TOKSYKOLOGIA MOLEKULARNA

Transkrypt

1 Paweł BRZUZAN, Maciej WOŹNY, Michał K. ŁUCZYŃSKI TOKSYKOLOGIA MOLEKULARNA przewodnik do ćwiczeń Olsztyn 2007

2 Spis treści WSTĘP... 2 ROZDZIAŁ 1. GENOTOKSYCZNOŚĆ... 6 ĆWICZENIE 1.1. ELEKTROFOREZA POJEDYNCZYCH JĄDER KOMÓRKOWYCH W śelu AGAROZOWYM (SCGE)... 6 Zadanie Elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych erytrocytów pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) poddanych działaniu H 2 O Zadanie Mikroskopowa analiza obrazu komet metodą Gedika ĆWICZENIE 1.2. TEST MIKROJĄDROWY (MN) Zadanie Test mikrojądrowy (MN) ĆWICZENIE 1.3. TEST AMESA ROZDZIAŁ 2. DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA: POLIMORFIZM GENÓW KODUJĄCYCH BIAŁKA UCZESTNICZĄCE W METABOLIZMIE KSENOBIOTYKÓW ĆWICZENIE 2.1. UZYSKIWANIE DNA GENOMOWEGO Zadanie Uzyskiwanie DNA genomowego z cebulki włosa Zadanie Uzyskiwanie DNA z krwi obwodowej za pomocą zestawu odczynników Pronto (Izrael).. 29 Zadanie Ocena jakościowa i ilościowa wyizolowanego DNA za pomocą spektrofotometru Zadanie Ocena jakościowa wyizolowanego DNA za pomocą rozdziału w Ŝelu agarozowym ĆWICZENIE 2.2. AMPLIFIKACJA GENÓW GSTM1 I GSTT1 Z WYKORZYSTANIEM METODY AS-PCR (VANDEN HEUVEL, 1998) Zadanie Detekcja polimorfizmu genów GSTM1 i GSTT Zadanie Obliczanie frekwencji genów GSTT1 i GSTM1 w grupie studentów ROZDZIAŁ 3. EKSPRESJA GENÓW POD WPŁYWEM TOKSYCZNYCH SUBSTANCJI CHEMICZNYCH ĆWICZENIE 3.1. UZYSKIWANIE RNA Zadanie Uzyskiwanie całkowitego RNA z wątroby (nerki) przy pomocy zestawu odczynników Total RNA (A&A Biotechnology, Polska) ĆWICZENIE 3.2. ODWROTNA TRANSKRYPCJA ĆWICZENIE 3.3. POMIAR STOPNIA INDUKCJI GENÓW CYP1A (METODA PÓŁILOŚCIOWA) ĆWICZENIE 3.4. POMIAR STOPNIA INDUKCJI GENÓW CYP1A (METODA ILOŚCIOWA) ĆWICZENIE 3.3. ANALIZA EKSPRESJI GENÓW Z UśYCIEM TECHNOLOGII REAL-TIME PCR Zadanie Relatywna kwantyfikacja liczby transkryptów mrna Zadanie Absolutna kwantyfikacja transkryptów mrna ROZDZIAŁ 4. MACIERZE CDNA ĆWICZENIE 4.1. METODA SONDOWANIA MOLEKULARNEGO GENÓW AKTYWNYCH TRANSKYPCYJNIE POD WPŁYWEM SKAśENIA ŚRODOWISKA WODNEGO WYBRANYMI WIELOPIERŚCIENIOWYMI WĘGLOWODORAMI AROMATYCZNYMI (Z WYKORZYSTANIEM ZESTAWU DIG DNA LABELING AND DETECTION KIT FIRMY ROCHE) ZAŁĄCZNIKI ZAŁĄCZNIK 1. TEST U-MANNA WHITNEYA

3 Wstęp Od kilku lat zespół toksykologii Katedry Biotechnologii w Ochronie Środowiska realizuje projekty dotyczące reakcji wybranych gatunków ryb jako kryterium oceny stopnia toksyczności i genotoksyczności ksenobiotyków naleŝących do rozmaitych grup związków chemicznych: wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, farmaceutyków i związków wykazujących aktywność estrogenną. Ocena wpływu tych związków na populacje ryb nabiera szczególnego znaczenia w przypadku naraŝenia ekosystemu na stały dopływ zanieczyszczeń, tak jak się to dzieje na obszarach zindustrializowanych lub w pobliŝu nieprawidłowo zaprojektowanych składowisk odpadów komunalnych i przemysłowych. Badanie odpowiedzi biologicznej na poziomie populacji, za pomocą tak zwanych biowskaźników (bioindykatorów) jest bardzo trudne, moŝna natomiast badać indywidualną reakcję kaŝdego osobnika i to juŝ na poziomie molekularnym za pomocą odpowiednio dobranego systemu biomarkerów (Iha i in. 2000). W przypadku niektórych związków chemicznych studia te mają ułatwić wybór wskaźników do badania potencjalnej mutagenności i kancerogenności wody do picia. Liczymy na opracowanie optymalnych metod biologicznego monitorowania zmian jakości środowiska wodnego, wywołanych przez mieszaniny mikrozanieczyszczeń. UŜytecznym biomarkerem w ocenie własności genotoksycznych albo mutagennych danego zanieczyszczenia środowiska, badanym na poziomie molekularnym, moŝe być stopień uszkodzenia DNA (Shugart 1990). Substancje mutagenne mogą tworzyć w pojedynczej nici DNA tak zwane addukty, albo wywoływać jej pęknięcia. W wyniku zmian w sekwencji i organizacji DNA powstają aberracje chromosomowe (CA), które mogą dotyczyć ich struktury albo zmian liczbowych. Zmiany te mogą prowadzić poprzez transformację komórki do procesów nowotworowych. W badaniach powstawania uszkodzeń DNA pod wpływem substancji genotoksycznych stosuje się między innymi metodę kometową (Comet Assay, Mitchelmore i Chipman 1998), test mikrojądrowy (MN) (Carrasco i in. 1990) a takŝe test mutagenności Amesa (Ames i in 1975). Sposób wykonania ćwiczeń, zalety i ograniczenia kaŝdej z metod przedstawiono w Rozdziale 1. ZróŜnicowana wraŝliwość organizmów na działanie czynników toksycznych jest w wielu przypadkach wynikiem polimorfizmu genów kodujących białka uczestniczące w szlakach aktywacji metabolicznej i/albo detoksykacji. Badania materiału genetycznego pełnią wówczas rolę diagnostyczną pozwalają wskazać, które z osobników mogą być najbardziej 2

4 wraŝliwe na działanie określonych czynników. Rozdział 2 opisuje jedną z metod molekularnych umoŝliwiających wykrycie polimorfizmu genetycznego ludzkiej S-transferazy glutationowej (GST), enzymu uczestniczącego w fazie II biotransformacji. Odmienne podejście metodyczne umoŝliwia badanie zmian aktywności genów wywołanych działaniem toksycznych substancji chemicznych. Cytochromy P450 (Nelson i in. 1996), naleŝą do głównych składowych systemu obrony organizmu ryb przeciw wielu ksenobiotykom wykrywanym w środowisku wodnym, takim jak na przykład wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polichlorowane bifenyle (PCB), dioksyny czy furany. PoniewaŜ wzrost aktywności genów P450 następuje w odpowiedzi na pojawienie ksenobiotyku, badanie poziomu P450 w tkankach umoŝliwia określenie naraŝenia populacji na zanieczyszczenie ich środowiska. Jeszcze do niedawna, pomiar stopnia indukcji cytochromu P450 wymagał zastosowania technik hybrydyzacyjnych (Southern i Western blotting), testów z immunosorbentami (ELISA), albo testów aktywności enzymatycznej O- deetylazy etoksyrezorufiny (EROD). Metody te wprawdzie pozwalają na detekcję produktów ekspresji odpowiednich genów P450 (zarówno jako mrna albo polipeptyd), to jednak nie jest moŝliwe oszacowanie liczby ich transkryptów mrna. Obecnie, ilościowe badanie ekspresji odpowiednich genów P450 moŝliwe jest przez zastosowanie metody RT-PCR (ang. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), czyli kombinowanej metody z udziałem enzymu odwrotnej transkryptazy w połączeniu z techniką PCR (Rozdział 3; Vanden Heuvel 1998). W tym rozdziale podajemy teŝ praktyczne informacje na temat technologii Real-Time PCR i jej zastosowanie w analizach ekspresji genów (Higuchi i in. 1993). Ostatni rozdział poświęcamy zagadnieniom toksykogenomiki i sposobom konstruowania macierzy cdna, które pozwalają na kompleksowe badanie ekspresji genów w tkankach ryb pod wpływem substancji toksycznych (profilowanie genetyczne). Toksykogenomika pozwala na odkrywanie i badanie genów ulegających transkrypcji w poszczególnych typach komórek i tkanek organizmów naraŝonych na działanie toksykantów lub ich mieszanin. Jak dotychczas, analizy profilu ekspresji genetycznej, z uŝyciem setek sond molekularnych nanoszonych na płytki szklane (mikromacierzy i makromacierzy cdna), sprzęŝone z opisem zmian fenotypowych organizmów są najbardziej czułym i odpowiednim narzędziem w badaniach środowiskowych szkodliwego wpływu róŝnych ksenobiotyków, w tym takŝe WWA, na procesy Ŝyciowe organizmów. 3

