aktualności biomérieux

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "aktualności biomérieux"

Transkrypt

1 aktualności biomérieux numer 43 grudzieƒ 2007 Warszawa diagnostyka êród em dobrego zdrowia

2 z życia firmy Zapraszamy na internetowà stron biomérieux Polska, gdzie w Dziale WiadomoÊci zamieszczamy informacje o nowoêciach w ofercie firmy. Z przyjemnoêcià informujemy, e dotychczasowà ofert biomérieux Polska w zakresie produktów do diagnostyki zaka eƒ wirusem HIV, która obejmuje testy w systemie automatycznym VIDAS HIV Duo Quick, VIDAS HIV DUO Ultra, testy ELISA Vironostica HIV oraz testy biologii molekularnej NucliSens EasyQ HIV-1 uzupe nia obecnie szybki, atwy w wykonaniu test: VIKIA HIV (nr kat ) Spis treści Z ycia firmy Techniki biologii molekularnej w badaniach epidemiologicznych zaka eƒ szpitalnych Enterokoki oporne na wankomycyn (VRE) epidemiologia i metody wykrywania Ocena przydatnoêci pod o a chromid VRE firmy biomérieux w monitorowaniu zaka eƒ szpitalnych Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) wytwarzanych przez E. coli i Klebsiella spp. za pomocà testu potwierdzajàcego wg CLSI oraz kart AST N041 systemu VITEK 2 20 Identifying Resistance StandLab IQs pierwszy polski internetowy program kontroli jakoêci Nowe produkty w ofercie bia ek specyficznych (Konelab system reagent) 27 Z ycia firmy XVI Zjazd PTDL POLMEDLAB Wydawca: biomérieux Polska Sp. z o.o. Osoba odpowiedzialna: El bieta Wójcik Osoby bioràce udzia w przygotowaniu nr 43: Katarzyna Haltof Marcin Iszku o Miros aw Kachalik Ireneusz Pop awski Barbara Krawczyƒska Piotr Czajka Karolina Âwiderska Adres redakcji i wydawcy: biomérieux Polska Warszawa, ul. eromskiego 17 tel. (22) fax (22) Przygotowalnia i druk: PASSA Zak ad Poligraficzny Wojciech Bia kowski Konstancin-Jeziorna, ul. Lipowa 26 Jest to jakoêciowy test wykorzystujàcy technik immunochromatograficznà, umo liwiajàcy wykrywanie przeciwcia anty- HIV1 i anty-hiv2 w surowicy, osoczu oraz w pe nej krwi. Wychodzàc naprzeciw oczekiwaniom u ytkowników systemu VIDAS oraz Êrodowiska medycznego, firma biomérieux Polska ma przyjemnoêç poinformowaç o wprowadzeniu nowego testu: nr kat VIDAS NT-proBNP jest testem iloêciowym w automatycznym systemie VIDAS do oznaczania N-koƒcowych fragmentów peptydów natriuretycznych typu B w surowicy lub osoczu (heparyna litowa), przy u yciu techniki ELFA (metoda enzymoimmunofluorescencyjna). Oznaczenia NT-proBNP wykorzystywane sà do diagnozowania pacjentów z podejrzeniem niewydolnoêci lewej komory serca. Jest to szczególnie przydatne do odró nienia pomi dzy dusznoêcià sercowà i p ucnà. Do zobaczenia w sieci! Zapraszamy równie do zapoznania si z wiadomoêciami o dzia alnoêci firmy biomérieux, które zamieszczane sà w Dziale Informacje Prasowe. Na stronie prasowe znajdujà si wiadomoêci nt. wprowadzenia na rynek testu do diagnostyki i prognostyki niewydolnoêci serca VIDAS NT-proBNP. Na tej stronie znajdà Paƒstwo równie informacje nt. podsumowania dzia- alnoêci firmy biomérieux za szeêç miesi cy 2007 roku.

3 80-lecie Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów Kraków, Âwiat cz owieka Êwiatem drobnoustrojów pod takim tytu em w dniach 31 sierpnia 1 wrzeênia 2007 roku, w Krakowie odby o si jubileuszowe sympozjum zorganizowane z okazji 80-lecia Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów (PTM). Towarzystwo powsta o w 1927 roku i nale y do najstarszych medycznych towarzystw naukowych w Polsce. Za o ycielami byli Roman Nitsch, Feliks Przesmycki i Zygmunt Szymanowski. Celem Towarzystwa jest propagowanie rozwoju nauk mikrobiologicznych i popularyzowanie osiàgni ç mikrobiologii wêród cz onków oraz szerokich kr gów spo eczeƒstwa. Z racji jubileuszu, wyk ad inauguracyjny zosta poêwi cony wielkim mikrobiologom. Program konferencji obejmowa ró norodnà problematyk, takà jak: nowe strategie walki z chorobami zakaênymi, nowe leki przeciwbakteryjne, implikacje kliniczne i terapeutyczne zaka eƒ Helicobacter pylori, metody genetyczne ró nicowania drobnoustrojów, zoonozy, zaka- enia pozaszpitalne, nowe metody post powania wobec H.influenzae, patogenez zaka eƒ C.difficile, leki przeciwwirusowe, szczepienia, grzyby dro d opodobne, badania mikrobiologiczne powietrza, a tak e wp yw drobnoustrojów na niszczenie zabytków oraz zarzàdzanie jakoêcià i akredytacj w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych. Oprócz wyk adów odby a si sesja plakatowa, a tak e wystawa firm diagnostycznych i farmaceutycznych. Firma biomérieux Polska prezentowa a na stoisku nast pujàce systemy: BacTAlert 3D 60 do wykrywania drobnoustrojów we krwi i innych p ynach ustrojowych, VITEK 2 compact do identyfikacji drobnoustrojów i okreêlania lekowra liwoêci oraz nowy system do genotypowania DiversiLab. Oprócz systemów automatycznych na stoisku mo na by o tak e zebraç informacje na temat nowych produktów w ofercie firmy, pod o y mikrobiologicznych, testów lateksowych oraz testu VIKIA HIV. Jubileusz by doskona à okazjà do spotkaƒ oraz wymiany doêwiadczeƒ pomi dzy mikrobiologami z ró nych oêrodków. èród o: materia y zjazdowe 3

4 Pomorskie Spotkania z Mikrobiologią Gdańsk Sobieszewo, W dniach roku w Sobieszewie pod patronatem J. M. Prof. dr hab. Romana Kaliszana Rektora Akademii Medycznej w Gdaƒsku oraz Prof. dr hab. Walerii Hryniewicz Prezesa Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów odby a si konferencja Pomorskie Spotkania z Mikrobiologià. Program obejmowa : nowoczesne metody w diagnostyce mikrobiologicznej, zaka enia wywo ywane przez bakterie Staphylococcus aureus, diagnostyk i ró nicowanie toksoplazmozy wczesnej i przewlek ej, laboratoryjnà diagnostyk chorób paso ytniczych ze szczególnym uwzgl dnieniem badaƒ molekularnych, zastosowanie bakteriofagów w diagnostyce i terapii, epidemiologi, diagnostyk i profilaktyk inwazyjnej choroby meningokokowej, posocznice bakteryjne, aktualne problemy antybiotykoterapii, zastosowanie markerów molekularnych w diagnostyce bakteryjnych patogenów roêlin, wytwarzanie biofilmu przez szczepy Enterococcus faecalis izolowane z przewodu pokarmowego oraz z zaka eƒ i in. Prace z ró nych oêrodków woj. pomorskiego, zosta y wystawione podczas bardzo interesujàcej sesji plakatowej. Firma biomérieux prezentowa a na stoisku firmowym produkty stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej. Zakażenia szpitalne monitorowanie, rozpoznawanie i zapobieganie Warszawa, paêdziernika 2007 roku odby a si druga z cyklu corocznych konferencji, organizowanych przez firm biomérieux Polska. Podobnie jak poprzednio, tegoroczna konferencja zosta a zorganizowana w Hotelu Marriott i poêwi cona by a tematyce zaka eƒ szpitalnych. Przybyli na nià kierownicy zak adów mikrobiologii, laboratoriów mikrobiologicznych oraz epidemiolodzy i dyrektorzy placówek ochrony zdrowia. Program naukowy obejmowa nast pujàce wyk ady: monitorowanie opornoêci bakterii na terenie szpitala, rozpoznawanie i zapobieganie opornoêci, a tak e diagnostyk mikrobiologicznà w monitorowaniu zaka eƒ szpitalnych. 4 GoÊciliÊmy znakomitych wyk adowców w osobach Pani Profesor Walerii Hryniewicz, Pani Doktor Ma gorzaty Fleischer i Pana Doktora Tomasza Ozorowskiego. Konferencja by a okazjà do burzliwej dyskusji i wymiany doêwiadczeƒ na temat kontroli zaka eƒ szpitalnych i trudnoêci w s u bie zdrowia wynikajàcych z szerzenia si opornoêci drobnoustrojów.

5 biologia molekularna Techniki biologii molekularnej w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych dr Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska Epidemiologia jest dzia em medycyny zajmujàcym si badaniem przyczyn wyst powania i szerzenia si chorób zakaênych i niezakaênych w zbiorowiskach ludzi, opracowuje metody zapobiegania i zwalczania chorób wywo anych przez wirusy, bakterie, dro d aki i dermatofity. W obecnej dobie rozwoju medycyny, wprowadzanie nowych technik i leków do terapii, zwi ksza z jednej strony prze ywalnoêç pacjentów, z drugiej strony pojawia si problem zaka eƒ szpitalnych. Du y problem stanowià infekcje szpitalne wywo ane przez szczepy wielooporne, które atwo rozprzestrzeniajà si w Êrodowisku szpitalnym, a których leczenie jest problematyczne ze wzgl du na ograniczone mo liwoêci terapeutyczne. Problem zaka eƒ szpitalnych i epidemii wynika z selekcji szczepów opornych, powstawania nowych mechanizmów opornoêci czy rozprzestrzeniania si genów a nawet ca ych kaset genów odpowiedzialnych za opornoêç na antybiotyki i chemioterapeutyki. Problem ten jest istotny nie tylko z punktu widzenia medycyny, ale równie ma pod o e ekonomiczne i prawne, dlatego tak istotny staje si program kontroli zaka eƒ szpitalnych. Od roku 1970 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) w Atlancie w Stanach Zjednoczonych, jako pierwsze stworzy o program ciàg ego nadzoru nad zaka eniami (NNIS National Nosocomial Infections Surveilance System). CDC jest najwa niejszym na Êwiecie centrum badaƒ nad wyst powaniem i profilaktykà chorób, w tym równie zaka eƒ szpitalnych. W Europie decyzjà (nr 2119/98/EC) Parlamentu Europejskiego oraz Rady z dnia 24 wrzeênia 1998 roku powsta- a sieç nadzoru epidemiologicznego oraz kontrola chorób zakaênych we Wspólnocie Europejskiej (Dz. U. EW nr L 268, z ). Nadzór epidemiologiczny w Europie reguluje Unia Europejska, która wprowadzi a obowiàzek rejestracji wskazanych chorób zakaênych, zaka eƒ szczepami lekoopornymi oraz zaka eƒ szpitalnych. JednoczeÊnie powo ano europejskie centrum epidemiologiczne, European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Mikrobiologiczne zaka enia szpitalne dotyczà wszystkich szpitali niezale nie od stopnia wyspecjalizowania czy poziomu rozwoju kraju, w którym si znajdujà. Dlatego te sta a kontrola zaka eƒ szpitalnych oraz dà enie do ograniczenia ich liczby powinno nale eç do g ównych obowiàzków personelu medycznego szpitali. Badania epidemiologiczne wewnàtrz szpitali sà prowadzone g ównie w celu opracowania efektywnego programu kontroli zaka eƒ. W wielu przypadkach prosta identyfikacja gatunkowa i badanie antybiotykowra liwoêci wystarczà do okreêlenia epidemiologicznej zale noêci szczepów oraz Êledzenia drogi ich rozprzestrzeniania si w czasie. W przypadku, gdy infekcja jest spowodowana mikroorganizmem b dàcym sk adnikiem naturalnej flory bakteryjnej lub Êrodowiska (np. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis), to do okre- Êlenia epidemiologicznej zale noêci poszczególnych izolatów potrzebne jest wykonanie dodatkowych testów. Badania fenotypowe w dochodzeniach epidemiologicznych sà kosztowne i czasoch onne, a cz sto trudne i niejednoznaczne w interpretacji, np. w przypadku szczepów o charakterze endemicznym. OkreÊlenie pokrewieƒstwa pomi dzy szczepami tego samego gatunku i wykrycie klonów lub grup klonalnych wywo ujàcych zaka enia epidemiczne bàdê endemiczne, a tak e ustalenie êród a szerzenia si zaka- eƒ i drogi transmisji pomi dzy oddzia ami, szpitalami, a nawet krajami jest mo liwe dzi ki dobrze rozwini tej technologii kwasów nukleinowych. Specyfika badaƒ metodami molekularnymi opartymi na analizie DNA polega na dok adnym okreêleniu, czy szczepy izolowane od wielu pacjentów nale à do jednego klonu, który rozprzestrzenia si horyzontalnie na oddziale, czy te problem zaka eƒ dotyczy szczepów reprezentujàcych kilka grup klonalnych. Badania epidemiologiczne prowadzone przez d u szy okres czasu wymagajà monitoringu rozprzestrzeniania si i okreêlenia dominacji poszczególnych szczepów, co mo e byç przydatne w opracowaniu d ugoterminowych programów kontroli zaka eƒ. W badaniach epidemiologicznych typowanie szczepów przeprowadzane jest nie tylko w szpitalach, ale równie w ramach kontroli kontaminacji wody i ywnoêci drobnoustrojami oraz w mikrobiologii weterynaryjnej. Typowanie szczepów ma wiele aplikacji w badaniach naukowych i przemyêle spo ywczym np. do kontroli jakoêci ywnoêci. Szybkie metody typowania szczepów mogà znaczàco zredukowaç koszty zwiàzane z leczeniem, powstrzymaniem rozprzestrzeniania si epidemii i dekontaminacjà. Metody genotypowania coraz cz Êciej stajà si integralnà cz Êcià zarówno w klinicznych, jak i naukowych laboratoriach mikrobiologicznych. Szeroka wiedza na temat mechanizmów molekularnych oraz w aêciwoêci fizyko-chemicznych makroczàsteczek komórkowych pozwala tworzyç nowe, coraz bardziej dok adne techniki genotypowania. Techniki te w g ównej mierze opierajà si na analizie restrykcyjnej, hybrydyzacji oraz amplifikacji DNA in vitro przy zastosowaniu aƒcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) oraz sekwencjonowaniu. Rozdzia powsta ych fragmentów DNA o ró nej 5

