Uniwersytet Wrocławski Instytut Genetyki i Mikrobiologii Zakład Genetyki. Jacek Skała ĆWICZENIA Z GENETYKI MOLEKULARNEJ

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Uniwersytet Wrocławski Instytut Genetyki i Mikrobiologii Zakład Genetyki. Jacek Skała ĆWICZENIA Z GENETYKI MOLEKULARNEJ"

Transkrypt

1 Uniwersytet Wrocławski Instytut Genetyki i Mikrobiologii Zakład Genetyki Jacek Skała ĆWICZENIA Z GENETYKI MOLEKULARNEJ Wrocław 2008

2 Spis treści Spis treści...2 Organizacja ćwiczeń...4 KRYTERIA OCENY...6 LITERATURA POMOCNICZA...6 PODSTAWOWE INFORMACJE O PLAZMIDACH I SZCZEPACH...8 PLAZMIDY...8 SZCZEPY...10 KLASYCZNA METODA IZOLACJI DNA PLAZMIDOWEGO Z ESCHERICHIA COLI...11 SZYBKA METODA IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Z ESCHERICHIA COLI...17 ULTRA SZYBKA METODA IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Z ESCHERICHIA COLI...19 WYBRANE METODY IZOLACJI, OCZYSZCZANIA I ZAGĘSZCZANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH...21 IZOLACJA I OCZYSZCZANIE DNA I RNA NA KOLUMNACH ZE ZŁOśEM KRZEMIONKOWYM...21 OCZYSZCZANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH FENOLEM...25 ZAGĘSZCZANIE ROZTWORÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH PRZEZ WYTRĄCANIE...28 MIKRODIALIZA...30 SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE STĘśENIA I CZYSTOŚCI KWASÓW NUKLEINOWYCH...31 TRAWIENIE DNA ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI...32 KILKA RAD PRAKTYCZNYCH O PRACY Z ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI...33 KIEDY ENZYM RESTRYKCYJNY NIE CHCE CIĄĆ...34 ENZYM RESTRYKCYJNY PRZY PRACY...35 ELEKTROFOREZA DNA W śelach AGAROZOWYCH...38 WPŁYW ILOŚCI DNA I CZASU TRWANIA ELEKTROFOREZY NA ROZDZIAŁ FRAGMENTÓW FAGA λ W śelu AGAROZOWYM...41 ELEKTROFOREZA DNA W AGAROZIE O NISKIM PUNKCIE TOPNIENIA...42 OGÓLNE REGUŁY POSTĘPOWANIA...42 ROZDZIAŁ I ODZYSKANIE DNA Z AGAROZY LMP...43 DEFOSFORYLACJA WEKTORA...46 LIGACJA...49 ELEKTROTRANSFORMACJA...50 PRZYGOTOWANIE DNA DO ELEKTROTRANSFORMACJI...50 PRZYGOTOWANIE ELEKTROKOMPETENTNYCH KOMÓREK ESCHERICHIA COLI...51 Elektrotransformacja Escherichia coli...53 PRZYGOTOWANIE ELEKTROKOMPETENTNYCH KOMÓREK SACCHAROMYCES CEREVISIAE...56 Elektrotransformacja Saccharomyces cerevisiae...58 CHEMICZNA TRANSFORMACJA SACCHAROMYCES CEREVISIAE...60 PRZYGOTOWANIE KOMÓREK DROśDśOWYCH DO TRANSFORMACJI CHEMICZNEJ...60 TRANSFORMACJA SACCHAROMYCES CEREVISIAE...61 PODŁOśE SELEKCYJNE Z X-GAL I IPTG...62 SELEKCJA TRANSFORMANTÓW ESCHERICHIA COLI Z WEKTOREM ZAWIERAJĄCYM DROśDśOWY GEN HIS

3 BEZPOŚREDNIE WYKAZANIE OBECNOŚCI GENU HIS3 W TRANSFORMANTACH DROśDśOWYCH...69 PCR...70 OGÓLNE ZASADY PROJEKTOWANIA STARTERÓW DO PCR...73 Startery do wykrywania droŝdŝowego genu HIS PREPARACJA DNA GENOMOWEGO Z DROśDśY SACCHAROMYCES CEREVISIAE...76 ZESTAWIENIE REAKCJI PCR Z DNA DROśDśOWYM...78 PROGRAM PCR DO WYKRYWANIA DROśDśOWEGO GENU HIS3 STARTERAMI HIS-P I HIS-K

4 Organizacja ćwiczeń Grupa studencka dzieli się na dwuosobowe zespoły. KaŜdy zespół otrzymuje dwa szczepy Escherichia coli JM109. Jeden z nich zawiera pusty wektor wahadłowy pfl44s, natomiast w drugim znajduje się plazmid pd11 złoŝony z części bakteryjnej oraz 1764 bp fragmentu genomowego DNA droŝdŝowego z genem HIS3 (Rys. 1). Zadaniem zespołu jest: a. przeniesienie genu HIS3 do wektora wahadłowego, b. transformacja nowo wytworzonym plazmidem zawierającym gen HIS3 szczepu Saccharomyces cerevisiae FY73, c. wyselekcjonowanie transformantów droŝdŝowych zdolnych do wzrostu na podłoŝu minimalnym bez histydyny oraz określenie wydajności transformacji wytworzonym plazmidem, d. bezpośrednie wykazanie obecności genu HIS3 w transformantach droŝdŝowych metodą PCR, e. opracowanie mapy restrykcyjnej wytworzonego plazmidu Realizacja postawionego zadania zajmuje pięć tygodni i odbywa się według poniŝszego planu: I tydzień Izolacja plazmidów pfl44s i pd11 ze szczepów bakteryjnych. Trawienie plazmidów pfl44s i pd11 enzymem BamHI. Elektroforeza kontrolna w Ŝelu agarozowym. II tydzień Defosforylacja końców rozciętego plazmidu pfl44s. 4

5 Rozdział fragmentów plazmidu pd11 w agarozowym Ŝelu preparatywnym o niskim punkcie topnienia (LMP). Odzyskanie z agarozy fragmentu plazmidu pd11 zawierającego gen HIS3. Ligacja plazmidu pfl44s (wektora) z wyizolowanym fragmentem DNA droŝdŝowego zawierającym gen HIS3. III tydzień Przygotowanie elektrokompetentnych komórek E. coli JM109. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek S. cerevisiae FY73. Przygotowanie podłoŝa selekcyjnego LB z ampicyliną, X-gal i IPTG. Dializa roztworu ligacyjnego Elektrotransformacja E. coli JM109 ligowanym DNA i wysiew na podłoŝe selekcyjne LB z ampicyliną, X-gal i IPTG. IV tydzień Obserwacja wzrostu i róŝnicowania transformantów bakteryjnych na podłoŝu selekcyjnym z X-gal i IPTG. ZałoŜenie hodowli płynnych wybranych białych kolonii transformantów. Preparacja DNA z hodowli wybranych transformantów bakteryjnych. Trawienie restrykcyjne wyizolowanego DNA plazmidowego, elektroforeza kontrolna oraz opracowanie mapy restrykcyjnej. Transformacja komórek droŝdŝowych wytworzonym plazmidem wahadłowym z genem HIS3. V tydzień Obserwacja wzrostu transformantów droŝdŝowych na podłoŝu selekcyjnym bez histydyny. 5

