Skład kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w tkance nowotworowej u chorych na raka jelita grubego w zależności od umiejscowienia guza

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(4): Praca oryginalna Original Article Skład kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w tkance nowotworowej u chorych na raka jelita grubego w zależności od umiejscowienia guza Fatty acids composition in tissue phospholipids depends on tumor localization in colorectal cancer patients Jolanta Bugajska 1, Joanna Berska 1, Małgorzata Wilusz 1, Diana Hodorowicz-Zaniewska 2, Krystyna Sztefko 1 1 Zakład Biochemii Klinicznej, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CMUJ 2 I Katedra Chirurgii Ogólnej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Streszczenie Przypuszcza się, że niektóre kwasy tłuszczowe biorą udział w patogenezie raka jelita grubego. Płynność błon komórkowych zależy od proporcji kwasów tłuszczowych nasyconych do nienasyconych zawartych w fosfolipidach. Niższa wartość indeksu nasycenia (SI) będącego stosunkiem kwasu stearynowego (C18) do kwasu oleinowego (C18:1) w błonach erytrocytów i tkankach nowotworowych może sugerować wykorzystanie SI jako potencjalnego markera nowotworowego. Cel: Ocena stężenia kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów oraz indeksu nasycenia w tkance prawidłowej i w tkance zmienionej nowotworowo chorych na raka jelita grubego. Badaniem objęto 49 chorych z rakiem jelita grubego. W tkankach jelita zmienionych nowotworowo (CA) oraz tkankach wolnych od procesu nowotworowego (NCA) oznaczono metodą chromatografii gazowej następujące kwasy: laurynowy-c12, mirystynowy-c14, palmitynowy-c16, palmitooleinowy-c16:1, stearynowy-c18, oleinowy-c18:1, linolowy-c18:2, i arachidonowy-c20:4. Obliczono całkowitą zawartość nasyconych (SFA), i jednonienasyconych (MUFA) kwasów tłuszczowych oraz indeks nasycenia (SI). Wyniki: Średnie wartości stężenia kwasów: C14, C16:1, C18:2, C20:4 (lokalizacja proksymalna nowotworu), kwasów: C16, C16:1, C18, C18:1, C18:2, C20:4 (lokalizacja dystalna nowotworu), oraz kwasów: C14 i C16:1 (nowotwór zlokalizowany w odbytnicy), były statystycznie znamiennie wyższe w tkance CA w porównaniu do tkanki NCA (p< ). Średnie wartości MUFA i SFA były statystycznie znamiennie wyższe w tkance CA w stosunku do tkanki NCA u pacjentów, u których nowotwór umiejscowiony był w dystalnej części jelita (p<0,04-0,005). Natomiast wartość SI była statystycznie znamiennie niższa w tkance CA w stosunku do tkanki NCA u pacjentów, u których nowotwór umiejscowiony był w proksymalnej części jelita (p<0,002). Wniosek: Skład kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów tkanki nowotworowej oraz indeks nasycenia u pacjentów z rakiem jelita zależą od umiejscowienia nowotworu. Summary Evidence show that fatty acids play a role in etiology of colorectal cancer. The degree of membrane fluidity depends on the ratio of saturated to unsaturated fatty acids in phospholipids (PL). Lower value saturation index (the ratio of C18 to C18:1 concentration, SI) in erythrocyte membranes and malignant tissues of patients with solid tumors indicates that this index could be used as a tumor marker. The aim: To compare the fatty acids (FA) of phospholipids and SI in colorectal cancer patients in relation to tumor localization. The study included 49 patients. Tissue level of cancerous (CA) and non-cancerous (NCA) tissue saturated FA (C12-lauric, C14-myristic, C16-palmitic, C18-stearic) and unsaturated FA (C16:1-palmitooleic, C18:1-oleic, C18:2-linoleic, C20:4-arachidonic) fatty acids were measured by gas chromatography. Total concentration of FA of PL, saturated FA (SFA), monounsaturated FA (MUFA) and SI were calculated. Results: The mean values of C14, C16:1, C18:2, C20:4 (proximal tumor location), all FA except C12, C14 (distal tumor location) and C14, C16:1(rectal tumor) were significantly higher in CA tissue as compared to NCA tissue (p< ). MUFA, SFA and total FA were significantly higher in CA as compared to NCA but only in patients with distal tumor localization the difference was significant (p< ). In contrast, significantly lower SI in CA as compared to NCA was observed only in patients with proximal tumor localization (p<0.002). Conclusion: FA composition of tissue phospholipid fraction, as well as SI value, depend on tumor localization in colorectal cancer patients. Słowa kluczowe: Key words: kwasy tłuszczowe, nowotwory jelita grubego fatty acids, colorectal cancer 287

2 Wstęp Wieloletnie badania epidemiologiczne wskazują nie tylko na stały wzrost liczby zachorowań na nowotwory złośliwe na świecie, ale również na wzrost spowodowanej nimi śmiertelności. W 2008 roku nowotwory jelita grubego i odbytnicy zajmowały trzecie miejsce u mężczyzn i drugie u kobiet wśród przyczyn zgonów na nowotwory złośliwe [1]. Nowotwory jelita grubego mogą być umiejscowione proksymalnie (kątnica, wstępnica, poprzecznica) lub dystalnie (zstępnica, esica) względem zagięcia śledzionowego lub w odbytnicy [2]. Poszczególne fragmenty jelita cechują różnice anatomiczne, fizjologiczne i biochemiczne, zatem nowotwory jelita mogą różnić się w zależności od umiejscowienia [3]. Sugeruje się, że ryzyko wystąpienia raka jelita grubego spowodowane przez czynniki środowiskowe i genetyczne jest różne dla proksymalnego i dystalnego umiejscowienia nowotworu [4]. Wykazano też, że pacjenci z nowotworem zlokalizowanym w części proksymalnej jelita mają o 13% mniejsze prawdopodobieństwo pięcioletniego przeżycia w porównaniu do pacjentów z nowotworem zlokalizowanym w części dystalnej jelita [5]. Chociaż ryzyko zachorowania na nowotwory złośliwe jelita grubego i odbytnicy wzrasta wraz ze wzrostem BMI, to nie wykazano różnic w wartościach BMI u chorych na raka jelita w zależności od umiejscowienia nowotworu [6]. Spośród czynników środowiskowych mający wpływ na powstawanie i rozwój raka jelita grubego istotne znaczenie mają nawyki żywieniowe. Różnorodność kwasów tłuszczowych dostarczanych z dietą odzwierciedla się w ich zawartości we frakcji fosfolipidów błon komórkowych. Cechy błon komórkowych tj. przepuszczalność a także aktywność enzymów i receptorów błonowych zależą od proporcji kwasów tłuszczowych nasyconych do nienasyconych zawartych w fosfolipidach. Długość łańcuchów węglowodorowych kwasów tłuszczowych, stopień ich nasycenia i konformacja mają duży wpływ na płynność błon. Wiadomo, że zwiększenie płynności błon prowadzi do wzrostu metabolizmu komórek [7], a cechą charakterystyczną komórek nowotworowych jest właśnie ich zwiększony metabolizm, wzmożone podziały i w konsekwencji intensywny wzrost. Z tego powodu oznaczanie stężenia kwasów tłuszczowych jest jedną z dróg poszukiwania markerów nowotworowych. Przykładem jest wykorzystanie indeksu nasycenia (SI; saturation index), będącego stosunkiem stężenia kwasu stearynowego (C18) do stężenia kwasu oleinowego (C18:1). Wykazano, że kwas stearynowy znacząco hamuje rozwój raka sutka u szczurów, a efektem obniżenia zawartości kwasu C18, jest niższa wartość SI u zwierząt z nowotworem [8]. Chociaż wyniki badań w tym zakresie u ludzi są niejednoznaczne, to u osób z różnymi nowotworami stwierdza się niższe poziomy kwasu C18 oraz wyższe kwasu C18:1 w porównaniu do grupy kontrolnej [9]. Niższy indeks nasycenia uzyskano także dla kwasów tłuszczowych zawartych w błonach erytrocytów u pacjentów z nowotworami [10]. Podobne wyniki otrzymano u pacjentów z rakiem pęcherzyka żółciowego, u których wykazano niższą wartość SI zarówno w porównaniu do grupy kontrolnej jak i do