(12) OPIS PATENTOWY. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US95/06915

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (21 ) Numer zgłoszenia: (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US95/06915 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W096/00583, PCT Gazette nr 03/96 (5 1 ) IntCl7 A61K 39/12 A61K 31/711 A61P 35/00 ( 5 4 ) Szczepionka polinukieotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków (30) Pierwszeństwo: ,US,08/ (73) Uprawniony z patentu: MERCK & CO.,INC, Rahway, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 09/97 (72) Twórcy wynalazku: John J. Donnelly, Rahway, US Margaret A. Liu, Rahway, US Douglas Martinez, Rahway, US Donna L. Montgomery, Rahway, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/01 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Spółka z 0.0. PL B1 (57) 1. Szczepionka polinukieotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający: a) co najmniej jeden polinukleotyd kodujący białko ludzkiego wirusa brodawczaków (HPV) wybrane z grupy obejmującej L 1 i L1+L2 jednego lub więcej typów HPV wybranych spośród HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 i HPV 18, b) promotor CMV, c) terminator transkrypcji z genu bydlęcego hormonu wzrostu i d) gen markerowy oporności na neomycynę, w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze.

2 Szczepionka polinukleotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków Zastrzeżenia patentowe 1. Szczepionka polinukleotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający: a) co najmniej jeden polinukleotyd kodujący białko ludzkiego wirusa brodawczaków (HPV) wybrane z grupy obejmującej L 1 i L 1 + L2 jednego lub więcej typów HPV wybranych spośród HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 i HPV 18, b) promotor CMV, c) terminator transkrypcji z genu bydlęcego hormonu wzrostu i d) gen markerowy oporności na neomycynę, w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze. 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że jako wektor zawiera VIJneo lub VIJns. * * * Przedmiotem wynalazku jest szczepionka polinukleotydow a dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków. Wynalazek dotyczy nowego produktu farmaceutycznego: kwasu nukleinowego, który po wprowadzeniu bezpośrednio do tkanki żywego kręgowca wywołuje odpowiedź odpornościową swoiście rozpoznającą wirusa brodawczaków. Zakażenia wirusem brodawczaków (PV) mają miejsce u wielu zwierząt, w tym ludzi, owiec, psów, kotów, królików, małp, węży i cieląt. Wirusy brodawczaków zakażają komórki nabłonkowe, wywołując łagodne nowotwory nabłonkowe i włóknisto-nabłonkowe w miejscu zakażenia. Wirusy brodawczaków s ą czynnikiem zakaźnym swoistym dla gatunku tzn. ludzkie wirusy brodawczaków generalnie nie zakażają innych zwierząt. Wirusy brodawczaków m ogą być podzielone na osobne grupy, w oparciu o gospodarza, którego zakażaj ą. Ludzkie wirusy brodawczaków (HPV) są dalej dzielone na ponad 60 rodzaj ów, w oparciu o homologię sekwencji DNA (patrz, praca przeglądowa: Papillomaviruses and Human Cancers, H. Pfister (ed.) CRC Press Inc., 1990). Zakażenia wirusem brodawczaków wydają się wywoływać odpowiedź odpornościową swoistą dla rodzaju, tak że odpowiedź neutralizująca na jeden z rodzajów wirusa nie zapewnia odporności wobec innego typu wirusa brodawczaków. U ludzi, różne rodzaje HPV powodują różne choroby, HPV typów 1,2,3,4, 7,10 i pow odują łagodne brodawki u osobników zarówno normalnych jak i poddanych immunosupresji. HPV typów 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 i powodują płytkie owrzodzenia u osobników poddanych immunosupresji. HPV typów 6, 11, 34, 39, i powodują niezłośliwe kłykciny na śluzówce narządów płciowych. HPV typów 16 i 18 powodują dysplazję nabłonkową na śluzówce narządów płciowych i są związane z większością raków in situ i inwazyjnych szyjki macicy, pochwy, sromu i kanału odbytu. Badania immunologiczne na zwierzętach wykazały, że wytwarzanie przeciwciał neutralizujących przeciwko antygenom wirusa brodawczaków zapobiega zakażeniu przez wirus homologiczny. Opracowanie efektywnych szczepionek przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków zostało spowolnione przez trudności związane z hodow lą wirusów brodawczaków in vitro. Opracowanie efektywnej szczepionki przeciwko HPV zostało szczególnie spowolnione przez brak odpowiedniego modelu zwierzęcego. Neutralizacja wirusów brodawczaków przez przeciwciała wydaje się być swoista dla rodzaju i zależy od epitopów konformacyjnych na powierzchni wirusa.