5 Celem przewodnika jest zapoznanie studentów ochrony środowiska z niektórymi zagadnieniami charakterystycznymi dla współczesnej toksykologii molekularnej i diagnostyki DNA. Mamy nadzieję, Ŝe robocze wydanie przewodnika będzie przydatne, a wszelkie uwagi przyjmiemy z wdzięcznością. Autorzy Piśmiennictwo: Ames B. N., J. McCann, E. Yamasaki,1975. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research, 31,347. Carrasco, K. R., Tilbury, K. L., and Myers, M. S. (1990). Assessment of the piscine micronucleus test as an in situ biological indicator of chemical contaminant effects. Can. J. Fish Aquat. Sci. 47: Higuchi, R., C. Fockler, G. Dollinger, R. Watson Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11: Jha A.N., Cheung V.V., Foulkes M..E., Hill S.J., Depledge M.H., Detection of genotoxins in the marine environment: adoption and evaluation of an integrated approach using the embryo-larval stages of the marine mussel, Mytilus edulis, Mutation Research 464: Mitchelmore, C.L., Chipman, J.K DNA strand breakage in aquatic organisms and the potential value of the comet assay in environmental monitoring. Mut. Res. 399: Nelson, D., Koymans, L., Kamataki, T., Stegeman, J., Feyereisen, R., Waxaman, D., Waterman, M., Gotoh, O., Coon, M., Estabrook, R., Gunslaus, I., Nebert, D P450 subfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Pharmacogenetics 6: Shugart L Biological monitoring:testing for genotoxicity. In: Biomarkers of environmental contamination (J.F. McCarthy and L.R. Shugart, eds.) s , Lewis, Chelsea. Vanden Heuvel, J.P PCR Protocols in Molecular Toxicology. CRC Press, New York, s

6 1. Genotoksyczność 5

7 Rozdział 1. Genotoksyczność Genotoksyczność rozumiemy jako zdolność do wywoływania przez określone czynniki względnie trwałych zmian w materiale genetycznym. Czynniki takie mogą mieć charakter chemiczny, na przykład wolne rodniki, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, metale cięŝkie lub fizyczny - promieniowanie UV, promieniowanie X. Pęknięcia DNA mogą mieć charakter pierwotny lub wtórny. Pierwotne pęknięcia wywoływane są bezpośrednio działaniem czynników fragmentujących nici DNA (powodowane przez: promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe czy tak zwane radiometryki), mogą zachodzić równieŝ na skutek działania reaktywnych form tlenu. Pęknięcia wtórne powstają w czasie trwania procesów naprawczych DNA prowadzonych przez enzymy naprawcze (szczególnie podczas naprawy uszkodzenia DNA polegającej na wycinaniu zasad azotowych - BER; base excision repair). Powoduje to powstawanie zmian w sekwencji i organizacji DNA, co z kolei moŝe doprowadzić do zmian w strukturze i liczbie chromosomów i/albo sprzyjać transformacji komórek, której skutkiem jest najczęściej powstanie nowotworu. Ćwiczenie 1.1. Elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych w Ŝelu agarozowym (SCGE) Jedną z metod badania stopnia uszkodzenia DNA wywołanego działaniem czynnika genotoksycznego jest elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych w Ŝelu agarozowym (SCGE single cell gel electrophoresis), popularnie nazywana metodą kometową (Comet Assay) z powodu charakterystycznego obrazu uzyskiwanego w mikroskopie fluorescencyjnym. Pierwszymi badaczami, którzy oceniali uszkodzenia DNA w pojedynczych komórkach byli Rydberg i Johanson (1978). Jednak właściwa metoda testu kometowego wprowadzona została w 1984 przez Östlinga i Johansona. Autorzy ci wykazali, Ŝe zawartość DNA w ogonie komety i jego długość są funkcją pochłoniętej przez komórkę dawki promieniowania; upraszczając, im większa dawka promieniowania tym dłuŝszy ogon komety. W metodzie kometowej bada się pojedyncze komórki; mogą to być komórki wątroby, krwi albo nabłonka, jedynym warunkiem jest by miały one jądra zawierające DNA. Wygodnym obiektem do badań tą metodą są erytrocyty ryb, poniewaŝ mają one jądra 6

8 komórkowe, są bardzo liczne (stanowią nawet 97% wszystkich elementów morfotycznych krwi ryby) i co bardzo waŝne, dokładnie poznane są ich cechy biochemiczne i fizjologiczne. Analiza komet jest metodą względnie prostą, łatwą do wykonania, a uzyskane wyniki są powtarzalne. Metoda ta jest obecnie ciągle udoskonalana; powstają modyfikacje z zastosowaniem przeciwciał albo hybrydyzacji z sondami molekularnymi (FISH), które pozwalają na szybkie i wybiórcze określenie charakteru zmian w obrębie jądrowego DNA. Zadanie Elektroforeza pojedynczych jąder komórkowych erytrocytów pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) poddanych działaniu H 2 O 2 Nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) jest źródłem tak zwanych wolnych rodników, które są bardzo reaktywne chemicznie i choć naturalnie występują w małych ilościach w kaŝdej Ŝywej komórce, to w sytuacjach patologicznych, jaką jest stres oksydatywny, są wysoce genotoksyczne. Komórki (erytrocyty) przeznaczone do badania (Rys.1A) poddaje się działaniu czynnika genotoksycznego (Rys.1B). Komórki zawiesza się następnie w roztworze agarozy (Rys.1C) i nanosi cienką warstwą na szkiełka mikroskopowe (Rys 1D), po czym poddaje się je działaniu pola elektrycznego prądu stałego (Rys.1E). PoniewaŜ kwas deoksyrybonukleinowy zawarty w jądrach komórkowych ma ładunek ujemny (-), wędruje w polu elektrycznym w kierunku bieguna dodatniego (+). Podczas elektroforezy w Ŝelu agarozowym, DNA i jego fragmenty powstałe na skutek działania czynnika genotoksycznego są rozdzielane w postępie odwrotnie proporcjonalnym do ich mas cząsteczkowych; najbliŝej wędruje wysokocząsteczkowy (nieuszkodzony) DNA, najdalej natomiast jego najkrótsze fragmenty (Rys.1F). Po przeprowadzeniu elektroforezy preparaty wybarwia się barwnikiem fluorescencyjnym i umieszcza pod mikroskopem wyposaŝonym w odpowiednie źródło światła i zestaw filtrów. Obraz otrzymywany spod mikroskopu przenosi się za pomocą kamery do komputera i korzystając z odpowiednich programów zliczających liczbę i wygląd poszczególnych komet, szacuje rozmiary uszkodzeń DNA jądrowego. 7