6 6 d ugoêci, uzyskuje si przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prà ków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Ró nice we wzorach Êwiadczà o odmiennoêci genetycznej badanych organizmów. Generalnie metody genotypowe uwa a si za bardziej kompleksowe. Nie sà to jednak metody uniwersalne i w zale noêci od rodzaju metody charakteryzuje je ró ny potencja ró nicujàcy, czu oêç i powtarzalnoêç, koszt i stopieƒ trudnoêci wykonania. Zostanà omówione trzy grupy metod opartych na analizie zmiennoêci genomowej: 1. analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA po àczona z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE); 2. techniki oparte o ligacj adaptorów oligonukleotydowych; 3. wykorzystanie sekwencji repetytywnych w genotypowaniu bakterii. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA po àczona z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE) Konwencjonalna elektroforeza agarozowa mo e byç stosowana tylko do rozdzia u DNA o wielkoêci do 20 kpz. Na migracj ma wp yw ró ny adunek pomi dzy fragmentami DNA, a rozdzia odbywa si na zasadzie sita molekularnego, utworzonego przez pory noênika. Fragmenty DNA migrujà jako sferyczne spirale, im mniejsza czàstka DNA, tym szybciej migruje przez pory w elu. Niestety dla czàstek DNA powy ej 20 kpz ruchliwoêç staje si coraz mniej zale na od rozmiarów czàsteczki i rozdzia ich klasycznymi metodami elektroforetycznymi staje si niemo liwy. W 1983 r. Schwatrz i Cantor wprowadzili elektroforez pulsowà (PFGE ang. Pulsed Field Gel Electrophoresis), która z biegiem czasu umo liwi a rozdzia w elu agarozowym DNA o d ugoêci od 20 50kpz do 2 10Mpz. Fragmenty wi ksze ni 20 kpz podczas migracji tworzà mocno rozciàgni tà spiral, która nie migruje na zasadzie sita molekularnego, tylko pe za jak wà (ang. snake like ). Fragmenty te nie b dà migrowa y ju zgodnie z efektem adunku. Technika PFGE polega na wymuszonej zmianie kierunku migracji czàsteczek DNA pod wp ywem okresowej zmiany orientacji pola elektrycznego. Zmiana kierunku pola elektrycznego wymusza zmian konformacji czàsteczki DNA i jej reorientacj w kierunku elektrody dodatniej. Czas potrzebny na reorientacj zale y od wielkoêci czàsteczki DNA i jest tym d u szy im czàsteczka jest wi ksza. Zatem wi ksze czàsteczki migrujà wolniej ni mniejsze, wi cej czasu zajmuje im przystosowanie si do nowego kierunku przep ywu pola elektrycznego. Ró nica w czasie reorientacji jest czynnikiem krytycznym, który decyduje o rozdziale fragmentów DNA o ró nej d ugo- Êci. Powsta o wiele odmian technik PFGE, które ró nià si sposobem rozmieszczenia elektrod tzn. kàtem, pod jakim zmienia si kierunek pola elektrycznego. Dzielimy je na dwie kategorie: techniki, w których kàt reorientacji wynosi 180 i techniki, dla których kàt reorientacji zawiera si w przedziale Pierwszà grup stanowi elektroforeza w odwracalnym polu elektrycznym FIGE (ang. Field Inversed Gel Electrophoresis) i polega na cyklicznej, okresowej zmianie polarnoêci jednorodnego pola elektrycznego pod kàtem 180. Czàsteczki DNA w zale noêci od polarnoêci ustawionych po obu stronach elu elektrod, poruszajà si raz w przód (F forward), raz w ty (R reverse). Ten typ elektroforezy PFGE jest stosowany g ównie do rozdzia u czàsteczek o wielkoêci kpz. Elektroforeza w polu elektrycznym o kàcie reorientacji zawierajàcym si w przedziale mo e ró niç si iloêcià i u o eniem stosowanych elektrod oraz kszta tem toru migracji czàstek. Elektroforeza w pulsowym polu PFG (ang. Pulsed Field Gel) i elektroforeza w zmiennym polu o kszta cie prostokàta OFAGE (ang. Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis) umo liwiajà dobry rozdzia fragmentów DNA, jednak e zakrzywienie toru ruchu czàsteczek DNA utrudnia interpretacj, szczególnie przy fragmentach o bardzo podobnej d ugoêci. Proste tory migracji czàstek dajà: elektroforeza w rotacyjnym polu RGE (ang. Rotating Gel Electrophoresis), elektroforeza pionowa w zmiennym polu TAFE (ang. Transverse Field Electrophoresis), elektroforeza w jednorodnym polu o kszta cie prostokàta PHOGE (ang. Pulsed Homogenous Orthogonal Gel Electrophoresis) i elektroforeza w zmiennym, homogennym polu o kszta cie szeêciokàta foremnego CHEF (ang. Contour Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis). Dla CHEF uk ad 24 elektrod tworzy dwa jednorodne pola skierowane do siebie pod kàtem 120, co daje najwi ksze mo liwoêci do rozdzia u czàstek, nawet o wielkoêci oko- o 10 Mpz. Technika ta zosta a wykorzystana mi dzy innymi do stworzenia mapy fizycznej ludzkiego genomu. Analiza polimorfizmu d ugoêci fragmentów restrykcyjnych po àczona z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE ang. Restriction Enzyme Analysis Pulsed Field Gel Electrophoresis) uznawana jest za z oty standard w typowaniu molekularnym bakterii. Metoda ta polega na trawieniu ca ego genomowego DNA enzymem (-ami) restrykcyjnym rzadko tnàcym. Liczba i wielkoêç otrzymanych fragmentów jest charakterystyczna dla danego organizmu i zale y od rozmieszczenia w genomie sekwencji rozpoznawanej przez stosowany enzym restrykcyjny. W wyniku trawienia otrzymuje si od 10 do 30 du ych fragmentów, o wielkoêci od ok. 0,5 kpz do 1000 kpz. Fragmenty restrykcyjne rozdziela si w pulsowej elektroforezie agarozowej. Metoda REA-PFGE mo e byç zastosowana dla dowolnego mikroorganizmu, z którego mo na wyizolowaç DNA (znajomoêç sekwencji nie jest wymagana). PFGE ze wzgl du na wysokà powtarzalnoêç wzoru i dobrà rozdzielczoêç dla wi kszoêci wspólnych enteropatogenów, w USA jest rutynowo stosowana w du ych laboratoriach, gdzie korzysta si z wystandaryzowanych protoko ów do typowania szczepów, a rezultaty zestawia si w centralnych bazach danych. Techniki oparte o ligacj adaptorów oligonukleotydowych (LM-PCR ang. Ligation Mediated PCR) Wiele obecnie stosowanych technik typowania molekularnego opiera si na analizie polimorfizmu genomowego DNA. Majà one na celu przypisanie konkretnemu szczepowi specyficznego profilu fragmentów DNA stanowiàcego jego tzw. odcisk palca (ang. fingerprint). Techniki fingerprinting, czyli techniki tzw. genomowego odcisku

7 palca, wykorzystujà w g ównej mierze amplifikacj fragmentów DNA in vitro przy zastosowaniu aƒcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR), bàdê analiz restrykcyjnà po àczonà z amplifikacjà PCR. Rozdzia powsta ych fragmentów DNA o ró nej d ugoêci uzyskuje si przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prà ków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Ró nice we wzorach Êwiadczà o odmiennoêci genetycznej badanych organizmów. Bardzo przyjaznà technikà do analizy DNA o nieznanej sekwencji jest grupa technik opartych o ligacj adaptorów oligonukleotydowych (LM-PCR ang. Ligation Mediated PCR). Do metod wykorzystujàcych adaptory w reakcji PCR nale à: AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism), ADSRRS (ang. Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites) oraz PCR MP (ang. PCR Melting Profiles). Ka da z tych metod oparta jest na selektywnej amplifikacji fragmentów restrykcyjnych uzyskanych w wyniku trawienia ca ego genomowego DNA endonukleazami (jednà lub dwoma), dajàcymi wiszàce koƒce 5 a nast pnie ligacji odpowiednio zaprojektowanych adaptorów oligonukleotydowych: oligonukleotydu pomocniczego, który zawiera sekwencj komplementarnà do sekwencji rozpoznawanej przez stosowany enzym restrykcyjny i umo liwia przez to hybrydyzacj adaptora do fragmentu restrykcyjnego oraz oligonukleotydu, który ulega w aêciwej ligacji i odpowiedzialny jest za wykreowanie miejsca wiàzania startera w reakcji PCR. Oba oligonukleotydy nie sà ufosforylowane na koƒcach 5, dzi ki czemu nie zachodzi pomi dzy nimi reakcja polimeryzacji podczas reakcji ligacji. Po ligacji adaptora do DNA otrzymuje si dwuniciowe fragmenty o znanej nam na koƒcach sekwencji, które mogà byç wykorzystane w amplifikacji. Reakcj PCR prowadzi si dwustopniowo. W pierwszym etapie (pre-pcr) przeprowadza si wst pnà denaturacj w wyniku, której oddysocjowuje niezligowany oligonukleotyd pomocniczy. Nast pnie zachodzi wype nianie koƒców 3 na matrycy oligonukleotydu ligowanego. W drugim etapie reakcji PCR przeprowadza si w aêciwà amplifikacj przy zastosowaniu startera o identycznej sekwencji jak oligonukleotyd ligowany, cz sto wyd u ony o sekwencj wiszàcego koƒca 5 miejsca restrykcyjnego. Metody LM PCR ró nià si mi dzy sobà g ównie sposobem selekcji amplifikowanych w reakcji PCR fragmentów DNA. W przypadku techniki AFLP w reakcji PCR stosuje si startery o sekwencji identycznej z sekwencjà oligonukleotydu ligowanego adaptora, wyd u onej na koƒcu 3 o sekwencj miejsca restrykcyjnego oraz o 2 4 dowolnych nukleotydów. Amplifikacja fragmentu DNA zachodzi jedynie w przypadku pe nej komplementarnoêci startera na koƒcu 3. Cz stoêç rozpoznawania specyficznego miejsca przez starter selekcyjny wynosi 1/4 n (n liczba zasad selekcyjnych). Dla techniki ADSRRS do ograniczenia iloêci amplifikowanych fragmentów wykorzystuje si zjawisko supresji (SSH, ang. Suppression Subtractive Hybridisation) reakcji PCR. Supresja, zwana inaczej wewnàtrzczàsteczkowà hybrydyzacjà fragmentów homologicznych mo e zajêç w przypadku, gdy jednoniciowe fragmenty DNA posiadajà na obu koƒcach komplementarne wzgl dem siebie sekwencje (w tym przypadku adaptory). Krawczyk i wsp. (2002, 2003, 2004) zastosowali ADSRRS-fingerprinting do typowania szczepów Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens i Acinetobacter baumannii w badaniach epidemiologicznych zaka eƒ szpitalnych. W metodzie PCR MP (ang. PCR Melting Profiles) ograniczenie iloêci amplifikowanych fragmentów uzyskuje si poprzez zastosowanie ni szej ni w standardowej metodzie LM PCR temperatury denaturacji DNA. W reakcji PCR selektywnoêç i potencja ró nicujàcy metody mo na regulowaç poprzez dobór odpowiedniego enzymu restrykcyjnego oraz temperatury denaturacji w reakcji PCR. Niewàtpliwà zaletà techniki PCR MP jest mo liwoêç ró nicowania fragmentów DNA o identycznej d ugoêci, ale ró nym sk adzie zasad, co znaczàco odró nia jà od pozosta ych technik LM PCR. Technika PCR MP zosta a wykorzystana przez Krawczyk i wsp. (2006, 2007) do ró nicowania klinicznych szczepów bakteryjnych E. coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus oraz dro d aków z rodzaju Candida. Szczególne zainteresowanie i dynamiczny rozwój techniki LM PCR zawdzi czajà: uniwersalnoêci nie wymagajà znajomoêci analizowanej sekwencji DNA; opierajà si na analizie ca ego genomu bakteryjnego czy grzybowego jest to korzystne ze wzgl du na fakt, i interpretacja i u ytecznoêç danych opartych na analizie genów lub operonów wyst pujàcych pojedynczo w genomie w wielu przypadkach jest niewystarczajàca; prostocie wykonania (w porównaniu np. z PFGE) przy zachowaniu wysokiego potencja u ró nicujàcego; wymagajà do przeprowadzenia pe nej analizy niewielkich iloêci DNA (warunkiem jest pozyskanie DNA z czystych kultur bakteryjnych); sà powtarzalne, charakteryzujà si wysokim stopniem dyskryminacji badanych organizmów; pozwalajà na wzgl dnie szybkà analiz bez potrzeby inwestowania w wysoko wyspecjalizowany sprz t, nie wymagajà du ych nak adów finansowych, dzi ki czemu metody LM PCR mogà byç stosowane w rutynowych laboratoriach diagnostycznych. Wykorzystanie sekwencji repetytywnych Sekwencjonowanie genomów ujawni o, e du y procent genomowego DNA mikroorganizmów wyst puje w postaci powtórzonych (repetytywnych) sekwencji (ang. DNA repeats). Powtórzenia ró nià si wielkoêcià, lokalizacjà, stopniem z o onoêci oraz rodzajem (ang. repeat mode). Powtórzenia mogà byç rozproszone na genomie, bàdê zlokalizowane w jednym miejscu. Sekwencje repetytywne oprócz du ego zakonserwowania ewolucyjnego, wykazujà równie wystarczajàcà zmiennoêç, która mo e byç wykorzystana do ró nicowania szczepów bakteryjnych. Powtórzone jednostki mogà byç identyczne (homogenne powtórzenia), bàdê mogà ró niç si nieznacznie wskutek mutacji punktowych (heterogenne powtórzenia). Zosta y wprowadzone ró ne podzia y sekwencji repetytywnych np. powtórzenia proste 7

8 8 (ang. direct repeats), powtórzenia podwójne (ang. dyad repeats), powtórzenia odwrócone (ang. inverted repeats). W Êwiecie bakterii zosta zaproponowany podzia na dwie klasy powtórzeƒ na genomie: 1. powtórzenia proste, z o one z krótkich oligonukleotydów (zwykle 1 5 nukleotydów), powtórzone wielokrotnie obok siebie w konfiguracji g owa-do-ogona (ang. head-to-tail), 2. d ugie powtórzenia (np. elementy insercyjne IS, transpozony Tn i powtórzenia rozdzielone (ang. spaced repeats). Istniej równie podzia na sekwencje rozproszone na genomie oraz skupione tzw. sàsiadujàce. Poni- ej przedstawiono krótki opis niektórych sekwencji repetytywnych i ich wykorzystanie w typowaniu mikroorganizmów. Rozproszone powtórzenia w genomie prokariotycznym Rozproszone repetytywne motywy znaleziono u du ej liczby gatunków bakterii. Opisano je w pracy przeglàdowej Lupski i Winstock (1992). Wi kszoêç tych elementów rozrzucona na genomie jest krótsza ni 200 par zasad (pz), sk ada si z sekwencji niekodujàcej, po o onej mi dzycistronowo. Do powtórzeƒ rozproszonych nale à sekwencje charakterystyczne dla bakterii Gram-ujemnych nale àcych do Enterobacteriaceae: ERIC (ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o d ugoêci pz, i REP (ang. Repetitive Extragenic Palindrome) o d ugoêci 38 pz. ERIC-PCR jest metodà fingerprinting opartà na amplifikacji genomowego DNA po o onego pomi dzy elementami ERIC lub pomi dzy elementami ERIC i innymi repetytywnymi sekwencjami DNA. Pomimo, e sekwencje te zosta y opisane dla bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae z powodzeniem technika ta mo e byç wykorzystana do typowania równie innych bakterii. Elementy repetytywne w systemie PCR zosta y wykorzystane do badania zwiàzków pomi dzy patogenami szpitalnymi np. dla E. coli, S. aureus ienterokoków. Analogiczne sekwencje by y wykryte u innych gatunków mikroorganizmów, takich jak: cyjanobakterie czy bakterie glebowe Rhizobium meliloti. We wczesnych latach dziewi çdziesiàtych zidentyfikowano inny motyw rozproszonego powtórzenia u Streptococcus pneumoniae, zwany powtórzeniem BOX, odmienny od powtórzeƒ ERIC czy REP. Te powtórzenia tworzà stabilne drugorz dowe struktury i sà w niektórych przypadkach transkrybowane. Ich funkcja jest prawdopodobnie zwiàzana z regulacjà ekspresji genów, poniewa spotyka si je w bliskim sàsiedztwie genów np. odpowiedzialnych za wirulencj. Od czasu wykrycia elementów BOX sà one wykorzystywane w typowaniu molekularnym. Wszystkie te prokariotyczne motywy reprezentujàce repetytywne DNA nie sà zorganizowane w tandemowe powtórzenia, ale sà rozrzucone wewnàtrz genomu mikroorganizmów. Powtórzenia sàsiadujàce (stykajàce si ) W okreêlonych fragmentach genomu spotykane sà krótkie powtórzone sekwencje (powtórzone jednostki liczà od 1 do 25 nukleotydów) nazywane: SSRs (ang. Short Sequences Repeats), bàdê krótkie tandemowe powtórzenia STRs (ang. Short Tandem Repeats). Bogate w tego typu repetytywne regiony sà m.in. geny kodujàce trna na genomie bakteryjnym. Stanowià je ró nej d ugoêci krótkie powtórzone jednostki. Jest kilka takich eubakteryjnych loci bogatych w SSR, np. dla Hemophilus influenzae geny lic1 lic3 zawierajà motyw powtórzony CAAT, w genomie Neisseria meningitidis wykryto domeny (CTA)9, podczas gdy domeny (CTA)11 i (CTT)21 by y odkryte odpowiednio w sekwencjach u Mycoplasma genitalium i Mycobacterium leprae. Takie SSR loci mogà byç wykorzystane jako markery w identyfikacji i rozprzestrzenianiu si szczepów bakteryjnych. Typowanie bakterii oparte na tandemowych powtórzeniach (ang. tandem repeats) Powtórzenia tandemowe majà istotne znaczenie w typowaniu bakterii, sà definiowane jako sekwencje monomeryczne, o zmiennej d ugoêci, nawet do kilkuset nukleotydów, powtórzone periotycznie o konfiguracji g owa-do-ogona. Sekwencje powtórzone tandemowo o okreêlonej konfiguracji monomerów mogà byç po o one w pojedynczym locus (geny jednokopijne), bàdê w kilku miejscach genomu. Równie do wykrywania polimorfizmu krótkich tandemowych powtórzeƒ mo na wykorzystaç technik PCR. Tandemowe powtórzenia DNA pos u- y y jako cel molekularny do opracowania metod genotypowych ró nicowania m.in. takich bakterii patogennych jak: Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. bovis, M. leprae, Leptospira interrogans sensu stricto, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, S. typhi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157, Borrelia spp., Bordetella pertusis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis. Regiony, w których wyst pujà ró nice w liczbie powtórzonych jednostek zwane sà domenami o zró nicowanej liczbie tandemowych powtórzeƒ (ang. Variable Number Tandem Repeat). Klasa VNTR u organizmów prokariotycznych dotyczy pojedynczego locus. Kombinacja polimorficznej natury VNTRs i zastosowanie techniki PCR sta o si podstawà opracowania nowej metody ró nicowania drobnoustrojów opartej na analizie zró nicowanej liczby tandemowych powtórzeƒ wielu loci MLVA (ang. multiple-locus variable number tandem repeats analysis). Funkcjonuje ona jako genetyczny fingerprint. Zró nicowana liczba tandemowych powtórzeƒ wielu loci (MLVA) mo e byç odpowiednim podejêciem do ró nicowania genetycznego wysoko monomorficznych gatunków takich jak Bacillus anthracis i Yersinia pestis. MLVA wykorzystano równie do ró nicowania szczepów Staphylococcus aureus w uk adzie MP-PCR (ang. Multiplex PCR). Amplifikacji poddawano wiele polimorficznych loci charakteryzujàcych si powtórzeniami tandemowymi: clfa, clfb, sdr, spa, sspa. W roku 1991 opublikowano wykorzystanie tandemowych powtórzeƒ typu DR (ang. Direct Repeats) do identyfikacji Mycobacterium tuberculosis. Powtórzenia DR po o one sà w obr bie flankujàcych sekwencji elementów insercyjnych IS i charakteryzujà si polimorfizmem pod wzgl dem rozmiaru i kompozycji wêród szczepów M. tuberculosis complex. Motyw DR sk ada si z krótkich powtórzonych sekwencji o d ugoêci 36 par zasad, rozdzielonych unikalnymi obszarami