3 Wirusy brodawczaków są małymi (50-60 nm) bezotoczkowymi, ejkozaedralnymi wirusami DNA, kodującymi geny wczesne i późne. Otwarte ramki odczytu (ORF) genomów wirusa oznaczone zostały od E 1 do E 7 i L 1 i L2, gdzie E oznacza wczesny, zaś L oznacza późny. L 1 i L2 kodują białka kapsy du wirusa. E 1 do E3 i E5 do E7 związane są z takimi funkcjami wirusa jak replikacja i transformacja komórkowa. Białko L 1 stanowi główne białko kapsydu o ciężarze cząsteczkowym równym kda. Białko L2 jest pobocznym białkiem kapsydu o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym około kda i pozornym ciężarze cząsteczkowym kda, co stwierdzono przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym. Dane immunologiczne i dane uzyskane z mikroskopu elektronowego sugerują, że większość białka L2 stanowi wnętrze białka L 1. Białka L2 są silnie zakonserwowane wśród różnych wirusów brodawczaków, zwłaszcza dziesięć zasadowych aminokwasów końca C. ORF L 1 jest silnie zakonserwowana wśród różnych wirusów brodawczaków. Geny L 1 i L2 stosowano do wytworzenia rekombinowanych białek do potencjalnego użycia do zapobiegania i leczenia zakażeń wirusami brodawczaków. Zhou i in., (1991,1992) wklonowali geny L 1 i L2 HPV typu 16, do wektora wirusa krowianki i zakazili komórki ssaków CV-1 wektorem rekombinowanym w celu wytworzenia cząstek wiroidalnych (VLP). Badania te interpretuje się jako stwierdzające, że ekspresja białek zarówno L 1 jak i L2 HPV typu 16 w komórkach nabłonkowych jest niezbędna i wystarczająca do umożliwienia tworzenia VLP. Ekspresja samego białka L 1 albo samego L2 albo podwójne zakażenie pojedynczymi rekombinowanymi wektorami wirusowymi krowianki zawierającymi geny L 1 i L2 nie powodowała wytwarzania cząstek. Wytworzono uzyskane z bakterii rekombinowane L 1 i L2 bydlęcych wirusów brodawczaków. Surowice neutralizujące w stosunku do białek z rekombinowanych bakterii w małym stopniu reagowały krzyżowo z wirusem natywnym, prawdopodobnie z powodu różnic konformacyjnych białek natywnych i uzyskanych z bakterii. Rekombinowane bakulowirusy ekspresjonujące otwarte ramki odczytu L 1 HPV 6 lub L2 HPV 16, zastosowano do zakażenia owadzich komórek SF9 i wytworzenia białek L 1 i L2. Analiza metodą Western blot wykazała, że uzyskane z bakulowirusa białka L 1 i L2 oddziaływały z przeciwciałem przeciwko HPV 16. Pokazano również wytwarzanie białek L 1 HPV 16 i L2 HPV 16 przez rekombinowany szczep Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zarówno u myszy jak i u ludzi są zdolne do rozpoznawania epitopów pochodzących z zakonserwowanych wewnętrznych białek wirusa i uważane są za kluczowe w odpowiedzi układu odpornościowego na wirusy, czyni się wysiłki aby opracować szczepionki CTL zdolne do zapewnienia ochrony heterologicznej przeciwko różnym szczepom wirusa. Wiadomo, że CTL CD8+ niszczą zakażone wirusem komórki, gdy ich receptory limfocytów T rozpoznają wirusowe peptydy związane z cząsteczkami MHC klasy I. Peptydy te pochodzą z wytwarzanych endogennie białek wirusowych niezależnie od umiejscowienia białka albo funkcji jaką pełni w wirusie. Tak więc, przez rozpoznanie epitopów z zakonserwowanych białek wirusowych, CTL mogą zapewnić ochronę międzyszczepową. Peptydy zdolne do wiązania się z cząsteczkami MHC klasy I w celu rozpoznania przez CTL pochodzą z białek obecnych lub przechodzących przez cytoplazmę albo siateczkę endoplazmatyczną. Stąd, białka egzogenne, wchodzące do szlaku obróbki endosomalnej (jak ma to miejsce w przypadku antygenów prezentowanych przez cząsteczki MHC klasy II) nie są efektywne w wywoływaniu odpowiedzi CTL CD8+. Wysiłki mające na celu wywołanie odpowiedzi CTL obejm ują zastosowanie wektorów replikujących w celu wytwarzania antygenu białkowego w komórce albo skupiają się na wprowadzaniu peptydów do cytozolu. Oba te podejścia mają ograniczenia, mogące zmniejszyć ich przydatność jako szczepionki. Wektory retrowirusowe m ają ograniczenia co do wielkości i budowy polipeptydów, które m ogą powstawać w wyniku ekspresji jako białka fuzyjne, przy zachowaniu zdolności rekombinowanego wirusa do replikacji zaś skuteczność wektorów takich jak krowianka w immunizacji może być zaburzona odpowiedzią odpornościow ą przeciwko samemu

4 wektorowi. Również, wektory wirusowe i zmodyfikowane patogeny niosą ze sobą ryzyko, które może wpływać na ich zastosowanie u ludzi. Ponadto, wybór epitopów peptydowych, które mają być prezentowane zależy od budowy antygenów MHC osobnika, tak więc szczepionki peptydowe m o g ą mieć ograniczoną skuteczność z pow odu różnorodności haplotypów MHC w populacji niewsobnej. Wykazano, że szczepienie domięśniowe konstruktami polinukleotydowymi, tj. plazmidowym DNA kodującym białka, powoduje wytwarzaniem białka in situ w komórkach mięśniowych. Przez zastosowanie plazmidów cdna kodujących białka wirusowe, można wywołać odpowiedź odpornościową, która zapewnia ochronę homologiczną po następującej później ekspozycji. Zastosowanie szczepionek polinukleotydowych (PNV) w celu wywołania przeciwciał może powodować przedłużoną trwałość odpowiedzi przeciwciał, jak również dostarczenie antygenu, który może ulegać odpowiedniej modyfikacji potranslacyjnej i mieć konformację białka natywnego (w przeciwieństwie do białka rekombinowanego). Białka wirusowe wytworzone in vivo po immunizacji PNV m ogą zachowywać swoją natyw ną konformację wywołując w ten sposób wytwarzanie przeciwciał neutralizujących wirusa. Wywołanie odpowiedzi CTL w ten sposób daje korzyść ochrony międzyszczepowej bez stosowania żywego, potencjalnie patogennego wektora albo wirusa atenuowanego. Benvenisty i in., donoszą, że DNA precypitowany CaCl2 wprowadzony myszy dootrzewnowo, dożylnie albo domięśniowo może ulegać ekspresji. Ostatnio, wstrzyknięcie domięśniowe (i. m.) wektorów ekspresyjnych DNA myszom powodowało, jak opisano, wychwyt DNA przez komórki mięśniowe i ekspresję białka kodowanego przez DNA (Wolff J. A. i in., 1990; Ascadi G. i in., 1991). Wstrzyknięte plazmidy, jak wykazano, utrzymywały się pozachromosomalnie i nie replikowały. Następnie, doniesiono o utrzymującej się ekspresji po wstrzyknięciu i. m. do mięśni szkieletowych szczurów, ryb i naczelnych oraz mięśnia serca szczurów. W WO 90/11092 (4 października 1990) opisana została technika zastosowania kwasów nukleinowych jako czynników immunogennych, w której nagie polinukleotydy zastosowano do szczepienia kręgowców. Sposób nie jest ograniczony do wstrzyknięcia domięśniowego. Przykładowo, wprowadzenie złotych mikropocisków opłaszczonych DNA, kodującym bydlęcy hormon wzrostu (BGH) do skóry myszy, powodowało wytwarzanie przez myszy przeciwciał przeciwko BGH. Do transfekcji skóry, mięśni, tkanki tłuszczowej i tkanek sutka żywych zwierząt zastosowano urządzenie jet injector. Różne sposoby wprowadzania kwasu nukleinowego zostały przedyskutowane przez Donnelly, Ulmer i Liu (The Immunologist, 2:20, 1994). Wynalazek dopuszcza wiele sposobów wprowadzania kwasu nukleinowego do żywych tkanek w celu wywołania ekspresji białek. Wynalazek dostarcza sposobów wprowadzania białek wirusowych do szlaku obróbki antygenu w celu wywołania CTL i przeciwciał swoistych wobec wirusa. Stąd, potrzeba swoistego czynnika leczniczego, zdolnego do wywołania pożądanej profilaktycznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko patogenom wirusowym w przypadku wirusów brodawczaków została zaspokojona dzięki wynalazkowi. Tak więc, wynalazek dostarcza konstruktów DNA kodujących białka wirusowe ludzkiego wirusa brodawczaków, które w yw ołują swoiste CTL i przeciwciała. Skuteczność ochronna szczepienia DNA przeciwko następującej później ekspozycji na wirusa została wykazana przez immunizację niereplikującym plazmidowym DNA kodującym jeden lub wiele wyżej wspomnianych białek wirusowych. Jest to korzystne ponieważ nie używa się czynnika zakaźnego, nie jest konieczna budowa cząstek wirusa i możliwa jest selekcja epitopów. Ponadto, poniew aż sekwencja niektórych produktów genowych je st zakonserw o- wana wśród wielu rodzajów wirusów brodawczaków, możliwa jest ochrona przed ekspozycją na różne rodzaje wirusa homologicznego bądź heterologicznego wobec szczepu, z którego pochodził sklonowany gen. Konstrukty DNA kodujące produkty genowe wirusa brodawczaków, zdolne do ulegania ekspresji po bezpośrednim wprowadzeniu do tkanek zwierzęcych są nowym środkiem profilaktycznym i leczniczym, zdolnym zapewnić ochronę odpornościow ą przeciwko wirusowi brodawczaków.

