TrueScience RespiFinder Identification Panels

Transkrypt

1 TrueScience RespiFinder Identification Panels SKRÓCONA INSTRUKCJA OBSŁUGI Informacje dotyczące bezpieczeństwa i zagrożenia biologicznego można znaleźć w części Safety w dokumencie TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Informacje dotyczące ostrzeżeń i środków ostrożności można znaleźć w dokumencie TrueScience RespiFinder Identification Panels Product Insert (PN ). W przypadku substancji chemicznych należy zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyk (SDS) i posługiwać się nimi w określony sposób. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, okulary i rękawice. Więcej informacji dotyczących paneli identyfikacyjnych TrueScience RespiFinder Identification Panels znajduje się na stronie Aby pobrać podręcznik użytkownika TrueScience RespiFinder Identification Panels, należy wejść na stronę i wybrać zakładkę Literature/Support. Skrócona instrukcja obsługi omawia następujące zagadnienia: Panele Opis i zasady działania produktu Przeznaczenie Obsługa techniczna Przed rozpoczęciem: procedury jednorazowe Procedura Panele Skrócona instrukcja obsługi dotyczy następujących paneli identyfikacyjnych TrueScience RespiFinder Identification Panels: Panel Przechow ywanie TrueScience RespiFinder 15 Viral Identification Panel 50 testów TrueScience RespiFinder 19 Pathogen Identification Panel 50 testów Opis i zasady działania produktu Panele identyfikacyjne TrueScience RespiFinder Identification Panels wykorzystują multipleksową reakcję PCR do wykrywania i różnicowania patogenów, które mogą wywołać zapalenie dróg oddechowych. Badanie TrueScience RespiFinder Identification Panels składa się z etapów: odwrotnej transkrypcji-pcr (RT-PCR) (aby przepisać wirusowe RNA na cdna i zaimplikować docelowe DNA/cDNA), hybrydyzacji sondy i ligacji/amplifikacji sondy. Do badania dołączona jest wewnętrzna kontrola amplifikacji (Internal Amplification Control, IAC) w celu rozróżnienia próbek prawdziwie negatywnych i fałszywie negatywnych, powstałych na skutek degradacji kwasu nukleinowego, hamowania reakcji PCR lub błędów podczas postępowania z próbkami. Wyniki są uzyskiwane poprzez analizę wielkości fragmentów DNA za pomocą elektroforezy kapilarnej. Więcej informacji zawiera dokument TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Panel Wykryte patogeny Liczba docelowych zestawów sond Zakres rozmiarów sond TrueScience RespiFinder 15 Viral Identification Panel TrueScience RespiFinder 19 Pathogen Identification Panel 14 wirusów RNA i 1 wirus DNA 15 plus IAC od 163 do 498 nukleotydów 14 wirusów RNA, 1 wirus DNA i 4 bakterie 19 plus IAC Przeznaczenie Testy TrueScience RespiFinder Identification Panels są jakościowymi, wieloparametrowymi testami, przeznaczonymi do równoczesnego wykrywania i identyfikacji najczęściej występujących patogenów oddechowych w oczyszczonych kwasach nukleinowych.