9 sekwencji rozdzielajàcej (ang. spacer element ) o d ugoêci od 35 do 41 nukleotydów. Metoda okreêlona jako spoligotyping oparta jest na amplifikacji PCR obszarów rozdzielajàcych sekwencje DR, ich znakowaniu i hybrydyzacji do oligonukleotydów (zakonserwowane powtórzenia) zwiàzanych z membranà nylonowà. Metod spoligotyping stosuje si do wst pnej analizy epidemiologicznej gruêlicy. Obecnie bardzo przydatna jest metoda oparta o analiz MIRU-VNTR. MIRU (ang. Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) sà to homologiczne nukleotydowe rozproszone sekwencje wykazujàce strukturalne podobieƒstwo do MSY1 ludzkich minisatelitów (zwane sà one równie przez to sekwencjami mikrosatelitarnymi). SpoÊród 41 sekwencji MIRU wykorzystuje si 12, o d ugoêci od 52 do 77 nukleotydów. Ka da z 12 sekwencji mo e wyst powaç na genomie w kilku lub kilkunastu powtórzeniach w zale noêci od szczepów. Metoda MIRU-VNTR oparta jest na niezale nej amplifikacji 12 loci przy wykorzystaniu sekwencji starterowych komplementarnych do regionów sàsiadujàcych z sekwencjami MIRU. Liczb powtórzeƒ sekwencji MIRU u poszczególnych loci obrazuje si jako uk ad liczb. System typowania MIRU- VNTR zosta równie zautomatyzowany i wykorzystuje uk ad multiplex-pcr, wyznakowane fluorescencyjnie startery i rozdzia na automatycznym sekwenatorze. Dzi ki technice PCR uleg a zwi kszeniu czu oêç i specyficznoêç badaƒ diagnostycznych. Wprowadzenie do diagnostyki medycznej techniki PCR uproêci o równie procedury badawcze umo liwiajàc ich automatyzacj i powstanie szeregu handlowo dost pnych testów. Komercyjny, zautomatyzowany system DiversiLab do typowania drobnoustrojów w oparciu o technik rep-pcr Tylko jeden system molekularnego typowania szczepów jest komercyjnie dost pny w postaci wystandaryzowanego kitu automatyczny system DiversiLab, który wykorzystuje rep-pcr do ró nicowania izolatów bakteryjnych i grzybowych oraz identyfikuje niektóre grzyby do poziomu gatunku. Po ekstrakcji DNA z wyizolowanych kultur, przeprowadzana jest reakcja amplifikacji w oparciu uk ad rep-pcr z wykorzystaniem starterów, dobranych odpowiednio do repetytywnych sekwencji, które sà rozdzielone sekwencjami genomu (stosujemy odpowiedni zestaw zwierajàcy w swoim sk adzie wszystkie komponenty potrzebne do przeprowadzenia reakcji PCR DiversiLab DNA Fingerprinting Kit). Amplifikacji ulegajà fragmenty pomi dzy sekwencjami repetytywnymi (startery dobrane do zewn trznych sekwencji powtórzenia i skierowane naprzeciw siebie amplifikujà region pomi dzy elementami repetytywnymi w przeciwieƒstwie do starterów skierowanych do wn trza sekwencji repetytywnej, które amplifikujà elementy repetytywne jak w przypadku zró nicowanej liczby tandemowych powtórzeƒ VNTR). Wiele amplikonów DNA o ró nej wielkoêci i iloêci (oraz intensywnoêci) jest wytwarzana podczas PCR. Manualna metoda nastawiona jest na klasyfikacj drobnoustroju do podgatunku oraz na ró nicowanie szczepów bakteryjnych. Automatyczna metoda rep-pcr zawiera trzy komponenty: 1. odczynniki do rep-pcr w formie kitu; 2. bioanalizator, który s u y do rozdzia u amplifikowanych fragmentów na zintegrowanym, p ytkowym mikrosystemie cieczowym (ang. microfluidic chip) i detekcji opartej na pomiarze intensywno- Êci fluorescencji i czasie migracji 3. oprogramowanie do analizy wyników (jest to analiza w czasie rzeczywistym), które okreêla podobieƒstwo pomi dzy wszystkimi analizowanymi próbkami i raport wygenerowny przez DiversiLab System. Wyniki przedstawione sà w postaci dendrogramów (ilustrujà hierarchiczne relacje pomi dzy izolatami) i wykresów graficznych, mo na uzyskaç równie obraz naêladujàcy elektroforegram. Komercyjnie dost pne kity, automatyzacja, prostota wykonania, szybkoêç (do ok. 4 godzin), przyjazny raport czyni DiversiLab System atrakcyjnym i dost pnym dla wszystkich laboratoriów mikrobiologicznych. DiversiLab System zosta wystandaryzowany dla wielu bakterii, dro d aków i dermatofitów. Ca y szereg prac naukowych donosi o du ej powtarzalno- Êci wewnàtrz- i mi dzylaboratoryjnej. Brano pod uwag ró ne warunki hodowli drobnoustrojów, st enie i jakoêç matrycy do reakcji rep-pcr, badano powtarzalnoêç w wielu laboratoriach z udzia em ró nego personelu i sprz tu laboratoryjnego. Manualny rep-pcr jest u yteczny w typowaniu szczepów, ale podwa any jest przez niskà powtarzalnoêç mi dzylaboratoryjnà, jest bardziej czasoch onny oraz wymaga rozdzia u i detekcji amplikonów na elu agarozowym. ReprodukcyjnoÊç metod genotypowania jest punktem krytycznym w d ugoterminowych badaniach epidemiologicznych i dla porównania archiwizowanych wzorów fingerprint. Wykazano, e rep-pcr fingerprinting jest stabilny po wielu pasa ach bakterii, powtarzalny w obr bie szczepu i odleg y pomi dzy szczepami. Zadowalajàcy potencja ró nicujàcy i powtarzalnoêç wzorów fingerprint dla rep-pcr Êwiadczy o przydatnoêci tej metody do porównania d ugoterminowych badaƒ i studiów epidemiologicznych. Podsumowanie Wybór metody molekularnej nale y dostosowaç do problemu, który chcemy rozwiàzaç: wykrywanie, identyfikacja, ró nicowanie, badania taksonomiczne. Nie bez znaczenia istotne sà tu równie aspekty techniczne tj. stopieƒ trudno- Êci wykonania (doêwiadczenie personelu), zaplecze badawcze (sprz t, którym dysponujemy), atwoêç interpretacji wyników, czas wymagany do analizy, ca kowite koszty stosowanej metody, oraz koszty pojedynczej próbki. W diagnostyce mikrobiologicznej system genotypowania drobnoustrojów powinien byç równie tak dobrany, aby metoda by a wystarczajàco czu a, powtarzalna, odtwarzalna i powinna mieç du y potencja ró nicujàcy. 9

10

11

12 mikrobiologia Enterokoki oporne na wankomycynę (VRE) epidemiologia i metody wykrywania dr Alicja Kuch Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Instytutu Leków w Warszawie 12 Enterokoki sà wzgl dnie beztlenowymi Gram-dodatnimi ziarenkowcami. Wyodr bnienie Enterococcus jako jednostki taksonomicznej nowego rodzaju wêród bakterii Gram-dodatnich, nastàpi o po roku 1980, co wiàza o si z wynikami badaƒ przeprowadzonych z wykorzystaniem nowych technik molekularnych uprzednio bakterie te zaliczano do paciorkowców grupy D. Do dziê opisano ponad 30 gatunków Enterococccus spp. (1). W praktyce klinicznej najcz Êciej wykrywa si i izoluje: Enterococcus faecalis (80 95%) i Enterococcus faecium (5 15%). W ostatnich latach E. faecium staje si jednak patogenem coraz powszechniejszym, co t umaczy si jego wi kszà opornoêcià na antybiotyki. Infekcje wywo ane przez pozosta e gatunki rodzaju Enterococcus sà sporadyczne. Enterokoki sà szeroko rozpowszechnione w Êrodowisku: wyst pujà zarówno w wodzie, jak i w glebie, spotkaç je mo na powszechnie w Êwiecie roêlin i zwierzàt. U ludzi wchodzà w sk ad mikroflory jelitowej, choç mogà równie kolonizowaç skór, cewk moczowà i eƒskie drogi rodne (2). Enterokoki nale y traktowaç jako drobnoustroje oportunistyczne powodujàce infekcje u osób z obni- onà odpornoêcià, hospitalizowanych, cierpiàcych na choroby przewlek e oraz poddawanych d ugotrwa ej antybiotykoterapii, zw aszcza cefalosporynami i glikopeptydami. Enterokoki powodujà zaka enia uk adu moczowego, zapalenie wsierdzia, posocznic, zaka enia w obr bie jamy brzusznej oraz infekcje mieszane ran oparzeniowych i chirurgicznych. Sporadycznie izolowane sà z zapaleƒ opon mózgowo-rdzeniowych i uogólnionych zaka- eƒ noworodkowych. Enterokoki nie posiadajà wielu spoêród czynników zjadliwoêci charakterystycznych dla innych Gram-dodatnich bakterii chorobotwórczych. Wytwarzajà jednak czynniki u atwiajàce ich adhezj do komórek gospodarza (adhezyna bia ko wià àce kolagen), czynniki modulujàce odpornoêç organizmu (bia ka wià àce domen Fc przeciwcia, peroksydaz, dysmutaz nadtlenkowà, feromony p ciowe) oraz czynniki wywo ujàce zmiany patologiczne takie jak: cytolizynya (hemolizyna), proteinazy, hialuronidaza (3,4). Po pa eczkach z rodziny Enterobacteriacae i Staphylococcus aureus enterokoki zajmujà trzecie miejsce wêród patogenów szpitalnych w USA i Europie (6,23). Do zaka eƒ szpitalnych mo e dochodziç zarówno na drodze endogennej jak i egzogennej, w tym ostatnim przypadku zw aszcza przez r ce personelu medycznego. Przyczynà utrzymywania si enterokoków w Êrodowisku szpitalnym jest ich opornoêç na czynniki fizyko-chemiczne, niskie wymagania od ywcze oraz naturalna i nabyta opornoêç na wiele antybiotyków i chemioterapeutyków. Dla rozpowszechniania wyst powania tej bakterii nie bez znaczenia jest równie wzrost liczby osób z niedoborami uk adu immunologicznego. Enterokoki nale à do najbardziej opornych na wysokie temperatury spoêród wszystkich bakterii nieprzetrwalnikujàcych. Wzrastajà w temperaturze C, w Êrodowisku 9,6% NaCl, przy ph 9,6 i prze ywajà ogrzewanie w 60 C przez 30 minut (2,7). Naturalna opornoêç, b dàca w aêciwo- Êcià rodzaju, dotyczy penicylin izoksazolilowych, niskich st eƒ antybiotyków aminoglikozydowych, kotrimoksazolu, cefalosporyn, linkozamidów oraz niskich st eƒ glikopeptydów u gatunków E. casseliflavus i E. gallinarum (fenotyp VanC). OpornoÊç nabyta jest nowà cechà szczepów, wynikajàcà ze zmian w materiale genetycznym. Z klinicznego punktu widzenia najistotniejsze znaczenie ma opornoêç na wysokie st - enie aminoglikozydów (HLAR) oraz opornoêç na wankomycyn (VRE). OpornoÊç ta stanowi powa ne niebezpieczeƒstwo, poniewa glikopeptydy sà antybiotykami z wyboru w terapii powa nych zaka eƒ wieloopornymi szczepami enterokoków oraz opornych na metycylin gronkowców (MRSA). Ponadto enterokoki mogà przekazywaç geny kodujàce opornoêç na glikopeptydy innym drobnoustrojom, np. Staphylococcus aureus (8). Szczepy E. faecium i E. faecalis HLAR i VRE w àczono na list szpitalnych patogenów alarmowych (5). Wankomycyna jest glikopeptydem o z o onej budowie chemicznej wywierajàcym dzia anie bakteriobójcze na bakterie Gram-dodatnie poprzez hamowanie syntezy g ównego sk adnika Êciany komórkowej bakterii, peptydoglikanu. Tworzy kompleks z D-alanylo-D-alaninà w czàsteczce prekursora mureiny hamujàc polimeryzacj i transpeptydacj peptydoglikanu. Mechanizm opornoêci na wankomycyn polega na wytwarzaniu przez bakterie zmienionych czàsteczek dipeptydów: D-alanino- D-mleczanu oraz D-alanino-D-seryny o niskim powinowactwie do wankomycyny, które w àczane sà zamiast D-alanylo-D-alaniny w aƒcuch prekursora. Wówczas wankomycyna nie jest ju w stanie zablokowaç syntez peptydoglikanu (9). Opisano dotychczas 6 fenotypów opornoêci na wankomycyn : VanA (10), VanB (11), VanC (12), VanD (13,14), VanE (15) i VanG (16) (Tabela 1). Fenotypy te ró nià si mi dzy sobà lokalizacjà genów warunkujàcych opornoêç (w tym zdolnoêcià do ich horyzontalnego rozprzestrzeniania), poziomem ekspresji, zakresem opornoêci i znaczeniem klinicznym. SpoÊród nabytych i rozprzestrzeniajàcych si horyzontalnie fenotypów najlepiej scharakteryzowane i najbardziej powszechne sà VanA i VanB. Fenotyp VanA zdefiniowany jest poprzez indukowalnà opornoêç na wysoki poziom wankomycyny i teikoplaniny. Fenotyp VanB cechuje indukowalna opornoêç wobec wankomycyny na ró nym poziomie i wra liwoêç na teikoplanin. OpornoÊç VanA i VanB jest przekazywana mi dzy drobnoustrojami za pomocà ru-