5 Figura 1 pokazuje odpowiedź przeciwciał neutralizujących wirusa, wywołanych u królików, którym wstrzyknięto DNA CRPV L 1, albo mieszaninę DNA L 1 i L2 (oś y) oraz odpowiadające miana ELISA wywołane przez nie. Figura 2. Odpowiedź przeciwciał królików, którym wstrzyknięto DNA L 1. Pokazano miana ELISA przeciwko L 1 VLP królików, którym podano pojedynczą immunizację w dobranej arbitralnie dawce 1 mg DNA L 1. Króliki, którym wstrzyknięto DNA kontrolny nie wytwarzały wykrywalnych mian przeciwciał przeciwko L 1 VLP. Figura 3. Wpływ absorbcji L 1 VLP na surowicę odpornościową, po immunizacji DNA L 1. A, surowica normalna i surowica odpornościowa absorbowana na natywnych i/lub zdenaturowanych VLP jak w (15), badane były na aktywność neutralizującą wirusa. Pokazano średnie pole powierzchni kłykcin w trzech miejscach ekspozycji po 7 tygodniach od ekspozycji. B, surowica odpornościowa od królików, którym wstrzyknięto podskórnie DNA L 1 była kolejno absorbowana trzykrotnie na natywnych (kółka) i/lub zdenaturowanych (kwadraty) L 1 VLP, poddanych ekspresji w rekombinowanym szczepie drożdży (Sacharomyces cerevisiae). Po każdej kolejnej absorpcji, porcje surowicy badano w teście ELISA, na aktywność przeciwciał przeciwko uzyskanym z bakulowirusa L 1 VLP. Miano ELISA absorbowanego materiału wykreślano jako procent początkowego miana ELISA surowicy nie absorbowanej. Figura 4. Odpowiedź, mierzona ELISA, w teście na przeciwciała przeciwko CRPV E2 (A) i CRPV E7 (b). Pokazano całkowite tempo reakcji (dla surowicy po 4 dawce minus surowica przed immunizacją w tym samym rozcieńczeniu) w mod/min, dla poszczególnych królików. Szczepionka według wynalazku zawiera wektor zawierający: a) co najmniej jeden polinukleotyd kodujący białko ludzkiego wirusa brodawczaków (HPV) wybrane z grupy obejmującej L 1 i L1+L2 jednego lub więcej typów HPV wybranych spośród HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 i HPV 18, b) promotor CMV, c) terminator transkrypcji z genu bydlęcego hormonu wzrostu i d) gen markerowy oporności na neomycynę, w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze. Korzystnie jako wektor szczepionka zawiera VIJeo lub VIJns. W ynalazek dostarcza polinukleotydów, które po bezpośrednim w prowadzeniu do organizmu kręgowca, takiego jak króliki amerykańskie i ludzie, wywołują ekspresję kodowanych peptydów w tkankach zwierzęcia. Gdy peptyd, taki jak białko związane z wirusem brodawczaków (PV), nie występuje w organizmie zwierzęcia z wyjątkiem zakażenia, układ odpornościowy zwierzęcia ulega pobudzeniu w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej. Ponieważ te egzogenne białka wytwarzane są przez komórki gospodarza, ulegają obróbce i prezentacji przez główny układ zgodności tkankowej (MHC). Rozpoznanie to jest analogiczne do zachodzącego po zakażeniu organizmem pokrewnym. Wynikiem jest, jak to wykazano, wywołanie odpowiedzi odpornościowej, która może chronić przed powtórnym zakażeniem. W znaczeniu tu użytym, polinukleotyd oznacza kwas nukleinowy, zawierający niezbędne elementy regulatorowe, taki, że po wprowadzeniu do komórki żywego kręgowca, jest zdolny do kierowania mechanizmem komórkowym w celu wytwarzania produktu translacji kodowanego przez geny wchodzące w skład polinukleotydu. Wynalazek dostarcza kwasów nukleinowych, które po wprowadzeniu do tkanek zwierzęcych in vivo wywołują ekspresję produktów genowych wirusa brodawczaków. Tak więc, przykładowo, wstrzyknięcie konstruktów DNA według wynalazku, do mięśni królika wywołuje ekspresję kodowanych produktów genowych i wywołuje przeciwciała neutralizujące wirusa. Po ekspozycji na wirusa brodawczaków królików amerykańskich (CRPV), w dawkach wywołujących zmiany u wszystkich królików kontrolnych, zwierzęta, którym wstrzyknięto szczepionkę polinukleotydową w ykazują zmiany znacznie mniejsze. Tak więc, wynalazek ujawnia szczepionkę przydatną do zapobiegania zakażeniom wirusem brodawczaków u ludzi. Konstrukty DNA kodujące białka wirusa brodawczaków wywołują ochronną odpowiedź odpornościową u zwierząt. Jak to będzie opisane szczegółowo dalej, odpowiedź odpornościowa