grupy pacjentów z kamicą żółciową [11]. Także u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego uzyskano niższy SI w porównaniu do grupy kontrolnej [12]. Natomiast Neoptolemos i wsp. nie stwierdzili różnic w wartościach SI dla kwasów oznaczanych w błonach erytrocytów u pacjentów z nowotworem jelita grubego w porównaniu do grupy kontrolnej [13]. W piśmiennictwie dostępne są tylko nieliczne doniesienia dotyczące wartości SI wyliczonego w oparciu o stężenie kwasów tłuszczowych oznaczone w tkance nowotworowej. Neoptolemos i wsp. [14] u chorych na raka jelita grubego i odbytnicy stwierdzili wyższą wartość SI w tkance zmienionej nowotworowo w porównaniu do tkanki prawidłowej, natomiast Chaudry i wsp. [15] u pacjentów ze zmianami chorobowymi otrzymali niższe wartości SI w tkance prostaty w zaawansowanej zmianie nowotworowej w porównaniu do zmiany łagodnej. Indeks nasycenia może być przydatny także w przewidywaniu ryzyka nawrotu choroby u pacjentów z rakiem prostaty [16, 17]. Nie wiadomo, czy u chorych na raka jelita grubego wartość SI mogłaby być wykorzystana jako marker nowotworowy. Celem pracy była ocena stężenia kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów oraz indeksu nasycenia w tkance prawidłowej i w tkance zmienionej nowotworowo u chorych na raka jelita grubego. Materiał i metody Badaniem objęto 49 chorych na raka jelita grubego (26 mężczyzn i 23 kobiety) w wieku 63,5±10,3 lat. U wszystkich pacjentów przeprowadzono zabieg chirurgiczny usunięcia guza i określono stopień zaawansowania choroby nowotworowej zgodnie z klasyfikacją Dukes a w modyfikacji Astler-Collera i TNM (UICC/AJCC). Dwóch chorych (4,1%) było w 0 stopniu zaawansowania choroby, 16 chorych (32,7%) w I stopniu, 5 chorych (10,2%) w II stopniu, 8 chorych (16,3%) w III stopniu, a 18 chorych (36,7%) w IV stopniu zaawansowania choroby nowotworowej. Zmiana nowotworowa u 14 chorych (28,6%) była zlokalizowana w części proksymalnej jelita grubego (grupa I), u 13 chorych (26,5%) w części dystalnej jelita (grupa II), a u 22 chorych (44,9%) guz zlokalizowany był w odbytnicy (grupa III). Prawidłowe BMI stwierdzono u 19 pacjentów, 22 miało nadwagę a ośmiu było w I stopniu otyłości. Podczas zabiegu usunięcia guza pobrano fragmenty tkanek zmienionych nowotworowo (CA) oraz fragmenty jelita wolne od procesu nowotworowego (NCA), które zamrożono i przechowywano w temperaturze -70 C do chwili wykonywania oznaczeń. We wszystkich próbkach tkanek oznaczono metodą chromatografii gazowej stężenia poszczególnych kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów, oraz metodą Bradforda (Bio-Rad Protein Assay, USA) oznaczono stężenie białka całkowitego. Próbki tkanek po rozmrożeniu i umieszczeniu w roztworze soli fizjologicznej dokładnie rozdrobniono i zhomogenizowano, a następnie ekstrahowano lipidy metodą Folcha i wsp. [18]. Rozdział frakcji lipidowych przeprowadzano na kolumienkach Sep-Pak NH 2 (Waters, USA) zgodnie z procedurą Kaluzny i wsp [19]. Metylację kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów prowadzono w temperaturze 100 C w szczelnie zamkniętych probówkach w atmosferze azotu przez 90 minut, stosując 14% BF 3 w metanolu (Sigma-Aldrich, Niemcy). Uzyskane estry metylowe kwasów tłuszczowych ekstrahowano heksanem, odparowywano w atmosferze azotu a następnie rozpuszczano suchą pozostałość w 100 ml heksanu. Rozdział estrów metylowych kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów wykonano przy użyciu 288