13 chomych elementów genetycznych takich jak plazmidy i transpozony. Fenotyp VanC jest zwiàzany z konstytutywnym, niskim stopniem oporno- Êci na wankomycyn i wra liwoêcià na teikoplanin. Fenotyp VanD przypomina VanB i charakteryzuje si konstytutywnà opornoêcià na wankomycyn i niskà opornoêcià na teikoplanin. Szczepy o fenotypie VanE wykazujà niski stopieƒ opornoêci na wankomycyn i wra liwoêç na teikoplanin. Szczep E. faecalis, zaklasyfikowany jako VanG, wykazuje wra liwoêç na glikopeptydy podobnà do enterokoków o fenotypie VanE, ale zespó genów warunkujàcych t opornoêç (vang) posiada odmiennà organizacj ni pozosta e znane loci dla van (16). Enterokoki oporne na wankomycyn VRE (ang. vancomycin-resistant enterococcus) wykryto po raz pierwszy w Europie w 1986 r. (17,18), a w 1988 r. opisano je w Stanach Zjednoczonych (19). W Polsce szczepy oporne na wankomycyn zarejestrowano po raz pierwszy w grudniu 1996 roku na oddziale hematologicznym Szpitala Klinicznego w Gdaƒsku (20). Od momentu pojawienia si szczepów VRE na Êwiecie obserwujemy systematyczny wzrost liczby infekcji wywo anych tymi szczepami. W USA liczba szpitalnych zaka eƒ VRE wzros a drastycznie w okresie z 0,3% do 25,2%, co zwiàzane jest z masowym wykorzystaniem wankomycyny w terapii zaka eƒ szczepami MRSA i biegunki poantybiotykowej wywo anej przez Clostridium difficile (6). W USA szczepy VRE izoluje si g ównie wêród pacjentów oddzia ów intensywnej opieki medycznej, nie stwierdzono natomiast pozaszpitalnych rezerwuarów VRE (21,22). Wg danych European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) w Europie liczba zaka eƒ szpitalnych VRE jest znacznie ni sza, pomimo obserwowanej tendencji wzrostowej z 3,3% w roku 2001 do 7,8% w roku 2004 (23). Najbardziej istotny statystycznie wzrost liczby szpitalnych zaka eƒ VRE w ciàgu ostatnich pi ciu lat odnotowano w pi ciu krajach: Grecja, W ochy, Anglia, Irlandia oraz Portugalia. Wi kszoêç epidemii szpitalnych VRE dotyczy oddzia ów hematologicznych i nefrologicznych i zwiàzana jest z rozprzestrzenianiem si wieloopornego, epidemicznego, szpitalnego kompleksu klonalnego 17 (CC 17) szczepów E. faecium (23, 24). W Europie, w przeciwieƒstwie do Stanów, opisano pozaszpitalne rezerwuary szczepów VRE wêród zdrowych ludzi (bezobjawowych nosicieli) i zwierzàt hodowlanych. Prawdopodobnym êród em pozaszpitalnych szczepów VRE by y zwierz ta, karmione paszà wzbogaconà innym antybiotykiem glikopeptydowym awoparcynà (25). Szczepy zwierz ce via aƒcuch pokarmowy uleg y przeniesieniu na ludzi a ich geny opornoêci przeniesieniu na szczepy pochodzenia ludzkiego za pomocà ruchomych elementów genetycznych (transpozony) (22). Kolonizacja dotyczy g ównie przewodu pokarmowego, rzadziej ujêcia cewki moczowej. Kolonizacja VRE zdrowych ludzi mo e trwaç od kilku tygodni do kilku lat (22) i stanowiç êród o infekcji VRE dla osób z grupy ryzyka (d ugotrwa a hospitalizacja, d ugotrwa a antybiotykoterapia, pobyt na oddziale intensywnej terapii, hematologicznym lub onkologicznym) (21). Dlatego wyhodowanie VRE od osoby z personelu medycznego wià e si z koniecznoêcià odsuni cia jej, do czasu ustania nosicielstwa, od opieki nad pacjentami VRE ujemnymi (21,26). Pacjenci skolonizowani lub zaka eni VRE powinni podlegaç procedurom opracowanym przez Zespó ds. Kontroli Zaka eƒ w celu zapobiegania i kontroli rozprzestrzeniania si zaka- eƒ VRE. W ostatnich latach prowadzi si badania z u yciem doustnych antybiotyków nad eradykacjà kolonizacji, co umo liwi kontrol rozprzestrzeniania si i zmniejszenie cz stoêci infekcji VRE (27). Identyfikacja Enterokoków Ziarniaki Gram-dodatnie katalazoujemne rodzaju Enterococcus w preparatach barwionych uk adajà si pojedynczo, parami lub w krótkie aƒcuszki. Schemat diagnostyczny enterokoków obejmuje ich izolacj na pod o u agarowym (Columbia, TSA, Schaedler) wzbogaconym krwià, identyfikacj fenotypowà do rodzaju i gatunku, oraz oznaczenie wra liwo- Êci na antybiotyki i chemioterapeutyki (antybiogram) zgodnie z rekomendacjami CLSI i KORDL obejmujàce: badanie w kierunku opornoêci na wysokie st enia aminoglikozydów (tzw. fenotyp HLAR) i opornoêci na wankomycyn (w przypadku VRE z oznaczeniem minimalnego st enia hamujàcego, MIC, wankomycyny i teikoplaniny). Szybka i precyzyjna identyfikacja do poziomu gatunku, szczególnie w przypadku ci kich zaka eƒ enterokokowych (zapalenie wsierdzia, posocznica), stanowi wa nà wskazówk terapeutycznà do momentu oznaczenia lekowra liwo- Êci badanego szczepu. Identyfikacja E. casseliflavus i E. gallinarum, które sà naturalnie oporne na wankomycyn (obecnoêç genu vanc), pozwala z góry uniknàç stosowania wankomycyny w terapii zaka eƒ wywo anych przez te gatunki. KoniecznoÊcià wydaje si obecnie rozró nienie gatunków E. faecalis i E. faecium ze wzgl du na ich znaczenie kliniczno-epidemiologiczne i gatunkowo-specyficzne mechanizmy opornoêci na leki (naturalna opornoêç E. faecalis na chinupristin / dalfopristin ) (28). Na pod o ach wzbogaconych krwià enterokoki rosnà w postaci kolonii szaro-bia ych, g adkich i okràg ych z hemolizà lub bez. Szczepy E. faecalis wytwarzajàce cytolizyn (hemolizyn ) na pod o ach agarowych z krwià króliczà, ludzkà lub koƒskà wykazujà hemoliz typu beta. Natomiast na pod o u agarowym z dodatkiem krwi baraniej szczepy te mogà dawaç hemoliz alfa lub gamma (brak hemolizy). Inne gatunki sà zazwyczaj alfa-hemolizujàce. Powszechnie stosowane pod o a wybiórczo-ró nicujàce dla enterokoków zawierajà ó ç, eskulin i cytrynian elaza oraz azydek sodu. Na tych pod o ach wokó kolonii enterokokowych pojawia si bràzowo-czarne zabarwienie wskutek hydrolizy eskuliny do eskuletiny, która reaguje z cytrynianem elaza dajàc barwny kompleks. Dodatek cytrynianu i azydku sodu warunkuje wybiórczoêç pod o a w stosunku do bakterii Gram-ujemnych i innych ni enterokoki Gram-dodatnich. Identyfikacja i zró nicowanie enterokoków do rodzaju obejmuje: wyglàd kolonii i typ hemolizy na pod- o u agarowym wzbogaconym krwià baranià, wyglàd drobnoustrojów w preparacie barwionym metodà Grama, 13

14 14 zdolnoêç do wytwarzania katalazy, zdolnoêç wzrostu w zakresie temperatur C, zdolnoêç wzrostu w bulionie o ph 9,6 oraz w bulionie z dodatkiem 6,5% NaCl, zdolnoêç hydrolizy eskuliny w obecnoêci 40% ó ci, zdolnoêç do hydrolizy L-pyrrolidonylo-β-naftylamidu (test PYR) i L-leucynoβ-naftyloamidu (test LAP). ZdolnoÊç hydrolizy PYR posiada ponad 96% enterokoków i wszystkie rozk adajà LAP. Wyjàtek stanowià gatunki o niewielkim znaczeniu klinicznym: E. cecorum, E. columbae i E. saccharolyticus, które nie posiadajà zdolnoêci hydrolizowania PYR (29,30), okreêlenie przynale noêci do grupy serologicznej D wg Lancefield (antygen D wyst puje u oko o 80% szczepów enterokoków). W celu identyfikacji enterokoków do poziomu gatunki wykorzystuje si g ównie ich cechy biochemiczne zgodnie ze schematem zaproponowanym przez Facklama (31,29): fermentacja cukrów i alkoholi (rafinoza, sacharoza, mannitol, sorbitol), hydroliza argininy, wykorzystanie pirogronianu z wytworzeniem acetoiny. W identyfikacji gatunku pomocne jest równie : obserwowanie ruchu umo liwiajàce odró nienie E. casseliflavus i E. gallinarum (gatunki ruchliwe) od E. faecalis i E. faecium (gatunki nie wykazujàce ruchu), wytwarzanie ó tego barwnika na pod o u agarowym przez E. casselifavus, E. mundtii i E. sulfurens, redukacja tellurynu potasu podczas wzrostu na pod o u agarowym z dodatkiem 0,04% tellurynu. Do ca kowitej redukcji tellurynu zdolny jest jedynie gatunek E. faecalis, po owicznà reakcj wykazujà natomiast gatunki ruchliwe: E. casseliflavus i E. gallinarum. Pozosta e istotne kliniczne gatunki enterokoków (E. faecium, E. durans, E. avium, E. hirae) wykazujà wynik ujemny w tym teêcie (31,32). E. faecalis wzrasta na pod- o u z dodatkiem 0,04% tellurynu potasu w postaci czarnych koloni w wyniku inkrustacji komórek bakteryjnych per owo-czarnymi kryszta ami zredukowanego do metalicznego telluru tellurynu potasu. Zaproponowany przez Facklama (31) schemat identyfikacji fenotypowej enterokoków do poziomu gatunku sta si podstawà do opracowania komercyjnych testów identyfikacyjnych o charakterze automatycznym i pó automatycznym wykorzystywanych rutynowo w laboratoriach mikrobiologicznych (33,34). Oznaczanie opornoêci na wankomycyn Rutynowo stosowanà w laboratoriach mikrobiologicznych metodà wykrywania VRE jest metoda dyfuzyjno-krà kowa z u yciem krà ków o zawartoêci wankomycyny 30 µg i teikoplaniny 30 µg (35,36). Nale y pami taç o koniecznoêci 24 godzinnej inkubacji. Odczyt przeprowadzaç nale y w Êwietle przechodzàcym. Izolat uznajemy za oporny równie w przypadku wzrostu mg awicowego i obecnoêci kolonii w strefie zahamowania wzrostu. Dla szczepów wykazujàcych stref Êredniej wra liwoêci nale y oznaczyç MIC lub oznaczyç wra liwoêç na glikopeptydy metodà przeglàdowà rekomendowanà przez CLSI. Na pod o e BHIA (Brain Heart Infusion Agar) o zawartoêci 6 µg/ml wankomycyny nale y nanieêç 10 µl zawiesiny bakteryjnej o g stoêci 0,5 McFarlanda, a nast pnie inkubowaç 24 godziny w temp. 35 C w warunkach tlenowych. Izolat uznaje si za oporny w przypadku uzyskania jego wzrostu na pod o u w postaci co najmniej jednej kolonii. Do okreêlenia fenotypu opornoêci badanego izolatu nale y wówczas okreêliç MIC oraz potwierdziç identyfikacj do gatunku. Konieczne jest wykonanie testu na ruch oraz wytwarzanie barwnika w celu rozró nienia czy nie mamy do czynienia z gatunkami o naturalnej oporno- Êci na wankomycyn (E. gallinarum i E. casseliflavus), które cz sto rosnà na pod o u z 6 µg/ml wankomycynà (35,36). Problem diagnostyczny stanowiç mogà E. gallinarum i E. casseliflavus nie wykazujàce ruchu, wówczas przydatny jest test na zakwaszenie metylo-d-glukopiranozydu (MGP). E. gallinarum i E. casseliflavus zakwaszajà MGP, natomiast E. faecium i E. faecalis nie wykazujà tej reakcji (37). Do badaƒ przesiewowych w kierunku VRE wykorzystywane sà równie pod- o a mikrobiologiczne zawierajàce obok wankomycyny substancje hamujàce wzrost innych drobnoustrojów ni szczepy wankomycynooporne (np. azydek sodu) oraz substancje wskaênikowe dla enterokoków (eskulina, 40% ó ç). Coraz cz Êciej do pod o y dodawane sà wskaêniki chromogenne. Ró ne systemy automatyczne stosowane w laboratoriach mikrobiologicznych dysponujà panelami antybiotykowymi umo liwiajàcymi wykrycie i zró nicowanie fenotypów VRE na VanA, VanB i VanC. Sà to testy szybkie, wiarygodne i odznaczajàce si wysokà czu oêcià (38,33,34). Referencyjnà metodà wykrywania VRE jest analiza molekularna z wykorzystaniem techniki PCR, za pomocà której precyzyjne okreêla si system opornoêci obecny w danym szczepie (39). PCR z regu y wykorzystywany jest w celu potwierdzenia klasycznych, fenotypowych oznaczeƒ lekowra liwoêci. Gwa towny wzrost liczby zaka eƒ enterokokowych, szczególnie w Êrodowisku szpitalnym, powoduje koniecznoêç wykonania badaƒ epidemiologicznych, w tym typowania fenotypowego i genotypowego, jako elementu systemu kontroli zaka eƒ. Typowanie, czyli ró nicowanie wewnàtrzgatunkowe polega na badaniu pokrewieƒstwa pomi dzy izolatami poddanymi analizie. Prowadzi ono do identyfikacji ogniska epidemicznego, ustalenia êród a i dróg transmisji szczepów epidemicznych (40). Metody fenotypowe wewnàtrzgatunkowego ró nicowania izolatów opierajà si na porównaniu np. cech biochemicznych, serologicznych, czy wzorów lekowra liwoêci, natomiast metody genotypowe (genetyczne, molekularne) polegajàce na analizie ró nic zawartoêci DNA chromosomalnego i pozachromosomalnego oraz ró nic okreêlonych sekwencji DNA pomi dzy poszczególnymi izolatami (41). Metoda referencyjna, wysoce ró nicujàca, stosowana w genotypowaniu enterokoków to analiza fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA w elektroforezie w zmiennym polu elektrycznym- RFLP-PFGE (Restriction Fragment Length Polimorphism Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (42). Szybkà i atwà metodà typowania jest analiza liczby tandemowych