6 u zwierząt obejmuje przeciwciała neutralizujące wirusa i ochronę przed ekspozycją królików na wirusa homologicznego z wirusem brodawczaków. Oczekiwane zalety w stosunku do innych szczepionek obejmują, choć nie tylko, rozszerzenie ochrony z powodu odpowiedzi CTL, poszerzenie zakresu przeciw ciał i przedłużoną trw ałość ochrony. Wynalazek zapewnia środki do wywołania krzyżowej odporności bez potrzeby użycia czynników samoreplikujących. Dodatkowo, immunizacja DNA oferuje liczne inne korzyści. Po pierwsze, to podejście do szczepienia powinno być możliwe do zastosowania w nowotworach jak również w przypadku czynników zakaźnych, ponieważ odpowiedź CTL CD8 + jest kluczowa w interwencji immunologicznej w obu procesach patofizjologicznych. Stąd, wywołanie odpowiedzi odpornościowej przeciwko białkom istotnym w procesach transformacji może być skutecznym środkiem ochrony przed nowotworem albo immunoterapią. Po drugie, wywołanie przeciwciał przeciwko białkom ekspresjonowanym po wstrzyknięciu DNA kodującego białka wirusowe sugeruje, że ta technologia dostarcza wygodnego i wydajnego sposobu wytwarzania szczepionek wywołujących przeciwciała. Łatwość wytwarzania i oczyszczania konstruktów DNA wypada korzystnie na tle tradycyjnego oczyszczania białek, co ułatwia wytwarzanie szczepionek skojarzonych. Tak więc, liczne konstrukty, przykładowo konstrukty kodujące białka L 1 i L2 jednego lub wielu typów HPV mogą być przygotowywane, mieszane i wspólnie podawane. Na koniec, ponieważ ekspresja białka może być utrzymywana przez długi okres czasu po wstrzyknięciu DNA, trwałość pamięci limfocytów B i T może być wydłużona, powodując długotrwałą odporność humoralną i komórkową. Ograniczenia proponowanych szczepionek HPV podkreślają potrzebę opracowania bardziej efektywnych sposobów zapobiegania zakażeniu i łagodzenia choroby. Wytworzenie ulepszonej odpowiedzi CTL przeciwko zakonserwowanemu białku może zapewnić długotrwałą odporność międzyszczepową. Wykazano ekspresję białka z konstruktów PNV u królików przez wykrycie odpowiedzi odpornościowej gospodarza skierowanej przeciwko antygenom CRPV. Wyniki tych doświadczeń na zwierzętach wskazują, że bezpośrednie wstrzyknięcie DNA może dostarczyć sposobu ochrony ludzi przed zakażeniem HPV i chorobą. W celu optymalizacji stosowanego stężenia porównano zakres dawek pod względem immunogenności. M ożna przewidzieć, że dawki rzędu 10, 50, 100 i 200 μg DNA są skuteczne u ludzi. Skuteczność u ludzi została wykazana na ochotnikach, którzy otrzymali szczepionkę DNA HPV. Kompozycja, dawkowanie i schemat podawania szczepionki oparte są na uprzednich badaniach. Skuteczność kliniczna została wykazana odsetkiem zakażeń, oceną choroby i długością choroby. Te parametry kliniczne porównano z badaniem laboratoryjnym odpowiedzi odpornościowej gospodarza i wykrywaniem wirusa, w celu określenia markerów zastępczych korelujących z ochroną. Biologia molekularna przygotowywania i oczyszczania konstruktów DNA umożliwia wytwarzanie środka farmaceutycznego DNA według wynalazku. Standardowe techniki biologii molekularnej są wystarczające do wytwarzania produktów według wynalazku, stanowiących nowe środki lecznicze, które mogą wytworzyć międzyszczepową ochronę krzyżową. Ilość zdolnego do ekspresji DNA, która ma być wprowadzona biorcy szczepionki zależy od siły promotorów transkrypcyjnych i translacyjnych zastosowanych w konstrukcie DNA oraz od immunogenności produktu genu ulegającego ekspresji. Ogólnie, immunologicznie albo immunoprofilaktycznie skuteczną dawkę rzędu od około 1 μg do 1 mg, korzystnie od około 10 μg do 300 μg, podaje się bezpośrednio do tkanki mięśniowej. Możliwe jest również wstrzyknięcie podskórne, wprowadzanie śródskórne, wciskanie przez skórę i inne metody podawania takie jak podawanie dootrzewnowe, dożylne albo wziewne. Podawanie szczepień przypominających również jest brane pod uwagę.

