Ocena występowania defensyn (HNP 1-3) w ślinie i surowicy osób z przewlekłym zapaleniem przyzębia

Transkrypt

1 Czas. Stomatol., 2008, 61, 12, Polish Dental Society Ocena występowania defensyn (HNP 1-3) w ślinie i surowicy osób z przewlekłym zapaleniem przyzębia Evaluation of defensin (HNP 1-3) presence in saliva and serum of patients with chronic periodontitis Jacek Hofman 1, Anna K. Szkaradkiewicz 2, Tomasz M. Karpiński 1 Z Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu 1 Kierownik: prof. dr hab. A. Szkaradkiewicz Z Katedry i Kliniki Stomatologii Zachowawczej i Periodontologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu 2 Kierownik: prof. dr hab. J. Stopa Summary Aim of the study: To research the concentration of antibacterial proteins - defensins (HNP 1-3) present in whole saliva and serum of patients with moderate and severe periodontitis. Material and methods: The studies were conducted on 50 patients. On the basis of clinical criteria two groups were formed. Study material consisted of samples of supernatants of centrifuged whole saliva and serums. Applying Elisa test level of α-defensins (HNP 1-3) was determined. Results: In serums of patients with moderate and severe periodontitis mean and SD concentrations of defensins (HNP 1-3) amounted to 89 ± 64 pg/ml and 91 ± 41 pg/ml, respectively. Obtained results did not differ statistically from levels of defensins in serums of the control group which amounted to 109 ± 60 pg/ ml. In supernatants of patients from group 1A and 1B saliva levels of HNP 1-3 were 628 ± 378 pg/ml and 784 ± 640 pg/ml, respectively, but in the control group it measured 246 ± 148 pg/ml. Conclusions: In chronic periodontitis, an increased level of defensins (HNP 1-3) is present in saliva irrespective of how advanced the condition is. Streszczenie Cel pracy: zbadano stężenie białek przeciwbakteryjnych defensyn (HNP 1-3) obecnych w pełnej ślinie i surowicach krwi pacjentów z umiarkowanym oraz ciężkim przewlekłym zapaleniem przyzębia. Materiał i metody: badaniami objęto 50 osób dorosłych. Na podstawie kryteriów klinicznych wyodrębniono 2 grupy badawcze. Materiał badawczy stanowiły supernatanty odwirowanej pełnej śliny i surowice. Stosując test Elisa oznaczano poziom α- -defensyn (HNP 1-3). Wyniki: w surowicach pacjentów z umiarkowanym i ciężkim przewlekłym zapaleniem przyzębia średnie i SD stężenia defensyn (HNP 1-3) wynosiły odpowiednio 89 ± 64 pg/ml i 91 ± 41 pg/ml. Uzyskane wyniki nie różniły się statystycznie od poziomu defensyn w surowicach grupy kontrolnej wynoszącego 109 ± 60 pg/ml. W supernatantach śliny pacjentów z grupy 1A i 1B poziomy HNP 1-3 wynosiły odpowiednio 628 ± 378 pg/ml i 784 ± 640 pg/ml, zaś w grupie kontrolnej poziom ten wynosił 246 ± 148 pg/ml. Wnioski: w przebiegu przewlekłych zapaleń przyzębia, niezależnie od stanu zaawansowania, występuje zwiększony poziom defensyn (HNP 1-3) w ślinie. KEYWORDS: periodontal diseases, defensins, saliva HASŁA INDEKSOWE: choroby przyzębia, defensyny, ślina 881

2 J. Hofman i in. Czas. Stomatol., Wstęp Przewlekłe zapalenia przyzębia stanowią złożony, wieloprzyczynowy proces chorobowy, w którym dominującą rolę odgrywają beztlenowe bakterie mikroflory jamy ustnej, a wśród nich, najczęściej Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythiensis i Treponema denticola, wchodzące w skład tzw. kompleksu czerwonego [21, 22]. Rozwój lokalnego zakażenia bakteryjnego mogą warunkować zaburzenia mechanizmów odpornościowych, w następstwie prowadząc do przewlekłej narządowej reakcji zapalnej, manifestującej się chorobą przyzębia o różnym stopniu zaawansowania. W jej patogenezie istotną rolę wydaje się spełniać aktywność przeciwbakteryjna śliny, głównie determinowana obecnością niskocząsteczkowych białek bakteriobójczych [5, 12, 23, 24]. Wiadomym jest obecnie, że szeroki