6 ZałoŜenie hodowli płynnych wybranych transformantów droŝdŝowych. Izolacja DNA genomowego z transformantów droŝdŝowych. Wykazanie obecności genu HIS3 w transformantach droŝdŝowych przy uŝyciu techniki PCR Końcowe omówienie wyników i zaliczenie ćwiczeń. Kryteria oceny Do zaliczenia ćwiczeń wymagane jest uzyskanie pozytywnych ocen za: a) aktywność intelektualną na zajęciach b) działalność praktyczną na zajęciach c) uzyskane wyniki d) kolokwium zaliczeniowe Literatura pomocnicza 1. Birnboim H. C., Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, Dale J. W., von Schantz M. (2007). From genes to genomes. Concepts and applications of DNA technology. Second edition. John Wiley, England. 3. PCR primer. A laboratory manual. (1995). Dieffenbach C.W., Dveksler G. S. [ed.], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 4. Sambrook J., Russell D. (2001). Molecular cloning. A laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 6

7 Tabela 1. Ogólny plan przebiegu ćwiczeń z genetyki molekularnej Tydzień Dzień I 1 II 2 III 3 Zadanie do wykonania - izolacja plazmidu pfl44s - izolacja plazmidu pd11 - trawienie enzymem BamHI - trawienie enzymem BamHI - elektroforeza kontrolna w Ŝelu agarozowym - przeniesienie pfl44s z buforu dla -rozdział fragmentów plazmidu pd11 BamHI do buforu do defosforylacji w Ŝelu agarozowym (LMP) - defosforylacja końców -odzyskanie z agarozy fragmentu plazmidu zawierającego gen HIS3 - oczyszczenie DNA fenolem -ligacja wektora z fragmentem zawierającym gen HIS3 -przygotowanie elektrokompetentnych komórek E. coli JM109 -przygotowanie elektrokompetentnych komórek S. cerevisiae FY73 -przygotowanie podłoŝa selekcyjnych LB z ampicyliną, X-gal i IPTG -dializa roztworu ligacyjnego -elektrotransformacja komórek E. coli JM109 ligowanym DNA IV V obserwacja wzrostu transformantów bakteryjnych E. coli JM109 na stałym podłoŝu selekcyjnym LB z ampicyliną, X-gal i IPTG -załoŝenie hodowli wybranych transformantów w płynnej poŝywce LB z ampicyliną -izolacja DNA plazmidowego z transformantów bakteryjnych -trawienie DNA plazmidowego enzymami restrykcyjnymi -elektroforeza kontrolna i opracowanie mapy restrykcyjnej -transformacja S. cerevisiae FY73 wybranymi preparatami nowo wytworzonych plazmidów -obserwacja wzrostu transformantów S. cerevisiae FY73 na podłoŝu selekcyjnym bez histydyny -załoŝenie hodowli płynnych wybranych transformantów droŝdŝowych -izolacja DNA genomowego z transformantów droŝdŝowych -wykazanie obecności genu HIS3 w transformantach droŝdŝowych techniką PCR -końcowa analiza wyników i zaliczenie ćwiczeń 7

8 Podstawowe informacje o plazmidach i szczepach Plazmidy pfl44s - wielkość 4319 bp, składa się następujących elementów (Rys. 1): bakteryjny gen Amp kodujący β laktamazę warunkującą oporność na ampicylinę droŝdŝowy gen URA3 bakteryjny region startu replikacji orib pochodzący z plazmidu ColE1 promotor operonu lac wraz z częścią genu lacz kodującą N-końcową część β galaktozydazy (α-peptyd) o długości 145 aminokwasów polilinker wbudowany do fragmentem genu lacz kodującego α-peptyd pd11 - wielkość 4591 bp, składa się z następujących elementów (Rys. 1): gen Amp kodujący β laktamazę warunkującą oporność na ampicylinę Fragment BamHI (1764 bp) z XV chromosomu Saccharomyces cerevisiae zawierający gen HIS3. Gen ten koduje enzym ze szlaku biosyntezy histydyny - IGP dehydratazę. Uszkodzenie geneu HIS3 objawia się u droŝdŝy brakiem wzrostu na poŝywce minimalnej bez histydyny bakteryjny region startu replikacji orib pochodzący z plazmidu ColE1 8

9 AatII 4522 PvuII 306 EcoRI 396 SacI 402 KpnI 408 SmaI 412 BamHI 417 lacz Amp pd11 PstI 3399 orib 4591 bps His3 HindIII 1191 BglII 1282 BglII 1342 HindIII 1378 KpnI 1505 PstI 1566 Enzym PstI BamHI Miejsce cięcia lacz BglII 2396 BglII 2083 ClaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII 2211 Amp AatII 4250 lacz PvuII 306 BglII EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII 447 pfl44s 4319 bps URA3 EcoRV 1319 Enzym Miejsce cięcia BamHI 417 KpnI 408 PstI 435 orib ClaI um ClaI 1854 BglII 1728 Rysunek 1. Budowa plazmidów pd11 i pfl44s. 9

10 Szczepy Saccharomyces cerevisiae FY73 (MATα, ura3-52, his3-200, GAL2) MATα - droŝdŝowy typ płciowy α ; ura mutacja w genie metabolizmu uracylu, uniemoŝliwia wzrost na podłoŝu minimalnym bez tego związku; his delecja o długości 1036 bp, obejmująca całą sekwencję kodującą genu HIS3 wraz z regionem promotorowym (Rysunek 4), fenotypowo objawia się brakiem wzrostu na podłoŝu minimalnym bez histydyny; GAL2 - zdolność do wykorzystywania galaktozy jako jedynego źródła węgla Escherichia coli JM109 [F, trad36, proa + B +, laci q, lacz Μ15] reca, r K-, enda1, gyra96, thi1, supe44, (lac-proab) F obecność plazmidu F warunkującego wytwarzanie pili płciowych; trad36 - mutacja blokująca przekazywanie plazmidu F podczas koniugacji; proab - mutacje w genach metabolizmu proliny powodujące brak wzrostu na podłoŝu minimalnym bez tego aminokwasu; laci q - mutacja powodująca nadprodukcję represora operonu lac; lacz M15 - delecja fragmentu genu lacz kodującego N-końcową część β-galaktozydazy (α-peptyd), pozostawiona jest natomiast część kodująca C-koniec (ω-peptyd); reca - mutacja w genie warunkującym rekombinację i naprawę DNA, uniemoŝliwia rekombinację obcego DNA z genomem gospodarza; r K- - brak systemu restrykcji; enda1 - mutacja w genie endonukleazy I, zwiększa wydajność i poprawia jakość izolowanego DNA plazmidowego; gyra96 - mutacja w podjednostce A gyrazy, wywołuje oporność na kwas nalidiksowy; thi1 - mutacja powodująca brak wzrostu na podłoŝu minimalnym bez tiaminy; supe44 - supresor mutacji amber (UAG); (lac-proab) - delecja operonu laktozowego i genów proab 10