15 powtórzeƒ MLVA (Multilocus variable-number tandem repeat analysis) (43). Technika ta opiera si na analizie tandemowo powtarzajàcych si sekwencji par zasad (minisatelitarny DNA) równoczeênie dla kilku wybranych loci. Liczba powtórzeƒ jest zró nicowana wêród ró nych szczepów tego samego gatunku, co jest spowodowane licznymi zdarzeniami rekombinacyjnymi. Ostatnio coraz cz Êciej wykorzystywanà metodà w ocenie pokrewieƒstwa szczepów bakteryjnych w badaniach populacyjnych i analizie epidemiologicznej jest technika MLST (Multilocus Sequence Typing). Polega ona na sekwencjonowaniu okre- Êlonych fragmentów kilku genów kodujàcych enzymy metabolizmu podstawowego (w przypadku enterokoków 7 genów) odznaczajàcych si pewnym stopniem polimorfizmu. Metoda ta odznacza si wysokà czu- oêcià i powtarzalnoêcià. Umo liwia identyfikacj drobnoustrojów i analiz porównawczà profili allelicznych z wykorzystaniem internetowej bazy danych (www.mlst.net) (44). Podsumowanie Wankomycycnooporne szczepy enetrokoków nale à do szpitalnych patogenów alarmowych i stanowià coraz cz stsze êród o epidemii szpitalnych dlatego znajomoêç mechanizmów opornoêci, szybka i precyzyjna diagnostyka, równie do poziomu gatunku, pozwala uniknàç powa nych b dów terapeutycznych i selekcji szczepów opornych. Coraz wi ksza dost pnoêç ró norodnych pod o y diagnostycznych, testów automatycznych i biochemicznych pozwala na skrócenie czasu identyfikacji patogenu. Rozwój i dost pnoêç nowych technik molekularnych umo liwi, nie tylko precyzyjna identyfikacj patogenu, czy mechanizmu opornoêci ale równie Êledzenie rozprzestrzeniania si fenotypów opornoêci, opracowywanie ognisk epidemicznych oraz porównywanie izolatów wyst pujàcych na ca ym Êwiecie. PiÊmiennictwo u Autora Tabela 1. Charakterystyka fenotypów VRE (5,21) Fenotyp opornoêci VanA VanB Vanc VanD VanE VanG Gatunki E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecium E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus E. faecalis E. gallinarum E. casseliflavus E. avium E. durans E. mundtii E. raffinosus OpornoÊç na Wankomycyna Wankomycyna Wankomycyna antybiotyk Teikoplanina Teikoplanina Wankomycyna Wankomycyna Wankomycyna MIC (mg/l) Wankomycyny MIC (mg/l) Teikoplaniny ,5 1 0, ,5 0,5 15 Poziom opornoêci wysoki zró nicowany niski Êredni niski niski Znaczenie kliniczne du e du e Êrednie nieznane nieznane nieznane Typ opornoêci nabyta nabyta naturalna nabyta nabyta nabyta Przenoszenie Tn1546 na plazmidzie Tn1547 na plazmidzie chromosomalnie chromosomalnie chromosomalnie chromosomalnie Syntetyzowany dipeptyd D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser Regulacja indukowalna indukowalna indukowalna konstytutywna konstytutywna indukowalna indukowalna

16 BADANIA PRZESIEWOWE BAKTERII WIELOOPORNYCH chromid VRE Podłoże chromogenne do badań przesiewowych E. faecium i E. faecalis wykazujących nabytą oporność na wankomycynę (VRE) Izolacja enterokoków opornych na wankomycynę VRE i Decyzja o Izolacji Pacjenta

17 ocena produktu Ocena przydatności podłoża chromid VRE firmy biomérieux w monitorowaniu zakażeń szpitalnych dr Elżbieta Stefaniuk, dr Alicja Kuch Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie Zaka enia wywo ywane wankomycynoopornymi enterokokami (VRE, ang. vancomycin resistant enterococci) stanowià problem na ca ym Êwiecie, w tym tak e i w naszym kraju. Pierwsze udowodnione epidemiologicznie zaka enie VRE w Polsce, mia- o miejsce ju w roku 1997 i od tego czasu obserwowaç mo na nasilenie tego zjawiska w skali ca ego kraju. Zaka enia Enterococcus spp. dotyczà w du ej mierze osób z dysfunkcjà uk adu immunologicznego, zw aszcza chorych onkologicznych, hematologicznych, zarówno pacjentów w wieku dzieci cym, jak i w wieku dojrza ym. Zaka enia enterokokowe mogà mieç charakter endogenny, jak równie, egzogenny stwarzajàcy istotne problemy epidemiologiczne, przenoszony z pacjenta na pacjenta. Do najcz stszych zaka eƒ enterokokowych nale à wywo ywane przez szczepy Enterococcus faecalis oraz E. faecium Wysi ki mikrobiologów zmierzajà w kierunku szybkiego i wiarygodnego stwierdzenia zaka enia, kolonizacji czy te nosicielstwa Enterococcus spp. oraz okreêlenia ich lekowra liwoêci z jednoczesnà identyfikacjà mechanizmów oporno- Êci, takich jak opornoêç wysokiego stopnia na aminoglikozydy tzw. HLAR (ang. high level aminoglicoside resistance), czy opornoêç na leki glikopeptydowe (wankomycyn, teikoplanin ). Zgodnie z zasadami monitorowania zaka eƒ szpitalnych, coraz wi cej szpitali wykonuje badania przesiewowe w kierunku patogenów charakteryzujàcych si groênymi mechanizmami opornoêci. Cel pracy W Zak adzie Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie przeprowadzono badanie walidacyjne pod o y chromogennych chromid VRE firmy biomérieux przeznaczonych do badaƒ przesiewowych, pozwalajàcych wykryç w badanym materiale szczepy enterokoków opornych na wankomycyn, z jednoczesnym rozró nieniem na podstawie ró nego zabarwienia kolonii szczepów E. faecalis (kolor niebiesko-zielony) i E. faecium (kolor fioletowy). Celem badania by a ocena przydatnoêci pod- o a chromid VRE firmy biomérieux do pracy rutynowej w monitorowaniu zaka eƒ VRE. Materia i metody Badanie przeprowadzono dwutorowo: a. z wykorzystaniem 70 izolatów klinicznych E. faecium (n=30), E. faecalis (n=30) i E. gallinarum (n=10) pochodzàcych z materia ów klinicznych od pacjentów hospitalizowanych w polskich szpitalach i znajdujàcych si w kolekcji NIL. Szczepy te charakteryzowa y si ró nà wra liwo- Êcià na leki glikopeptydowe: szczepy wankomycynowra liwe (n=20) oraz z obecnoêcià mechanizmów VanA (n=20), VanB (n=20) i VanC (n=10), b. z wykorzystaniem materia ów klinicznych (wymazy z odbytu) od siedmiu chorych hematologicznych. Materia kliniczny opracowywano równolegle wg rutynowej procedury z wykorzystaniem pod o y wzrostowych i ró nicujàcych w kierunku enterokoków. Wszystkie u yte do badania izolaty zosta y dobrze scharakteryzowane w Zak adzie Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej NIL, dzi ki zastosowaniu ró nych technik identyfikacyjnych (metody konwencjonalne i automatyczne), metod oznaczania lekowra liwosci (metoda mikrorozcienczeƒ w bulionie wg zaleceƒ CLSI, metoda E-test wg zaleceƒ AB Biodisk), technik biologii molekularnej metody PCR do wykrywania genów oporno- Êci vana, vanb i vanc. Wyniki uzyskane tymi metodami stanowi y wyniki odniesienia w prowadzonej ocenie. Kontrol jakoêci przeprowadzono z u yciem szczepów wzorcowych z kolekcji ATCC oraz kolekcji MIKROBANK. Badane izolaty w postaci hodowli na pod o u Columbia Agar z 5% krwi baraniej oraz materia y posiewano metodà redukcyjnà na pod o e chromid VRE firmy biomérieux w dwojaki sposób: bezpoêrednio na pod o e chromogenne oraz po wcze- Êniejszej godzinnej inkubacji w temp. 37 C w bulionie mózgowosercowym (Brain-Heart broth) z krà kiem antybiogramowym zawierajàcym 30 µg wankomycyny. Posiane w ten sposób pod o a inkubowano 24 godz. w 37 C w warunkach tlenowych. Nast pnie obserwowano charakter wzrostu oraz zabarwienie kolonii poszczególnych izolatów. W przypadku bezpoêredniego posiewu na pod o- e chromogenne, w sytuacji skàpego wzrostu lub braku wzrostu, inkubacj przed u ano o kolejne 24 godziny, zgodnie z zaleceniami producenta pod o a. Ocenie poddawano wzrost lub jego brak oraz zabarwienie kolonii poszczególnych izolatów bakteryjnych u ytych do badania, wyniki porównywano do wyników metod odniesienia. W przypadku posiewów materia ów klinicznych obserwowano charakter wzrostu drobnoustrojów, oceniano stopieƒ trudnoêci interpretacji uzyskanego obrazu tak e w odniesieniu do wyników uzyskanych metodami konwencjonalnymi. Wyniki I. Izolaty bakteryjne E. faecalis, E. faecium i E. gallinarum B. wyniki posiewu bezpoêredniego na pod o e chromid VRE Po 24-godzinnej inkubacji w 37 C w warunkach tlenowych uzyskano wyraêny wzrost, w postaci drobnych 17

18 18 kolonii szczepów E. faecalis i E. faecium, u których wykryto metodami odniesienia mechanizmy VanA i VanB. Kolonie E. faecalis wykazywa y zabarwienie od zielonego, poprzez turkusowy, a do niebieskiego. Kolonie szczepów E. faecium zabarwione by y na kolor fioletowy o ró nej intensywnoêci. Po przed u eniu czasu inkubacji o kolejne 24 godziny w warunkach j.w. uzyskano wzrost badanych szczepów w postaci du ych, intensywnie zabarwionych kolonii. Uzyskany obraz nie stwarza problemów identyfikacyjnych. Po 24-godzinnej inkubacji w 37 C w warunkach tlenowych, w przypadku wankomycynowra liwych szczepów E. faecalis i E. faecium oraz szczepów nale àcych do gatunku E. gallinarum uzyskano delikatny, smu àcy wzrost na linii pierwszego posiewu wyraênie ró niàcy si od wzrostu szczepów wankomycynoopornych. Nie obserwowano wzrostu na ca ej powierzchni posiewu. Obraz nie ulega zmianie po kolejnej dobie inkubacji. B. wyniki posiewu badanych szczepów z zastosowaniem etapu namna ania W posiewie na pod o e chromid VRE, poprzedzonym etapem namna- ania badanych szczepów E. faecalis, E. faecium oraz E. gallinarum w bulionie mózgowo-sercowym (Brain- Heart broth) w obecnoêci krà ka antybiogramowego z 30 µg wankomycyny, uzyskano wzrost wy àcznie wankomycynoopornych szczepów E. faecalis i E. faecium w postaci du- ych intensywnie zabarwionych kolonii pozwalajàcych odró niç mi dzy sobà te dwa gatunki drobnoustroju. W miejscu posiewu szczepów E. faecalis i E. faecium wankomycynowra liwych i szczepów E. gallinarum nie uzyskano adnego wzrostu. kolonie zabarwione na fioletowo bàdê turkusowo, których izolacja i identyfikacja potwierdzi y przynale noêç do rodzaju Enterococcus. Drobnoustroje towarzyszàce rosnà na pod o u w postaci kolonii bezbarwnych. B. wyniki posiewu wymazów z odbytu z zastosowaniem etapu namna ania Po zastosowaniu wczeêniejszego etapu namna ania, na pod o u chromid VRE uzyskano wzrost mniej liczny ni w przypadku tych samych materia ów z posiewu bezpoêredniego. ObecnoÊç pojedynczych kolonii oraz intensywniejsze zabarwienie u atwia o interpretacj otrzymanego obrazu, kolonie o zabarwieniu fioletowym by y du e, w odró nieniu od kolonii turkusowych, których wzrost okreêlono jako s aby, a intensywnoêç zabarwienia jako Êrednià. Kolonie o zabarwieniu fioletowym i turkusowym poddawano dalszej identyfikacji: w preparacie mikroskopowym barwionym metodà Grama widoczne by y komórki ziarniaków Gram-dodatnich, po uzyskaniu wzrostu na pod o u agarowym z krwià wykonano identyfikacj biochemicznà testem rapid ID 32 Strep. Wyniki identyfikacji wskaza y w jednym przypadku Enterococcus faecalis, w pozosta ych E. faecium. Otrzymane wyniki by y zgodne z uzyskanymi metodami odniesienia. III. Sposób wykonania posiewu na pod o u chromid VRE Posiew redukcyjny zarówno materia ów klinicznych jak i szczepów bakteryjnych pozwoli uzyskaç wzrost pojedynczych kolonii badanych drobnoustrojów, co w po àczeniu z zabarwieniem kolonii umo liwi o wst pnà interpretacj oraz przeprowadzenie dalszych badaƒ diagnostycznych. dzi ki wytwarzaniu β-galaktozydazy, E. faecalis kolor niebiesko-zielony dzi ki wytwarzaniu α-glukozydazy. Przeprowadzona analiza z u yciem 70 ró nych pod wzgl dem wra liwo- Êci na leki glikopeptydowe i mechanizmów opornoêci izolatów klinicznych E. faecalis, E. faecium oraz E. gallinarum w pe ni potwierdza to stwierdzenie. Pod o e chromid VRE firmy biomérieux hamuje wzrost szczepów enterokoków, które nie wykazujà ekspresji nabytej opornoêci na wankomycyn, gatunków enterokoków o fenotypie VanC, wi kszoêci bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz grzybów. Przeprowadzone badania wskazujà na koniecznoêç wykonywania posiewu badanego materia u metodà redukcyjnà oraz stosowanie etapu namna ania w bulionie mózgowo-sercowym. Stosowanie tych zaleceƒ umo liwia i u atwia interpretacj wyniku posiewu. Interpretacja wyników posiewu zarówno wyizolowanych izolatów bakteryjnych, jak i materia ów klinicznych powinna byç wykonywana przez do- Êwiadczonego mikrobiologa. Wiedza i doêwiadczenie stanowià gwarancj uzyskania wiarygodnego wyniku. Wybiórcze pod o e chromogenne chromid VRE firmy biomérieux jest pod o em przydatnym do wykrywania wankomycynoopornych szczepów E. faecium i E. faecalis u pacjentów z grup ryzyka. Nale y pami taç, e jest to pod o e do badaƒ przesiewowych i nie zast puje rutynowych metod oznaczania lekowra liwoêci. II. Wymazy z odbytu od pacjentów oddzia u hematologicznego A. wyniki posiewu bezpoêredniego na pod o e chromid VRE Po 24-godzinnej inkubacji w 37 C w warunkach tlenowych p ytek z bezpoêrednim posiewem wymazów z odbytu na pod o e chromid VRE uzyskano wzrost zwartej masy drobnoustrojów charakteryzujàcych si ró nym wyglàdem kolonii pod wzgl dem wielkoêci i zabarwienia. WÊród wyros ych kolonii widoczne sà Wnioski Pod o e chromogenne chromid VRE firmy biomérieux, dzi ki zawartoêci dwóch chromogennych substratów oraz 8 µg/l wankomycyny, pozwala w sposób szybki i wiarygodny wykryç szczepy E. faecalis i E. faecium oporne na wankomycyn. BezpoÊrednie wykrycie E. faecium i E. faecalis mo liwe jest dzi ki charakterystycznemu zabarwieniu kolonii: E. faecium przyjmuje fioletowy kolor