zakres aktywności przeciwdrobnoustrojowej o działaniu wobec bakterii Gram-dodatnich i Gramujemnych, a także grzybów chorobotwórczych, wirusów osłonkowych oraz niektórych pierwotniaków charakteryzuje występujące w ślinie defensyny [3, 8]. Główny ich efekt przeciwdrobnoustrojowy jest wywierany w mechanizmie zwiększającym przepuszczalność błony patogenów poprzez dezorganizację ich dwuwarstwowych struktur lipidowych [19]. Są to małe białka kationowe, obejmujące aminokwasów, produkowane przez neutrofile α-defensyny (tzw. ludzkie peptydy neutrofilów, HNP 1-3) i strukturalnie bardzo podobne, wytwarzane u ludzi przez komórki nabłonkowe β defensyny, jak dotąd nie wykrywalne w lokalnych stężeniach [7, 8]. Cel pracy Celem podjętych badań było zbadanie stężeń białek przeciwbakteryjnych α-defensyn (HNP 1-3) obecnych w pełnej ślinie i surowicach krwi pacjentów z umiarkowanym i ciężkim przewlekłym zapaleniem przyzębia. Materiał i metody Badaniami objęto 50 dorosłych osób w wieku lat. Na podstawie kryteriów klinicznych wyodrębniono 2 grupy badawcze. Grupę 1 stanowiło 25 pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia w wieku lat. Na podstawie badania klinicznego, wyodrębniono wśród nich 14 pacjentów z umiarkowaną postacią przewlekłego zapalenia przyzębia (grupa 1A) oraz 11 osób z ciężką postacią tej choroby (grupa 1B). Stopień zaawansowania choroby przyzębia określano na podstawie kryteriów klasyfikacji chorób przyzębia, oceniając wskaźnik utraty położenia przyczepu łącznotkankowego (CAL) oraz głębokość kieszonek (PD) [1, 11]. Umiarkowaną postać choroby przyzębia rozpoznawano, przy następujących wartościach: CAL wynoszącym 3-4 mm i PD > 4 mm. Natomiast, ciężką chorobę przyzębia rozpoznawano, przy CAL > 5 mm i PD > 4 mm. Grupę kontrolną stanowiło 25 osób ze zdrowym przyzębiem w wieku lat (grupa 2). Materiał badawczy stanowiły surowice i próbki pełnej śliny spoczynkowej wszystkich uczestniczących w badaniach pacjentów. Próbki od pacjentów były pozyskiwane przed rozpoczęciem leczenia periodontologicznego. Ślinę spoczynkową pobierano do sterylnych pojemników w godzinach porannych, po upływie 2 godzin od posiłku. Następnie pobraną ślinę (2 ml) umieszczano w jałowych probówkach i wirowano (3000 obr./min., 30 min., w temp. 4ºC). Supernatanty odwirowanej pełnej śliny i surowice, przechowywano w temperaturze -20ºC do czasu wykonania oznaczeń. Poziom α-defensyn (HNP 1-3) oznaczano metodą immunoenzymatyczną (ELISA), z uży- 882

3 2008, 61, 12 Defensyny w ślinie osób z przewlekłym zapaleniem przyzębia T a b e l a 1. Wyniki oznaczeń defensyn (HNP 1-3) w surowicach pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia, postacią umiarkowaną (grupa 1A) i ciężką (grupa 1B) oraz w grupie kontrolnej (grupa 2) Badana grupa Średnie stężenie defensyn (pg/ml) ± SD Grupa 1A 628 ± 378 Grupa 1B 784 ± 640 Grupa 2 (kontrolna) 246 ± 148 T a b e l a 2. Wyniki oznaczeń defensyn (HNP 1-3) w ślinie pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia, postacią umiarkowaną (grupa 1A) i ciężką (grupa 1B) oraz w grupie kontrolnej (grupa 2) Badana grupa Średnie stężenie defensyn (pg/ml) ± SD Średnie wartości wskaźników klinicznych CAL GI PLI Grupa 1A 628 ± 378 5,81 ± 0,36 1,75 ± 0,28 2,26 ± 0,14 Grupa 1B 784 ± 640 6,95 ± 1,05 2,29 ± 0,18 2,19 ± 0,17 Grupa 2 (kontrolna) 246 ± 148 2,06 ± 0,64 0,14 ± 0,13 0,45 ± 0,32 ciem zestawu ELISA (Hycult biotechnology, Hbt, Uden). Wartość absorbancji odczytywano, przy λ = 450 nm, stosując czytnik Elisa 250 (bio- Merieux). W analizie statystycznej uzyskanych wyników zastosowano test rangowy Kruskala- Wallisa z testem Dunna. Różnice uznawano za istotne statystycznie, przy p < 0,05. Wyniki Uzyskane wyniki stężeń defensyn (HNP 1-3) w surowicach i ślinie badanych osób w zestawieniu z uzyskanymi wskaźnikami stanu zapalnego tkanek przyzębia i występowania płytki