2 Próbka wejściowa to kwas nukleinowy wyodrębniony i oczyszczony z wymazów nosowo-gardłowych, aspiratów z nosa, plwociny i płukań oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL), pobrana od pacjentów z podejrzeniem zapalenia dróg oddechowych. Przygotowanie próbek klinicznych nie wchodzi w zakres analizy paneli. Należy używać odpowiednich metod lub produktów podczas obchodzenia się z próbkami oraz ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych. Panele TrueScience RespiFinder Identification Panels w połączeniu z wynikami klinicznymi i laboratoryjnymi pomagają w diagnozowaniu zapalenia dróg oddechowych. Wyniki negatywne nie są jednoznaczne z brakiem wirusowego lub bakteryjnego zapalenia dróg oddechowych; wyniki negatywne nie powinny stanowić jedynej podstawy diagnozy, terapii lub innych decyzji dotyczących leczenia. Wyniki pozytywne nie wykluczają równoczesnego zakażenia innymi patogenami. Wykryte patogeny nie stanowią pewnej przyczyny choroby. Ostateczna diagnoza musi być oparta o inne badania laboratoryjne i ocenę prezentacji klinicznej. Charakterystyki wydajności zostały ustalone zgodnie z zatwierdzonymi panelami EQA dostępnymi na stronie Produkt powinien być używany przez wykwalifikowanych laborantów i jest przeznaczony do użycia z określonymi urządzeniami i oprogramowaniem do analizy danych firmy Life Technologies. Obsługa techniczna Informacje na temat najnowszych usług i obsługi technicznej dla wszystkich lokalizacji można znaleźć na stronie w zakładce Support lub należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem firmy Life Technologies. Przed rozpoczęciem: procedury jednorazowe Przygotowanie miejsc pracy Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy wykonywać czynności eksperymentalne w wydzielonych miejscach. Więcej informacji zawiera dokument TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Programowanie termocyklera Należy zaprogramować termocykler dla trzech programów: 1. Program odwrotnej transkrypcji i reakcji PCR 2. Program hybrydyzacji sondy 3. Program ligacji i reakcji PCR Etap Temp Czas (mm:ss) Etap Temp Czas (mm:ss) Etap Temp Czas (mm:ss) Odwrotna transkrypcja Aktywacja hot-start Taq Cykliczność: 30 cykli 50 C 30:00 Denaturyzacja DNA 95 C 15:00 Hybrydyzacja sondy 98 C 10:00 Ligacja sondy 54 C 15:00 60 C 60:00 Wstępna denaturyzacja 95 C 2:00 94 C 00:30 Zatrzymanie 60 C Przejście Cykliczność: 94 C 0:30 55 C 00:30 bezpośrednio do 33 cykle 60 C 0:30 72 C 01:00 następnego 72 C 1:00 etapu Zatrzymanie 20 C Przejście bezpośrednio do elektroforezy kapilarnej lub przechowywania Zatrzymanie 20 C Przejście bezpośrednio do następnego etapu lub przechowywania Przechowywać w temperaturze 4 C przez 1 tydzień lub w temperaturze 20 C przez dłuższy czas. Konfiguracja oprogramowania do pobierania danych Przed pierwszym użyciem paneli TrueScience RespiFinder Identification Panels należy skonfigurować oprogramowanie 3130/3130xl Data Collection Software v3.0, v3.1 lub 3500 Data Collection Software v1.0. Więcej informacji na ten temat znajduje się w podręczniku użytkownika TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN ). Aby go pobrać, należy wejść na stronę i wybrać zakładkę Literature/Support. 2

3 Procedura 1 Ekstrakcja kwasów nukleinowych i dodawanie wewnętrznej kontroli amplifikacji (Internal Amplification Control, IAC) do poddanych lizie próbek a. Należy pobrać próbki kliniczne. Więcej informacji na ten temat zawiera dokument TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). b. (Zalecane) Należy wstępnie przeanalizować próbki pod kątem lepkości i zawartości stałych elementów komórkowych. Więcej informacji na ten temat zawiera dokument TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). c. Należy wyodrębnić kwasy nukleinowe (RNA i DNA), używając odpowiedniej metody ekstrakcji i postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Więcej informacji na temat zatwierdzonych metod ekstrakcji zawiera dokument TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). W przypadku większości metod ekstrakcji zaleca się używać 200 µl materiału próbkowego i eluować w 100 µl buforu. d. Po inkubacji buforu lizującego, do próbki należy dodać wewnętrzną kontrolę amplifikacji (Internal Amplification Control, IAC), a następnie dobrze wymieszać. Należy dodać 5 µl wewnętrznej kontroli amplifikacji IAC na każde 100 µl buforu elucyjnego. WAŻNE! W przypadku wszystkich protokołów ekstrakcji, kontrolę IAC należy dodać po zakończeniu inkubacji buforu lizującego do próbki. Jeśli kontrola IAC zostanie dodana do mieszanki próbki/buforu lizującego przed ukończeniem inkubacji, RNazy i DNazy w próbce mogą rozłożyć kontrolę IAC, powodując fałszywie negatywne wyniki. Bufor lizujący hamuje RNazy i DNazy oraz zapobiega degradacji kontroli IAC. 2 Przygotowanie i pipetowanie mieszanki RT/PCR Mix a. Następujące elementy należy rozmrozić, a następnie umieścić w lodzie: Wzornik kwasu nukleinowego (RNA i DNA) Pre-Amplification Primer Mix Dilution Buffer dntp Mix 5 RT-PCR Buffer b. Należy przygotować ilość mieszanki RT/PCR Mix odpowiednią do ilości próbek poddawanych analizie oraz dodatkową ilość uwzględniając straty podczas pipetowania. Podczas przygotowywania mieszanki należy przestrzegać poniższych zasad postępowania zodczynnikami: W przypadku mieszanki RT-PCR Enzyme Mix: należy wyjąć mieszankę z miejsca przechowywania bezpośrednio przed pipetowaniem. Mieszankę należy odwirować przez 5 sekund, a następnie wymieszać poprzez delikatne pipetowanie w górę i dół. Podczas obchodzenia się z mieszanką należy używać niskoretencyjnych końcówek do pipet. Bezpośrednio po użyciu należy umieścić mieszankę w miejscu przechowywania. W przypadku wszystkich innych odczynników i wzorników kwasu nukleinowego: bezpośrednio przed użyciem probówki należy zmieszać i przez chwilę odwirować. Składniki mieszanki RT/PCR Mix Objętość na reakcję Dilution Buffer 5,5 µl 5 RT-PCR Buffer 5,0 µl Pre-Amplification Primer Mix 2,5 µl dntp Mix 1,0 µl RT-PCR Enzyme Mix 1,0 μl Całkowita objętość mieszanki RT/PCR 15 µl Mix na reakcję c. RT/PCR Mix należy przez chwilę mieszać, wydzielić 15 µl do 0,2-ml probówek PCR, a następnie zamknąć probówki. Należy umieścić probówki PCR w lodzie. 3