7 Polinukleotydy mogą być nagie, co oznacza, że są niezwiązane z żadnym białkiem, adiuwantem albo innym czynnikiem wpływającym na układ odpornościowy biorcy. W tym przypadku, jest pożądane aby polinukleotyd znajdował się w roztworze dopuszczalnym fizjologicznie, takim jak, choć nie ograniczonym do sterylnego roztworu soli albo sterylnego zbuforowanego roztworu soli. Alternatywnie, polinukleotydy mogą być związane z liposomami, takimi jak liposomy lecytynowe albo inne liposomy znane w technice, jako mieszanina DNA-liposomy, albo DNA może być związany z adiuwantem znanym w technice ze wspomagania odpowiedzi odpornościowej, takim jak białko albo inny nośnik. Czynniki ułatwiające komórkowy wychwyt DNA, takie jak, choć nie wyłącznie jony wapnia, białka wirusowe albo inne czynniki wspomagające transfekcję, m ogą być również zastosowane z korzyścią. Czynniki te określane są ogólnie jako czynniki ułatwiające transfekcję oraz jako nośniki dopuszczalne farmaceutycznie. Istnieje kilka zalet immunizacji genem zamiast produktem genu. Jedną z zalet jest względna łatwość z jak ą antygen natywny lub prawie natywny może ulegać prezentacji układowi odpornościowemu. Inną zaletą immunizacji polinukleotydem jest możliwość wejścia immunogenu w szlak MHC klasy I i wywołania odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych. Ponieważ immunizacja polinukleotydem może wywołać zarówno odpowiedź humoralną jak i komórkową, inną zaletą może być to, że zapewnia względnie prostą metodę zbadania przydatności jako szczepionek olbrzymiej liczby genów wirusowych i rodzajów wirusa. Immunizacja przez wstrzyknięcie polinukleotydów umożliwia tworzenie szczepionek multiwalentnych przez zmieszanie pojedynczych składników. W znaczeniu tu użytym, określenie gen oznacza segment kwasu nukleinowego, który koduje osobny polipeptyd. Określenia środek farmaceutyczny i szczepionka są stosowane zamiennie, w celu wskazania kompozycji przydatnej do wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Określenia konstrukt i plazmid są stosowane zamiennie. Określenie wektor jest stosowane w celu wskazania DNA, do którego m ogą być klonowane geny, do stosowania zgodnie z wynalazkiem. Kompozycje przydatne farmaceutycznie zawierające DNA mogą być przygotowywane według znanych sposobów takich jak domieszanie dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika. Przykłady takich nośników i sposobów przygotowywania można znaleźć w Remington s Pharmaceutical Sciences. Kompozycja dopuszczalna farmaceutycznie odpowiednia do skutecznego podawania, powinna zawierać skuteczną ilość DNA HPV. Kompozycje terapeutyczne i diagnostyczne według wynalazku są podawane osobnikowi w ilościach odpowiednich do leczenia albo diagnozowania zakażenia PV. Skuteczna ilość może wahać się w zależności od wielu czynników jak stan osobnika, ciężar, płeć i wiek. Inne czynniki obejmują sposób podawania. Ogólnie, kompozycje m ogą być podawane w dawkach zawierających się od około 1 mikrograma do około 1 miligrama. Kompozycje farmaceutyczne m ogą być podawane osobnikowi różnymi drogami takimi jak podskórna, miejscowa, doustna i domięśniowa. Szczepionki według wynalazku zawierają DNA HPV, który koduje białka rekombinowane HPV obejmujące determinanty antygenowe wywołujące tworzenie przeciwciał neutralizujących w organizmie ludzkiego biorcy. Szczepionki takie są również wystarczająco bezpieczne aby mogły być podawane bez zagrożenia infekcją kliniczną; nie wykazują objawów toksycznych; m ogą być podawane skuteczną drogą; są stabilne i kompatybilne z nośnikami szczepionek. Szczepionki m ogą być podawane różnymi drogami, takimi jak doustna, pozajelitowa, podskórna albo domięśniowa. Podawana dawka może wahać się w zależności od wielu czynników jak stan osobnika, ciężar, płeć i wiek osobnika; drogi podania oraz rodzaju szczepionego PV. Szczepionki m ogą być stosowane w różnych postaciach dawkowania takich jak kapsułki, zawiesiny, eliksiry albo roztwory wodne. Szczepionki m ogą być wytwarzane z nośnikiem dopuszczalnym immunologicznie. Szczepionki s ą podawane w ilościach skutecznych profilaktycznie albo leczniczo, tzn. ilościach wystarczających do wywołania chroniącej odpowiedzi odpornościowej. Ilość skuteczna

8 może być różna w zależności od rodzaju HPV. Szczepionki m ogą być podawane w dawce pojedynczej albo w licznych dawkach. Szczepionki według wynalazku do zapobiegania zakażeniom PV m ogą być monowalentne i multiwalentne. Przykładowo, monowalentna szczepionka przeciwko HPV typu 16 może być wytworzona przez włączenie DNA kodującego białko L 1 HPV 16 albo L2 albo L1+L2. Alternatywnie, szczepionka multiwalentna przeciwko HPV może być wytworzona przez mieszanie DNA kodujących białka L 1 albo L2 albo L1+L2 z różnych typów HPV. DNA może być zastosowane do wywołania przeciwciał. Określenie przeciwciało w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje zarówno przeciwciała monoklonalne jak i poliklonalne, jak również ich fragmenty takie jak Fv, Fab, F(ab)2, zdolne do wiązania antygenu albo haptenu. DNA PV oraz przeciwciała m ogą być zastosowane do typowania-serologicznego zakażeń HPV albo CRPV oraz do badań przesiewowych w kierunku HPV. DNA HPV i CRPV oraz przeciwciała nadają się same do wytwarzania zestawów przydatnych do wykrywania i typowania serologicznego HPV albo CRPV. Zestawy takie obejmują podzielony nośnik odpowiedni do ścisłego utrzymywania co najmniej jednego zasobnika. Nośnik powinien zawierać jeszcze reagenty takie jak DNA HPV albo przeciwciała przeciwko HPV odpowiednie do wykrywania różnych rodzajów HPV. Nośnik może również zawierać środki do wykrywania takie jak znakowany antygen albo substraty enzymów itp. Poniższe przykłady dostarczono w celu lepszego określenia wynalazku, jednakże, bez ograniczania go do szczegółów przykładów. Przykład 1. Wektory do wytwarzania szczepionek A) VI: Wektor ekspresyjny VI skonstruowano z pcmyie-aki-dhfr (Y. Whang i in., J. Virol. 61,1796 (1987)). Geny AKI i DHFR usunięto z wektora przez cięcie wektora EcoRI i samoligację. Wektor ten nie zawierał intronu A w promotorze CMV, a więc dodano go jako fragment PCR z usuniętym wewnętrznym miejscem SacI (w pozycji 1855 według numeracji B. S. Chapmana i in., Nuci. Acids Res., 19, 3979 (1991)). Jako matrycę do reakcji PCR zastosowano pcmvinta-lux, wytworzony przez ligację fragmentu HindIII i NheI z pcm V6al20 (patrz, Chapman B. S. i in., wyżej) zawierającego promotor/wzmacniacz hcmv-iel oraz intron A, w miejsce HindIII i XbaI pbl3 tworząc pcmvintbl. Fragment genu lucyferazy wielkości 1881 bp (HindIII-SmaI wypełniony fragmentem Klenowa) z RSV-Lux (J. R. de Wet i in., Mol. Cell Biol., 7, 725, 1987) wklonowano w miejsce SalI pcm VIntBL, wypełnionym fragmentem Klenowa i traktowanym fosfatazą Startery obejmujące Intron A miały sekwencje: starter 5': 5 '-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3(Identyfikator Sekw. N r 1) starter 3': 5'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3';(Identyfikator Sekw.Nr 2). Startery zastosowane w celu usunięcia miejsca SacI miały sekwencje: Starter sensowny, Identyfikator Sekw. N r 3: 5 '-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3'; Starter antysensowny, Identyfikator Sekw. N r 4: 5 '-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3'. Fragment PCR cięto SacI i BglII i wprowadzono do wektora ciętego tymi samymi enzymami. B) Wektor ekspresyjny V 1J, Identyfikator Sekw. Nr 5 Celem tworzenia V 1J było usunięcie elementów promotora i terminatora transkrypcji z wektora V 1, w celu umieszczenia ich w bardziej określonym kontekście, tworząc wektor bardziej spójny i poprawiając efekty oczyszczania plazmidu. V 1J jest uzyskany z wektorów V 1 i puc 19, plazmidu dostępnego w handlu. V 1 trawiono enzymami restrykcyjnymi Sspl i EcoRI tworząc dwa fragmenty DNA. Mniejszy z nich, zawierający promotor CMVIntA i terminator transkrypcyjny bydlęcego hormonu wzrostu (BGH), które sterują ekspresją genów heterologicznych, oczyszczono przez elektroforezę na żelu aga-