9 Wykonanie Dzień przed doświadczeniem przygotować: łaźnie - piaskową i wodną pipety automatyczne szkiełka pokryte agarozą 1% NMP komorę Bürkera opisane probówki typu eppendorf schłodzić w lodówce wodę na bufor do elektroforezy schłodzić w lodówce kominek W dniu doświadczenia przygotować: bufor do lizy pojemnik z lodem Rysunek 1. Schemat metody SCGE (szczegóły w tekście). 8

10 Część I. Doświadczenie (patrz rysunek poniŝej) 1. Pobrać krew z Ŝyły ogonowej pstrąga tęczowego. 2. Krew rozcieńczyć w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) w stosunku 5 µl krwi na 1 ml PBS. 3. Sprawdzić liczbę komórek w komorze Bürkera aby osiągnąć odpowiednią liczbę komórek w jednostce objętości (konsultować z prowadzącym ćwiczenia). 4. Opcjonalnie wykonać test Ŝywotności komórek (CFDA). 5. Wymieszać 100 µl rozcieńczonego preparatu ze 100 µl genotoksykanta (H 2 O 2 ) w odpowiednim stęŝeniu i pozostawić na 5 min (ekspozycja). 6. Przenieść po 10 µl do nowych probówek. 9

11 Część II. Elektroforeza 1. Do kaŝdej probówki dodać 65 µl rozgrzanej agarozy LMP 0,5%, wymieszać przez pipetowanie. 2. Szybko nałoŝyć warstwę mieszaniny agarozy LMP z komórkami na oznaczone szkiełko pokryte 1% agarozą. 3. Szkiełka schłodzić na płycie z lodem. 4. NałoŜyć na szkiełka druga warstwę agarozy LMP. 5. Powtórzyć krok Przygotowane preparaty umieścić w kominku z buforem lizującym na 1 godzinę. 7. Po lizie umieścić preparaty w aparacie do elektroforezy, zalać buforem i pozostawić w nim na 20 min (Uwaga bufor do elektroforezy jest silnie zasadowy!). 8. Włączyć aparat do elektroforezy, czas 15 min. 9. Po skończeniu elektroforezy przenieść preparaty na kratkę i neutralizować przez 3 krotne polanie kaŝdego szkiełka, co 5 min. buforem (0,4 Tris, ph=7,5). 10. Preparaty wybarwić roztworem EtBr (20 µl/ml Uwaga! Bromek etydyny jest silnym kancerogenem!), rozprowadzając ostroŝnie pipetą 50 µl na kaŝdym. Nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Zadanie Mikroskopowa analiza obrazu komet metodą Gedika Wybarwiając preparaty uzyskane metodą SCGE posługujemy się z reguły bromkiem etydyny. MoŜna równieŝ stosować inne metody wizualizacji np. barwienie azotanem srebra, pozwalające na obserwację preparatów w świetle białym. Przy ocenie skali uszkodzenia materiału genetycznego moŝna posłuŝyć się komputerową analizą obrazu wykorzystując specjalistyczne oprogramowanie. Inny prosty sposób analizy obrazów komet, opierający się na klasyfikacji uszkodzeń DNA jądrowego w komórce do pięciu klas (patrz niŝej), zaproponował Gedik i wsp. (1992). Wykonanie 1. Analizę mikroskopową wykonujemy w świetle UV, zliczając po 50 komórek z kaŝdego szkiełka. Korzystając ze skali Gedika poniŝej uzupełnij tabelę. 2. Oblicz frekwencję komórek w poszczególnych zakresach uszkodzeń dla róŝnych stęŝeń genotoksykanta. Opisz swoje wnioski i obserwacje. 10

12 Stopień uszkodzenia DNA w jądrze komórki W próbie kontrolnej Dla dawki 50 µm H2O2 Dla dawki 500 µm H2O2 N L M H T 11

13 Skala Gedika N - brak uszkodzeń uszkodzenia Mniej niŝ 5% DNA w ogonie komety L - małe uszkodzenia 5% do 25% DNA w ogonie komety M - średnie uszkodzenia 20% do 40% DNA w ogonie komety H - duŝe uszkodzenia 40% do 95% DNA w ogonie komety T - całkowite uszkodzenia Ponad 95% DNA w ogonie komety 12

14 Piśmiennictwo: Gedik, C.M., Ewen, S.W., Colins, A.R Single cell gel electrophoresis applied to the analysis of UV-C damage and its repair in human cells. Int. J. Radiat. Biol., s. 62. Rojas, E., Lopez, M.C., Valverde, M Single cell gel electrophoresis assay: methodology and aplications. J. Chrom. B, 722:

15 Ćwiczenie 1.2. Test mikrojądrowy (MN) Test mikrojądrowy jest prostą i powszechnie stosowaną metodą słuŝącą do przyŝyciowego określania uszkodzeń chromosomów pod wpływem róŝnych czynników. Mikrojądra mogą być łatwo identyfikowane we wszystkich komórkach posiadających jądro komórkowe. Dotyczy to np. erytrocytów takich zwierząt jak ryby, płazy i ptaki, komórek nabłonka skrzeli ryb i małŝy, a takŝe komórek hemolimfy małŝy i innych bezkręgowców. W przypadku ssaków, ze względu na brak jąder w erytrocytach, mikrojądra analizuje się w leukocytach. Mikrojądra to chromatynowe struktury wewnątrz cytoplazmy, przypominające małe, dodatkowe jądra w komórce. Formują się one z chromosomów opóźnionych i utraconych podczas anafazy podziału mitotycznego komórki lub z acentrycznych fragmentów chromatynowych. (części chromosomów nie zawierające centromeru). Powstawanie mikrojąder jest zatem związane z chromosomowymi aberracjami liczbowymi (ubytek jednego lub kilku chromosomów z jądra komórkowego) oraz strukturalnymi (ubytek fragmentu jednego lub kilku chromosomów). Utracone podczas podziału komórki chromosomy lub ich fragmenty tworzą w cytoplazmie charakterystyczne, okrągłe struktury. Barwią się one odczynnikiem Giemzy w identyczny sposób jak jądro komórkowe (a inaczej niŝ cytoplazma), poniewaŝ są zbudowane z tego samego materiału co jądro, czyli z chromatyny jądrowej. Struktury te, zwane mikrojądrami, pojawiają się w komórkach na skutek oddziaływania czynników fizycznych (np. temperatura) lub chemicznych (związki o działaniu mutagennym i kancerogennym, na przykład policykliczne węglowodory aromatyczne). Test mikrojądrowy umoŝliwia analizowanie genotoksyczności zarówno określonych związków chemicznych, jak i mieszanin substancji o nieznanym lub bardzo złoŝonym składzie (Carrasco i in. 1990), na przykład wody zanieczyszczonej odpadami chemicznymi czy odcieków z wysypiska śmieci. 14

16 Zadanie Test mikrojądrowy (MN) Wykonanie 1. Pobieranie krwi. Miejscem, z którego pobiera się krew, moŝe być tętnica, Ŝyła ogonowa lub serce. Krew z tętnicy lub Ŝyły ogonowej najłatwiej pobrać za pomocą strzykawki, wbijając igłę za płetwą odbytową. 2. Wykonanie rozmazu Na szkiełko podstawowe nanosimy krople krwi, po czym rozprowadzamy ją szkiełkiem nakrywkowym. 3. Rozmaz utrwala się w metanolu przez 5 min. 4. Barwienie roztworem Giemzy (rozcieńczenie 1:9) przez 20 min. 5. Płukanie w buforze fosfranowym (ph 6,8) przez 10 min. 6. Wysuszony preparat oglądamy pod mikroskopem, zliczając 2000 erytrocytów. Za mikrojądra (Rys. 2) uznajemy struktury, spełniające następujące warunki: wybarwione w taki sam sposób jak jądro komórkowe, regularne, kuliste struktury nie połączone z jądrem, struktury, stanowiące mniej niŝ 1/3 objętości jądra komórkowego. Rysunek 2. Mikroskopowy obraz mikrojądra w erytrocycie pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) Piśmiennictwo: Carrasco, K. R., Tilbury, K. L., and Myers, M. S. (1990). Assessment of the piscine micronucleus test as an in situ biological indicator of chemical contaminant effects. Can. J. Fish Aquat. Sci. 47:

17 Ćwiczenie 1.3. Test Amesa Najczęściej stosowanym krótkoterminowym testem bakteryjnym jest test Amesa, który określa poziom mutacji powrotnych z histydynowej auksotrofii do prototrofii w wielu specjalnie skonstruowanych mutantach szczepu Salmonella typhimurium LT 2 (Ames,1975). Szczepy te posiadają rfa mutację powodującą przepuszczalność błony komórkowej w wyniku zmiany jej składników lipoproteinowych. Do badań stosowane są szczepy S. typhimurium: TA 97, TA 98, TA 100, TA 102, TA 104, TA 1535, TA Wymienione szczepy pozwalają określić zmiany w DNA w wyniku indukcyjnego działania badanego związku (Maron i Ames 1983). Skonstruowano wiele szczepów testowych, które zawierają róŝne mutacje w operonie histydyny. Badania prowadzone w ostatnich latach pogłębiły znajomość nie tylko charakteru pierwotnych mutacji, ale równieŝ dróg, które prowadzą do rewersji. W rutynowych badaniach przesiewowych autorzy testu początkowo zalecali uŝywanie pięciu szczepów: TA 1535, TA 1537, TA 1538, TA 98 i TA 100. Obecnie zalecany jest zestaw składający się z czterech szczepów: TA 97 (wraŝliwy na czynniki utleniające), TA 98, TA 100, i TA 102 (wraŝliwy na większą liczbę mutagenów niŝ szczep TA 1537), który umoŝliwia wykrycie szerokiego spektrum mutagenów przy zastosowaniu mniejszej liczby szczepów testowych. Mimo to, ze względów technicznych częściej stosuje się zestaw pierwotny. Jednym z powodów jest to, Ŝe szczep TA 102 wykazuje duŝą zmienność liczby kolonii rewertantów spontanicznych (niestabilny plazmid paq1), a powolny wzrost kolonii rewertantów szczepu TA 97 utrudnia liczenie kolonii po standardowej 48 godzinnej inkubacji (MielŜyńska i in. 1998). Stosowanie odpowiednio zmutowanych szczepów bakterii umoŝliwia dostosowanie systemu do określonych typów mutagenów poddawanych badaniom. Nowe szczepy Salmonella typhimurium: YG 1012, YG 1021, YG1024 oraz NM 2009 są wraŝliwe na działanie heterocyklicznych amin aromatycznych oraz ich pochodnych, a szczepy TA 98NR i TA 98/1-DNP6 pozwalają na wykrywanie aktywności mutagennej nitrowych i aminowych pochodnych węglowodorów aromatycznych. Szczepy TA 97 i TA 98 są wraŝliwe na działanie mutagenów wywołujących zmianę fazy odczytu, a szczepy TA 100 na mutacje typu zmiany zasad lub par zasad nukleotydu G-C lub A-T. Szczepy S. typhimurium TA 102 i TA 104 w miejscu zapisu rewersji zawierają mutacje ochre (kodon stop ). Odmiany tych mutantów są bardziej wraŝliwe na działanie związków utleniających, takich jak aldehydy i ketony. Ponadto 16

18 szczep TA 102 pozwala dodatkowo wykryć związki chemiczne powodujące powstawanie wiązań krzyŝowych w DNA (Traczewska 2002). Schemat standardowego testu Amesa przedstawia Rysunek 3. Szczepy bakterii (mutanty), uŝywane w teście nie mają zdolności syntezowania histydyny, stąd nie są one zdolne do wzrostu na poŝywce pozbawionej promutagenu (mutagenu aktywowanego frakcją S-9). Po poddaniu takich szczepów bakterii działaniu mutagenu wraz z systemem aktywującym (frakcja mikrosomalna S-9) obserwuje się występowanie mutacji w komórkach bakterii. Rewertanty posiadają juŝ zdolność syntezowania histydyny, a więc mogą się rozmnaŝać. Licząc kolonie rewertantów na szalkach Petriego z poŝywką i odnosząc liczbę kolonii rewertantów do grupy kontrolnej (liczba rewertantów spontanicznych), nie zawierającej promutagenu, moŝna oszacować aktywność mutagenną danych połączeń badanych związków (Łuczyński i in. 2007). Więcej na temat aktywacji metabolicznej WWA w rozdziale 2. 17

19 Rysunek 3. Schemat standardowego testu Amesa (Pirogowicz 2006) 18

20 Wykonanie 1. Przygotowanie poŝywek: A. Bulion odŝywczy, B. Agar odŝywczy, C. Agar minimalny, D. Top agar, 2. Przygotowanie płynnej hodowli (hodowla Overnight), 3. Przygotowanie mieszaniny S9, 4. Sprawdzenie genotypu testowych szczepów: 4.1. Mutacje w operonie histydynowym, 4.2. Sprawdzenie obecności plazmidu pkm101, 4.3. Delecje uvrb, Pasmo testowych szczepów w kontakcie z ampicyliną Bakterie naświetlane promieniami UV Hodowla z fioletem krystalicznym 5. Kontrole mutacji spontanicznych: kontrola wpływu rozpuszczalnika i mutagenów na poziom mutacji spontanicznych, 6. Procedura testu Amesa (kroki poprzedzające rozpoczęcie eksperymentu): 6.1. Zaszczepić kolonie Salmonella godzin przed rozpoczęciem eksperymentu, 6.2. Sporządzić odpowiednie rozcieńczenia badanych związków w DMSO, 6.3. Oznakować i rozłoŝyć 90 szalek Petriego z poŝywką agarozową oraz taką samą liczbę sterylnych probówek: 60 płytek dla badanych pochodnych (trzy powtórzenia dla dwóch szczepów i dwóch związków o stęŝeniu 100 µl/płytkę bez S9; 100, 10, 1, 0,1 µl/płytkę z frakcją S9), po 3 płytki dla SR, BaP, NQNO, 0, O A (A-ampicylina) szczepu TA98 i taką samą liczbę dla szczepu TA100, 7. Stopić wierzchnią warstwę agarową z dodatkiem 0,05 M histydyny i biotyny i przechowywać w temperaturze o C, 8. Do szklanych probówek przechowywanych w temperaturze 43 o C dodać w następującym porządku: 10 µl roztworu badanego mutagenu, 2,5 ml przygotowanego agaru powierzchniowego top agaru, zawierającego śladowe ilości roztworu L histydyny i biotyny, 0,10 ml przygotowanej wcześniej kultury szczepu Salmonella, 0,5 ml frakcji aktywującej (S-9) lub buforu fosforanowego w zaleŝności od wariantu aktywacji, 9. Zawartość probówek wymieszać opalić w płomieniu palnika zewnętrzne ściany probówek i wylać ich zawartość na przygotowane wcześniej szalki Petriego z poŝywką agarozową, następnie rozprowadzić równomiernie i odstawić do zastygnięcia, 10. Po stwardnieniu wierzchniej warstwy agarozowej (2-3 min), szalki odwrócić i umieścić w inkubatorze o temp. 37 o C na 48 godzin, 19

21 11. Zliczyć kolonie rewertantów i przedstawić jako: liczba kolonii rewertantów na płytkę (Uzupełnić tabele poniŝej). 12. Opracowanie uzyskanych wyników: W badaniach nad oceną aktywności mutagennej stosuje się metodę najmniejszych kwadratów, która obejmuje analizę regresji oraz analizę wariancji. Do przeprowadzenia prawidłowej analizy statycznej konieczne są wyniki przynajmniej dla dwóch dawek i kontroli negatywnej oraz dwukrotnych powtórzeń dla tych samych dawek W ocenie dopasowania danych do modelu liniowego naleŝy posłuŝyć się współczynnikiem determinacji R 2 oraz prawdopodobieństwem ryzyka błędu p dla przyjętego poziomu ufności α=0,05 przeprowadzonej analizy wariancji. Na podstawie parametrów równania zaleŝności liniowej naleŝy obliczyć przewidywaną liczbę kolonii rewertantów (LRI) oraz liczbę rewertantów netto (LRN) indukowaną przez 1 µg badanej substancji. Wielkość efektu mutagennego dla omawianych związków przedstawia się równieŝ w postaci względnej miary efektu mutagennego, tzw. aktywności mutagennej (AM). Jest to iloraz liczby rewertantów netto (LNR= LRI-KN) i liczby rewertantów w odpowiedniej kontroli negatywnej (AM= LNR/KN). Odjęcie liczby rewertantów otrzymanych w odpowiedniej kontroli negatywnej pozwala na porównanie wyników uzyskanych w róŝnych doświadczeniach. 20