19 mikrobiologia Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) wytwarzanych przez E. coli i Klebsiella spp. za pomocą testu potwierdzającego wg CLSI oraz kart AST N041 systemu VITEK 2 Łukasz Golec, dr Krzysztof Golec Zakład Mikrobiologii Szpital Wojewódzki nr 2 w Rzeszowie Wprowadzenie Beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) sà grupà enzymów majàcych zdolnoêç hydrolizy nawet trzeciej generacji cefalosporyn. Zaka enia wywo ane bakteriami posiadajàcymi ten mechanizm opornoêci w znacznym stopniu ograniczajà opcje terapeutyczne zaka eƒ wywo- anych przez te szczepy. Z tego powodu szybkie i dok adne wykrywanie bakterii wytwarzajàcych ESBL jest bardzo wa ne w rutynowej pracy ka dego laboratorium mikrobiologii klinicznej, umo liwiajàc nie tylko prawid owà terapi, ale wa ne jest równie w zapobieganiu szerzenia si tego mechanizmu opornoêci w Êrodowisku. Cel pracy Celem niniejszej pracy by o porównanie wykrywania β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym u Escherichia coli i Klebsiella spp. przez system Vitek 2 z zastosowaniem kart AST N041 w porównaniu z testem potwierdzajàcym wg CLSI (5). Materia y i metody Materia badany niniejszej pracy stanowi y izolaty bakterii E. coli i Klebsiella spp., uzyskane z materia ów klinicznych dostarczanych do Zak adu Mikrobiologii Szpitala Wojewódzkiego Nr 2 w Rzeszowie w okresie od 01. marca do 31. lipca 2007 r. Analizie poddano 187 szczepów bakteryjnych, z których 139 pochodzi o z materia ów od chorych hospitalizowanych i 48 z materia- ów pozaszpitalnych (specjalistyczne przychodnie przyszpitalne, poradnie POZ, laboratoria prywatne) (Ryc. 1.). Identyfikacj do gatunku wykonano przy pomocy kart GN systemu VITEK 2, Tab. 1. Rodzaje materia ów, z których uzyskano izolaty Rodzaj materia u IloÊç izolatów Wymaz z górnych dróg oddechowych (gard o, nos) 50 Wymaz z dróg rodnych 44 Wymaz z rany, ropy 42 Mocz 25 Krew, PMR 12 Materia y z dolnych dróg oddechowych (plwocina, BAL) 9 ó ç 5 natomiast oznaczenie obecnoêci ESBL z u yciem kart AST-N041 tego systemu oraz testem potwierdzajàcym wg CLSI (5). 1. Test potwierdzajàcy wg CLSI Na pod o e Mueller-Hinton (biomérieux) nanoszono zawiesin badanego szczepu (o g stoêci 0,5 McFarlanda). Do oznaczeƒ u yto krà ków firmy BectonDickinson wysycanych nast pujàcymi antybiotykami: ceftazydym (CAZ 30 µg), ceftazydym + kwas klawulanowy (CAZ/CLA 30/10 µg), cefotaksym (CIX 30 µg), cefotaksym+kwas klawulanowy (CTX/CLA 30/10 µg). Krà ki umieszczano na p ytce o Êrednicy 90 mm w maksymalnych odleg oêciach od siebie, pozwalajàcej na dok adne zmierzenie stref zahamowania wzrostu. P ytki inkubowano przez 18 h w 37 C i mierzono strefy zahamowania wzrostu. Za dodatni wynik testu uznawano taki w którym, strefa zahamowania wzrostu wokó krà ka zawierajàcego antybiotyk + inhibitor by a wi ksza lub równa 5mm, w porównaniu za strefà wzrostu wokó krà ka z samym antybiotykiem. 2. System VITEK 2 Metoda ta wykorzystuje karty ze studzienkami wype nionymi odpowiednimi antybiotykami. Do badaƒ u yto kart AST-N041 umo liwiajàcych wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym. W sk ad testu ESBL wchodzi szeêç studzienek: zawierajàce sam cefotaksym (CTX) i ceftazydym (CAZ) w st eniach 0,5 µg /ml oraz cefepim (FEP) w st eniu 1µg/ml, oraz studzienki zawierajàce antybiotyk w po àczeniu z kwasem klawulanowym (CTX/CAZ+CLA) w st eniu 0,5/4 µg /ml oraz (FEP + CLA) w st eniu 1/10. Badania wykonywano zgodnie z procedurà zalecanà przez producenta. Wynik testu przedstawiany jest jako: ESBL POS ESBL dodatni: wysokie prawdopodobieƒstwo, e drobnoustrój wytwarza ESBL. ESBL NEG - ESBL ujemny: bardzo niskie prawdopodobieƒstwo, e drobnoustrój wytwarza ESBL. Jako szczepów kontrolnych dla wymienionych metod u yto szczepów: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC Wyniki i ich omówienie WÊród zbadanych 187 szczepów 144 (77%) nale a o do gatunku E. coli, 36 (19%) Klebsiella pneumoniae, a 7 do gatunku Klebsiella oxytoca, co stanowi o niespe na 4% wszystkich badanych szczepów (Ryc. 2.). W 48 izolatach wyhodowanych z materia ów pozaszpitalnych nie stwierdzono w adnej z metod, szczepów produkujàcych β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym. 19

20 Ryc. 1. Rozk ad procentowy badanych szczepów pod wzgl dem pochodzenia 25,70% szczepy szpitalne ,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 8,40% àcznie E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 111 Ryc. 2. Badane szczepy E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 5,40% 74,30% szczepy pozaszpitalne Ryc. 3. Liczba izolatów szpitalnych Ryc. 4. Odsetek szczepów ESBL+ w obr bie gatunku E. coli i K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae 3 28% Ryc. 5. Produkcja ró nych typów ESBL 7 Nie stwierdzono równie, szczepów ESBL dodatnich w gatunku Klebsiella oxytoca. Wszystkie szczepy produkujàce ESBL obejmowa y gatunki K. pneumoniae i E. coli oraz pochodzi y wy àcznie z materia ów nades anych od chorych hospitalizowanych. Testem potwierdzajàcym wg CLSI stwierdzono12 szczepów ESBL dodatnich, natomiast przy pomocy systemu VITEK 2 z u yciem kart AST-N041 stwierdzono 13 takich szczepów. Ogó em uzyskano blisko 100% (99,5%) zgodnoêç pomi dzy testami, w tym 100% zgodnoêci uzyskano dla rodzaju Klebsiella sp. i 99,3% dla gatunku E. coli. Wyniki nasze okaza y si zgodne z innymi badaniami, w których stwierdzano równie wysokà zgodnoêç (80 100%), wykrywania enzymów ESBL u tych gatunków bakterii, przy pomocy kart AST-N041 systemu VITEK 2 z innymi metodami rutynowo stosowanymi w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych (3,4). W naszych badaniach, niezgodnoêç dotyczy a jednego szczepu E. coli w którym VITEK 2 wskaza na obecnoêç enzymu, przy bardzo niskich wartoêciach MIC dla Ceftazydymu i Cefotaxymu wynoszàcym <=1 µg/ml, natomiast test wg CLSI uznano za ujemny, gdy ró nica, pomi dzy krà kami dla Ceftazydymu i jego po- àczenia z kwasem klawulanowym, wynosi a tylko 3 mm przy takich samych strefach dla Cefotaxymu oraz jego po àczeniem z klawulanianem. Fot. 1. àcznie w izolatach od chorych hospitalizowanych, uzyskano dwoma metodami 13 szczepów ESBL dodatnich, z czego 6 nale a o do gatunku E. coli i 7 do gatunku K. pneumoniae. Odsetek szczepów ESBL dodatnich dla tych gatunków przedstawia Ryc. 4. Te wycinkowe, obejmujàce okres 5 miesi cy, wskazujà równie na stabilnà iloêç szczepów ESBL dodatnich w szpitalu w stosunku do lat wczeêniejszych, gdzie odsetek tych szczepów w latach by zbli ony dla tych obydwu gatunków. (1) Ocenie poddano równie preferencje substratowe analizowanych szczepów ESBL dodatnich. Tylko jeden szczep Klebsiella pneumoniae produkowa enzymy rozk adajàce wy àcznie cefotaxym, w pozosta ych przypadkach hydrolizowane by y dwie badane cefalosporyny (Ryc. 5.). W 139 izolatach od chorych hospitalizowanych, szczepy ESBL+ pochodzi y z nast pujàcych materia ów: mocz 6, górne drogi oddechowe 3, rana 3, dolne drogi oddechowe 1. Jak wynika z Ryc. 6. blisko po owa szczepów ESBL dodatnich pochodzi a z moczu, co stanowi o 24% wszystkich izolatów z tego materia u. Wnioski 1. System Vitek 2 z dostosowanymi do wykrywania ESBL kartami AST- N041 jest czu ym testem wykrywania tych enzymów u gatunków E. coli i Klebsiella pneumoniae mocz 91,60% górne drogi oddechowe rana ceftazydymaza+ cefotaksymaza+ ceftazydymazacefotaksymaza+ Ryc. 6. Liczbowa zawartoêç szczepów ESBL+ w poszczególnych materia ach szpitalnych dolne drogi oddechowe 23 mm 26 mm Z 139 materia ów nades anych od chorych hospitalizowanych izolaty E. coli stanowi y 111 szczepów natomiast izolaty Klebsiella pneumoniae 25 oraz 3 szczepy K. oxytoca (Ryc. 3.). 2. Metoda wykrywania ESBL przez system Vitek 2 z zastosowaniem kart AST-N041 okaza a si w blisko 100% zgodna z metodà krà kowà wg CLSI i mo e byç z nià stosowana zamiennie. 3. IloÊç szczepów ESBL dodatnich w Szpitalu Wojewódzkim 2 w Rzeszowie, w obr bie gatunków E. coli i K. pneumoniae od 2004 roku jest na stabilnym i stosunkowo niskim poziomie. PiÊmiennictwo u Autorów

Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska

Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska Narzędzia diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznym (genotypowaniu) Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w

Bardziej szczegółowo

Nowoczesna diagnostyka mikrobiologiczna

Nowoczesna diagnostyka mikrobiologiczna Nowoczesna diagnostyka mikrobiologiczna 1 2 Nowoczesne laboratorium mikrobiologiczne połączenie metod manualnych i automatyzacji Nowoczesne laboratorium mikrobiologiczne To nie tylko sprzęt diagnostyczny,

Bardziej szczegółowo

ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 23 grudnia 2011 r.

ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 23 grudnia 2011 r. Dziennik Ustaw Nr 294 17195 Poz. 1741 1741 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 23 grudnia 2011 r. w sprawie listy czynników alarmowych, rejestrów zakażeń szpitalnych i czynników alarmowych oraz raportów

Bardziej szczegółowo

ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 17 października 2007 r. (Dz. U. z dnia 2 listopada 2007 r.)

ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 17 października 2007 r. (Dz. U. z dnia 2 listopada 2007 r.) Dz.U.07.203.1467 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 17 października 2007 r. w sprawie rodzaju biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu, wzorów formularzy zgłoszeń dodatnich

Bardziej szczegółowo

SHL.org.pl SHL.org.pl

SHL.org.pl SHL.org.pl Kontrakty na usługi dla szpitali SIWZ dla badań mikrobiologicznych Danuta Pawlik SP ZOZ ZZ Maków Mazowiecki Stowarzyszenie Higieny Lecznictwa Warunki prawne dotyczące konkursu ofert Ustawa z dnia 15 kwietnia

Bardziej szczegółowo

Racjonalna. antybiotykoterapia. mgr Magdalena Pietrzyńska

Racjonalna. antybiotykoterapia. mgr Magdalena Pietrzyńska Racjonalna antybiotykoterapia mgr Magdalena Pietrzyńska Droga do sukcesu terapeutycznego PK Stężenie w ognisku infekcji Czynniki gospodarza Eradykacja PD PATOGEN MIC/MBC/MBQ/siła bójcza/pae WYLECZENIE

Bardziej szczegółowo

TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM

TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM Stefania Giedrys-Kalemba 7 110 Podstawowym zadaniem zespołu kontroli zakażeń jest prowadzenie systematycznego nadzoru i rejestracji zakażeń w celu

Bardziej szczegółowo

Dotyczy zastosowania ww produktów w mikrobiologii klinicznej

Dotyczy zastosowania ww produktów w mikrobiologii klinicznej Warszawa,14.11.2013 WAŻNE: Notatka bezpieczeństwa Dotyczy produktów: ZYM B (Nr kat.70493), API Listeria (Nr kat.10300), API NH (Nr kat.10400) nr serii: patrz załącznik 1 Dotyczy zastosowania ww produktów

Bardziej szczegółowo

"Diagnostyka szczepów wirusa grypy przy użyciu nowych metod molekularnych." Streszczenie

Diagnostyka szczepów wirusa grypy przy użyciu nowych metod molekularnych. Streszczenie "Diagnostyka szczepów wirusa grypy przy użyciu nowych metod molekularnych." Streszczenie Szacuje się, że każdego roku, sezonowe epidemie wirusa grypy są przyczyną od 2 do 5 milionów zachorowań oraz od

Bardziej szczegółowo

Diagnostyka molekularna w OIT

Diagnostyka molekularna w OIT Diagnostyka molekularna w OIT B A R B A R A A D A M I K K A T E D R A I K L I N I K A A N E S T E Z J O L O G I I I I N T E N S Y W N E J T E R A P I I U N I W E R S Y T E T M E D Y C Z N Y W E W R O C

Bardziej szczegółowo

Spis treœci. 1. Wstêp... 1

Spis treœci. 1. Wstêp... 1 Spis treœci 1. Wstêp........................................................... 1 Czêœæ 1: MIKROBIOLOGIA OGÓLNA..................................... 3 2. Budowa i taksonomia bakterii.....................................

Bardziej szczegółowo

Wpływ racjonalnej antybiotykoterapii na lekowrażliwość drobnoustrojów

Wpływ racjonalnej antybiotykoterapii na lekowrażliwość drobnoustrojów WOJSKOWY SZPITAL KLINICZNY Wpływ racjonalnej BYDGOSZCZ antybiotykoterapii na lekowrażliwość drobnoustrojów 10 Wojskowy Szpital Kliniczny z Polikliniką SP ZOZ w Bydgoszczy dr n. med. Joanna Sierzputowska

Bardziej szczegółowo

Rekomendacje diagnostyczne inwazyjnych zakażeń bakteryjnych nabytych poza szpitalem M. Kadłubowski, A. Skoczyńska, W. Hryniewicz, KOROUN, NIL, 2009

Rekomendacje diagnostyczne inwazyjnych zakażeń bakteryjnych nabytych poza szpitalem M. Kadłubowski, A. Skoczyńska, W. Hryniewicz, KOROUN, NIL, 2009 Opracowanie: Marcin Kadłubowski, Anna Skoczyńska, Waleria Hryniewicz Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN) Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii

Bardziej szczegółowo

Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu

Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Jak ju wspomniano, kinesiotaping mo e byç stosowany jako osobna metoda terapeutyczna, jak równie mo e stanowiç uzupe nienie innych metod fizjoterapeutycznych.

Bardziej szczegółowo

Zalecenia rekomendowane przez Ministra Zdrowia. KPC - ang: Klebsiella pneumoniae carbapenemase

Zalecenia rekomendowane przez Ministra Zdrowia. KPC - ang: Klebsiella pneumoniae carbapenemase Zalecenia dotyczące postępowania w przypadku identyfikacji w zakładach opieki zdrowotnej szczepów bakteryjnych Enterobacteriaceae wytwarzających karbapenemazy typu KPC * * KPC - ang: Klebsiella pneumoniae

Bardziej szczegółowo

Podsumowanie europejskiego badania nt. rozpowszechnienia bakterii opornych na karbapenemy. Podsumowanie. Projekt EuSCAPE

Podsumowanie europejskiego badania nt. rozpowszechnienia bakterii opornych na karbapenemy. Podsumowanie. Projekt EuSCAPE Podsumowanie europejskiego badania nt. rozpowszechnienia bakterii opornych na karbapenemy Październik 2013 Podsumowanie Celem Europejskiego Badania nt. Rozpowszechnienia Pałeczek Enteriobacteriaceae Wytwarzających

Bardziej szczegółowo

Narodowy Instytut Leków ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa Tel. 022 851-46-70, Fax. 022 841-29-49 www.korld.edu.pl Warszawa, dn. 21.10.2009r.

Narodowy Instytut Leków ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa Tel. 022 851-46-70, Fax. 022 841-29-49 www.korld.edu.pl Warszawa, dn. 21.10.2009r. Narodowy Instytut Leków ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa Tel. 022 851-46-70, Fax. 022 841-29-49 www.korld.edu.pl Warszawa, dn. 21.10.2009r. Wytyczne postępowania w przypadku wykrycia szczepów pałeczek

Bardziej szczegółowo

SHL.org.pl SHL.org.pl

SHL.org.pl SHL.org.pl Krystyna Paszko Monitorowanie patogenów alarmowych w Szpitalu św. Wojciecha w Gdańsku nowe przepisy i ich konsekwencje dla monitorowania patogenów alarmowych XII Konferencja naukowo-szkoleniowa SHL Stare

Bardziej szczegółowo

Epidemiologia weterynaryjna

Epidemiologia weterynaryjna Jarosław Kaba Epidemiologia weterynaryjna Testy diagnostyczne I i II i III Zadania 04, 05, 06 Warszawa 2009 Testy diagnostyczne Wzory Parametry testów diagnostycznych Rzeczywisty stan zdrowia chore zdrowe

Bardziej szczegółowo

Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI

Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI SKLAROWANEGO SOKU JABŁKOWEGO Skutecznym sposobem leczenia soku

Bardziej szczegółowo

Dokumentacja obejmuje następujące części:

Dokumentacja obejmuje następujące części: Załącznik nr 6 WYMAGANIA, JAKIM POWINNA ODPOWIADAĆ DOKUMENTACJA NIEZBĘDNA DO OCENY SUBSTANCJI CZYNNEJ JAKĄ SĄ MIKROORGANIZMY, W TYM TAKŻE WIRUSY I GRZYBY, ZAWARTE W PRODUKCIE BIOBÓJCZYM Wymagania ogólne.