3 Diagn Lab 2014; 50(4): chromatografu gazowego (Agilent Technologies 6890N Network GC Systems), wyposażonego w detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) oraz dozownik 7683B. Do rozdziału zastosowano kolumnę HP-88 (100 m, 0,250 mm, 0,20 μm). Jako wzorzec wewnętrzny wykorzystano 1,2-dipentadekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (Sigma-Aldrich, Niemcy). Kwasy tłuszczowe identyfikowano na podstawie porównania czasów retencji poszczególnych kwasów tłuszczowych, z czasami retencji kwasów wchodzących w skład mieszaniny kalibracyjnej. Oznaczono stężenie następujących kwasów: kwas laurynowy (C12), kwas mirystynowy (C14), kwas palmitynowy (C16), kwas palmitooleinowy (C16:1(n-7)), kwas stearynowy (C18), kwas oleinowy (C18:1(n-9)), kwas linolowy (C18:2(n-6)), kwas arachidonowy (C20:4(n-6)). Obliczenia statystyczne Wyniki stężenia kwasów tłuszczowych podawano w μmol/g białka. Do oceny statystycznej wykorzystano średnie arytmetyczne i odchylenie standardowe. Całkowitą zawartość kwasów tłuszczowych (FA całk ), nasyconych kwasów tłuszczowych (SFA), jednonienasyconych kwasów tłuszczowych (MUFA) oraz indeks nasycenia (SI) obliczono wg następujących wzorów: FA całk = C12+C14+C16+C18+C16:1(n-7)+C18:1(n-9)+C18:2(n- -6)+C20:4(n-6) SFA = C14+C16+C18 MUFA = C16:1(n-7)+C18:1(n-9) SI = C18/C18:1 Oceniano rozkład zmiennych ciągłych pod kątem zgodności z rozkładem normalnym stosując test Shapiro-Wilka. Różnice pomiędzy wartościami średnich określono przy użyciu analizy Ryc. 1 Stężenia nasyconych kwasów tłuszczowych: C12, C14, C16, C18 w tkance zmienionej nowotworowo (CA) oraz wolnej od procesu nowotworowego (NCA) w zależności od umiejscowienia nowotworu (grupa I guz zlokalizowany w części proksymalnej jelita grubego, grupa II guz zlokalizowany w części dystalnej jelita grubego, grupa III guz zlokalizowany w odbytnicy). wariancji Anova. Jako testu post-hoc użyto test Tukeya dla różnych N. Wartość p<0,05 przyjęto za statystycznie znamienną. Do analizy statystycznej wykorzystano program Statistica 10 (StatSoft) oraz Microsoft Excel Wyniki Średnia wartość stężenia białka całkowitego w tkankach zmienionych nowotworowo (CA) oraz w tkankach wolnych od procesu nowotworowego (NCA) nie była zależna od umiejscowienia zmiany nowotworowej. Średnie wartości stężenia kwasów: C14, C16:1, C18:2, C20:4 w grupie I, kwasów: C16, C16:1, C18, C18:1, C18:2, C20:4 w grupie II oraz kwasów: C:14 i C16:1 w grupie III były statystycznie znamiennie wyższe w tkance CA w porównaniu do tkanki NCA (p<0,05-p<0,004) (ryc.1, ryc.2). W tkance zmienionej nowotworowo średnia wartość stężenia FA całk była wyższa w porównaniu do analogicznej wartości w tkance wolnej od procesu nowotworowego, jednakże statystycznie istotną różnicę stwierdzono tylko dla grupy II (nowotwór w części dystalnej jelita) (p<0,04) (ryc. 3). Średnie wartości MUFA i SFA były statystycznie znamiennie wyższe w tkance CA w stosunku do tkanki NCA w grupie II (odpowiednio p<0,005; p<0,02), natomiast wartość SI była statystycznie znamiennie niższa w tkance CA w stosunku do tkanki NCA w grupie I (p<0,002) (ryc. 3). Nie stwierdzono zależności pomiędzy BMI a umiejscowieniem nowotworu. Dyskusja Kwasy tłuszczowe biorą udział w wielu reakcjach biochemicznych organizmu, są też wbudowywane w błony komórkowe a w razie potrzeby są z nich uwalniane i transportowane we krwi w kompleksach białkowo-lipidowych do miejsc docelowych. Podczas procesu nowotworowego dochodzi do zmian w metabolizmie kwasów tłuszczowych, a kwasy tłuszczowe pochodzące z frakcji fosfolipidów uznawane są za najbardziej czuły wskaźnik tych zmian. Analizę kwasów tłuszczowych w tkankach można przeprowadzić oznaczając je łącznie we wszystkich frakcjach lipidowych (mono-, dii triglicerydach, estrach cholesterolu i fosfolipidach) lub też oznaczyć je tylko w wybranej frakcji. Z tego powodu porównywanie wyników różnych prac dotyczących kwasów tłuszczowych jest bardzo trudne. W obecnej pracy przeanalizowano kwasy tłuszczowe frakcji fosfolipidów z tkanki prawidłowej i z tkanki zmienionej nowotworowo pobranych od pacjentów z nowotworem jelita grubego, z uwzględnieniem szczegółowej lokalizacji zmiany nowotworowej. W piśmiennictwie można znaleźć 289