11 Klasyczna metoda izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli Obecnie do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych stosowane są metody róŝniące się niekiedy dość znacznie w poszczególnych etapach preparacji. Wszystkie je jednak cechuje zastosowanie lizy komórek SDS-em w warunkach alkalicznych. Podstawy tej metody opracowali Birnboim i Doly w roku Podany wówczas sposób postępowania doczekał się licznych, zazwyczaj drobnych modyfikacji skracających czas preparacji, a czasem równieŝ poprawiających czystość uzyskiwanych plazmidów. Najbardziej znacząca modyfikacja polegała na zastosowaniu gotowych kolumn ze złoŝem krzemionkowym co zostało opisane w rozdziale Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych na kolumnach. PoniŜej podano opis klasycznej metody izolacji DNA plazmidowego z bakterii z uŝyciem lizy alkalicznej i oczyszczania fenolem jak podali Birnboim i Doly (1979). Do protokołu postępowania wprowadzono jedynie modyfikacje dostosowujące go do potrzeb zająć ćwiczeniowych i posiadanego wyposaŝenia laboratoryjnego. Metoda ta daje dobre wyniki nawet w rękach osób początkujących. Przy jej uŝyciu moŝna izolować plazmidy o wielkości do 15 kbp, a po nabyciu wprawy nawet do około 30 kbp. Wyizolowane plazmidy nie są całkowicie wolne od zanieczyszczeń, ale stopień ich czystości jest wystarczający do analizy restrykcyjnej, reakcji PCR i ligacji, a po nabraniu wprawy równieŝ i do sekwencjonownia. Metoda ta działa bardzo dobrze równieŝ po zmianie skali preparacji. MoŜna więc izolować DNA plazmidowe z hodowli bakteryjnych o innej objętości niŝ podane 3 ml. W tym celu objętości poszczególnych roztworów roboczych naleŝy zmienić proporcjonalnie do zmiany objętości hodowli. 1. 3,5 ml poŝywki LB (wyciąg droŝdŝowy 1 %, trypton 1 %, NaCl 0,5 %) z ampicyliną (100 µg/ml) zaszczepić szczepem E. coli zawierającym odpowiedni plazmid. 2. Hodowlę inkubować przez 18 od 20 godzin w temp. 37 o C z wytrząsaniem ( cykli na minutę). 3. Do probówki Eppendorfa przenieść 1,5 ml hodowli bakteryjnej po czym wirować przez 3 min. JeŜeli podano jedynie czas to znaczy, Ŝe wirowanie naleŝy wykonać w wirówce typu Eppendorf, w temperaturze pokojowej. Wirówki tej klasy najczęściej nie mają chłodzenia oraz moŝliwości regulacji obrotów i pracują ze stałą prędkością około obr/min. 11

12 W przypadkach gdy obok czasu podano równieŝ temperaturę i prędkość obrotową naleŝy uŝyć wirówki z moŝliwością regulowania tych parametrów. 4. Usunąć supernatant przy pomocy pompki próŝniowej zachowując osad bakteryjny. Do probówki przenieść kolejne 1,5 ml hodowli i ponownie wirować przez 3 min. 5. Supernatant usunąć przy pomocy pompki próŝniowej zbierając równieŝ kropelki pozostające na ściance probówki. 6. Osad bakteryjny zawiesić przy pomocy pipety w 200 µl buforu TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0) tak, aby powstała jednolita, pozbawiona grudek zawiesina, co jest warunkiem prawidłowego przebiegu lizy. 7. Do zawiesiny bakterii dodać 300 µl świeŝo przygotowanego roztworu do lizy (1% SDS, 0,2 N NaOH), po czym całość dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki do góry dnem. NaleŜy unikać gwałtownego potrząsania probówką. Liza komórek następuje natychmiast po dodaniu roztworu SDS z NaOH i objawia się wzrostem lepkości oraz przejrzystości zawiesiny przy równoczesnym zaniku barwy beŝowej. 8. Probówkę z lizatem umieścić na 3 min. w lodzie. 9. Do lizatu dodać 240 µl 3M octanu sodu (ph 5,2) i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki do góry dnem. W lizacie powinny pojawić się białawe "serowate" kłaczki wytrąconych białek. 10. Lizat z wytrąconymi białkami inkubować przez 10 min. w temp. -20 o C. 11. Probówkę z lizatem wirować przez 15 min. ( obr/min., 4 o C). W wyniku wirowania lizat powinien się rozdzielić na jasno beŝowy osad i lekko śluzowaty, przejrzysty supernatant. jeŝeli rozdział nie jest dobry to wirowanie (15 min, obr/min., 4 o C) naleŝy powtórzyć po ewentualnym rozcieńczeniu lizatu buforem TGE w przypadku dobrego rozdziału supernatant naleŝy ostroŝnie zebrać pipetą znad osadu i przenieść do czystej probówki Eppendorfa 12

13 12. Do supernatantu zebranego znad osadu dodać jedną objętość fenolu i całość energicznie wytrząsać do wytworzenia jednorodnej emulsji. Patrz równieŝ rozdział Oczyszczanie kwasów nukleinowych fenolem. 13. Probówkę z emulsją wodno-fenolową wirować przez 5 min. Zawartość probówki powinna rozdzielić się na dwie wyraźne odgraniczone fazy: fenolową (dolna) i wodną (górna). Zanieczyszczenia białkowe gromadzą się w fazie fenolowej i na granicy faz. 14. Pipetą zebrać fazę wodną i przenieść do czystej probówki. Przy zbieraniu szczególną uwagę naleŝy zwrócić na to, by nie pobrać zanieczyszczeń znajdujących się na granicy faz. 15. Do fazy wodnej dodać około dwie objętości eteru. Probówkę dokładnie zamknąć i energicznie wytrząsać do wytworzenia jednorodnej emulsji. 16. Probówkę z emulsją wodno-eterową wirować przez 5 min. RównieŜ i tym razem zawartość probówki powinna rozdzielić się na dwie fazy: wodną (dolna) i eterową (górna). Zanieczyszczenia gromadzą się w fazie eterowej i na granicy faz. 17. Posługując się pompką wodną odessać fazę eterową wraz z interfazą. Dla zminimalizowania strat naleŝy unikać zasysania fazy wodnej. 18. Powtórzyć postępowanie opisane w punktach od 15 do 17 po czym przejść do punktu Do fazy wodnej pozostałej po dwukrotnej ekstrakcji eterem dodać jedną objętość zimnego (-20 o C) izopropanolu i całość wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki do góry dnem. JeŜeli stęŝenie DNA w roztworze jest wysokie to po dodaniu izopropanolu pojawi się strąt w postaci pływającego kłaczka. Przy małym stęŝeniu DNA strąt moŝe być niewidoczny. 20. Probówkę z zawartością inkubować w temp. -20 o C przez 10 do 15 min. Inkubacja w niskiej temperaturze przyspiesza wytrącanie kwasów nukleinowych i poprawia wydajność. 13

14 21. Po zakończeniu inkubacji probówkę z zawartością wirować przez 10 min ( obr/min, 4 o C). Osad kwasów nukleinowych (DNA i RNA) zbiera się na ściance bocznej i dnie probówki i najczęściej jest słabo widoczny. 22. OstroŜnie, tak aby nie naruszyć osadu kwasów nukleinowych, usunąć supernatant. Następnie do probówki dodać 1 ml 70 % etanolu. 23. Wirować przez 1 min. 24. Supernatant usunąć znad osadu przy pomocy pompki próŝniowej. Zebrać moŝliwie wszystkie kropelki osadzone na ściance probówki. 25. Osad wysuszyć w suszarce próŝniowej z wirującym rotorem (speedvac). 26. Wysuszony osad kwasów nukleinowych rozpuścić w 31 µl wody miliq. 27. Po rozpuszczeniu osadu pobrać 1 µl roztworu do nowej probówki Eppendorfa i zachować do kontroli. 28. Do pozostałych 30 µl roztworu kwasów nukleinowych dodać 1 µl roztworu RNazy o stęŝeniu 10 mg/ml. 29. Część preparatu plazmidowego pociąć enzymem restrykcyjnym BamHI. W tym celu zestawić roztwory reakcyjne przenosząc poszczególne składniki do probówek Eppendorfa jak podano w Tabeli 2. Następnie krótko zwirować (10 do 15 sekund) co zapewnia zebranie wszystkich składników reakcyjnych na dnie probówki i ułatwia ich wymieszanie. Po wymieszaniu zawartość probówki naleŝy ponownie krótko zwirować. Tabela 2. Trawienie plazmidów pfl44s i pd11 enzymem BamHI Numer probówki 1 2 DNA 10,0 µl pfl44s 10,0 µl pd11 Bufor Bam 2,0 µl 2,0 µl Woda 6,0 µl 6,0 µl Enzym BamHI (10 U/µl) 2,0 µl 2,0 µl 30. Roztwory reakcyjne inkubować przez 2 godz. w cieplarce w temp. 37 o C. 31. Po zakończeniu inkubacji przygotować próbki do elektroforezy kontrolnej. W tym celu wskazane w Tabeli 3 objętości poszczególnych roztwo- 14