4 3 Przygotowanie i pipetowanie mieszanki Probe Hybridization Mix a. Należy rozmrozić bufory Dilution Buffer, Hybridization Buffer i mieszankę Probe Mix, a następnie umieścić je w lodzie. b. Należy przygotować odpowiednią ilość mieszanki Probe Hybridization Mix do ilości próbek poddawanych analizie oraz dodatkową ilość uwzględniając straty podczas pipetowania. Uwaga: Bezpośrednio przez użyciem każdy odczynnik należy zmieszać i przez chwilę odwirować. Składniki mieszanki Probe Hybridization Mix Objętość na reakcję Dilution Buffer 3,0 µl Hybridization Buffer 1,5 µl Probe Mix 1,5 µl Całkowita objętość mieszanki Probe Hybridization Mix na reakcję 6,0 µl c. Za pomocą pipety należy dodać 6 µl mieszanki Probe Hybridization Mix do nowych 0,2-ml probówek PCR, po czym zamknąć probówki i umieścić probówki PCR w temperaturze 4 C aż do ponownego użycia. 4 Konfiguracja i uruchamianie odwrotnej transkrypcji ireakcji PCR a. Do każdej probówki PCR zawierającej 15 µl mieszanki RT/PCR Mix należy dodać 10 µl wzornika kwasu nukleinowego. Należy dobrze wymieszać składniki, delikatnie pipetując w górę i dół, a następnie przez chwilę odwirować. Należy umieścić probówki PCR w lodzie do momentu podgrzania termocyklera. Uwaga: Jeśli wewnętrzne procedury laboratorium wymagają przeprowadzenia kontroli negatywnej, należy dodać 0,25 µl kontroli Internal Amplification Control do 10 µl wody wolnej od DNaz/RNaz, a następnie dodać tę mieszankę do probówki PCR zawierającej 15 µl mieszanki RT/PCR Mix. b. Należy rozpocząć program odwrotnej transkrypcji/pcr w termocyklerze. Gdy temperatura wzrośnie do 50 C, umieścić probówki PCR w termocyklerze. 5 Konfiguracja i uruchamianie hybrydyzacji sondy a. Do każdej mieszaniny reakcyjnej odwrotnej transkrypcji/pcr należy dodać 100 µl sterylnej wody (nie wchodzi w skład zestawu), a następnie dobrze wymieszać poprzez delikatne pipetowanie. b. Dodać 2 µl rozcieńczonej mieszaniny reakcyjnej odwrotnej transkrypcji/pcr do każdej probówki, która zawiera 6 µl mieszanki Probe Hybridization Mix, a następnie przez chwilę odwirować. c. Umieścić probówki PCR w termocyklerze, a następnie uruchomić program hybrydyzacji sondy. WAŻNE! Mieszankę TwoStep Mix należy przygotować w ciągu ostatnich 60 minut hybrydyzacji sondy. Po zakończeniu hybrydyzacji sondy uruchomić proces ligacji i reakcję PCR. Umieścić probówki PCR w termocyklerze w temperaturze 60 C aż do momentu kontynuacji procesu ligacji i uruchomienia reakcji PCR. 6 (Podczas hybrydyzacji sondy) Przygotowanie mieszanki TwoStep Mix Mieszankę TwoStep Mix należy przygotować w ciągu ostatnich 60 minut hybrydyzacji sondy: a. Rozmrozić bufor TwoStep Buffer, a następnie umieścić go w lodzie. b. Przygotować ilość mieszanki TwoStep Mix odpowiednią do ilości próbek poddawanych analizie oraz dodatkową ilość uwzględniając straty podczas pipetowania. Do momentu użycia mieszankę należy umieścić w lodzie. Podczas przygotowywania mieszanki należy przestrzegać poniższych zasad postępowania z odczynnikami: W przypadku enzymów Ligase Enzyme i Taq Polymerase: należy wyjąć każdy odczynnik z miejsca przechowywania bezpośrednio przed pipetowaniem. Należy odwirować każdy odczynnik przez 5 sekund, a następnie każdy z nich wymieszać poprzez delikatne pipetowanie w górę i dół. Podczas postępowania z odczynnikami należy używać końcówek niskoretencyjnych. Bezpośrednio po użyciu odczynniki należy odstawić w miejsce przechowywania. 4