4 Ryc. 2 Stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych: C16:1, C18:1, C18:2 i C20:4 w tkance zmienionej nowotworowo (CA) oraz wolnej od procesu nowotworowego (NCA) w zależności od umiejscowienia nowotworu (grupa I guz zlokalizowany w części proksymalnej jelita grubego, grupa II guz zlokalizowany w części dystalnej jelita grubego, grupa III guz zlokalizowany w odbytnicy). Ryc. 3 Parametry wyliczone: suma kwasów tłuszczowych (FA całk ), suma nasyconych kwasów tłuszczowych (SFA), suma jednonienasyconych kwasów tłuszczowych (MUFA) oraz indeks nasycenia (SI, C18/C18:1) w tkance zmienionej nowotworowo (CA) oraz wolnej od procesu nowotworowego (NCA) w zależności od umiejscowienia nowotworu (grupa I guz zlokalizowany w części proksymalnej jelita grubego, grupa II guz zlokalizowany w części dystalnej jelita grubego, grupa III guz zlokalizowany w odbytnicy). niewiele prac, w których analizowano kwasy tłuszczowe w poszczególnych frakcjach lipidowych. Najczęściej stężenia kwasów tłuszczowych oznaczane były łącznie we wszystkich frakcjach lipidowych [14, 16, 17] a rzadko publikowane są prace dotyczące kwasów tłuszczowych we frakcji fosfolipidów pochodzących z tkanki [15]. Porównanie wyników stężeń poszczególnych kwasów tłuszczowych z danymi innych autorów jest trudne również z powodu różnego sposobu wyrażania wyników. Niektórzy autorzy przeliczają zawartość kwasów tłuszczowych na gram tkanki [14] a inni podają ich zawartość jako udział odsetkowy [15-17]. W obecnej pracy z kolei zawartość kwasów określano podając ich ilość na gram białka. Banares i wsp. [20] oznaczali indywidualne kwasy tłuszczowe we wszystkich frakcjach lipidowych łącznie u chorych na raka jelita grubego i odbytnicy. Otrzymali oni wyższą procentową zawartość kwasów nasyconych (C16+C18+C24) w tkance zmienionej nowotworowo względem tkanki wolnej od procesu nowotworowego. Natomiast nie zaobserwowali różnic dla kwasu C18:2 oraz kwasu C20:4 pomiędzy tkanką NCA a tkanką CA. W obecnej pracy wykazano wyższe stężenia SFA, jak również wyższe stężenie kwasów C18:2 i C20:4 w tkance CA względem tkanki NCA. W badaniach przeprowadzonych na szczurach Nicholson i wsp.[21], analizując wpływ bogato tłuszczowej diety na rozwój nowotworu jelita grubego, stwierdzili wyższą zawartość kwas arachidonowego w tkance guza w porównaniu do prawidłowej tkanki jelita. Natomiast nie wykazali oni różnic w zawartości kwasu C18:2 w badanych fragmentach tkanek zmienionych nowotworowo i wolnych od procesu nowotworowego. Neoptolemos i wsp. [14] u chorych na raka jelita grubego uzyskali wyższą wartość SI w tkance zmienionej nowotworowo w porównaniu do tkanki prawidłowej co nie jest zgodne z wynikami obecnej pracy. Jednakże autorzy ci oznaczali kwasy tłuszczowe we wszystkich frakcjach lipidowych tkanki, wyrażając wyniki procentowo oraz w mg/g tkanki. Trudno jest zatem dokonać jakiegokolwiek porównania. Istotnym wynikiem obecnej pracy jest wykazanie statystycznych zmian wartości SI u pacjentów, u których zmiana nowotworowa zlokalizowana była w części proksymalnej jelita. U pacjentów mających nowotwór w części dystalnej jelita lub w odbytnicy wartości SI w tkance NCA i tkance CA był porównywalne. Uzyskane w obecnej pracy wyniki mogą być odniesione do prac dotyczących przeżywalności pacjentów z różnym umiejscowieniem nowotworu, bowiem 290