22 Uzupełnij poniŝsze tabele: I II III SR 0 0A NQNO B[a]P Wyniki szczep TA98 StęŜenie X µg/płytkę 0,1 Data I II III Wyniki szczep TA100 StęŜenie X µg/płytkę 0,1 Data I II III SR - spontaniczne rewertanty 0 - kontrola negatywna 0A - kontrola negatywna z aktywacją (+S9) NQNO - kontrola pozytywna (mutagen bezpośredni) B[a]P - kontrola pozytywna (mutagen pośredni (+S9)) 21

23 W tabelach przedstaw wyniki testu Amesa (liczba rewertantów indukowanych) dla testowanych dawek badanych związków. Oblicz i uzupełnij wartości aktywności mutagennej (AM) dla poszczególnych stęŝeń badanych pochodnych. Tabela. Wartości liczby rewertantów indukowanych oraz aktywności mutagennej badanego związku. Testowany TA98 TA100 szczep Miara LRI AM LRI AM Dawka [µg/płytkę] 0 0, Tabela. Zakres wartości efektu mutagennego dla bakterii uŝywanych w teście Amesa. Szczepy: Efekt mutagenny TA98, TA100, AM Słaby Silny AM 2 Piśmiennictwo: Ames B. N., J. McCann, E. Yamasaki,1975. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research, 31,347. Łuczyński M.K., M. Góra, D. MielŜyńska, P. Brzuzan, S. Tejs, P. Pirogowicz, M. Łuczyński, Preliminary evaluation of mutagenic activity of two amino derivatives of cyclopenta[c]phenanthrene. Environmental Biotechnology 3, Maron D. M., B. N. Ames, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, 113, 173. MielŜyńska D., E. Siwińska, A. Bubak, Genotoksyczność 13 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w wybranych systemach in vitro, IMPiZŚ, Sosnowiec. Pirogowicz P., Ocena aktywności mutagennej dwóch amino pochodnych cyklopenta[c]fenantrenu metodą testu Amesa. Katedra Biotechnologii w Ochronie Środowiska, Wydział Ochrony Środowiska i Rybactwa, Uniwersytet Warmińsko- Mazurski w Olsztynie. Traczewska T. M., Biomonitoring mutagenności mikrozanieczyszczeń wody do picia, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej. 22

24 2. Diagnostyka molekularna: polimorfizm genów kodujących białka uczestniczące w metabolizmie ksenobiotyków 23

25 Rozdział 2. Diagnostyka molekularna: polimorfizm genów kodujących białka uczestniczące w metabolizmie ksenobiotyków Przykładami genów, w których określono korelację pomiędzy zmiennością budowy a zwiększonym ryzykiem wystąpienia chorób nowotworowych u człowieka są geny kodujące białka z grupy S-transferaz glutationowych (GST). Białka te są dobrze poznane pod względem budowy i funkcji. Cytozolowe oraz membranowe formy GST kodowane są przez dwie odmienne rodziny genów. Obecnie znanych jest osiem odrębnych klas cytozolowych enzymu GST, które oznaczono jako: Alfa (α), Kappa (κ), M (µ), Omega (ω), Pi (π), Sigma (σ), Theta (θ) oraz Zeta (ζ). Enzymy te katalizują sprzęganie zredukowanego glutationu (GSH) z róŝnymi ksenobiotykami mającymi elektrofilowy charakter. Na schemacie 1 przedstawiono przykładową reakcję katalizowaną przez enzym: O + GSH HO SG HO HO OH OH Enzymy klasy M (GSTM) biorą udział w detoksykacji róŝnorodnych elektrofilowych ksenobiotyków, a w szczególności ich reaktywnych metabolitów. Jednym z lepiej poznanych enzymów tej grupy jest GSTM 1. Białko to zbudowane jest z 217 aminokwasów i ma masę daltonów (Da). Głównym miejscem występowania S-transferazy glutationowej typu M jest cytozol komórek wątroby. Enzym ten pełni waŝną rolę w II fazie detoksykacji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA). U człowieka gen kodujący GSTM1 jest zlokalizowany razem z innymi genami kodującymi transferazy typu M na chromosomie 1p13.3 (rysunek poniŝej) i ma wielkość 5924 par zasad (pz). 24

26 Jak dotąd wyróŝniono dwa enzymy klasy θ (GSTT): GSTT1 i GSTT2. Enzym GSTT1 zbudowany jest z 239 aminokwasów (27204 Da). NajwyŜszą aktywność enzymatyczną tego enzymu stwierdza się w erytrocytach, komórkach wątroby i nabłonku płuc. Enzym bierze udział w dezaktywacji tlenku etylenu, epoksybutanów oraz halometanów. Uczestniczy tez w metabolizmie ksenobiotyków (II faza) w tym wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) występujących w dymie papierosowym. W genomie człowieka geny kodujące obie formy (GSTT1 i GSTT2) zlokalizowane są w odległości około pz od siebie i mają podobną strukturę; geny są skomponowane z pięciu eksonów, a ich sekwencje są rozdzielone intronami. Gen kodujący S-transferazę glutationową GSTT1 ma wielkość 8,092 pz i zmapowany został na chromosomie 22q Polimorfizm obu opisanych powyŝej genów polega na występowaniu dwu form (tak zwanych alleli). Produktem ekspresji allelu prawidłowego (GST+) jest funkcjonalne białko enzymatyczne. W allelu nieprawidłowym (GST-) występuje mutacja polegającą na delecji fragmentu sekwencji w obrębie jednego z eksonów kodujących białko produktem ekspresji tego genu jest białko które nie wykazuje aktywności enzymatycznej. Osoby, u których stwierdzono mutację w obrębie genów GSTM1 i GSTT1, co oznacza brak w organizmie obu form enzymów, są w większym stopniu naraŝone na wystąpienie róŝnych form nowotworów. Dane z wielu krajów wskazują, Ŝe znaczna część populacji moŝe być obciąŝona zmutowanymi genami transferazy glutationowej M. Przeprowadzone w Stanach Zjednoczonych Ameryki badania polimorfizmu genów GSTM1 wykazały, Ŝe 23-43% mieszkańców o rodowodzie afrykańskim ma allel GSTM1(-). W innych grupach frekwencje allelu GSTM1(-) miały następujące wartości: Azjaci 32-53, Latynosi 40-53, natomiast Europejczycy 35-62%. W Ameryce Południowej badania wykazały występowanie delecji na poziomie 21% u Chilijczyków, 55% u Brazylijczyków pochodzenia Kaukaskiego, 33% u czarnych Brazylijczyków i 20% u Indian Amazońskich. Spośród narodów europejskich delecję przenosi 46% Francuzów, 53 % Włochów, 44% Węgrów i 50% Słowaków. Stosunkowo wysoki poziom obecności w populacji uszkodzonego genu stwierdza się u 25

