej szczegółowo

Pamiętając o komplementarności zasad azotowych, dopisz sekwencję nukleotydów brakującej nici DNA. A C C G T G C C A A T C G A...

Pamiętając o komplementarności zasad azotowych, dopisz sekwencję nukleotydów brakującej nici DNA. A C C G T G C C A A T C G A... 1. Zadanie (0 2 p. ) Porównaj mitozę i mejozę, wpisując do tabeli podane określenia oraz cyfry. ta sama co w komórce macierzystej, o połowę mniejsza niż w komórce macierzystej, gamety, komórki budujące

Bardziej szczegółowo

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier.

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier. ID Testu: F5679R8 Imię i nazwisko ucznia Klasa Data 1. Na indywidualne cechy danego osobnika ma (maja) wpływ A. wyłacznie czynniki środowiskowe. B. czynniki środowiskowe i materiał genetyczny. C. wyłacznie

Bardziej szczegółowo

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedra Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 4 i 5 OCENA EKOTOKSYCZNOŚCI TEORIA Chemia zanieczyszczeń środowiska

Bardziej szczegółowo

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału

Bardziej szczegółowo

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7.2. Metody biologii molekularnej (technika PCR, sekwencjonowanie DNA) wykorzystywane w taksonomii roślin Autor: Magdalena Dudek

Bardziej szczegółowo

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7 Poznań, dnia 28.04.2014 r. BioVentures Institute Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością ul. Promienista 83 60 141 Poznań Zapytanie ofertowe nr 01/2014 Projekt Nowa technologia wytwarzania szczepionek

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Aparatura

Spis treści. Aparatura Spis treści Aparatura I. Podstawowe wyposażenie laboratoryjne... 13 I.I. Probówki i naczynia laboratoryjne... 13 I.II. Pipety... 17 I.II.I. Rodzaje pipet automatycznych... 17 I.II.II. Techniki pipetowania...

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Załącznik nr 1 do SIWZ Nazwa i adres Wykonawcy Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Przedmiot zamówienia; automatyczny system do diagnostyki molekularnej:

Bardziej szczegółowo

Materiał i metody. Wyniki

Materiał i metody. Wyniki Abstract in Polish Wprowadzenie Selen jest pierwiastkiem śladowym niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Selen jest wbudowywany do białek w postaci selenocysteiny tworząc selenobiałka (selenoproteiny).

Bardziej szczegółowo

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr 1. 2. 3. a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr 1. 2. 3. a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System Załącznik nr 1A do SIWZ. PARAMETRY TECHNICZNE PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA Zadanie nr 1. TERMOSTAT CYRKULACYJNY Termostat cyrkulacyjny Z grzaniem i chłodzeniem Zakres temperatury roboczej 25 o C do + 200 o C

Bardziej szczegółowo

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!)

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!) Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ======================================================== Ćwiczenie 2

Bardziej szczegółowo

RAPORT Z BADAŃ 164/Z/20110825/D/JOGA. Dostarczony materiał: próbki tworzyw sztucznych. Ilość próbek: 1. Rodzaj próbek: tworzywo

RAPORT Z BADAŃ 164/Z/20110825/D/JOGA. Dostarczony materiał: próbki tworzyw sztucznych. Ilość próbek: 1. Rodzaj próbek: tworzywo Blirt S.A. 80-172 Gdańsk, ul. Trzy Lipy 3/1.38 RAPORT Z BADAŃ Dział DNA-Gdańsk Nr zlecenia 164/Z/20110825/D/JOGA NAZWA I ADRES KLIENTA GROUND-Therm spółka z o.o. ul. Stepowa 30 44-105 Gliwice Tytuł zlecenia:

Bardziej szczegółowo

1. Na podanej sekwencji przeprowadź proces replikacji, oraz do obu nici proces transkrypcji i translacji, podaj zapis antykodonów.