15 rów przenieść do probówek Eppendorfa, krótko zwirować, wymieszać i ponownie zwirować. Pozostałą część roztworów restrykcyjnych oraz preparaty plazmidów zamrozić w temp. -20 o C. Tabela 3. Przygotowanie próbek do elektroforezy kontrolnej. Probówka A B C D E F DNA 1 µl pfl44s bez RNazy 1 µl pfl44s 2 µl pfl44s/ BamHI 1 µl pd11 bez RNazy 1 µl pd11 2 µl pd11/ BamHI Woda 7 µl 7 µl 6 µl 7 µl 7 µl 6 µl Barwnik do nanoszenia 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 33. Przygotowane próbki nanieść na 0,9 % Ŝel agarozowy w buforze TBE z bromkiem etydyny (0,25 µg/ml). Na Ŝel nanieść równieŝ marker masy o znanym stęŝeniu i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem od 150 V do 190 V w zaleŝności od wielkości Ŝelu. Patrz równieŝ rozdział Elektroforeza DNA w Ŝelach agarozowych 34. Wykonać zdjęcie Ŝelu w przechodzącym świetle ultrafioletowym (maksimum emisji lampy przy 312 nm). 35. Na podstawie zdjęcia ocenić jakość wyizolowanych plazmidów pd11 i pfl44s, sporządzić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć wielkość fragmentów liniowych obu plazmidów oraz oszacować błąd metody. 36. Na podstawie porównania intensywności świecenia prąŝków plazmidowych z intensywnością świecenia markera masy oszacować ilość uzyskanego plazmidowego DNA. 37. Posługując się spektrofotometrem do pomiarów kwasów nukleinowych w małych objętościach zmierzyć absorbancję uzyskanych preparatów plazmidowych przy długości fali 230 nm, 260 nm i 280 nm. Na tej podstawie określić ich stęŝenie i czystość. Patrz równieŝ rozdział Spektrofotometryczne oznaczanie stęŝenia i czystości kwasów nukleinowych. 15

16 Materiały poŝywka LB (wyciąg droŝdŝowy 1 %, trypton 1 %, NaCl 0,5 %) ampicylina (10 mg/ml) bufor TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0) roztwór do lizy (SDS 1%, NaOH 0,2 M) Roztwór do lizy przygotowuje się bezpośrednio przed uŝyciem mieszając ze sobą równe objętości 2 % SDS i 0,4 M NaOH. octan sodu (3 M, ph 5,2) fenol (nasycony roztwór fenolu w 0,1 M Tris-HCl (ph 8,0) z 0,1 % dodatkiem hydroksychinoliny) eter izopropanol 70 % etanol woda destylowana jałowa (miliq) RNaza (10 mg/ml) enzym restrykcyjny BamHI (Fermentas, nr kat. ER0051) bufor Bam zalecany przez producenta do trawienia enzymem BamHI (10 mm Tris-HCl (ph 8,0), 5 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 0,02 % merkaptoetanol, 0,1 mg/ml BSA) agaroza LE (Prona) marker masy - DNA faga λ trawiony enzymami EcoRI i HindIII barwnik do nanoszenia na Ŝel 5 x stęŝony (Ficoll %, błękit bromofenolowy 0,15 %) bufor TBE 10 x stęŝony (Tris 100,89 g, kwas borny 59 g, EDTA 9,35 g, woda do 1000 ml, ph 8,0) bromek etydyny (10 mg/ml) Literatura 1. Birnboim H. C. i Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: Sambrook J., Fritsch E.F. i Maniatis T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 16

17 Szybka metoda izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli Klasyczną metodę izolacji DNA plazmidowego z Escherichia coli moŝna znacznie uprościć usuwając z niej etapy związane z oczyszczaniem fenolem. Skrócona wersja doskonale sprawdza się w sytuacjach gdy wyselekcjonowanie poŝądanej konstrukcji plazmidowej wymaga przeszukania duŝej liczby transformantów. Ponadto, podobnie jak jej rozszerzona wersja, daje dobre wyniki równieŝ w rękach osób o małym doświadczeniu. Uzyskane tą drogą plazmidy nadają się do analizy restrykcyjnej i jako matryca do reakcji PCR, ale zazwyczaj nie są wystarczająco czyste do innych zastosowań. 1. W probówce Eppendorfa odwirować (3 min) 1,5 ml całonocnej hodowli (poŝywka LB z odpowiednim antybiotykiem) szczepu E.coli zawierającego badany plazmid. Supernatant usunąć przy pomocy pompki próŝniowej zachowując osad bakteryjny. 2. Osad bakteryjny dokładnie zawiesić w 200 µl buforu TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0). 3. Do zawiesiny bakterii dodać 300 µl świeŝo przygotowanego roztworu do lizy (1% SDS, 0,2 N NaOH), po czym całość dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki do góry dnem. 4. Do lizatu dodać 240 µl 3M octanu sodu (ph 5,2) i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki do góry dnem. 5. Lizat z wytrąconymi białkami inkubować przez 10 min. w temp. -20 o C. 6. Probówkę z lizatem wirować przez 15 min. ( obr/min., 4 o C). 7. Supernatant przenieść do nowej probówki i dodać jedną objętość zimnego (-20 o C) izopropanolu. Całość wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki. 8. Probówkę inkubować w temp. -20 o C przez 10 min. 9. Po inkubacji probówkę z zawartością wirować przez 10 minut ( obr/min, 4 o C). 17

18 10. OstroŜnie, nie naruszając osadu, usunąć supernatant. Następnie do probówki dodać 1 ml 70 % etanolu. 11. Wirować przez 1 min. 12. Supernatant usunąć znad osadu przy pomocy pompki próŝniowej. Zebrać moŝliwie wszystkie kropelki osadzone na ściance probówki. 13. Osad wysuszyć w suszarce typu speedvac. 14. Wysuszony osad rozpuścić w 29 µl wody miliq po czym dodać 1 µl roztworu RNazy o stęŝeniu 10 mg/ml. 15. Uzyskany preparat wykorzystać w dalszych etapach prowadzonego eksperymentu lub zamrozić w temp. 20 o C. Materiały poŝywka LB (wyciąg droŝdŝowy 1 %, trypton 1 %, NaCl 0,5 %) bufor TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0) roztwór do lizy (SDS 1%, NaOH 0,2 M) Roztwór do lizy przygotowuje się bezpośrednio przed uŝyciem mieszając ze sobą równe objętości 2 % SDS i 0,4 M NaOH. octan sodu (3 M, ph 5,2) izopropanol 70 % etanol woda destylowana jałowa (miliq) RNaza (10 mg/ml) 18