27 mieszkańców wysp Pacyfiku i Malezji, nawet do 100%. Badania z innych krajów azjatyckich wskazują, Ŝe średnio co drugi mieszkaniec Chin, Korei i Japonii ma delecję w genie GSTM1. Mutację polegającą na delecji fragmentu genu GSTT1 [GSTT1( -)] stwierdza się znacznie rzadziej niŝ delecję w genie GSTM1; 15-31% Amerykanów pochodzenia Europejskiego, 22-29% pochodzenia Afrykańskiego i 10-12% pochodzenia Hiszpańskiego jest nosicielami tej delecji. W Europie, 21% Włochów i 28% Słowaków przenosi zmutowaną kopię GSTT1. W Ameryce Południowej frekwencja zmutowanego genu jest niŝsza; allel GSTT1(-) stwierdza się u 19% Brazylijczyków o pochodzeniu Europejskim i Afrykańskim a tylko u 11% mieszkańców Amazonii. Natomiast w Azji stwierdza się najwyŝszy poziom mutacji genu GSTT1; 53% Chińczyków, 38% Malezyjczyków i 42-46% Koreańczyków jest nosicielami tej delecji. Ćwiczenie 2.1. Uzyskiwanie DNA genomowego Badanie polimorfizmu DNA wymaga uzyskania odpowiedniej jego ilości, stąd pierwszym etapem analizy jest izolacja DNA. Proces izolacji naleŝy przeprowadzać bardzo starannie. W diagnostyce ludzi i zwierząt (ssaków) jako źródło DNA genomowego wykorzystuje się najczęściej komórki krwi (głównie leukocyty). DNA genomowe uzyskuje się równieŝ z innych tkanek lub komórek: plemników komórek nabłonkowych wycinków tkanek, preparatów mikroskopowych naskórka włosów hodowli bakteryjnych ikry ryb 26

28 DNA moŝna izolować równieŝ z innych materiałów nie będących tkankami. moczu, kału, mleka, śliny osadu czynnego tak zwanych materiałów archiwalnych fragmentów kostnych ze stanowisk archeologicznych, zasuszonych łusek, preparatów zakonserwowanych w roztworach alkoholu lub formaldehydu Izolacja DNA polega na rozbiciu komórek i oddzieleniu DNA od związanych z nim struktur komórkowych, białek oraz RNA. Izolację DNA przeprowadza się w kilku etapach: 1. Liza komórek i jąder komórkowych - etap ten ma na celu uwolnienie ze struktur komórkowych jąder lub innych organelli komórkowych (mitochondriów lub plastydów) zawierających materiał genetyczny, a następnie zniszczenie błon komórkowych i uwolnienie DNA do roztworu. W zaleŝności od potrzeb stosuje się w tym celu czynnik fizyczny (szok termiczny lub osmotyczny), mechaniczny (rozcieranie) lub najczęściej chemiczny (lizostatyna, lizozym, detergenty: SDS, DTT, Tween, Triton X-100). W tym etapie izolacji stosuje się często enzym proteolityczny Proteinazę K. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe materiał z którego zamierzamy izolować DNA często wymaga wstępnego opracowania (płukanie w buforach, homogenizacja tkanek, odwirowanie niepoŝądanych frakcji itp.). 2. Ekstrakcja DNA ma na celu oddzielenie kwasów nukleinowych od białek. W klasycznej procedurze izolacji stosuje się do tego kolejno wytrząsanie z fenolem, chloroformem i alkoholem izoamylowym (Sambrook i wsp. 1989). 3. Precypitacja DNA - wytrącanie DNA, odbywa się najczęściej z uŝyciem roztworu izopropanolu albo etanolu w obecności octanu amonu, octanu potasu lub octanu sodu. W ostatnich latach popularne stały się gotowe zestawy do izolacji DNA oparte na złoŝach krzemionkowych lub jonowymiennych, w ich wypadku procedura izolacji jest skrócona nawet do 20 minut a otrzymane DNA charakteryzuje się duŝą czystością. Uzyskane DNA zawiesza się w wodzie wolnej od nukleaz lub buforach, na przykład TE (10 mm Tris- HCl, 1 mm EDTA ph 8.0), po czym określa jego czystość i ilość w roztworze. Zawiesinę DNA moŝna przechowywać w temperaturze pokojowej w czasie do 1 tygodnia, w lodówce (4-8 C) kilka miesięcy, a zamroŝone (-20 do -80 C) nawet przez lata. 27

29 Zadanie Uzyskiwanie DNA genomowego z cebulki włosa Przedstawiony poniŝej sposób uzyskiwania DNA naleŝy do dość nietypowych. Zaletą jest szybkość, prostota i dostępność materiału, a uzyskana ilość DNA jest wystarczającą do przeprowadzenia czterech reakcji PCR. Wykonanie 1. Pojedyncze włosy wraz z cebulkami umieszczamy w probówkach PCR 0.2 ml jak na rysunku poniŝej. 2. Umieszczamy w probówce bufor do lizy (objętości 20 µl na 1 próbę) o składzie: Proteinaza K ( U/ml) 1 µl Bufor PCR (ph 8.0) 2 µl wolna od nukleaz H 2 O 17 µl 3. Reakcje trawienia przeprowadzamy w termocyklerze przy następującym profilu termicznym: 65 C, 90 min trawienie 85 C, 15 min inaktywacja enzymu 4 C schłodzenie produktu reakcji 28

30 Zadanie Uzyskiwanie DNA z krwi obwodowej za pomocą zestawu odczynników Pronto (Izrael) W ofercie większości firm biotechnologicznych są gotowe zestawy odczynników do izolacji DNA/RNA (tak zwanych kitów). Zaletami tego typu zestawów jest prostota i oszczędność czasu oraz duŝa powtarzalność gwarantowana przez producenta. Kity są najczęściej dostosowane do konkretnego rodzaju materiału na przykład krwi ludzkiej albo śliny, niekiedy jednak mają szeroki zakres stosowania. Wykorzystany w tym zadaniu zestaw został stworzony z myślą o izolacji DNA z krwi obwodowej człowieka. Wykonanie 1. Krew w probówkach z EDTA naleŝy wstrząsać przez 15 min. 2. W probówce zmieszać 200 µl krwi z 600 µl roztworu A, krótko wstrząsnąć. Wirować 20 sekund z prędkością obr/min. 3. Wylać płyn uwaŝając, aby nie pozbyć się płytki osadu z dna probówki. 4. Rozpuścić płytkę przez pipetowanie w 100 µl roztworu A, następnie dodać 500 µl roztworu A, krótko wstrząsnąć. Wirować 20 sekund z prędkością obr/min. 5. OstroŜnie wylać płyn bez wzruszania płytki osadu. 6. Powtórzyć krok 4 i Przygotować roztwór B przez zmieszanie roztworu B1 i B2 w ilości odpowiednio 45 µl i 5 µl na próbkę. 8. Przy uŝyciu pipety rozetrzeć płytkę w 50 µl świeŝo przygotowanego roztworu B. 9. Inkubować w 65 C przez 1 godzinę. Po inkubacji krótko zwirować. 10. Przekłuć wieczko probówki, inkubować 10 minut w 95 C. Po inkubacji krótko zwirować. 11. Przenieść roztwór DNA do nowej probówki. 29

31 Zadanie Ocena jakościowa i ilościowa wyizolowanego DNA za pomocą spektrofotometru Przy spektrometrycznej ocenie ilości DNA wykorzystuje się właściwość budujących kwasy nukleinowe zasad azotowych, które absorbują światło o długości 260 nm. Zawartość DNA w roztworze wody liczy się ze wzoru: A 260 x 50 x R = ilość DNA µg/ml gdzie: 50 stała wynikająca z tego, Ŝe 1 jednostka absorbancji równa jest 50 µg dupleksu DNA R rozcieńczenie Czystość wyizolowanego DNA (zawartość białek) ocenia się korzystając z właściwości białek, które wykazują maksimum absorbancji dla światła o długości fali 280 nm. Czystość wylicza się ze wzoru: A 260 /A 280 = czystość DNA wynik: =1,8 oznacza 100% czystości preparatu <1,8 oznacza obecność w preparacie białek Wykonanie 1. Ustawić spektrofotometr na pomiar dwuniciowego DNA w µg/µl przy współczynniku rozcieńczenia 20. Filtr 260 nm. 2. Do kuwety pomiarowej dodać 70 µl wody redestylowanej, umieścić kuwetę wewnątrz komory pomiarowej, wyzerować spektrometr ( Reference ), wyjąć kuwetę i usunąć z niej wodę pipetą. 3. Do probówki 1,5 ml typu Eppendorf dodać 66,5 µl wody redestylowanej oraz 3,5 µl zawiesiny DNA µl zawiesiny z punktu 3 delikatnie nanieść do kuwety i dokonać pomiaru zawartości ( Test ). 5. Usunąć kuwetę, przemyć tryskawką, zostawić do wyschnięcia na ręczniku papierowym. 30