1. Na podanej sekwencji przeprowadź proces replikacji, oraz do obu nici proces transkrypcji i translacji, podaj zapis antykodonów. mrna 1. Na podanej sekwencji przeprowadź proces replikacji, oraz do obu nici proces transkrypcji i translacji, podaj zapis antykodonów. GGA CGC GCT replikacja CCT GCG CGA transkrypcja aminokwasy trna antykodony

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie SCENARIUSZ LEKCJI OPRACOWANY W RAMACH PROJEKTU: INFORMATYKA MÓJ SPOSÓB NA POZNANIE I OPISANIE ŚWIATA. PROGRAM NAUCZANIA INFORMATYKI Z ELEMENTAMI PRZEDMIOTÓW MATEMATYCZNO-PRZYRODNICZYCH Autorzy scenariusza:

Bardziej szczegółowo

Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych

Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych ROZDZIAŁ 4 Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych Wojciech Garczorz Diagnostyka molekularna jest obecnie najszybciej rozwijającym się działem diagnostyki medycznej. W wielu dziedzinach medycyny

Bardziej szczegółowo

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK WSTĘP Aby wyizolować białka otrzymane np. w systemach

Bardziej szczegółowo

Znaczenie genetyki. Opracował A. Podgórski

Znaczenie genetyki. Opracował A. Podgórski Znaczenie genetyki Opracował A. Podgórski InŜynieria genetyczna InŜynieria genetyczna ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Istota inŝynierii genetycznej

Bardziej szczegółowo

Dozymetria biologiczna

Dozymetria biologiczna OCHRONA RADIOLOGICZNA 2 Dozymetria biologiczna Jakub Ośko Dozymetria biologiczna Pozwala na ocenę dawki pochłoniętej na podstawie zmian zachodzących w organizmie człowieka. Stosowana w sytuacjach awaryjnych

Bardziej szczegółowo

Geny i działania na nich

Geny i działania na nich Metody bioinformatyki Geny i działania na nich prof. dr hab. Jan Mulawka Trzy królestwa w biologii Prokaryota organizmy, których komórki nie zawierają jądra, np. bakterie Eukaryota - organizmy, których

Bardziej szczegółowo

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl Strona 1 z 7 Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl Sosnowiec: Sukcesywna dostawa odczynników dla Instytutu Medycyny

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BLOOD przeznaczony

Bardziej szczegółowo

Polimorfizm genu mitochondrialnej polimerazy gamma (pol γ) w populacjach ludzkich Europy

Polimorfizm genu mitochondrialnej polimerazy gamma (pol γ) w populacjach ludzkich Europy Polimorfizm genu mitochondrialnej polimerazy gamma (pol γ) w populacjach ludzkich Europy Praca wykonana pod kierunkiem dr hab. Tomasza Grzybowskiego w Katedrze Medycyny Sądowej w Zakładzie Genetyki Molekularnej

Bardziej szczegółowo

DNA musi współdziałać z białkami!

DNA musi współdziałać z białkami! DNA musi współdziałać z białkami! Specyficzność oddziaływań między DNA a białkami wiążącymi DNA zależy od: zmian konformacyjnych wzdłuż cząsteczki DNA zróżnicowania struktury DNA wynikającego z sekwencji

Bardziej szczegółowo

TEST Z CYTOLOGII GRUPA II

TEST Z CYTOLOGII GRUPA II TEST Z CYTOLOGII GRUPA II Zad. 1 (4p.) Rysunek przedstawia schemat budowy pewnej struktury komórkowej. a/ podaj jej nazwę i określ funkcję w komórce, b/ nazwij elementy oznaczone cyframi 2 i 5 oraz określ

Bardziej szczegółowo

Syngen Gel/PCR Mini Kit

Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR ME Mini Kit Zestawy do oczyszczania DNA: - z żelu agarozowego - po reakcji PCR i innych reakcjach enzymatycznych - z żelu agarozowego z małą objętością elucji - po

Bardziej szczegółowo

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 5 Droga od genu do

Bardziej szczegółowo

PRAKTYCZNY KURS SZKOLENIOWY OCENY MUTAGENNOŚCI WODY WYKONANY TESTEM MIKROPŁYTKOWYM AMES MPF 98/100 AQUA

PRAKTYCZNY KURS SZKOLENIOWY OCENY MUTAGENNOŚCI WODY WYKONANY TESTEM MIKROPŁYTKOWYM AMES MPF 98/100 AQUA 1999 PRAKTYCZNY KURS SZKOLENIOWY OCENY MUTAGENNOŚCI WODY WYKONANY TESTEM MIKROPŁYTKOWYM AMES MPF 98/100 AQUA organizowany przez TIGRET Sp. z o.o. pod patronatem naukowym Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego,