nazębnej zestawiono w tab. 1 i 2. W surowicach pacjentów z umiarkowanym (grupa 1A) i ciężkim przewlekłym zapaleniem przyzębia (grupa 1B), średnie stężenia defensyn (HNP 1-3) wynosiły odpowiednio 89 ± 64 pg/ml i 91 ± 41 pg/ml. Uzyskane wartości nie różniły się statystycznie (p=0,3625) od poziomu HNP 1-3 w surowicach grupy kontrolnej (grupa 2). Z kolei, średnie poziomy HNP 1-3 w supernatantach śliny pacjentów z umiarkowanym i ciężkim przewlekłym zapaleniem przyzębia (grupa 1A i 1B) wynosiły odpowiednio 628 ± 378 pg/ml i 784 ± 640 pg/ml, przy czym uzyskane wartości w obu grupach nie różniły się statystycznie (p>0,05). Natomiast, średni poziom badanych defensyn w grupie 2 (kontrolnej) wynosił 246 ± 148 pg/ml i był statystycznie niższy (p<0,01) od stwierdzanych stężeń defensyn obu grup badanych pacjentów. Omówienie wyników i dyskusja W badaniach własnych wykazano obecność α-defensyn (HNP 1-3) w surowicach i ślinie, zarówno u osób zdrowych, jak i u pacjentów z chorobą przyzębia, co zgodne jest z innymi danymi z piśmiennictwa [2, 4, 9, 14, 20]. Analizując uzyskane wyniki w surowicach badanych osób stwierdzono, że stężenia HNP 1-3 u pacjentów z chorobą przyzębia odpowiadają 883

4 J. Hofman i in. Czas. Stomatol., wartościom kontrolnym. Dane te, jakkolwiek w chwili obecnej, trudno odnieść do innych tego rodzaju badań w przewlekłych zapaleniach przyzębia, pozwalają wnioskować, że produkcja surowiczych defensyn w periodontopatii nie jest zaburzona. Z kolei, prezentując w tej pracy wyniki oznaczeń HNP 1-3 w ślinie pacjentów z umiarkowaną i ciężką postacią przewlekłego zapalenia przyzębia, stwierdzono statystyczne zwiększenie ich poziomów w porównaniu z grupą kontrolną. Te wyniki są zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi wzrost stężenia HNP 1 w próbkach pełnej śliny, pochodzących od osób z rozpoznanym stanem zapalnym jamy ustnej [3, 16, 17]. Zwiększony poziom ślinowych α-defensyn może zatem mieć znaczenie obronne wobec oddziaływania periodontopatogenów. Sugestię tę wspierają badania wykazujące aktywność przeciwbakteryjną α-defensyn w połączeniu z obecnym w ślinie peptydem LL-37 [10, 18]. Jednocześnie stwierdzono, że działanie przeciwbakteryjne α-defensyn jest skierowane wobec metabolicznie aktywnych drobnoustrojów [6]. Występowanie znacznych stężeń α-defensyn wykazano także w płynie dziąsłowym, zarówno u osób ze zdrowym przyzębiem jak i u pacjentów z chorobą przyzębia [15]. Lundy i wsp. [13] na podstawie wykonanych badań sugerują, że wysoki poziom α-defensyn w płynie dziąsłowym występuje częściej u osób zdrowych, aniżeli w przebiegu choroby przyzębia. Jednak powyższa sugestia nie została uprawdopodobniona analizą statystyczną uzyskanych wyników. Ponadto, w cytowanej pracy nie uwzględniono stanu zaawansowania choroby przyzębia. Stąd te wyniki trudno porównać z badaniami prezentowanymi w tej pracy. Uzyskane dane wskazują, że w przewlekłych zapaleniach przyzębia występuje zwiększony poziom ślinowych defensyn (HNP 1-3), co wydaje się być następstwem miejscowej reakcji odpornościowej. Jednocześnie, wykazano, że ich stężenie nie zależało od stanu zaawansowania choroby przyzębia. Możliwym jest zatem, że w przebiegu przewlekłego procesu zapalnego przyzębia, uwalniane przez neutrofile α-defensyny ulegają w ślinie inaktywacji, czego następstwem jest ich nieefektywne oddziaływanie wobec periodontopatogenów. Wydaje się jednak, że oznaczenia poziomu ślinowych defensyn (HNP 1-3) mogą mieć istotne znaczenie kliniczne we wczesnej diagnostyce przewlekłych zapaleń przyzębia. Podsumowanie W przebiegu przewlekłych zapaleń przyzębia, niezależnie od stanu zaawansowania, występuje zwiększony poziom defensyn (HNP 1-3) w ślinie, co wydaje się być następstwem miejscowej reakcji odpornościowej. Zwiększone stężenie defensyn w ślinie może zatem mieć znaczenie kliniczne we