5 Przed pipetowaniem bufor TwoStep Buffer należy zmieszać i przez chwilę odwirować. Składniki mieszanki TwoStep Mix Objętość na reakcję 7 (Bezpośrednio po hybrydyzacji sondy) Ustawianie i uruchamianie ligacji ireakcji PCR TwoStep Buffer 30,6 µl Ligase Enzyme 1,0 µl Taq Polymerase 0,4 µl Całkowita objętość mieszanki TwoStep Mix 32,0 µl na reakcję Bezpośrednio po uruchomieniu hybrydyzacji sondy: a. Bezpośrednio po zatrzymaniu programu hybrydyzacji sondy należy uruchomić program ligacji ipcr. b. Kiedy temperatura w termocyklerze osiągnie 54 C, nacisnąć klawisz Pause, aby utrzymać w termocyklerze stałą temperaturę 54 C. c. Przygotować reakcje hybrydyzacji sondy do ligacji i PCR: 1. Usunąć mieszaniny reakcyjne hybrydyzacji sondy z termocyklera. 2. Należy dodać 32 µl mieszanki TwoStep Mix do każdej 8 µl hybrydyzacji sondy. 3. Należy umieścić probówki z powrotem w termocyklerze. Uwaga: Jeśli przeprowadzana jest duża ilość reakcji, należy wykonać ten etap 7c partiami. Na przykład: używając taśm po 8 probówek, należy usunąć 8 mieszanin reakcyjnych, dodać mieszankę TwoStep Mix, a następnie wymienić probówki w termocyklerze przed usunięciem następnych 8 reakcji. d. Należy ponownie uruchomić zatrzymany program ligacji i PCR. 8 Przeprowadzanie elektroforezy kapilarnej a. Należy połączyć standard wielkości, formamid i produkt reakcji PCR: 1. Połączyć niniejsze produkty i dokładnie wymieszać. Przygotować ilość odpowiednią do ilości próbek poddawanych analizie oraz dodatkową ilość uwzględniając straty podczas pipetowania. Składniki mieszanki Size Standard Mix Objętość na mieszankę reakcyjną (produkt reakcji PCR lub reference marker) GeneScan 600 LIZ Size Standard (PN ) 0,5 µl Hi-Di Formamide (PN ) 10,0 µl Całkowita objętość mieszanki Size Standard Mix na reakcję 10,5 µl 2. W mikropłytce 96-dołkowej, za pomocą pipety dodać 10,5 µl mieszanki Size Standard Mix do każdego wymaganego dołka. 3. (Zalecane) Dodać pipetą 1 µl markera referencyjnego Reference Marker (FAM ) do jednego z dołków zawierających mieszankę Size Standard Mix. Wymieszać za pomocą pipety. 4. Dla każdej próbki produktu reakcji PCR: Rozcieńczyć 5 µl próbki produktu reakcji PCR w 45 µl wody dejonizowanej. Dodać pipetą 1 µl rozcieńczonej próbki produktu reakcji PCR do dołka zawierającego mieszankę Size Standard Mix, a następnie wymieszać za pomocą pipety. 5