19 Ultra szybka metoda izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli PoniŜej przedstawiono kolejną metodę izolacji DNA plazmidowego w warunkach lizy alkalicznej. Tym razem jako główny cel postawiono sobie maksymalne skrócenie czasu trwania preparacji, nawet kosztem znacznego zmniejszenia wydajności i pogorszenia jakości izolowanego DNA. Metoda ta nadaje się wyłącznie do selekcji transformantów i, co najbardziej chyba zaskakujące, bardzo często zawodzi w rękach osób z małym doświadczeniem laboratoryjnym. Podany poniŝej protokół opracowali Cormack i Somssich (1997). 1. Do probówki zawierającej 1 ml poŝywki SB (wyciąg droŝdŝowy 2 %, pepton 3,2 %, NaCl 0,5 %) z ampicyliną (100 µg/ml) przenieść jedną, dobrze wyrośniętą kolonię bakteryjną. 2. Hodowlę inkubować przez 18 godzin w temp. 37 o C z energicznym wytrząsaniem ( cykli na minutę). 3. Do probówki Eppendorfa przenieść 250 µl hodowli i dodać do niej 250 µl świeŝo przygotowanego roztworu do lizy (1% SDS, 0,2 N NaOH), po czym całość dokładnie wymieszać przez kilkakrotne odwrócenie probówki do góry dnem. 4. Do lizatu dodać 250 µl 3M octanu sodu (ph 5,2) i wymieszać przez odwracanie probówki do góry dnem. 5. Probówkę z lizatem wirować przez 6 min. 6. Pipetą ostroŝnie zebrać supernatant i przenieść do czystej probówki Eppendorfa. 7. Do zebranego supernatantu dodać 750 µl zimnego (-20 o C) izopropanolu i wymieszać przez odwracanie probówki. 8. Wytrącone DNA odwirować (4 min.) 9. Przy pomocy pompki próŝniowej usunąć supernatant nie naruszając osadu. 19

20 10. Probówkę krótko wirować i dokładnie usunąć pozostałe resztki supernatantu. 11. Osad rozpuścić w 20 µl jałowej wody destylowanej i dodać 1 µl roztworu RNazy o stęŝeniu 10 mg/ml. 16. Uzyskany preparat wykorzystać bezpośrednio w dalszych etapach prowadzonego eksperymentu lub zamrozić w temp. 20 o C. Materiały poŝywka SB (wyciąg droŝdŝowy 2 %, pepton 3,2 %, NaCl 0,5 %) ampicylina (10 mg/ml) roztwór do lizy (SDS 1%, NaOH 0,2 M) Roztwór do lizy przygotowuje się bezpośrednio przed uŝyciem mieszając ze sobą równe objętości 2 % SDS i 0,4 M NaOH. 3 M octan sodu, ph 5,2 izopropanol jałowa woda miliq RNaza (10 mg/ml) Literatura Cormack R. S., Somssich I. E. (1997). Ultra-fast alkaline lysis plasmid extraction (UFX). Technical Tips Online, 1, 25:T

21 Wybrane metody izolacji, oczyszczania i zagęszczania kwasów nukleinowych Izolacja i oczyszczanie DNA i RNA na kolumnach ze złoŝem krzemionkowym W roku 1979 Vogelstein i Gillespie zaobserwowali, Ŝe w obecności jodku sodu liniowe, krótkie fragmenty dwuniciowego DNA adsorbują się na powierzchni sproszkowanego szkła typu flint. W kolejnych latach wykazano, Ŝe zjawisko to obejmuje równieŝ i pozostałe rodzaje kwasów nukleinowych, to jest dsdna, ssdna i RNA. Flint to szkło krzemowo-ołowiowe o wysokim współczynniku załamania światła zawierające od 4 do 60 % tlenku ołowiu. Obecnie, ze względu na toksyczne właściwości ołowiu, do produkcji flintu uŝywany jest dwutlenek tytanu lub cyrkonu. Sole chaotropowe (jodek sodu, chlorowodorek guanidyny, izotiocyjanian guanidyny) są to związki, które w roztworach wodnych wprowadzają zaburzenia w sieci wiązań wodorowych w cząsteczkach wody. Powodują równieŝ rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. W obecności wysokich stęŝeń soli chaotropowych tylko kwasy nukleinowe wiąŝą się ze złoŝem krzemionkowym podczas gdy wszystkie inne związki pozostają w roztworze. Wiązanie jest odwracalne i po zmianie ph oraz obniŝeniu siły jonowej kwasy nukleinowe odłączają się od złoŝa krzemionkowego. Wiele firm biotechnologicznych, wykorzystując to zjawisko, opracowało zestawy zawierające kolumny z uformowanymi złoŝami krzemionkowymi oraz odpowiednie bufory przeznaczone do izolacji DNA plazmidowego i genomowego oraz RNA z takich źródeł jak bakterie, droŝdŝe, tkanki roślinne i zwierzęce, a takŝe wydzieliny i płyny ustrojowe. Opracowano równieŝ zestawy do odzyskiwania kwasów nukleinowych z Ŝeli agarozowych oraz do oczyszczania po reakcjach enzymatycznych takich jak znakowanie, cięcie restrykcyjne czy PCR. Aktualnie najbardziej rozpowszechnione są złoŝa wykonane w postaci membran z niemodyfikownej chemicznie krzemionki. Kolumny z tego typu złoŝami są względnie tanie i pozwalają na uzyskanie kwasów nukleinowych o czystości wystarczającej do analizy restrykcyjnej, ligacji, znakowania, amplifikcji (PCR i RTPCR) oraz sekwencjonownia. ZłoŜa najnowszej generacji wykonywane są z mikrokuleczek krzemionkowych do których na trwale przyłączono na przykład dietyloaminoetanol (DEAE). Działanie tego typu złoŝa opiera się na interakcji między ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi kwasu nukleinowego, a dodatnio 21

22 naładowanymi grupami DEAE. Dzięki przyłączeniu cząsteczek DEAE do kulek krzemionkowych uzyskuje się duŝe zwiększenie gęstości dodatniego ładunku powierzchniowego, co powoduje mocniejsze wiązanie oczyszczanego kwasu nukleinowego ze złoŝem. Dzięki temu moŝna zastosować bardziej energiczne odpłukiwanie zanieczyszczeń, przekładające się w konsekwencji na lepsze oczyszczenie izolowanego materiału. Stopień czystości uzyskanych tą drogą kwasów nukleinowych odpowiada czystości uzyskiwanej w wyniku dwukrotnego wirowania w gradiencie chlorku cezu. Jest to czystość wymagana w tak krytycznych zastosowaniach jak transfekcja, mikroinjekcja i terapie genowe. Wszystkie firmy dostarczają produkowane przez siebie zestawy wraz ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi ich przeznaczenia i sposobu uŝycia. Zazwyczaj instrukcje te nie podają składu oferowanych buforów oraz zawierają jedynie podstawową informację o rodzaju uŝytego złoŝa. Mimo dość duŝej róŝnorodności wszystkie oferowane zestawy wiąŝe kilka cech wspólnych: 1. Przygotowanie materiału do naniesienia na kolumnę lizat komórek bakteryjnych poddaje się wirowaniu w celu odrzucenia kompleksów białko-sds oraz DNA chromosomalnego tkanki zwierzęce trawi się proteinazą K i następnie dodaje bufor o wysokim stęŝeniu soli chaotropowych tkanki roślinne rozbija się mechaniczne (młynek Retcha lub rozcieranie ręczne w moździerzu w obecności płynnego azotu) i przenosi do bufor o wysokim stęŝeniu soli chaotropowych agarozę z której ma być odzyskany DNA roztapia się w buforze o wysokim stęŝeniu soli chaotropowych w temp. 50 do 60 o C do roztworów po reakcjach enzymatycznych dodaje się bufor z solami chaotropowymi w przypadku stosowania kolumn NUCLEOBOND (produkowanych przez firmę Macherey i Nagel) wstępnie przygotowany materiał, przed naniesieniem na kolumnę, oczyszcza się na dodatkowym sączku 2. Przepuszczenie wstępnie przygotowanego materiału przez kolumnę W zaleŝności od skali preparacji stosowane są kolumny o przepływie grawitacyjnym (np. NUCLEOBOND ) lub o przepływie wymuszonym przez wirowanie (np. QIAGEN oraz A&A Biotechnology). Kwasy nukleinowe zawarte w przepływającym przez kolumnę materiale zostają selektywnie związane ze złoŝem silikonowym. Wszystkie inne składniki przechodzą do odbieralnika kolumny. 22