Bardziej szczegółowo

Ampli-LAMP Salmonella species

Ampli-LAMP Salmonella species Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego bakterii z rodzaju

Bardziej szczegółowo

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Specyfikacja zestawu 2 2.3

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII ĆWICZENIA Z BIOCHEMII D U STUDENTfiW WYDZIAŁU LEKARSKIEGO Pod redakcją Piotra Laidlera, Barbary Piekarskiej, Marii Wróbel WYDAWNICTWO UNIWERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO ĆWICZENIA Z BIOCHEMII DLA STUDENTÓW WYDZIAŁU

Bardziej szczegółowo

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Mikrobiologia na kierunku chemia kosmetyczna

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Mikrobiologia na kierunku chemia kosmetyczna 1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Mikrobiologia na kierunku chemia kosmetyczna 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału (zagadnienia)

Bardziej szczegółowo

BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK

BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO-FAZOWYM;

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012 www.dnagdansk.com Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN przeznaczony jest do szybkiej

Bardziej szczegółowo

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Czas trwania lekcji: 2x 45 minut Cele lekcji: 1. Ogólny zapoznanie

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 4. Oczyszczanie ścieków ze związków fosforu

ĆWICZENIE 4. Oczyszczanie ścieków ze związków fosforu ĆWICZENIE 4 Oczyszczanie ścieków ze związków fosforu 1. Wprowadzenie Zbyt wysokie stężenia fosforu w wodach powierzchniowych stojących, spiętrzonych lub wolno płynących prowadzą do zwiększonego przyrostu

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego Przykładowe zadania z BIOLOGii przygotowujące do egzaminu maturalnego Prezentowane zadania są zgodne z podstawą programową kształcenia ogólnego w zakresie rozszerzonym i podstawowym. Prócz zadań, które

Bardziej szczegółowo

Program ćwiczeń z przedmiotu BIOLOGIA MOLEKULARNA I GENETYKA, część I dla kierunku Lekarskiego, rok I 2015/2016. Ćwiczenie nr 1 (06-07.10.

Program ćwiczeń z przedmiotu BIOLOGIA MOLEKULARNA I GENETYKA, część I dla kierunku Lekarskiego, rok I 2015/2016. Ćwiczenie nr 1 (06-07.10. Program ćwiczeń z przedmiotu BIOLOGIA MOLEKULARNA I GENETYKA, część I dla kierunku Lekarskiego, rok I 2015/2016 Ćwiczenie nr 1 (06-07.10.2015) Temat: Wprowadzenie 1. Omówienie regulaminu zajęć Temat: Wprowadzenie

Bardziej szczegółowo

prof. Joanna Chorostowska-Wynimko Zakład Genetyki i Immunologii Klinicznej Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie

prof. Joanna Chorostowska-Wynimko Zakład Genetyki i Immunologii Klinicznej Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie prof. Joanna Chorostowska-Wynimko Zakład Genetyki i Immunologii Klinicznej Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie Sekwencyjność występowania zaburzeń molekularnych w niedrobnokomórkowym raku płuca

Bardziej szczegółowo

Imię i nazwisko...kl...