32 Zadanie Ocena jakościowa wyizolowanego DNA za pomocą rozdziału w Ŝelu agarozowym Zawartość białka nie jest jedynym czynnikiem opisującym jakość wyizolowanego DNA. Matryca DNA moŝe zostać uszkodzona na skutek nieprawidłowego lub zbyt długiego przechowywania prób a takŝe samej procedury izolacji. W przypadku wątpliwości niezbędna staje się ocena wizualna preparatu, której dokonać moŝna poprzez rozdział elektroforetyczny w Ŝelu agarozowym w obecności bromku etydyny (barwnik wykazujący powinowactwo do dwuniciowej cząsteczki DNA, fluoryzujący w świetle o długości fali 302 nm). Pośrednio, moŝna teŝ poprzez porównanie z próbką o znanej zawartości DNA, określić ilość DNA w badanej próbie mierząc róŝnice w intensywności fluorescencji. Stosuje się do tego specjalistyczne oprogramowanie do analizy obrazu. Wykonanie!!!Uwaga!!! Wykorzystywany w poniŝszej procedurze bromek etydyny ma silne działanie toksyczne i mutagenne! Promieniowanie UV jest szkodliwe dla wzroku - na włączony transiluminator moŝna patrzeć tylko przez maskę lub szybę! 1. Przygotować formę do wylania Ŝelu agarozowego i umieścić ją w zacisku. 2. Odmierzyć agarozę NMP odpowiednio do uzyskania zamierzonego stęŝenia Ŝelu. W celu uzyskania 50 ml 1,5% Ŝelu naleŝy odmierzyć 0,75 g agarozy. 3. Wlać do kolby odpowiednią ilość buforu TBE (Tris, kwas borny, EDTA, ph 8,5). 4. Zawartość kolby podgrzewać ostroŝnie, mieszając, w kuchence mikrofalowej do momentu uzyskania jednorodnego płynu (bez bąbelków i fragmentów nierozpuszczonej agarozy). 5. Dodać roztworu 10 µl bromku etydyny (EtBr, 1 mg/ml). Delikatnie wymieszać i pozostawić na kilka minut. 6. Powoli, tak aby nie powstały bąble powietrza, wlać odpowiednią objętość agarozy do formy. śel powinien mieć wysokość 5-8 mm. 7. Umieścić grzebień w Ŝelu. 8. Po zastygnięciu (ok. 10 min.) moŝna delikatnie wyciągnąć grzebień z Ŝelu i wyjąć formę z zacisków. 9. Umieścić formę z Ŝelem w aparacie do elektroforezy. śel powinien się znajdować pod powierzchnią buforu, jednak najlepiej nie głębiej niŝ 1-2mm. 10. Przygotować zawiesinę matrycy DNA. Na kawałek parafilmu nanieść bufor obciąŝający (SBX) po około 1,5-3,0 µl w tylu punktach ile prób zamierzamy rozdzielać. Dodać kolejno wyizolowane DNA w ilości 6-10 µl i wymieszać przez pipetowanie. Uwaga! Nie zanurzać tej samej pipety w róŝnych probówkach! 11. Nanieść DNA z buforem do studzienek w Ŝelu. 12. Ustawić aparat na V, czas rozdziału min. 13. Po rozdziale Ŝel wyjąć ostroŝnie z aparatu i umieścić na transiluminatorze. 14. Wykonać zdjęcie w świetle UV. 31

33 Ćwiczenie 2.2. Amplifikacja genów GSTM1 i GSTT1 z wykorzystaniem metody AS- PCR (Vanden Heuvel, 1998) Jednym z przełomowych wynalazków, dzięki którym nastąpił w ostatnich latach szybki rozwój biologii molekularnej jest łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), wykorzystującej jedno z najpowszechniejszych w przyrodzie zjawisk replikację DNA. Proces ten moŝna przeprowadzić in vitro powielając (amplifikując) określony odcinek DNA (lub RNA) przez wielokrotne poddawanie mieszaniny enzymów i substratów reakcji zmieniającej się cyklicznie temperaturze, zgodnie z 3-częściowym profilem: 1. Denaturacja matrycy (94-98 C, sek.) 2. Przyłączanie starterów w określonym miejscu matrycy 3. (40-70 C, sek.) 4. Elongacja na ograniczonych starterami odcinkach matrycy nowych nici przez termostabilną polimerazę DNA (72 C, 5-60 sek.). Na ćwiczeniach zostanie zaprezentowana animacja przebiegu reakcji PCR. Mieszanina reakcyjna składa się z 6 podstawowych składników: 1. Matrycy DNA- próbki DNA uzyskanej w wyniku izolacji (patrz Ćwiczenie 1.1). 2. Starterów reakcji PCR - krótkich (do 40 pz), sztucznie syntezowanych odcinków jednoniciowego DNA, komplementarnych do obu końców badanego fragmentu matrycy. 3. Polimerazy DNA - najczęściej Polimerazy DNA Taq która katalizuje reakcję syntezy nowej nici DNA. 4. Trifosforanów deoksynukleozydów (datp, dctp, dgtp, dttp) - wysokoenergetycznych nukleotydów stanowiących cegiełki słuŝące do budowy nowych łańcuchów DNA. 5. Buforu reakcji PCR - zapewniającego odpowiednie środowisko dla działania polimerazy DNA i przyłączania starterów. 6. Jonów metali dwuwartościowych najczęściej Mg 2+, katalizujących działanie polimerazy DNA. 32

34 Znanych jest wiele modyfikacji metody PCR, jedną z nich jest AS-PCR (ang. Allele Specific PCR). ZałoŜeniem tej metody jest wykrywanie w genomie osobnika obecności lub braku jednego z alleli. Uzyskuje się to przez takie zaprojektowanie starterów reakcji, aby miejsce róŝnicujące oba allele znalazło się w obrębie sekwencji komplementarnej przynajmniej do jednego z pary starterów - w takim przypadku amplifikacja nie powiedzie się. Czasem jednak reakcja PCR nie zachodzi z powodu złej jakości matrycy DNA, co moŝe być mylnie zinterpretowane jako brak odpowiedniego allelu genu. Dlatego w praktyce amplifikuje się dodatkowy odcinek DNA marker jakości matrycy DNA (szczegóły w zadaniach poniŝej). Zadanie Detekcja polimorfizmu genów GSTM1 i GSTT1 W zadaniu poddane zostaną analizie polimorfizmu jednocześnie 2 loci genetyczne GSTM1 i GSTT1 (Chen i in. 1997). Technika, w której stosuje się jednocześnie (w jednej probówce) kilka par starterów do powielenia kilku specyficznych fragmentów DNA nosi nazwę multiplex PCR. Jako marker jakości matrycy DNA zastosowano locus β-globina produkt amplifikacji PCR tego locus powinien być obecny we wszystkich próbach. Rysunek 4 przedstawia miejsca przyłączania starterów reakcji PCR do matrycy DNA oraz wzory prąŝków powstałych po rozdziale elektroforetycznym produktów PCR uzyskanych od 8 pacjentów (zdjęcie). Pacjenci 2, 4 i 8 mają obie kopie genów (zapisujemy to GSTT1+ oraz GSTM1+), u pacjentów 1, 5 i 7 stwierdza się tylko allel genu GSTT1 (GSTT1+ i GSTM1-), natomiast u pacjenta 3 tylko allel GSTM1 (GSTT1- i GSTM1+). Pacjent numer 6 nie ma obu alleli (GSTT1- i GSTM1-). M oznacza wzorzec masowy DNA. 33