9 rozowym. Końce tego fragmentu DNA stępiono przy użyciu polimerazy DNA T4 w celu polepszenia ligacji z innym tępym fragmentem DNA. puc 19 wybrano aby stanowił szkielet wektora ekspresyjnego. Jest on znany z dużej wydajności uzyskiwanego plazmidu, jest dobrze scharakteryzowany co do sekwencji i funkcji i ma minimalne wymiary. Przez trawienie enzymem restrykcyjnym HaeII, z wektora usunięto cały operon lac, ponieważ był on niepotrzebny z punktu widzenia wynalazku, mógł natomiast ujemnie wpływać na ilość uzyskiwanego plazmidu i ekspresję genów heterologicznych. Pozostały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono końce polimeraządna T4, traktowano cielęcąjelitową fosfatazą alkaliczną i poddano ligacji z elementem CMVIntA/BGH, opisanym wyżej. Uzyskano plazmidy wykazujące obie możliwe orientacje elementu promotora w szkielecie puc. Jeden z tych plazmidów dawał znacznie większe ilości DNA w E. Coli, i został oznaczony V 1J. Struktura tego wektora została potwierdzona przez analizę sekwencji regionów połączeń, a następnie wykazano jego zdolność do ekspresji genów heterologicznych na poziomie równym bądź wyższym w porównaniu z V 1. C) Wektor ekspresyjny V 1 Jneo, Identyfikator Sekw. N r 6 Okazało się konieczne usunięcie genu amp', stosowanego do selekcji na antybiotyku bakterii niosących V 1J, ponieważ ampicylina nie może być stosowana w fermentatorach wielkiej skali przy produkcji ludzkich produktów klinicznych. Gen amp' usunięto ze szkieletu puc V 1J przez trawienie enzymami restrykcyjnymi SspI i Eam1105I. Powstały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono końce polim erazą DNA T4 i traktowano cielęcąjelitow ą fosfatazą alkaliczną. Dostępny w handlu gen kan', uzyskany z transpozonu 903 i zawarty w plazmidzie puc4k, wycięto stosując enzym restrykcyjny PstI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i stępiono końce polimerazą DNA T4. Fragment ten poddano ligacji ze szkieletem V 1J i uzyskano plazmidy z genem kan' w obu możliwych orientacjach, które nazwano V 1Jneo# 1 i #3. Każdy z tych potwierdzono analizą restrykcyjną, sekwencjonowaniem DNA regionów połączeń i jak wykazano powodowały one powstanie podobnych ilości plazmidu co V 1J. Ekspresja produktów genów heterologicznych była również dla tych wektorów V IJneo porównywalna z V1J. Jako konstrukt ekspresyjny, arbitralnie wybrano V 1Jneo#3, określany dalej jako V 1Jneo, zawierający gen kan' w tej samej orientacji co gen amp'. D) Wektor ekspresyjny V1Jns Do V 1Jneo dodano miejsce SfiI w celu ułatwienia badań nad integracją. W miejscu KpnI w sekwencji BGH wektora, dodano dostępny w handlu łącznik SfiI o długości 13 par zasad (New England BioLabs). V 1Jneo linearyzowano przy użyciu KpnI, oczyszczono na żelu, stępiono polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z tępymi końcami łącznika SfiI. Wybrano izolaty klonalne stosując mapowanie restrykcyjne i potwierzdzono je sekwencjonując przez łącznik. Nowy wektor nazwano V 1Jns. Ekspresja genów heterologicznych w V 1Jns (z SfiI) była porównywalna z ekspresją tego samego genu w V 1Jneo (z KpnI). Przykład 2. Wytwarzanie konstruktów DNA kodujących białka wirusa brodawczaków królika amerykańskiego Źródłem DNA CRPV dla wszystkich klonowanych genów jest CRPV-pLAII. Jest to kompletny genom CRPV wklonowany do pbr322 w miejscu SalI (Nasseri, M., Meyers, C. i Wettstein, F. O. (1989)). Analiza genetyczna patogenezy CRPV: otwarta ramka odczytu L 1 nie jest niezbędna do transformacji komórkowej ale jest niezbędna do tworzenia brodawczaków (Virology 170, ). 1. V 1Jns-L1: Sekwencję kodującą L 1 wytworzono przez PCR, stosując DNA CRPV-pLAII jako matrycę. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BamHI do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu. Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego L 1 startery PCR, miały sekwencje: Starter sensowny: 5' -GGTACAGGATCCACCATGGCAGTGTGGCTGTCTACGCAG-3' (Identyfikator Sekw. N r 7) BamHI