Imię i nazwisko...kl... Gimnazjum nr 4 im. Ojca Świętego Jana Pawła II we Wrocławiu SPRAWDZIAN GENETYKA GR. A Imię i nazwisko...kl.... 1. Nauka o regułach i mechanizmach dziedziczenia to: (0-1pkt) a) cytologia b) biochemia c)

Bardziej szczegółowo

C 6 H 12 O 6 2 C 2 O 5 OH + 2 CO 2 H = -84 kj/mol

C 6 H 12 O 6 2 C 2 O 5 OH + 2 CO 2 H = -84 kj/mol OTRZYMYWANIE BIOETANOLU ETAP II (filtracja) i III (destylacja) CEL ĆWICZENIA: Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie procesu filtracji brzeczki fermentacyjnej oraz uzyskanie produktu końcowego (bioetanolu)

Bardziej szczegółowo

OCENA Rozprawy doktorskiej mgr Aksany Varabyovej Biogeneza dysmutazy ponadtlenkowej 1 w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej

OCENA Rozprawy doktorskiej mgr Aksany Varabyovej Biogeneza dysmutazy ponadtlenkowej 1 w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej prof. dr hab. Barbara Zabłocka Pracownia Biologii Molekularnej Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN ul. Pawińskiego 5, 02-106 Warszawa tel: 22-60 86 486 e-mail: bzablocka@imdik.pan.pl

Bardziej szczegółowo

BIOMONITORING MUTAGENNOŚCI POWIETRZA ATMOSFERYCZNEGO I WODY

BIOMONITORING MUTAGENNOŚCI POWIETRZA ATMOSFERYCZNEGO I WODY BIOMONITORING MUTAGENNOŚCI POWIETRZA ATMOSFERYCZNEGO I WODY Dr Anicenta Bubak Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego, Sosnowiec Wszystkie dotychczas prowadzone badania nad narażeniem populacji

Bardziej szczegółowo

WODA I OGIEŃ. Prezentacja Mileny Oziemczuk

WODA I OGIEŃ. Prezentacja Mileny Oziemczuk WODA I OGIEŃ Prezentacja Mileny Oziemczuk Ogień Ogień - suma obserwowalnych zjawisk towarzyszących na ogół fizykochemicznemu procesowi spalania,, a przede wszystkim: emisja promieniowania widzialnego -światła

Bardziej szczegółowo

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wstęp Określenie próbka biologiczna jest

Bardziej szczegółowo

Jeśli wyniki tego samego badania przeprowadzone dwoma różnymi metodami nie różnią się od siebie

Jeśli wyniki tego samego badania przeprowadzone dwoma różnymi metodami nie różnią się od siebie lek.wet. Agnieszka Dereczeniuk Badania laboratoryjne w hodowli Łódź 24.03.2012 Po co badać? Badania przesiewowe Badania profilaktyczne Badania obowiązkowe dla danej rasy Badania okresowe Badania diagnostyczne

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu DNA) Jest to reakcja powielania (replikacji)

Bardziej szczegółowo

Zaoczne Liceum Ogólnokształcące Pegaz

Zaoczne Liceum Ogólnokształcące Pegaz WYMAGANIA EGZAMINACYJNE ROK SZKOLNY 2015/2016 Semestr jesienny TYP SZKOŁY: liceum ogólnokształcące PRZEDMIOT: biologia SEMESTR: II LICZBA GODZIN W SEMESTRZE: 15 PROGRAM NAUCZANIA: Program nauczania biologii

Bardziej szczegółowo

Opracował dr inż. Tadeusz Janiak

Opracował dr inż. Tadeusz Janiak Opracował dr inż. Tadeusz Janiak 1 Uwagi dla wykonujących ilościowe oznaczanie metodami spektrofotometrycznymi 3. 3.1. Ilościowe oznaczanie w metodach spektrofotometrycznych Ilościowe określenie zawartości

Bardziej szczegółowo

SZYBKOŚĆ REAKCJI CHEMICZNYCH. RÓWNOWAGA CHEMICZNA

SZYBKOŚĆ REAKCJI CHEMICZNYCH. RÓWNOWAGA CHEMICZNA SZYBKOŚĆ REAKCJI CHEMICZNYCH. RÓWNOWAGA CHEMICZNA Zadania dla studentów ze skryptu,,obliczenia z chemii ogólnej Wydawnictwa Uniwersytetu Gdańskiego 1. Reakcja między substancjami A i B zachodzi według