5 Diagn Lab 2014; 50(4): mniejsze prawdopodobieństwo przeżycia dotyczyło pacjentów z umiejscowieniem nowotworu w części proksymalnej jelita [5]. Oczywiście nie jest to zależność przyczynowa, ale wiadomo że właściwe proporcje kwasów tłuszczowych w fosfolipidach mogą mieć wpływ na funkcjonowanie błon komórkowych. Poszukiwanie nowych biomarkerów mogących polepszyć wczesną diagnostykę nowotworów jest żmudnym procesem, rzadko kończącym się sukcesem. Ale zawsze poznawcze aspekty takich działań przyczyniają się do lepszego zrozumienia przemian biochemicznych zachodzących w całym organizmie lub tylko w tkance nowotworowej. Obecna praca wykazała, że ocena potencjalnych markerów, przynajmniej z punktu widzenia przemian lipidowych, musi uwzględniać umiejscowienie guza u pacjentów z rakiem jelita grubego. Wniosek Skład kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów tkanki nowotworowej oraz indeks nasycenia u pacjentów z rakiem jelita zależą od umiejscowienia nowotworu. purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957; 226: Kaluzny MA, Duncan LA, Merritt MV, et al. Rapid separation of lipid classes in high yield and purity using bonded phase columns. J Lipid Res 1985; 26: Fernandez-Banares F, Esteve M, Navarro E, et al. Changes of the mucosal n3 and n6 fatty acid status occur early in the colorectal adenoma-carcinoma sequence. Gut 1996; 38: Nicholson ML, Neoptolemos JP, Clayton HA, et al. Increased cell membrane arachidonic acid in experimental colorectal tumours. Gut 1991; 32: Adres do korespondencji: dr n. med. Jolanta Bugajska Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kraków, ul. Wielicka jola.bugajska@uj.edu.pl Zaakceptowano do druku: Piśmiennictwo 1. Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011; 61: Iacopetta B. Are there two sides to colorectal cancer? Int J Cancer 2002; 101: Carethers JM. One colon lumen but two organs. Gastroenterology 2011; 141: Bufill JA. Colorectal cancer: evidence for distinct genetic categories based on proximal or distal tumor location. Ann Intern Med 1990; 113: Wong R. Proximal tumors are associated with greater mortality in colon cancer. J Gen Intern Med 2010; 25: Robsahm TE, Aagnes B, Hjartaker A, et al. Body mass index, physical activity, and colorectal cancer by anatomical subsites: a systematic review and meta-analysis of cohort studies. Eur J Cancer Prev 2013; 22: Cooper RA. Abnormalities of cell-membrane fluidity in the pathogenesis of disease. N Engl J Med 1977; 297: [8] Habib NA, Wood CB, Apostolov K et al. Stearic acid and carcinogenesis. Br J Cancer 1987; 56: Mikirova N, Riordan HD, Jackson JA, et al. Erythrocyte membrane fatty acid composition in cancer patients. P R Health Sci J 2004; 23: Kelly SB, Miller J, Wood CB, et al. Erythrocyte stearic acid desaturation in patients with colorectal carcinoma. Dis Colon Rectum 1990; 33: Pandey M, Khatri AK, Dubey SS, et al. Erythrocyte membrane stearic to oleic acid ratio in carcinoma of the gallbladder: a preliminary study. Eur J Surg Oncol 1998; 24: Persad RA, Gillatt DA, Heinemann D, et al. Erythrocyte stearic to oleic acid ratio in prostatic carcinoma. Br J Urol 1990; 65: Neoptolemos JP, Thomas BS. Erythrocyte membrane stearic acid: oleic acid ratios in colorectal cancer using tube capillary column gas liquid chromatography. Ann Clin Biochem 1990; 27(Pt 1): Neoptolemos JP, Husband D, Imray C, et al. Arachidonic acid and docosahexaenoic acid are increased in human colorectal cancer. Gut 1991; 32: Chaudry A, McClinton S, Moffat LE, et al. Essential fatty acid distribution in the plasma and tissue phospholipids of patients with benign and malignant prostatic disease. Br J Cancer 1991; 64: Kositsawat J, Flanigan RC, Meydani M, et al. The ratio of oleic-to-stearic acid in the prostate predicts biochemical failure after radical prostatectomy for localized prostate cancer. J Urol 2007; 178: ; discussion Freeman VL, Flanigan RC, Meydani M. Prostatic fatty acids and cancer recurrence after radical prostatectomy for early-stage prostate cancer. Cancer Causes Control 2007; 18: Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and 291

6 292