10 Starter antysensowny: 5 '-CCACATGGATC CTTAAGTACGTCTCTTGCGTTTAGATG-3' (Identyfikator Sekw. N r 8) BamHI Fragment PCR oczyszczono na żelu, cięto BamHI i poddano ligacji z V 1Jns przeciętym BgIII. 2. V 1Jns-L2: Region kodujący L2 wytworzono przez PCR. Wektor CRPV-pLAII zawierał gen L2, zniszczony miejscem SalI zastosowanym do wprowadzenia CRPV do pbr322. Stąd, matrycę do PCR wytworzono przez cięcie CRPV-pLAII przy użyciu SalI i ligację DNA CRPV w postaci kolistej w miejscu SalI. Ligowany DNA CRPV zastosowano jako matrycę do PCR. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BamHI do cięcia fragmentu PCR po oczyszczeniu na żelu. Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego L2 startery PCR, miały sekwencje: Starter sensowny: 5'-GGTACAGGATCCACCATGGTTGCACGGTCACGAAAACGC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 9) BamHI Starter antysensowny: 5' -CCACATGGATCCTTATTCTGCGTAGACAGCCACACT- 3' (Identyfikator Sekw. N r 10 BamHI 3. V 1Jns-E2: Sekwencję kodującą E2 wytworzono przez PCR, stosując DNA CRPV-pLAII jako matrycę. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BgIII do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu. Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego E2 startery PCR, miały sekwencje: Starter sensowny: 5 '-GGTACAAGATCTACCATGGAGGCTCTCAGCCAGCGCTTA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 11) BgIII Starter antysensowny: 5 '-CCACATAGATCTCTAAAGCCCATAAAAATTCCCTAAAAACAC-3' (Identyfikator Sekw. N r 12) BgIII 4. V 1Jns-E4: Sekwencję kodującą E4 wytworzono przez PCR, stosując DNA CRPV-pLAII jako matrycę. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BgIII do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu. Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego E4 startery PCR, miały sekwencje: Starter sensowny: 5' -GGTACAAGATCTACCATGAGCCATGGACATTGCAGGATAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 13) BgIII Starter antysensowny: 5'-CCACATAGATCTTTATAAGCTCGCGAAGCCGTCTATTCC-3' (Identyfikator Sekw. N r 14) BgIII 5. V 1Jns-E7: Sekwencję kodującą E7 wytworzono przez PCR, stosując jako matrycę DNA CRPV-pLAII w jednym przypadku, zaś w innym oczyszczony DNA CRPV szczepu Kreidera. W obu przypadkach zastosowano te same startery PCR. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BgIII do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu. Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego E7 startery PCR, miały sekwencje: Starter sensowny: 5' -GGTACAAGATCTACCATGATAGGCAGAACTCCTAAGCTTAG-3' BgIII Starter antysensowny: 5 '-CCACATA GATCTTCAGTTACAACACTCCGGGCACAC-3'. 6. pgex-2t-e2: Region kodujący E2 wytworzono przez PCR jak to opisano dla V 1Jns-E2. Fragment klonowano do pgex-2t w miejscu BamHI, tworząc fuzję w jednej ramce z transferazą S glutationu (GST). Konstrukt ten zastosowano do wytworzenia białka w E. coli.

11 pgex-2t-e4: Region kodujący E4 wytworzono przez PCR jako to opisano dla VI Jns-E4. Fragment klonowano do pgex-2t w miejscu BamHI, tworząc fuzję w jednej ramce z transferazą S glutationu (GST). Konstrukt ten źastosowano do wytworzenia białka w E. coli. 8. pgex-2t-e7: Region kodujący E7 wytworzono przez PCR jak to opisano dla V 1Jns-E7. Fragment klonowano do pgex-2t w miejscu BamHI, tworząc fuzję w jednej ramce z transferazą S glutationu (GST). Konstrukt ten zastosowano do wytworzenia białka w E. coli. Przykład 3. Oczyszczanie plazmidu z E. coli Konstrukty V 1J hodowano przez noc do osiągnięcia nasycenia. Komórki zebrano i poddano lizie w zmodyfikowanej procedurze alkalicznego SDS (Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y., wyd. 2 (1989). Modyfikacja polegała na trzykrotnym zwiększeniu objętości do lizy komórek i ekstrakcji DNA. DNA oczyszczono przez dwukrotne wirowanie na gradiencie CsCl-EtBr. Bromek etydyny usunięto przez ekstrakcję 1-butanolem. Powstały DNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform i precypitowano etanolem. DNA zawieszono w TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA), ph 8 do transfekcji i w 0,9% NaCl do wstrzyknięcia myszom. Stężenie i czystość każdego z preparatów DNA oznaczono przez odczyt OD260/280- Stosunki 260/280 wynosiły 1,8. Przykład 4. Wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec CRPV in vivo Grupy po pięć królików skrwawiono i nastrzykiwano po 1,2 ml soli fizjologicznej zawierającej 1 mg V 1Jns-L1, V 1Jns-L2, V 1Jns-L1 zmieszany z V 1Jns-L2 (w sumie 2 mg) albo sam V 1Jns (wektor kontrolny nie kodujący białka). Inokulum podzielono na równo między sześć miejsc domięśniowych w obie łapy tylne, łapy przednie i dół grzbietu. Trzy tygodnie po początkowym wstrzyknięciu DNA, króliki skrwawiono i podawano drugie wstrzyknięcie DNA w podobny sposób. Cztery tygodnie po drugim wstrzyknięciu zwierzęta ponownie skrwawiano. Surowice badano w kierunku przeciwciał neutralizujących wirusa, przez zmieszanie dziesięciokrotnych kolejnych rozcieńczeń surowic odpornościowych z rozcieńczeniem 1:3 zawiesiny wyjściowej wirusa (szczep Kreidera). Rozcieńczenia wykonano w pożywce Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM) z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Zawiesinę w yjściow ą CRPV (uzyskaną od dr J. Kreidera, Hershey, PA) wytworzono z fragmentów skóry uzyskanej od dzikich królików amerykańskich, które były zakażone CRPV i wszczepionej pod torebkę nerki myszy bezgrasiczych. Powstałe kłykciny homogenizowano i sklarowano przez odwirowanie, uzyskując preparat zawiesiny wyjściowej wirusa. Mieszaniny surowic odpornościowych i zawiesiny wyjściowej wirusa inkubowano na lodzie przez co najmniej 60 minut, następnie 50 μl każdej z mieszanin nałożono na 1 cm2 ogolonej, skaryfikowanej skóry na grzbiecie 3 królików nowozelandzkich. Zwierzęta obserwowano po 7 tygodniach w kierunku obecności brodawek i mierzono elipsoidalne brodawki w wymiarach przedniotylnym i bocznym (w mm). Miana końcowe oznaczano z częstości występowania brodawek w różnych rozcieńczeniach przez zastosowanie interpolacji Reed-Muench a. Miana neutralizujące przeciwciał królików, którym wstrzyknięto DNA L 1 albo DNA L 1+L2 wykreślono na osi y na figurze 1. Surowice królików, którym wstrzyknięto DNA L 1 były również badane w kierunku przeciwciał w teście ELISA. Polistyrenowe płytki ELISA opłaszczano przez noc w 4 C przy użyciu 1 μg/studzienkę częściowo oczyszczonego, rekombinowanego białka L 1 CRPV, uzyskanego z drożdży. Rekombinowane L 1 wytworzono w S. cerevisiae i oczyszczono jak to opisali Kimbauer i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: , 1992) z małymi modyfikacjami. Dodano rozcieńczonych surowic i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem na wytrząsarce poziomej). Płytki płukano, po czym dodawano kozich przeciwciał przeciw króliczym IgG (swoistych wobec Fc) sprzęgniętych z peroksydazą chrzanową. Po godzinie inkubacji z wytrząsaniem płytek, płytki płukano i dodawano substratu. Płytki odczytywano przy długości fali 450 nm, stosując kinetyczny czytnik ELISA (Molecular Devices Corp.), zaś uzyskane wartości były korygowane pod względem tła przez odejmowanie wartości szybkości reakcji surowic przed immunizacją od surowic po immunizacji w tym samym rozcieńczeniu. Miana oznaczano przez interpolację powstałej krzywej skorygowanych w artości szybkości reakcji