Bardziej szczegółowo

Automatyczne Systemy Infuzyjne

Automatyczne Systemy Infuzyjne Automatyczne Systemy Infuzyjne Wype nienie luki Nie ma potrzeby stosowania skomplikowanych i czasoch onnych udoskonaleƒ sprz tu infuzyjnego wymaganych do specjalistycznych pomp. Pompy towarzyszàce pacjentowi

Bardziej szczegółowo

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego

Bardziej szczegółowo

Dziennik Ustaw Nr 229 14531 Poz. 1916 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA FINANSÓW. z dnia 12 grudnia 2002 r.

Dziennik Ustaw Nr 229 14531 Poz. 1916 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA FINANSÓW. z dnia 12 grudnia 2002 r. Dziennik Ustaw Nr 229 14531 Poz. 1916 1916 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA FINANSÓW z dnia 12 grudnia 2002 r. zmieniajàce rozporzàdzenie w sprawie wzorów deklaracji podatkowych dla podatku od towarów i us ug oraz

Bardziej szczegółowo

Mikrobiologia - Bakteriologia

Mikrobiologia - Bakteriologia Mikrobiologia - Bakteriologia 5050 Bezpośrednie barwienie bakteriologiczne Kwiecień, październik 3-9 zdjęć cyfrowych wybarwionych bezpośrednio preparatów, prezentowane na stronie internetowej Labquality

Bardziej szczegółowo

SHL.org.pl SHL.org.pl

SHL.org.pl SHL.org.pl Najważniejsze zagrożenia epidemiczne w oddziałach dziecięcych w Polsce Dr med. Paweł Grzesiowski STOWARZYSZENIE HIGIENY LECZNICTWA SZPITAL SPECJALISTYCZNY ŚW. ZOFII W WARSZAWIE FUNDACJA INSTYTUT PROFILAKTYKI

Bardziej szczegółowo

Strategia rozwoju kariery zawodowej - Twój scenariusz (program nagrania).

Strategia rozwoju kariery zawodowej - Twój scenariusz (program nagrania). Strategia rozwoju kariery zawodowej - Twój scenariusz (program nagrania). W momencie gdy jesteś studentem lub świeżym absolwentem to znajdujesz się w dobrym momencie, aby rozpocząć planowanie swojej ścieżki

Bardziej szczegółowo

Szpitalne ogniska epidemiczne w Polsce w 2014 roku

Szpitalne ogniska epidemiczne w Polsce w 2014 roku Szpitalne ogniska epidemiczne w Polsce w 2014 roku Izabela Kucharska Alicja Rychlewska Departamentu Zapobiegania oraz Zwalczania Zakażeń i Chorób Zakaźnych u Ludzi Główny Inspektorat Sanitarny Warszawa

Bardziej szczegółowo

LECZENIE NIEDOKRWISTOŚCI W PRZEBIEGU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI

LECZENIE NIEDOKRWISTOŚCI W PRZEBIEGU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI Załącznik nr 14 do Zarządzenia Nr 41/2009 Prezesa NFZ z dnia 15 września 2009 roku Nazwa programu: LECZENIE NIEDOKRWISTOŚCI W PRZEBIEGU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI NEREK ICD-10 N 18 przewlekła niewydolność

Bardziej szczegółowo

PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc

PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc PRAWA ZACHOWANIA Podstawowe terminy Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc a) si wewn trznych - si dzia aj cych na dane cia o ze strony innych

Bardziej szczegółowo

Podręcznik ćwiczeniowy dla pacjenta

Podręcznik ćwiczeniowy dla pacjenta Podręcznik ćwiczeniowy dla pacjenta 1 Dostarczone przez Janssen Healthcare Innovation (Szczegóły na tylnej stronie okładki). Str 01 Czym zajmuje się program Care4Today? Program Care4Today został stworzony

Bardziej szczegółowo

Temat lekcji: Bakterie a wirusy.

Temat lekcji: Bakterie a wirusy. Anna Tomicka Scenariusz lekcji biologii Dział: Różnorodność organizmów. Klasa: I b Temat lekcji: Bakterie a wirusy. 1.Cele lekcji: Cel ogólny: Uczeń: omawia budowę komórki bakterii oraz wirusów, wyjaśnia

Bardziej szczegółowo

Typ badania laboratoryjnego, które dało dodatni wynik. na obecność laseczki wąglika: - badania

Typ badania laboratoryjnego, które dało dodatni wynik. na obecność laseczki wąglika: - badania Rodzaje biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających Zgłoszeniu, typy badań laboratoryjnych w kierunku biologicznych czynników chorobotwórczych, które dały dodatni wynik, oraz okoliczności dokonywania

Bardziej szczegółowo

Przedmiot zamówienia -Specyfikacja cenowa

Przedmiot zamówienia -Specyfikacja cenowa Przedmiot zamówienia -Specyfikacja cenowa Zał nr 1 do SIWZ Grupa 1: gotowe podłoża, testy i odczynniki Podłoża na płytkach petriego o średnicy 90 mm, podłoża w probówkach,testy i odczynniki mikrobiologiczne

Bardziej szczegółowo

Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników

Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników poradnik dla bezpoêredniego prze o onego wprowadzanego pracownika WZMOCNIENIE ZDOLNOÂCI ADMINISTRACYJNYCH PROJEKT BLIèNIACZY PHARE PL03/IB/OT/06 Proces

Bardziej szczegółowo

Osiągnięcia Katedry i Zakładu Mikrobiologii

Osiągnięcia Katedry i Zakładu Mikrobiologii Osiągnięcia Katedry i Zakładu Mikrobiologii Katedra i Zakład Mikrobiologii została powołana Zarządzeniem Rektora Akademii Medycznej z 1985 roku. Pierwszym jej Kierownikiem był Prof. dr hab. n. med. Zenon

Bardziej szczegółowo

WYTYCZNE W-0018_001 WYTYCZNE WYDAWANIA RAPORTÓW Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH. Data wprowadzenia: 10-10-2010

WYTYCZNE W-0018_001 WYTYCZNE WYDAWANIA RAPORTÓW Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH. Data wprowadzenia: 10-10-2010 WYDAWANIA RAPORTÓW Z BADAŃ Data wprowadzenia: 1 / 6 Nazwisko Stanowisko Data Podpis Opracował Tadeusz Gadomski Kierownik 10.10.2010 ZaakceptowałBożena Szelągowska Pełnomocnik ds. Zarządzania Jakością 10.10.2010

Bardziej szczegółowo

Rozprawa doktorska. mgr inż. Karolina Stojowska

Rozprawa doktorska. mgr inż. Karolina Stojowska Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra Mikrobiologii Rozprawa doktorska Opracowanie nowych metod typowania genetycznego bakterii opartych o ligację adaptorów oligonukleotydowych do fragmentów restrykcyjnych

Bardziej szczegółowo

Objaśnienia do Wieloletniej Prognozy Finansowej na lata 2011-2017

Objaśnienia do Wieloletniej Prognozy Finansowej na lata 2011-2017 Załącznik Nr 2 do uchwały Nr V/33/11 Rady Gminy Wilczyn z dnia 21 lutego 2011 r. w sprawie uchwalenia Wieloletniej Prognozy Finansowej na lata 2011-2017 Objaśnienia do Wieloletniej Prognozy Finansowej

Bardziej szczegółowo

Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego

Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Białystok, 19 grudzień 2012 r. Seminarium współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach

Bardziej szczegółowo

ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 2. ZATRUDNIENIE NA CZĘŚĆ ETATU LUB PRZEZ CZĘŚĆ OKRESU OCENY

ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 2. ZATRUDNIENIE NA CZĘŚĆ ETATU LUB PRZEZ CZĘŚĆ OKRESU OCENY ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 1. ZMIANA GRUPY PRACOWNIKÓW LUB AWANS W przypadku zatrudnienia w danej grupie pracowników (naukowo-dydaktyczni, dydaktyczni, naukowi) przez okres poniżej 1 roku nie dokonuje

Bardziej szczegółowo

Urząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-17/10:16:18

Urząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-17/10:16:18 Europejski Dzień Prostaty obchodzony jest od 2006 roku z inicjatywy Europejskiego Towarzystwa Urologicznego. Jego celem jest zwiększenie społecznej świadomości na temat chorób gruczołu krokowego. Gruczoł

Bardziej szczegółowo

Prezentacja dotycząca sytuacji kobiet w regionie Kalabria (Włochy)

Prezentacja dotycząca sytuacji kobiet w regionie Kalabria (Włochy) Prezentacja dotycząca sytuacji kobiet w regionie Kalabria (Włochy) Położone w głębi lądu obszary Kalabrii znacznie się wyludniają. Zjawisko to dotyczy całego regionu. Do lat 50. XX wieku przyrost naturalny

Bardziej szczegółowo

Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska

Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska Zarządzanie projektami wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska 1 DEFINICJA PROJEKTU Zbiór działań podejmowanych dla zrealizowania określonego celu i uzyskania konkretnego, wymiernego rezultatu produkt projektu

Bardziej szczegółowo

Analiza mikrobiologiczna oddziałów szpitalnych - skumulowane dane na temat antybiotykowrażliwości dla celów empirycznej terapii zakażeń

Analiza mikrobiologiczna oddziałów szpitalnych - skumulowane dane na temat antybiotykowrażliwości dla celów empirycznej terapii zakażeń K o n s u l t a n t K r a j o w y w d z i e d z i n i e m i k r o b i o l o g i i l e k a r s k i e j P r o f. d r h a b. m e d. W a l e r i a H r y n i e w i c z N a r o d o w y I n s t y t u t L e k

Bardziej szczegółowo

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp 1. Informacja o pracownikach wyznaczonych do udzielania pierwszej pomocy oraz o pracownikach wyznaczonych do wykonywania działań w zakresie

Bardziej szczegółowo

1. Najnowsze dane dotyczące zapotrzebowania energetycznego w okresie wzrostu

1. Najnowsze dane dotyczące zapotrzebowania energetycznego w okresie wzrostu 1. Najnowsze dane dotyczące zapotrzebowania energetycznego w okresie wzrostu Im wi kszy pies doros y, tym proporcjonalnie mniejsza waga urodzeniowa szczeni cia. Waga nowonarodzonego szczeni cia rasy Yorkshire

Bardziej szczegółowo

Seminarium 1: 08. 10. 2015

Seminarium 1: 08. 10. 2015 Seminarium 1: 08. 10. 2015 Białka organizmu ok. 15 000 g białka osocza ok. 600 g (4%) Codzienna degradacja ok. 25 g białek osocza w lizosomach, niezależnie od wieku cząsteczki, ale zależnie od poprawności

Bardziej szczegółowo

PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP

PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP Warszawa, dnia 04 września 2015 r. RZECZPOSPOLITA POLSKA MINISTER FINANSÓW PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP W związku z interpelacją nr 34158 posła Jana Warzechy i posła

Bardziej szczegółowo

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH. Wniosek DECYZJA RADY

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH. Wniosek DECYZJA RADY KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH Bruksela, dnia 13.12.2006 KOM(2006) 796 wersja ostateczna Wniosek DECYZJA RADY w sprawie przedłużenia okresu stosowania decyzji 2000/91/WE upoważniającej Królestwo Danii i

Bardziej szczegółowo

OGÓLNY PLAN ĆWICZEŃ I SEMINARIÓW Z MIKROBIOLOGII OGÓLNEJ dla studentów STOMATOLOGII w roku akademickim 2015-2016 semestr zimowy

OGÓLNY PLAN ĆWICZEŃ I SEMINARIÓW Z MIKROBIOLOGII OGÓLNEJ dla studentów STOMATOLOGII w roku akademickim 2015-2016 semestr zimowy OGÓLNY PLAN ĆWICZEŃ I SEMINARIÓW Z MIKROBIOLOGII OGÓLNEJ dla studentów STOMATOLOGII w roku akademickim 2015-2016 semestr zimowy Ćwiczenia - co tydzień 5 ćwiczeń x 2 godz. = 10 godz. Piątek: 9.45-11.15

Bardziej szczegółowo

Nowe karty antybiogramowe VITEK 2 i VITEK 2 Compact

Nowe karty antybiogramowe VITEK 2 i VITEK 2 Compact Nowe karty antybiogramowe VITEK 2 i VITEK 2 Compact dr Dorota Żabicka 1, dr Elżbieta Stefaniuk 1,2 1 Narodowy Instytut Leków, Warszawa 2 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej,

Bardziej szczegółowo

Sprawozdanie z działalności Rady Nadzorczej TESGAS S.A. w 2008 roku.

Sprawozdanie z działalności Rady Nadzorczej TESGAS S.A. w 2008 roku. Sprawozdanie z działalności Rady Nadzorczej TESGAS S.A. w 2008 roku. Rada Nadzorcza zgodnie z treścią Statutu Spółki składa się od 5 do 9 Członków powoływanych przez Walne Zgromadzenie w głosowaniu tajnym.

Bardziej szczegółowo

Program ćwiczeń z mikrobiologii klinicznej dla studentów III roku Oddziału Analityki Medycznej, rok akademicki 2015/2016

Program ćwiczeń z mikrobiologii klinicznej dla studentów III roku Oddziału Analityki Medycznej, rok akademicki 2015/2016 Program ćwiczeń z mikrobiologii klinicznej dla studentów III roku Oddziału Analityki Medycznej, rok akademicki 2015/2016 SEMESTR ZIMOWY Wykłady (14 godz.): Ćwiczenia (60 godz.): Wtorek 15.00 16.30 sala

Bardziej szczegółowo

Bojszowy, dnia 22.02.2010r. Znak sprawy: GZOZ/P1/2010 WYJAŚNIENIE TREŚCI SIWZ

Bojszowy, dnia 22.02.2010r. Znak sprawy: GZOZ/P1/2010 WYJAŚNIENIE TREŚCI SIWZ Bojszowy, dnia 22.02.2010r. Znak sprawy: GZOZ/P1/2010 WYJAŚNIENIE TREŚCI SIWZ Dotyczy: przetargu nieograniczonego na Zakup wraz z dostawą i instalacją aparatu USG dla potrzeb Gminnego Zakładu Opieki Zdrowotnej

Bardziej szczegółowo

probiotyk o unikalnym składzie

probiotyk o unikalnym składzie ~s~qoy[jg probiotyk o unikalnym składzie ecovag, kapsułki dopochwowe, twarde. Skład jednej kapsułki Lactobacillus gasseri DSM 14869 nie mniej niż 10 8 CFU Lactobacillus rhamnosus DSM 14870 nie mniej niż

Bardziej szczegółowo

SHL.org.pl SHL.org.pl

SHL.org.pl SHL.org.pl NOWE PRZEPISY W SPRAWIE CZYNNIKÓW ALARMOWYCH, REJESTRACJI I RAPORTOWANIA ZAKAŻEŃ SZPITALNYCH Dr med. Paweł Grzesiowski STOWARZYSZENIE HIGIENY LECZNICTWA FUNDACJA INSTYTUT PROFILAKTYKI ZAKAŻEŃ 1.03.2012

Bardziej szczegółowo

Ewidencjonowanie nieruchomości. W Sejmie oceniają działania starostów i prezydentów

Ewidencjonowanie nieruchomości. W Sejmie oceniają działania starostów i prezydentów Posłowie sejmowej Komisji do Spraw Kontroli Państwowej wysłuchali NIK-owców, którzy kontrolowali proces aktualizacji opłat rocznych z tytułu użytkowania wieczystego nieruchomości skarbu państwa. Podstawą

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

SHL.org.pl SHL.org.pl

SHL.org.pl SHL.org.pl Polityka antybiotykowa w oddziale pediatrycznym Adam Hermann Zespół Kontroli Zakażeń Szpitalnych Stowarzyszenie Higieny Lecznictwa Fundacja Instytut Profilaktyki Zakażeń Adam Hermann Stare Jabłonki 05-07.10.2014r.