35 Rysunek 4. Schemat amplifikacji PCR fragmentów genów GSTM1 i GSTT1 (Chen i in. 1997). Szczegóły metodyczne w tekście. Wykonanie 1. W probówce 0,5 ml wykonaj mieszaninę reakcyjną o następującym składzie (objętość końcowa jednej próby wraz z matrycą 20 µl): Bufor reakcyjny PCR z MgCl2 2 µl Mieszanina dntp (10 mm) 1 µl starter GSTM1 F 0,5 µl starter GSTM1 R 0,5 µl starter GSTT1 F 0,5 µl starter GSTT1 R 0,5 µl starter β-globina F 0,5 µl staretr β-globina R 0,5 µl Polimeraza Taq 0,5 U Woda wolna od nukleaz - do uzyskania odpowiedniej objętości (dodaj 5% na straty podczas przenoszenia) 2. Rozdzielić mieszaninę do probówek PCR 0,2 ml. 3. Dodać matryce w ilości 5 µl. Pozostawić próbę kontrolną. 4. Wstawić próby do termocyklera zaprogramowanego na następujący profil: 94 C, 4 min. wstępna denaturacja matrycy 94 C, 10 sek. denaturacja 62 C - 30 sek. przyłączanie starterów 72 C - 45 sek elongacja 72 C 4 min. końcowa elongacja 4 C schłodzenie produktu reakcji x Po schłodzeniu próby wykonać rozdział elektroforetyczny i zdjęcie jak w zadaniu

36 Zadanie Obliczanie frekwencji genów GSTT1 i GSTM1 w grupie studentów Wykonanie 1. Analizując obrazy Ŝeli agarozowych z zadania uzupełnij tabelę. Lp. GSTM1+ GSTT1+ Suma Frekwencja F [%] 35

37 Frekwencję allelu obliczamy ze wzoru: F GST [%] = n GST 100 N gdzie: F gst [%] frekwencja danego allelu GST w % n gst liczba osobników z danym allelem GST N całkowita liczba przebadanych 2. Korzystając z danych w tabeli oblicz frekwencję alleli GSTM1- oraz GSTT1- w badanej grupie studentów 3 roku ochrony środowiska. 3. Oblicz frekwencję kaŝdego z moŝliwych do otrzymania w badaniu genotypów (GSTM1+/GSTT1+, GSTM1-/GSTT1+, GSTM1+/GSTT1- oraz GSTM1-/GSTT1-). 4. Jakie zalecenia moŝna dać osobie, u której badanie dało negatywny wynik w obu loci? Piśmiennictwo: Chen, C-L., Liu, Q., Pui, C-H., Rivera, G.K., Sandlund, J.T., Ribeiro, R., Evans, W.E., Relling, M.V Higher frequency of Glutathione S-transferase deletions in black children, with acute lymphoblastic leukemia. Blood, 89 (5): Łuczyński, M., Brzuzan, P., Jankun, M Genetyka ryb. Zeszyt 1, Wyd. IRS, s. 76. Sambrook, J., Fritsch, E.,F., Maniatis, T Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. Vanden Heuvel, J.,P PCR protocols in molecular toxicology. CRC Press, New York. 36

38 3. Ekspresja genów pod wpływem toksycznych substancji chemicznych 37

39 Rozdział 3. chemicznych Ekspresja genów pod wpływem toksycznych substancji Wiele ksenobiotyków wywołuje zmiany aktywności genów na drodze aktywacji specyficznych czynników transkrypcyjnych wewnątrzkomórkowych białek receptorowych. Takie zróŝnicowane wyraŝanie się genów via receptor w odpowiedzi na określony czynnik chemiczny moŝe mieć charakter adaptacji (na przykład indukcja monooksygenaz metabolizujących określony ksenobiotyk), ale moŝe prowadzić takŝe do efektów toksycznych. Wiele róŝnych związków chemicznych moŝe indukować ekspresję genów, wśród nich do najgroźniejszych naleŝą wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) oraz dioksyny, a zarazem najbardziej rozpowszechnione zanieczyszczenia występujące w środowisku. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne indukują ekspresję genów kodujących polipeptydy hemoproteidu, cytochromu P450, a w większości zbadanych przypadków mediatorem molekularnym ekspresji jest receptor węglowodorów aromatycznych AhR (Rys. 5). System detoksykacji z udziałem cytochromu P450 jest dobrze poznany, a jego obecność stwierdza się u bakterii, roślin i zwierząt. Aktywność enzymatyczną cytochromu P450 łączy się między innymi z metabolizmem steroidów, prostaglandyn oraz niektórych ksenobiotyków (Nelson i in. 1996). Cytochrom P450, występuje w wielu róŝnych formach, które mają odmienne, ale zachodzące na siebie specyficzności substratowe, a do najlepiej zbadanych naleŝą formy cytochromu P4501A, CYP1A (Stegeman i in. 2001). Mechanizm indukcji genu CYP1A1, kodującego CYP1A, został dokładnie poznany u wielu gatunków ryb w tym u pstrąga tęczowego, Oncorhynchus mykiss (Cao i in 2000). CYP1A1 ulega ekspresji w obecności takich ksenobiotyków jak WWA, PCB, dioksyny, furany po wcześniejszym związaniu z receptorem Ah; pojawienie się większej ilości cytochromu P450 prowadzi do szybszej biotransformacji. W normalnych warunkach ma to znaczenie obronne i umoŝliwia szybsze pozbycie się ksenobiotyku, który wywołał indukcję. PoniewaŜ ekspresja CYP1A następuje w odpowiedzi na pojawienie się rozmaitych ksenobiotyków, badanie poziomu P450 w tkankach umoŝliwia określenie naraŝenia populacji na zanieczyszczenie ich środowiska. Przypuszcza się, Ŝe u osobników z podwyŝszonym poziomem P4501A moŝe być większy stopień uszkodzeń DNA spowodowany kancerogenami i mutagenami środowiskowymi; benzo[a]piren i inne WWA są aktywowane przez indukowaną formę P4501A, co determinuje albo nasila ich mutagenne bądź teŝ rakotwórcze 38

40 działanie (Burczynski i Pennig 2000). Prawidłowy szlak metaboliczny, będący mechanizmem obronnym organizmu wobec obecności WWA prowadzi poprzez utlenianie K-regionu cząsteczki (Jerina i Daly 1974) (Schemat 2). Metabolity takie charakteryzują się w większości przypadków niŝszą toksycznością i są łatwiejsze do usunięcia z organizmu. W przypadku węglowodorów posiadających tak zwany bay region lub fjord region istnieje moŝliwość błędu we wspomnianym mechanizmie obronnym, co prowadzi do utleniania niewłaściwego pierścienia aromatycznego cząsteczki. Powstające w ten sposób epoksydiole, posiadające pierścień epoksydowy w bay region molekuły charakteryzują się właściwościami mutagennymi, wynikającymi z ich zdolności do łączenia się z DNA (Schemat 2). Rysunek 5. Uproszczony model regulacji ekspresji genetycznej przez receptor węglowodorów arylowych AhR u ssaków. W większości komórek AhR występuje jako nieaktywny kompleks z białkami opiekuńczymi typu HSP90 (HSP90 chaperon) oraz białkiem fuzyjnym XAP2 (XAP2 fusion protein). Po przyłączeniu się ligandu molekularnego (np. dioksyny lub WWA) kompleks wędruje do jądra komórkowego. W regulacji ekspresji genetycznej uczestniczy dimer złoŝony z AhR oraz jądrowego białka translokującego (ARNT; ang. AhR nuclear translocator). Dimer ten rozpoznaje w DNA specyficzne motywy sekwencji XRE (ang. xenobiotic response elements) w miejscu promotorowym genów tak zwanej baterii genetycznej Ah (naleŝą do niej równieŝ geny CYP1A) i daje sygnał do rozpoczęcia procesu transkrypcji. Jeszcze do niedawna, pomiar stopnia indukcji cytochromu P4501A u ryb wymagał zastosowania technik hybrydyzacyjnych (Southern i Western blotting), testów z immunosorbentami (ELISA), albo testów aktywności enzymatycznej O-deetylazy 39