12 w stosunku do rozcieńczenia do wartości szybkości 10 mod/min. M iana ELISA królików, którym wstrzyknięto DNA L 1 albo DNA L 1+L2 wykreślono na osi x na figurze 1. Figura 1 pokazuje, że 12/13 surowic było pozytywnych pod względem aktywności neutralizującej (log miana 1, tzn. pozytywne bez rozcieńczania) jak również pod względem przeciwciał w ELISA (miano ELISA 100). Cztery spośród czterech surowic, które były negatywne pod względem przeciwciał neutralizujących wykazywało miana ELISA 350. Wszystkie surowice od królików, które otrzym ały albo DNA L2 sam albo wektor kontrolny V 1J wykazywały miana poniżej 100. Podsumowując, dane wskazują, że przeciwciała swoiste wobec CRPV oraz zdolne do neutralizacji uzyskano po wstrzyknięciu DNA L 1. Miana ELISA u królików pozostawały nie zmienione przez co najmniej 32 tygodnie po immunizacji (figura 2). Przykład 5. Ochrona królików po ekspozycji na zjadliwy CRPV Pięciu królikom na grupę wstrzyknięto domięśniowo po 1 mg V 1Jns-L1, V 1Jns-L2, V 1Jns-L1 zmieszany z V 1Jns-L2 (w sumie 2 mg) albo sam V 1Jns (wektor kontrolny nie kodujący białka) jak opisano wyżej. Trzy tygodnie po początkowym wstrzyknięciu DNA, podawano drugie wstrzyknięcie tego samego DNA. Cztery tygodnie po drugim wstrzyknięciu zwierzęta eksponowano na CRPV. Ekspozycję na CRPV przeprowadzano przez nałożenie 50 μl każdego z dwóch rozcieńczeń zawiesiny wyjściowej wirusa (1:2 albo 1:12 w DMEM+1 % BSA) na trzy miejsca po 1 cm2 ogolonej, skaryfikowanej skóry na grzbiecie każdego z królików. Surowice pobrane w momencie ekspozycji od zwierząt, którym wstrzyknięto DNA L 1 albo DNA L1+L2 zawierały przeciwciała w stosunku do L 1 badane ELISA, i przeciwciała neutralizujące wirusa, jak to opisano wyżej. Zwierzęta obserwowano w kierunku tworzenia się brodawek w 3,6 i 10 tygodni po ekspozycji. Wśród królików, które nie otrzymały DNA L 1, w 51 spośród 54 miejsc eksponowanych na CRPV, rozwinęły się brodawczaki, podczas gdy u zwierząt, które otrzymały DNA L 1 brodawczaki rozwinęły się w 2 spośród 60 miejsc. Jedna z dwóch brodawek obserwowanych u królików immunizowanych DNA L 1, zanikła po 3 tygodniach po pojawieniu się. W tabeli 1 przedstaw iono rozkład brodawek u królików po ekspozycji na CRPV. Profilaktyczna immunizacja DNA L 1 chroniła króliki przed rozwinięciem się brodawek po ekspozycji na zjadliwy CRPV. Przykład 6. Swoistość konformacyjna przeciwciał wywołanych DNA L 1 W celu wykazania, że ochronne, neutralizujące przeciwciała rozpoznają epitopy konformacyjne na VLP, przeprowadzono doświadczenia z absorbcją. Absorbcja surowic odpornościowych za pomocą VLP L 1 (15) usuwała wszystkie przeciwciała neutralizujące i aktywność ELISA (figura 3 A, B). N ałożenie na skaryfikow aną skórę CRPV zm ieszanego z króliczą surowicą sprzed immunizacji powodowała powstanie kłykcin we wszystkich eksponowanych miejscach, podczas gdy CRPV mieszano z surowicami odpornościowymi i nakładano podobnie, nie obserwowano kłykcin z powodu neutralizującej aktywności przeciwciał. Gdy CRPV mieszano z surowicą odpornościową którą uprzednio absorbowano VLP L 1, które powinny usuwać przeciwciała neutralizujące, wszystkie (3/3) miejsca ekspozycji były pozytywne pod względem kłykcin. W przeciwieństwie, gdy surowicę odpornościową absorbowano denaturowanym białkiem L 1, nie tworzącym cząstek, (denaturowanym przez redukcję i alkilację 8 M mocznikiem), surowice były wciąż zdolne do neutralizacji CRPV (figura 3 A) i zachowywały aktywność w ELISA (figura 3B). Tak więc, przeciwciała neutralizujące wirusa, wywołane przez immunizację DNA L 1 mogą być usunięte tylko przez VLP LI w konformacji natywnej nie zaś przez zdenaturowane L 1. Wydaje się, że test ELISA rozpoznaje przeciwciała swoiste wobec konformacji pierwotnej reagujące z kompletnymi VLP L 1, ponieważ zniesienie aktywności ELISA przez absorbcję odpowiadała usunięciu przeciwciał neutralizujących (figura 3B).

13

14 FIG. 1

15 FIG. 2

16 FIG. 3A

17 FIG. 3B

18 FIG. 4A

19 FIG. 4B

20 FIG.5 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.