wczesnej diagnostyce chorób przyzębia. Piśmiennictwo 1. Albandar M J: Periodontal disease surveillance. J Periodontol 2007, 78, 7: Dale B A: Periodontal epithelium: a newly recognized role in health and disease. Periodontol , 30: Dale B A, Fredericks P L: Antimicrobial peptides in the oral environment: expression and function in health and disease. Curr Issues Mol Biol 2005, 7, 2: Dale B A, Krisanaprakornkit S: Defensin antimicrobial peptides in the oral cavity. J Oral Pathol Med 2001, 30, 6: Dunsche A, Açil Y, Siebert R, Harder J, Schröder J M, Jepsen S: Expression profile of human defensins and antimicrobial proteins 884

5 2008, 61, 12 Defensyny w ślinie osób z przewlekłym zapaleniem przyzębia in oral tissues. J Oral Pathol Med 2001, 30, 3: Edgerton M, Koshlukova S E, Araujo M W, Patel R C, Dong J, Bruenn J A: Salivary histatin 5 and human neutrophil defensin 1 kill Candida albicans via shared pathways. Antimicrob Agents Chemother 2000, 44: Ericksen B, Wu Z, Lu W, Lehrer R I: Antibacterial activity and specificity of the six human α-defensins. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49, 1: Ganz T, Lehrer R I: Defensins. Pharmacol Ther 1995, 66, 2: Goebel C, Mackay L G, Vickers E R, Mather L E: Determination of defensin HNP-1, HNP-2, and HNP-3 in human saliva by using LC/MS. Peptides 2000, 21, 6: Gomez-Garces J L, Alos J I, Sanchez J, Cogollo R: Bacteremia by multidrug-resistent Capnocytophaga sputigena. J Clin Microbiol 1994, 32: Górska R, Borakowska M: Nowa klasyfikacja chorób przyzębia choroby dziąseł. Stomatol Współcz 2001, 8: Konopka T, Ziętek M: Współczesne poglądy na rolę zaburzeń czynnościowych granulocytów obojętnochłonnych w etiopatogenezie zapaleń przyzębia. Dent Med Probl 2002, 39, 1: Lundy F T, Orr D F, Shaw C, Lamey P J, Linden G J: Detection of individual human neutrophil α-defensins (human neutrophil peptides 1, 2 and 3) in unfractionated gingival crevicular fluid A MALDI-MS approach. Molec Immunol 2005, 42: Marschall R I: Gingival defensins: linking the innate and adaptive immune responses to dental plaque. Periodontol , 35: McKay M S, Olson E, Hesla M A, Panyutich A, Ganz T, Perkins S, Rossomando E F: Immunomagnetic recovery of human neutrophil defensins from the human gingival crevice. Oral Microbiol Immunol 1999, 14: Mizukawa N, Sugiyama K, Ueno T, Mishima K, Takagi S, Suguhara T: Defensin-1, an antimicrobial peptide present in the saliva of patients with oral diseases. Oral Dis 1999, 5, 2: Mizukawa N, Sugiyama K, Ueno T, Mishima K, Takagi S, Suguhara T: Levels of human defensin, an antimicrobial peptide, in saliva of patients with oral inflammation. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1999, 87, 5: Nagaoka I, Hirota S, Yomogida S, Ohwada A, Hirata M: Synergistic actions of antibacterial neutrophil defensins and cathelicidins. Inflamm Res 2000, 49: Raj P A, Dentino A R: Current status of defensins and their role in innate and adaptive immunity. FEMS Microbiol Lett 2002, 206, 1: Shiomi K, Nakazato M, Ihi T, Kangawa K, Matsuo H, Matsukura S: Establishment of radioimmunoassay for human neutrophil peptides and their increases in plasma and neutrophil in infection. Biochem Biophys Res Commun 1993, 195, 3: Socransky S S, Haffajee A D, Cugini M A, Smith C, Kent R L: Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 1998, 25, 2: Stanley C, Ebersole H J: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia: the red complex, a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol , 38: Tenovuo J: Antimicrobial agents in saliva protection for the whole body. J Dent Res 2002, 81, 12: Tenovuo J: Antimicrobial function of human saliva how important is it for oral heath? Acta Odontol Scand 1998, 56, 5: Otrzymano: dnia 12.VIII.2008 Adres autorów: Poznań, ul. Wieniawskiego 3 Tel.: 0-61/ Fax: 0-61/ mikromed@amp.edu.pl 885