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów na metycylinę

Ćwiczenie 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów na metycylinę XI. Antybiotyki i chemioterpeutyki ćwiczenia praktyczne W przedstawionych ćwiczeniach narysuj i zinterpretuj otrzymane wyniki badań mechanizmów oporności. Opisz rodzaje krążków użytych do badań oraz sposób

Bardziej szczegółowo

ŚRODA 4 września 2013

ŚRODA 4 września 2013 X JUBILEUSZOWE REGIONALNE FORUM MEDYCYNY ZAKAŻEŃ - od teorii do praktyki "PROBLEMY ANTYBIOTYKOTERAPII ZAKAŻEŃ" oraz DZIEŃ DIAGNOSTY LABORATORYJNEGO W WOJEWÓDZTWIE WARMIŃSKO-MAZURSKIM ŚRODA 4 września 2013

Bardziej szczegółowo

CENNIK - DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ

CENNIK - DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ (obowiązuje od 01 czerwca 2015 roku) załącznik nr 4 do regulaminu organizacyjnego CENNIK - DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej - siedziba ul. Św. Józefa 53-59 oraz ul. Konstytucji

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

Biologia Kalendarz przygotowaƒ do matury 2007

Biologia Kalendarz przygotowaƒ do matury 2007 Biologia Kalendarz przygotowaƒ do matury 2007 imi i nazwisko zakres podstawowy (wersja dla ucznia) wykonane Tyg. Dzia Tematy Zadania 2.10 1 6.10 Przygotowanie do pracy zapoznanie si z informacjami na temat

Bardziej szczegółowo

Edycja geometrii w Solid Edge ST

Edycja geometrii w Solid Edge ST Edycja geometrii w Solid Edge ST Artykuł pt.: " Czym jest Technologia Synchroniczna a czym nie jest?" zwracał kilkukrotnie uwagę na fakt, że nie należy mylić pojęć modelowania bezpośredniego i edycji bezpośredniej.

Bardziej szczegółowo

Strategia rozwoju sieci dróg rowerowych w Łodzi w latach 2015-2020+

Strategia rozwoju sieci dróg rowerowych w Łodzi w latach 2015-2020+ Strategia rozwoju sieci dróg rowerowych w Łodzi w latach 2015-2020+ Projekt: wersja β do konsultacji społecznych Opracowanie: Zarząd Dróg i Transportu w Łodzi Ul. Piotrkowska 175 90-447 Łódź Spis treści

Bardziej szczegółowo

Program szkoleniowy Efektywni50+ Moduł III Standardy wymiany danych

Program szkoleniowy Efektywni50+ Moduł III Standardy wymiany danych Program szkoleniowy Efektywni50+ Moduł III 1 Wprowadzenie do zagadnienia wymiany dokumentów. Lekcja rozpoczynająca moduł poświęcony standardom wymiany danych. Wprowadzenie do zagadnień wymiany danych w

Bardziej szczegółowo

Nie racjonalnych powodów dla dopuszczenia GMO w Polsce

Nie racjonalnych powodów dla dopuszczenia GMO w Polsce JANUSZ WOJCIECHOWSKI POSEŁ DO PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO WICEPRZEWODNICZĄCY KOMISJI ROLNICTWA I ROZWOJU WSI Tekst wystąpienia na Konferencji: "TRADYCYJNE NASIONA - NASZE DZIEDZICTWO I SKARB NARODOWY. Tradycyjne

Bardziej szczegółowo

NAJWAŻNIEJSZE ZALETY LAMP DIODOWYCH

NAJWAŻNIEJSZE ZALETY LAMP DIODOWYCH NAJWAŻNIEJSZE ZALETY LAMP DIODOWYCH Pozwalają zaoszczędzić do 80% energii elektrycznej i więcej! Strumień światła zachowuje 100% jakości w okresie eksploatacji nawet do 50.000 do 70.000 h tj. w okresie

Bardziej szczegółowo

Waldemar Szuchta Naczelnik Urzędu Skarbowego Wrocław Fabryczna we Wrocławiu

Waldemar Szuchta Naczelnik Urzędu Skarbowego Wrocław Fabryczna we Wrocławiu 1 P/08/139 LWR 41022-1/2008 Pan Wrocław, dnia 5 5 września 2008r. Waldemar Szuchta Naczelnik Urzędu Skarbowego Wrocław Fabryczna we Wrocławiu WYSTĄPIENIE POKONTROLNE Na podstawie art. 2 ust. 1 ustawy z

Bardziej szczegółowo

INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201

INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201 INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: PZ-41SLB-E PL 0101872HC8201 2 Dziękujemy za zakup urządzeń Lossnay. Aby uŝytkowanie systemu Lossnay było prawidłowe i bezpieczne, przed pierwszym uŝyciem przeczytaj niniejszą

Bardziej szczegółowo

Umowy Dodatkowe. Przewodnik Ubezpieczonego

Umowy Dodatkowe. Przewodnik Ubezpieczonego Umowy Dodatkowe Przewodnik Ubezpieczonego Umowy dodatkowe sà uzupe nieniem umowy ubezpieczenia na ycie. Za cz sto niewielkà sk adk mo esz otrzymaç dodatkowà ochron. Dzi ki temu Twoja umowa ubezpieczenia

Bardziej szczegółowo

Spis treêci. 1. Wprowadzenie Barbara Bu hak-jachymczyk, Miros aw Jarosz... 15. 2. Energia Barbara Bu hak-jachymczyk... 32

Spis treêci. 1. Wprowadzenie Barbara Bu hak-jachymczyk, Miros aw Jarosz... 15. 2. Energia Barbara Bu hak-jachymczyk... 32 Spis treêci 1. Wprowadzenie Barbara Bu hak-jachymczyk, Miros aw Jarosz.... 15 1.1. Rys historyczny rozwoju norm ywienia.............. 16 1.2. Wspó czesne metody opracowywania norm............ 19 1.3. Rodzaje

Bardziej szczegółowo

Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry. (Plany lekcyjne) POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM FINANSOWANIE: AUTORZY

Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry. (Plany lekcyjne) POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM FINANSOWANIE: AUTORZY POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry (Plany lekcyjne) AUTORZY FINANSOWANIE: Plan lekcyjny dla modułu 3 Rak skóry bez tajemnic I. Wprowadzenie

Bardziej szczegółowo

Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe

Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe Projekt MES Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe 1. Ugięcie wieszaka pod wpływem przyłożonego obciążenia 1.1. Wstęp Analizie poddane zostało ugięcie wieszaka na ubrania

Bardziej szczegółowo

7 Oparzenia termiczne

7 Oparzenia termiczne 7 Oparzenia termiczne Nastêpstwa i zagro enia... 162 Jak oparzenie penetruje w g³¹b skóry?.... 163 Zagro enia przy rozleg³ych oparzeniach.... 164 Kiedy nale y iœæ do lekarza?... 164 Preparaty naturalne

Bardziej szczegółowo

ZAKAZENIA ZAKLADOWE (SZPITALNE): - RAPORTY ROCZNE DROBNOUSTROJÓW ALARMOWYCH ZA ROK 2005, - OGNISKA ZAKAZEN SZPITALNYCH W LATACH 2001-2005.

ZAKAZENIA ZAKLADOWE (SZPITALNE): - RAPORTY ROCZNE DROBNOUSTROJÓW ALARMOWYCH ZA ROK 2005, - OGNISKA ZAKAZEN SZPITALNYCH W LATACH 2001-2005. ZAKAZENIA ZAKLADOWE (SZPITALNE): - RAPORTY ROCZNE DROBNOUSTROJÓW ALARMOWYCH ZA ROK 2005, - OGNISKA ZAKAZEN SZPITALNYCH W LATACH 2001-2005. lek. med. Maria Szulc WSSE SZCZECIN Wedlug definicji WHO ZAKAZENIE

Bardziej szczegółowo

ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ: ZAGROŻENIE DLA ZDROWIA PUBLICZNEGO

ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ: ZAGROŻENIE DLA ZDROWIA PUBLICZNEGO ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ: ZAGROŻENIE DLA ZDROWIA PUBLICZNEGO materiał prasowy Europejskiego Dnia Wiedzy o Antybiotykach i Światowego Tygodnia Wiedzy o Antybiotykach Antybiotyki jeszcze do niedawna były najskuteczniejszą

Bardziej szczegółowo

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 448

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 448 ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 448 wydany przez POLSKIE CENTRUM AKREDYTACJI 01-382 Warszawa ul. Szczotkarska 42 Wydanie nr 12, Data wydania: 29 września 2014 r. Nazwa i adres AB 448 WOJEWÓDZKA

Bardziej szczegółowo

Instalacja. Zawartość. Wyszukiwarka. Instalacja... 1. Konfiguracja... 2. Uruchomienie i praca z raportem... 4. Metody wyszukiwania...

Instalacja. Zawartość. Wyszukiwarka. Instalacja... 1. Konfiguracja... 2. Uruchomienie i praca z raportem... 4. Metody wyszukiwania... Zawartość Instalacja... 1 Konfiguracja... 2 Uruchomienie i praca z raportem... 4 Metody wyszukiwania... 6 Prezentacja wyników... 7 Wycenianie... 9 Wstęp Narzędzie ściśle współpracujące z raportem: Moduł

Bardziej szczegółowo

Szybkoschładzarki SZYBKOSCHŁADZARKI. Szybkoschładzarki z funkcją 50 szybkozamrażania

Szybkoschładzarki SZYBKOSCHŁADZARKI. Szybkoschładzarki z funkcją 50 szybkozamrażania SZYBKOSCHŁADZARKI Szybkoschładzarki z funkcją 50 szybkozamrażania SZYBKOSCHŁADZARKI DLACZEGO WARTO ICH UŻYWAĆ? Wszystkie świeże produkty zawierają naturalną florę bakteryjną, która w sprzyjających warunkach

Bardziej szczegółowo

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.mcs-przychodnia.pl

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.mcs-przychodnia.pl Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.mcs-przychodnia.pl Warszawa: Dostawa materiałów i wypełnień stomatologicznych dla Mazowieckiego

Bardziej szczegółowo

Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko

Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Karta pracy III.. Imię i nazwisko klasa Celem nauki jest stawianie hipotez, a następnie ich weryfikacja, która w efekcie

Bardziej szczegółowo

Instrument oceny 360 stopni zgodny z naukową metodologią, to jest możliwe! Analiza przypadku

Instrument oceny 360 stopni zgodny z naukową metodologią, to jest możliwe! Analiza przypadku Instrument oceny 360 stopni zgodny z naukową metodologią, to jest możliwe! Analiza przypadku dr Victor Wekselberg, Senior Konsultant Mirosława Achinger, Prezes Mispol SA Plan wystąpienia 1. Czym jest kwestionariusz

Bardziej szczegółowo

ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 23 grudnia 2002 r. w sprawie niepo àdanych odczynów poszczepiennych.

ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 23 grudnia 2002 r. w sprawie niepo àdanych odczynów poszczepiennych. Dziennik Ustaw Nr 241 15978 Poz. 2097 2097 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 23 grudnia 2002 r. w sprawie niepo àdanych odczynów poszczepiennych. Na podstawie art. 19 ust. 3 ustawy z dnia 6 wrzeênia

Bardziej szczegółowo

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

Mikrosatelitarne sekwencje DNA Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012

Bardziej szczegółowo

Podstawowe pojęcia: Populacja. Populacja skończona zawiera skończoną liczbę jednostek statystycznych

Podstawowe pojęcia: Populacja. Populacja skończona zawiera skończoną liczbę jednostek statystycznych Podstawowe pojęcia: Badanie statystyczne - zespół czynności zmierzających do uzyskania za pomocą metod statystycznych informacji charakteryzujących interesującą nas zbiorowość (populację generalną) Populacja

Bardziej szczegółowo

RZECZPOSPOLITA POLSKA. Prezydent Miasta na Prawach Powiatu Zarząd Powiatu. wszystkie

RZECZPOSPOLITA POLSKA. Prezydent Miasta na Prawach Powiatu Zarząd Powiatu. wszystkie RZECZPOSPOLITA POLSKA Warszawa, dnia 11 lutego 2011 r. MINISTER FINANSÓW ST4-4820/109/2011 Prezydent Miasta na Prawach Powiatu Zarząd Powiatu wszystkie Zgodnie z art. 33 ust. 1 pkt 2 ustawy z dnia 13 listopada

Bardziej szczegółowo

ZAPYTANIE OFERTOWE. Tłumaczenie pisemne dokumentacji rejestracyjnej ZAPYTANIE OFERTOWE

ZAPYTANIE OFERTOWE. Tłumaczenie pisemne dokumentacji rejestracyjnej ZAPYTANIE OFERTOWE ZAPYTANIE OFERTOWE Tłumaczenie pisemne dokumentacji rejestracyjnej Biofarm sp. z o.o. ul. Wałbrzyska 13 60-198 Poznań Poznań, 09 grudnia 2015r. ZAPYTANIE OFERTOWE I. Nazwa i adres Zamawiającego: Biofarm

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU

OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU Celem ćwiczenia jest zapoznanie z techniką atomowej spektrometrii absorpcyjnej z atomizacją

Bardziej szczegółowo

GŁÓWNY URZĄD STATYSTYCZNY Notatka informacyjna Warszawa 5.10.2015 r.

GŁÓWNY URZĄD STATYSTYCZNY Notatka informacyjna Warszawa 5.10.2015 r. GŁÓWNY URZĄD STATYSTYCZNY Notatka informacyjna Warszawa 5.10.2015 r. Informacja o rozmiarach i kierunkach czasowej emigracji z Polski w latach 2004 2014 Wprowadzenie Prezentowane dane dotyczą szacunkowej

Bardziej szczegółowo

Ampli-LAMP Salmonella species

Ampli-LAMP Salmonella species Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego bakterii z rodzaju

Bardziej szczegółowo

Zastosowanie nowych technologii w diagnostyce mikrobiologicznej. Ireneusz Popławski

Zastosowanie nowych technologii w diagnostyce mikrobiologicznej. Ireneusz Popławski Zastosowanie nowych technologii w diagnostyce mikrobiologicznej Ireneusz Popławski 22 biomerieux Polska partner w mikrobiologii z wieloletnim doświadczeniem 33 biomerieux Polska Sp. z o.o. biomerieux Polska

Bardziej szczegółowo

REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW. OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA NIEPEŁNOSPRAWNEGO LUB PRZEWLEKLE CHOREGO

REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW. OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA NIEPEŁNOSPRAWNEGO LUB PRZEWLEKLE CHOREGO Załącznik nr 1 do Uchwały Okręgowej Rady Pielęgniarek i Położnych w Opolu Nr 786/VI/2014 z dnia 29.09.2014 r. REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA

Bardziej szczegółowo

Zarządzanie Produkcją II

Zarządzanie Produkcją II Zarządzanie Produkcją II Dr Janusz Sasak Poziomy zarządzania produkcją Strategiczny Taktyczny Operatywny Uwarunkowania decyzyjne w ZP Poziom strategiczny - wybór strategii - wybór systemu produkcyjnego

Bardziej szczegółowo

Rekrutacją do klas I w szkołach podstawowych w roku szkolnym 2015/2016 objęte są dzieci, które w roku 2015 ukończą:

Rekrutacją do klas I w szkołach podstawowych w roku szkolnym 2015/2016 objęte są dzieci, które w roku 2015 ukończą: Załącznik nr 1 do Zarządzenia nr 2/2015 Dyrektora Szkoły Podstawowej nr 1 w Radzyniu Podlaskim z dnia 27 lutego 2015 r. Regulamin rekrutacji uczniów do klasy pierwszej w Szkole Podstawowej nr 1 im. Bohaterów

Bardziej szczegółowo