6 Uwaga: W pewnych przypadkach (na przykład przy dużej zawartości wirusów) konieczne może być większe rozcieńczenie produktu reakcji PCR, aby uniknąć wyników maksymalnych znajdujących się poza skalą. Więcej informacji znajduje się w dokumencie TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol. 5. Mikropłytkę szczelnie zamknąć odpowiednią pokrywą. b. Wykonać analizę mikropłytki z próbkami: 1. Odwirować mikropłytkę przy 1000 g przez 10 sekund, aby płyn spłynął na dno dołków i aby usunąć pęcherzyki powietrza. 2. Mikropłytkę należy załadować do analizatora genetycznego, skonfigurować oprogramowanie do pobierania danych zgodnie z opisem zawartym w podręczniku użytkownika TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN ), a następnie podłączyć mikropłytkę i rozpocząć analizę. 9 Analiza i interpretacja danych Należy wykonać identyfikację stanu potencjalnych patogenów poprzez analizę danych, używając zalecanych ustawień, paneli i par zasad. Więcej informacji na ten temat znajduje się w podręczniku użytkownika TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN ). Firma Life Technologies zaleca, aby każde laboratorium ustaliło własne kryteria oraz procedury interpretacji i raportowania. 6

7 7

8 Not for sale in U.S.A. Zastrzeżenie Wyniki uzyskane za pomocą niniejszych lub innych paneli diagnostycznych należy wykorzystywać i interpretować wyłącznie w kontekście całościowego obrazu klinicznego. Firma Life Technologies nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek podejmowane decyzje kliniczne. Firma Life Technologies nie traktuje tej instrukcji jako całościowego omówienia wszystkich możliwości paneli identyfikacyjnych TrueScience RespiFinder Identification Panels. Ta instrukcja jest przeznaczona wyłącznie jako materiał pomocniczy. Instrukcja nie jest przeznaczona do klinicznej interpretacji wyników analizy. Laboratorium musi interpretować i przedstawiać raporty wyników analizy zgodnie z własnymi procedurami. Information in this document is subject to change without notice. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. TO THE FULLEST EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF, WHETHER OR NOT FORESEEABLE AND WHETHER OR NOT APPLIED BIOSYSTEMS IS ADVISED OF THE POSSIBILITY OF SUCH DAMAGES. Symbole na etykietach i opakowaniach: PRODUCENT LICZBA TESTÓW SPRAWDŹ W INSTRUKCJI OBSŁUGI PRZECHOWYWAĆ W TEMPERATURZE UŻYĆ PRZED NUMER KATALOGOWY NUMER SERII LUB PARTII Life Technologies Ltd. 7 Kingsland Grange Woolston, Warrington, WA1 4SR, United Kingdom NOTICE TO PURCHASER: This product is a RespiFinder product manufactured by PathoFinder B.V. in Maastricht, The Netherlands within quality systems accredited to ISO13485:2003. These products are sold for use by the end-user only and may not be re-sold, distributed or re-packaged. LIMITED USE LABEL LICENSE: No right to resell this product or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. For information on obtaining additional rights, please contact outlicensing@lifetech.com or Out Licensing, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California Trademarks: The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. RespiFinder is a registered trademark of PathoFinder B.V. PANELE IDENTYFIKACYJNE TRUESCIENCE RESPIFINDER IDENTIFICATION PANELS SŁUŻĄ DO PROFESJONALNYCH TESTÓW DO DIAGNOSTYKI IN VITRO. PRODUKT NIE ZAPEWNIA LICENCJI DO WYKONYWANIA PCR STOSUJĄC PATENTY POSIADANE PRZEZ INNE FIRMY, W TYM FIRMY HOFFMANN-LA ROCHE (HOFFMANN-LA ROCHE LTD, DIAGNOSTICS, CH-4070 BASEL, SWITZERLAND) I ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, INC (ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, INC., 1145 ATLANTIC AVENUE, ALAMEDA, CALIFORNIA 94501) Klient jest odpowiedzialny za weryfikację analiz i zgodność z wymaganiami regulacyjnymi, które dotyczą procedur i korzystania z produktów firmy RespiFinder Life Technologies Corporation. All rights reserved. Part Number Rev. B 07/2011 Translated from the English PN Rev. A Headquarters 5791 Van Allen Way Carlsbad, CA USA Phone Technical Resources and Support For the latest technical resources and support information for all locations, please refer to our Web site at