Bardziej szczegółowo

BADANIA GENOTOKSYCZNOŚCI PRÓBEK ŚRODOWISKOWYCH NA PRZYKŁADZIE TESTÓW WYKORZYSTUJĄCYCH SZCZEP SALMONELLA TYPHIMURIUM

BADANIA GENOTOKSYCZNOŚCI PRÓBEK ŚRODOWISKOWYCH NA PRZYKŁADZIE TESTÓW WYKORZYSTUJĄCYCH SZCZEP SALMONELLA TYPHIMURIUM Maciej K. BEŁCIK*, Katarzyna PIEKARSKA* mutacja, próbki środowiskowe, test Salmonella, test Amesa II, test UMU BADANIA GENOTOKSYCZNOŚCI PRÓBEK ŚRODOWISKOWYCH NA PRZYKŁADZIE TESTÓW WYKORZYSTUJĄCYCH SZCZEP

Bardziej szczegółowo

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 3 Oznaczanie chlorków metodą spektrofotometryczną z tiocyjanianem rtęci(ii)

Bardziej szczegółowo

DETEKCJA W MIKRO- I NANOOBJĘTOŚCIACH. Ćwiczenie nr 3 Detektor optyczny do pomiarów fluorescencyjnych

DETEKCJA W MIKRO- I NANOOBJĘTOŚCIACH. Ćwiczenie nr 3 Detektor optyczny do pomiarów fluorescencyjnych DETEKCJA W MIKRO- I NANOOBJĘTOŚCIACH Ćwiczenie nr 3 Detektor optyczny do pomiarów fluorescencyjnych Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest zaznajomienie się z zasadą działania i zastosowaniami detektora optycznego

Bardziej szczegółowo

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze DNA Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom

Bardziej szczegółowo

Zagrożenia i ochrona przyrody

Zagrożenia i ochrona przyrody Wymagania podstawowe Uczeń: Wymagania ponadpodstawowe Uczeń: Zagrożenia i ochrona przyrody wskazuje zagrożenia atmosfery powstałe w wyniku działalności człowieka, omawia wpływ zanieczyszczeń atmosfery

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 3. I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów

ĆWICZENIE 3. I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów ĆWICZENIE 3 I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów Alkacymetria jest metodą opartą na reakcji zobojętniania jonów hydroniowych jonami wodorotlenowymi lub odwrotnie. H 3 O+ _ + OH 2 O Metody

Bardziej szczegółowo

PRZYKŁADOWE ZADANIA ORGANICZNE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE AZOT

PRZYKŁADOWE ZADANIA ORGANICZNE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE AZOT PRZYKŁADOWE ZADANIA ORGANICZNE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE AZOT Zadanie 1127 (1 pkt) Uszereguj podane związki według rosnącego ph w roztworze wodnym. Właściwy porządek podaj zapisując go wzorami półstrukturalnymi.

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU ELEKTROFOREZA

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU ELEKTROFOREZA SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU ELEKTROFOREZA SPIS TREŚCI: I. Wprowadzenie. II. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. III. Karty pracy. 1. Karta

Bardziej szczegółowo

badanie moczu Zwierzę Typ cewnika moczowego Rozmiar (jedn. francuskie) * gumy lub dla kocurów polietylenowy Elastyczny winylowy, z czerwonej

badanie moczu Zwierzę Typ cewnika moczowego Rozmiar (jedn. francuskie) * gumy lub dla kocurów polietylenowy Elastyczny winylowy, z czerwonej badanie moczu Rozmiary cewników... 139 Rutynowe postępowanie przy badaniu moczu... 140 Ogólne badanie moczu... 141 Badanie osadu moczu... 142 Tabela ph moczu dla kryształów moczu 142 Komórki i wałeczki...

Bardziej szczegółowo

Zestaw SIT Szybki Identyfikacyjny Test Szczepów Salmonella Enteritidis i Typhimurium

Zestaw SIT Szybki Identyfikacyjny Test Szczepów Salmonella Enteritidis i Typhimurium Zestaw SIT Szybki Identyfikacyjny Test Szczepów Salmonella Enteritidis i Typhimurium W związku z wprowadzeniem w 2011 roku przez Komisję UE zmian w rozporządzeniach nr 2160/3003 i 2073/2005 w odniesieniu

Bardziej szczegółowo