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

Novabeads Food DNA Kit

Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii molekularnej, umożliwiającym izolację DNA z produktów spożywczych wysoko przetworzonych. Metoda oparta

Bardziej szczegółowo

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna. Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna. wersja 0916 6 x 20 transformacji Nr kat. 4010-120 Zestaw zawiera

Bardziej szczegółowo

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616 Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616 10 izolacji Nr kat. 995-10 Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 500 µg 1 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna ĆWICZENIE I PREPARATYKA RNA

Biologia Molekularna ĆWICZENIE I PREPARATYKA RNA Biologia Molekularna ĆWICZENIE I PREPARATYKA RNA ĆWICZENIE I (RNA) W komórkach występują trzy główne rodzaje RNA: mrna, trna, rrna. Największą pulę RNA stanowi rrna kodujące podjednostki rybosomów (u Eukariota

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa tel. 22 572 0735, 606448502

Bardziej szczegółowo

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 20 izolacji Nr kat. 895-20D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA Nr kat. EM01 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji plazmidowego DNA EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM01 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne ćw. 1 1 z 6

Techniki molekularne ćw. 1 1 z 6 Techniki molekularne ćw. 1 1 z 6 Instrukcja do ćwiczeń Nr 1. Temat: Izolacja całkowitego DNA z tkanki ssaczej metodą wiązania DNA do kolumny krzemionkowej oraz spektrofotometryczna ocena jego czystości

Bardziej szczegółowo

Plasmid Mini. 50 izolacji, 250 izolacji. Zestaw do izolacji plazmidów wysokokopijnych wersja Nr kat ,

Plasmid Mini. 50 izolacji, 250 izolacji. Zestaw do izolacji plazmidów wysokokopijnych wersja Nr kat , Plasmid Mini Zestaw do izolacji plazmidów wysokokopijnych wersja 1016 50 izolacji, 250 izolacji Nr kat. 020-50, 020-250 Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 20 µg. 1 Skład zestawu Składnik 50 izolacji

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA. Nr kat. EM01 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA. Nr kat. EM01 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji plazmidowego DNA Nr kat. EM01 Wersja zestawu: 1.2012 www.dnagdansk.com Nr kat. EM01 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME PLASMID DNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji

Bardziej szczegółowo

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 1. Izolacja genomowego DNA różnymi metodami

Ćwiczenie 1. Izolacja genomowego DNA różnymi metodami Ćwiczenie 1 Izolacja genomowego DNA różnymi metodami Praca laboratoryjna z użyciem materiału biologicznego wymaga szczególnej dbałości o prawidłowe wykonanie każdego etapu pracy, dlatego też tylko zastosowanie

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0117

Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0117 Plasmid Midi AX Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0117 10 izolacji Nr kat. 092-10 Pojemność kolumny do oczyszczania DNA

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM. Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: TERAPIA GENOWA Plan ćwiczeń Ćwiczenie 1: Przygotowanie warsztatu terapii genowej 1. Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych paav/lacz,

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA

Bardziej szczegółowo

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115 Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115 20 izolacji Nr kat. 052-20M tel: +48 58 7351194, fax: +48 58 6228578 info@aabiot.com www.aabiot.com 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Plasmid Mini AX Gravity

Plasmid Mini AX Gravity !"# Plasmid Mini AX Gravity zestaw do izolacji ultraczystego plazmidowego DNA (plazmidy wysokokopijne) wersja 0515/I 100 izolacji Nr kat. 015-100 1 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny

Bardziej szczegółowo

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!)

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!) Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ======================================================== Ćwiczenie 2

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych Nr kat. EM08 Wersja zestawu: 1.2012 www.dnagdansk.com Nr kat. EM08 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA GEL OUT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN CZĘŚĆ TEORETYCZNA Mechanizmy promujące wzrost rośli (PGP) Metody badań PGP CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Mechanizmy promujące wzrost roślin. Odczyt. a) Wytwarzanie

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

Otrzymany w pkt. 8 osad, zawieszony w 2 ml wody destylowanej rozpipetować do 4 szklanych probówek po ok. 0.5 ml do każdej.

Otrzymany w pkt. 8 osad, zawieszony w 2 ml wody destylowanej rozpipetować do 4 szklanych probówek po ok. 0.5 ml do każdej. Kwasy nukleinowe izolacja DNA, wykrywanie składników. Wymagane zagadnienia teoretyczne 1. Struktura, synteza i degradacja nukleotydów purynowych i pirymidynowych. 2. Regulacja syntezy nukleotydów. Podstawowe

Bardziej szczegółowo

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV ENZYMY RESTRYKCYJNE Enzymy z klasy endonukleaz (hydrolaz), wykazujące powinowactwo do specyficznych fragmentów dwuniciowych cząsteczek DNA i hydrolizujące wiązania fosfodiestrowe w obu niciach Naturalnie

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych. Nr kat. EM03 Wersja zestawu:

Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych. Nr kat. EM03 Wersja zestawu: Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych Nr kat. EM03 Wersja zestawu: 1.2012 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA CLEAN-UP przeznaczony jest do szybkiego i wydajnego oczyszczania

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji totalnego DNA z bakterii. Nr kat. EM02 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji totalnego DNA z bakterii. Nr kat. EM02 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji totalnego DNA z bakterii Nr kat. EM02 Wersja zestawu: 1.2012 Nr kat. EM02 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BACTERIA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji bakteryjnego

Bardziej szczegółowo

Izolacja DNA z komórki zwierzęcej

Izolacja DNA z komórki zwierzęcej Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Izolacja DNA z komórki zwierzęcej Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym

Bardziej szczegółowo

Metody badania ekspresji genów

Metody badania ekspresji genów Metody badania ekspresji genów dr Katarzyna Knapczyk-Stwora Warunki wstępne: Proszę zapoznać się z tematem Metody badania ekspresji genów zamieszczonym w skrypcie pod reakcją A. Lityńskiej i M. Lewandowskiego

Bardziej szczegółowo

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BLOOD przeznaczony

Bardziej szczegółowo

Sherlock AX. 25 izolacji, 100 izolacji

Sherlock AX. 25 izolacji, 100 izolacji Sherlock AX Zestaw do izolacji genomowego DNA z materiałów o jego śladowej zawartości (plamy krwi, nasienia i śliny, włosy i sierść, tkanki zakonserwowane w parafinie i formalinie, tkanki świeże, krew

Bardziej szczegółowo

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 100 ml, 250 ml, 500 ml Nr kat. 038-100, 038-250, 038-500 Nietosyczny roztwór wodny do przechowywania i zabezpieczania różnego rodzaju tkanek

Bardziej szczegółowo

Spektrofotometryczna analiza jakościowa i ilościowa DNA i RNA za pomocą urządzenia NanoDrop protokół

Spektrofotometryczna analiza jakościowa i ilościowa DNA i RNA za pomocą urządzenia NanoDrop protokół Spektrofotometryczna analiza jakościowa i ilościowa DNA i RNA za pomocą urządzenia NanoDrop protokół Wiele laboratoriów ma problem z izolacją RNA. Ten wstępny etap może zaważyć na powodzeniu lub klęsce

Bardziej szczegółowo

Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0217

Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0217 Plasmid Maxi AX Sil Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0217 2 izolacje Nr kat. 093-02S Pojemność kolumny do oczyszczania

Bardziej szczegółowo

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji

Bardziej szczegółowo

GeneMATRIX Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit

GeneMATRIX Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit GeneMATRI Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit Uniwersalny zestaw do oczyszczania DNA z bakterii Gram +, Gram - oraz drożdży kat. nr E3580 Wersja zestawu 1.1 Wrzesień, 2008 Uwaga: Minikolumny

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Ćwiczenie 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Część doświadczalna obejmuje: - sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy - oznaczanie aktywności

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 1. Aminokwasy

ĆWICZENIE 1. Aminokwasy ĆWICZENIE 1 Aminokwasy Przygotować 5 (lub więcej) 1% roztworów poszczególnych aminokwasów i białka jaja kurzego i dla każdego z nich wykonać wszystkie reakcje charakterystyczne. Reakcja ksantoproteinowa

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna Podstawy

Biologia Molekularna Podstawy Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp.

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym,

Bardziej szczegółowo

2015-11-18. DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA

2015-11-18. DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA Fosfataza alkaliczna CIP Calf Intestine Phosphatase- pochodzenie: jelito cielęce BAP Bacterial Alcaline Phosphatase- pochodzenie: E. coli SAP Shrimp Alcaline Phosphatase- pochodzenie: krewetki Pandalus

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu

Bardziej szczegółowo

WPŁYW SUBSTANCJI TOWARZYSZĄCYCH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ OSADÓW

WPŁYW SUBSTANCJI TOWARZYSZĄCYCH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ OSADÓW WPŁYW SUBSTANCJI TOWARZYSZĄCYCH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ OSADÓW Wstęp W przypadku trudno rozpuszczalnej soli, mimo osiągnięcia stanu nasycenia, jej stężenie w roztworze jest bardzo małe i przyjmuje się, że ta

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012 www.dnagdansk.com Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN przeznaczony jest do szybkiej

Bardziej szczegółowo

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie Nazwa modułu: Genetyka molekularna Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3 Wydział: Elektrotechniki, Automatyki, Informatyki i Inżynierii Biomedycznej Kierunek: Inżynieria Biomedyczna

Bardziej szczegółowo

KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY (REAKCJA ENZYMATYCZNA I CHEMICZNA)

KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY (REAKCJA ENZYMATYCZNA I CHEMICZNA) Ćwiczenie nr 2 KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY (REAKCJA ENZYMATYCZNA I CHEMICZNA) ĆWICZENIE PRAKTYCZNE I. Kinetyka hydrolizy sacharozy reakcja chemiczna Zasada: Sacharoza w środowisku kwaśnym ulega hydrolizie

Bardziej szczegółowo

O trawieniu restrykcyjnym

O trawieniu restrykcyjnym O trawieniu restrykcyjnym Enzymy II klasy, Mg 2+, dsdna z rozpoznawaną sekwencją, tępe, lepkie (kohezyjne) końce, warunki reakcji bufor o różnym stężeniu NaCl i określonym ph BSA -stabilizator 37 o C /lub

Bardziej szczegółowo

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Specyfikacja zestawu 2 2.3

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI MANGANU W GLEBIE

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI MANGANU W GLEBIE OZNACZANIE ZAWARTOŚCI MANGANU W GLEBIE WPROWADZENIE Przyswajalność pierwiastków przez rośliny zależy od procesów zachodzących między fazą stałą i ciekłą gleby oraz korzeniami roślin. Pod względem stopnia

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE I - BIAŁKA. Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami fizykochemicznymi białek i ich reakcjami charakterystycznymi.

ĆWICZENIE I - BIAŁKA. Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami fizykochemicznymi białek i ich reakcjami charakterystycznymi. ĆWICZENIE I - BIAŁKA Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami fizykochemicznymi białek i ich reakcjami charakterystycznymi. Odczynniki: - wodny 1% roztwór siarczanu(vi) miedzi(ii), - 10% wodny

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności

Bardziej szczegółowo

Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji

Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią =================================================================

Bardziej szczegółowo

Recykling surowcowy odpadowego PET (politereftalanu etylenu)

Recykling surowcowy odpadowego PET (politereftalanu etylenu) Laboratorium: Powstawanie i utylizacja zanieczyszczeń i odpadów Makrokierunek Zarządzanie Środowiskiem INSTRUKCJA DO ĆWICZENIA 24 Recykling surowcowy odpadowego PET (politereftalanu etylenu) 1 I. Cel ćwiczenia

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie żelaza i miedzi metodą miareczkowania spektrofotometrycznego

Oznaczanie żelaza i miedzi metodą miareczkowania spektrofotometrycznego Oznaczanie żelaza i miedzi metodą miareczkowania spektrofotometrycznego Oznaczanie dwóch kationów obok siebie metodą miareczkowania spektrofotometrycznego (bez maskowania) jest możliwe, gdy spełnione są

Bardziej szczegółowo

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Wprowadzenie: Większość lądowych organizmów kręgowych część jonów amonowych NH + 4, produktu rozpadu białek, wykorzystuje w biosyntezie

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych

Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych

Bardziej szczegółowo

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu w porównaniu z analizą trankryptomu:

Bardziej szczegółowo

IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!!

IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!! WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!! W1-4p W2-4p W3-4p W4-4p W5-4p W6-4p W7-4p W8-4p W9-4p W10-4p min 21p wyjściówka I 40p wyjściówka II 40p egzamin I egzamin II min 21p 60p 60p min

Bardziej szczegółowo

GENETYKA MOLEKULARNA

GENETYKA MOLEKULARNA Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego GENETYKA MOLEKULARNA Materiały do zajęć laboratoryjnych Skrypt przygotowany przez pracowników Zakładu Genetyki UW Warszawa 2003 Spis treści Wstęp...3 Enzymy restrykcyjne...4

Bardziej szczegółowo

Laboratorium z biochemii

Laboratorium z biochemii Laboratorium z biochemii DLA STUDENTÓW BIOLOGII, BIOTECHNOLOGII I OCHRONY ŚRODOWISKA Praca zbiorowa pod redakcją Antoniego Polanowskiego Poprawki do wydania III wprowadzone pod redakcją Justyny Ciuraszkiewicz

Bardziej szczegółowo

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny.

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. 1 Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 1. Aminokwasy

ĆWICZENIE 1. Aminokwasy ĆWICZENIE 1 Aminokwasy Przygotować 5 (lub więcej) 1% roztworów poszczególnych aminokwasów i białka jaja kurzego i dla każdego z nich wykonać wszystkie reakcje charakterystyczne. Reakcja ksantoproteinowa

Bardziej szczegółowo

Endonukleazy restrykcyjne molekularne nożyczki

Endonukleazy restrykcyjne molekularne nożyczki Endonukleazy restrykcyjne molekularne nożyczki Inżynieria genetyczna nauka o technikach badawczych pozwalających na ingerencję w materiał genetyczny organizmów w celu wyizolowania i charakterystyki określonych

Bardziej szczegółowo

Nowoczesne systemy ekspresji genów

Nowoczesne systemy ekspresji genów Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą

Bardziej szczegółowo

Recykling surowcowy odpadowego PET (politereftalanu etylenu)

Recykling surowcowy odpadowego PET (politereftalanu etylenu) Utylizacja i neutralizacja odpadów Międzywydziałowe Studia Ochrony Środowiska INSTRUKCJA DO ĆWICZENIA 24 Recykling surowcowy odpadowego PET (politereftalanu etylenu) Opracowała: dr Elżbieta Megiel 1 I.

Bardziej szczegółowo

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość* Poznao, 6 lutego 2012 r. Zapytanie ofertowe nr 001 /2012 dotyczące zakupu odczynników chemicznych do izolacji DNA i reakcji PCR GENESIS Polska Sp. z o.o Ul. Za Cytadelą 19, 61-659 Poznao NIP 778 13 56

Bardziej szczegółowo

ALGALTOXKIT F Procedura testu

ALGALTOXKIT F Procedura testu ALGALTOXKIT F Procedura testu 1 PRZYGOTOWANIE STANDARDOWEJ POŻYWKI A B C D - KOLBKA MIAROWA (1 litr) - FIOLKI Z ROZTWORAMI POŻYWEK A (2 fiolki), B, C, D - DESTYLOWANA (lub dejonizowana) WODA 2 A PRZENIEŚĆ

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS Zagadnienia teoretyczne. Spektrofotometria jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska

Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska Adam Dawidowski Klasa III b (autor) mgr Beata Ulczyńska (opiekun) BADANIE WPŁYWU GENU orf654 Z OPERONU mboii NA ZJAWISKO PRZESUNIĘCIA RAMKI ODCZYTU TRANSLACJI -1 W ZMUTOWANYM GENIE mboiim2δ I Akademickie

Bardziej szczegółowo

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu Protokół pochodzi ze strony molekularnie.wordpress.com Kopiowanie i rozpowszechnianie wyłącznie w całości, z zachowaniem praw autorskich zgodnie z zasadami licencji GNU Dziękuję za uszanowanie mojej pracy,

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa Ćwiczenie 3 Izolacja i rozdział

Bardziej szczegółowo

LABORATORIUM CHEMII ORGANICZNEJ PROGRAM ĆWICZEŃ

LABORATORIUM CHEMII ORGANICZNEJ PROGRAM ĆWICZEŃ LABORATORIUM CHEMII ORGANICZNEJ Rok studiów: II CC-DI semestr III Liczba godzin: 15 (5 spotkań 3h co 2 tygodnie, zajęcia rozpoczynają się w 3 tygodniu semestru) PROGRAM ĆWICZEŃ Ćwiczenie nr 1 Ćwiczenie

Bardziej szczegółowo

Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej

Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej

Bardziej szczegółowo

Laboratorium 3 Toksykologia żywności

Laboratorium 3 Toksykologia żywności Laboratorium 3 Toksykologia żywności Literatura zalecana: Orzeł D., Biernat J. (red.) 2012. Wybrane zagadnienia z toksykologii żywności. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrocław. Str.:

Bardziej szczegółowo

WŁASNOŚCI FIZYKOCHEMICZNE BIAŁEK. 1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego białka

WŁASNOŚCI FIZYKOCHEMICZNE BIAŁEK. 1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego białka 12. WŁASNOŚCI FIZYKOCHEMICZNE BIAŁEK 1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego białka Oznaczenie opiera się na najniŝszej rozpuszczalności białek, w tym analizowanej kazeiny, w środowisku o wartości ph równej

Bardziej szczegółowo

Syngen Gel/PCR Mini Kit

Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR ME Mini Kit Zestawy do oczyszczania DNA: - z żelu agarozowego - po reakcji PCR i innych reakcjach enzymatycznych - z żelu agarozowego z małą objętością elucji - po

Bardziej szczegółowo

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR Ćwiczenie 11 METODA RT-PCR Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych: bromek etydyny T+ EDTA Xi etanol, 96% F kwas octowy, 96% C -merkaptoetanol N, T Tris Xi UWAGI WSTĘPNE Praca z kwasami

Bardziej szczegółowo

1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej.

1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej. ĆWICZENIE OZNACZANIE AKTYWNOŚCI LIPAZY TRZUSTKOWEJ I JEJ ZALEŻNOŚCI OD STĘŻENIA ENZYMU ORAZ ŻÓŁCI JAKO MODULATORA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ. INHIBICJA KOMPETYCYJNA DEHYDROGENAZY BURSZTYNIANOWEJ. 1. Oznaczanie

Bardziej szczegółowo

BADANIE WŁASNOŚCI KOENZYMÓW OKSYDOREDUKTAZ

BADANIE WŁASNOŚCI KOENZYMÓW OKSYDOREDUKTAZ KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska BADANIE WŁASNOŚCI KOENZYMÓW OKSYDOREDUKTAZ ĆWICZENIE 2 Nukleotydy pirydynowe (NAD +, NADP + ) pełnią funkcję koenzymów dehydrogenaz przenosząc jony

Bardziej szczegółowo

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 4. Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne

Ćwiczenie 4. Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne Klasyczna Analiza Jakościowa Organiczna, Ćw. 4 - Identyfikacja wybranych cukrów Ćwiczenie 4 Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne Zagadnienia teoretyczne: 1. Budowa

Bardziej szczegółowo

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła

Bardziej szczegółowo

RÓWNOWAGI W ROZTWORACH ELEKTROLITÓW.

RÓWNOWAGI W ROZTWORACH ELEKTROLITÓW. RÓWNOWAGI W ROZTWORACH ELEKTROLITÓW. Zagadnienia: Zjawisko dysocjacji: stała i stopień dysocjacji Elektrolity słabe i mocne Efekt wspólnego jonu Reakcje strącania osadów Iloczyn rozpuszczalności Odczynnik

Bardziej szczegółowo

Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?

Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych sekwencjach nukleotydów

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 3. Cukry mono i disacharydy

ĆWICZENIE 3. Cukry mono i disacharydy ĆWICZENIE 3 Cukry mono i disacharydy Reakcja ogólna na węglowodany (Reakcja Molischa) 1 ml 1% roztworu glukozy 1 ml 1% roztworu fruktozy 1 ml 1% roztworu sacharozy 1 ml 1% roztworu skrobi 1 ml wody destylowanej

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 2: Właściwości osmotyczne koloidalnych roztworów biopolimerów.

Ćwiczenie 2: Właściwości osmotyczne koloidalnych roztworów biopolimerów. 1. Część teoretyczna Właściwości koligatywne Zjawiska osmotyczne związane są z równowagą w układach dwu- lub więcej składnikowych, przy czym dotyczy roztworów substancji nielotnych (soli, polisacharydów,

Bardziej szczegółowo

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL PL 220315 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 220315 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 400252 (22) Data zgłoszenia: 06.08.2012 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7 Poznań, dnia 28.04.2014 r. BioVentures Institute Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością ul. Promienista 83 60 141 Poznań Zapytanie ofertowe nr 01/2014 Projekt Nowa technologia wytwarzania szczepionek

Bardziej szczegółowo