(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/52 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A01K 67/027 ( ) C12N 15/867 ( ) A61K 48/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Transgeniczne zwierzę i sposób jego otrzymywania (30) Pierwszeństwo: PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/43 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/04 (73) Uprawniony z patentu: Instytut Biologii Doświadczalnej Im. M. Nenckiego PAN, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 LESZEK KACZMAREK, Komorów, PL WITOLD KONOPKA, Knurów, PL KAMILA DUNIEC, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Transgeniczne zwierzę i sposób jego otrzymywania. Przedmiotem wynalazku jest transgeniczny ssak, nie będący człowiekiem, oraz sposób jego otrzymywania, które mogą posłużyć do uzyskania dogodnego narzędzia badawczego. [0002] Od wielu lat zwierzęta, szczególnie gryzonie laboratoryjne, takie jak szczur i mysz, stanowią modele służące poznawaniu mechanizmów wielu procesów fizjologicznych, a także patogenezy różnych chorób. Szczególny przykład stanowi szczur laboratoryjny, który od ponad 100 lat jest głównym modelem badawczym w neurobiologii, fizjologii, farmakologii, toksykologii i wielu innych gałęziach nauk biologicznych i medycznych. Bardzo często pożądanym modelem jest zwierzę transgeniczne. Otrzymywanie transgenicznych ssaków zostało najwcześniej opracowane dla myszy. Znana (tradycyjna) metoda otrzymywania transgenicznych ssaków, przykładowo szczurów jest adaptacją wcześniejszych metod opracowanych dla myszy i polega na izolowaniu zapłodnionych komórek jajowych (tzw. embrionów jednokomórkowych) z jajowodów samic po wywołanej superowulacji i odbytej kopulacji (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., and Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) i wprowadzaniu metodami in vitro obcego DNA do wyizolowanych embrionów jednokomórkowych. Następnie wprowadza się zmodyfikowane embriony doprowadzone do stadium dwukomórkowego do jajowodów matek zastępczych, którymi są samice w ciąży urojonej (szczegółowy opis poszczególnych etapów: Methods in Molecular Biology, Vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D.Murphy i A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Matki zastępcze otrzymuje się wcześniej w wyniku odbytej kopulacji z bezpłodnymi samcami (po wazektomi). W stanie techniki jest znanych wiele modeli transgenicznych otrzymanych wyżej opisaną metodą lub jej rozwinięciem. [0003] Patent US zastrzega szczurzy model reumatoidalnego zapalenia stawów. Wykorzystano tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych szczurów. Szczepy szczurów transgenizowanych to: LEW i F344. Superowulacja wywołana jest poprzez ciągły wlew hormonu FSH (patrz też Armstrong, D. T. and Opavsky, M. A. (1988 ). Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, ). Embriony transferowano zaraz po mikroiniekcji (w stadium jednokomórkowym). Jako matki zastępcze wykorzystano samice rasy Sprague-Dawley po kopulacji z wazektomizowanymi samcami. [0004] Opis EP ujawnia jedynie transgenezę myszy. Wykorzystywana jest standardowa procedura stosująca samice w ciąży urojonej jako matki zastępcze. [0005] Zgłoszenie WO opisuje zwierzęcy model choroby Alzheimera. Opisana została transgenizacja zarówno myszy jak i szczurów. W przypadku myszy ujawniona technika polega na modyfikowaniu embrionalnych komórek macierzystych (ES). Procedura transgenizacji szczurów 2

3 przebiega zasadniczo metodą tradycyjną. Jako szczep szczurów transgenizowanych wykorzystano Sprague-Dawley. Superowulacja była wywołana poprzez jednorazową podskórną iniekcję PMSG bez użycia hcg. Embriony transferowano zaraz po mikroiniekcji. Jako samice na matki zastępcze wykorzystano samice w ciąży urojonej rasy Sprague-Dawley. W treści opisu przedstawiono procedurę otrzymywania szczurów, ale jak się wydaje otrzymano tylko myszy. [0006] W zgłoszeniu patentowym PL ujawniono ulepszoną metodę otrzymywania szczurów transgenicznych z wykorzystaniem mikroiniekcji DNA do przedjądrza zygoty. [0007] Wspomniane metody polegające na wprowadzaniu całego systemu regulowanej ekspresji do zwierzęcia za pomocą transgenizacji są nieskuteczne w przypadku centralnego układu nerwowego. Cytowane systemy działają jednocześnie w kilku innych narządach, przez co nie nadają się do stosowania do badania działania miejscowego wprowadzonych genów np. ich działania w mózgu. Stąd też, istnieje ciągle potrzeba otrzymania transgenicznego zwierzęcia posiadającego zdolność miejscowego indukowania ekspresji, w szczególności w tkance nerwowej. [0008] Tak określony problem został nieoczekiwanie rozwiązany w niniejszym wynalazku. [0009] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zwierzę transgeniczne nie będące człowiekiem zawierające a) we wszystkich komórkach diploidalnych pierwszą sekwencję DNA umożliwiająca ekspresję białka z genu pod kontrolą promotora tetracyklinowego (Tet-promotor), oraz b) w zakręcie zębatym hipokampa drugą sekwencję DNA, która została wprowadzona do zakrętu zębatego hipokampa za pomocą iniekcji lentiwirusa ją obejmującego, przy czym druga sekwencja DNA umożliwia wyrażanie genu rtta pod kontrolą promotora specyficznego dla zakrętu zębatego hipokampa, tak że wyrażanie rtta indukuje ekspresję białka kodowanego przez pierwszą sekwencję DNA w tej tkance docelowej. [0010] Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób otrzymywania zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, w którym do komórek zwierzęcia wprowadza się dwie sekwencje DNA, przy czym: a) pierwsza sekwencja DNA jest wprowadzona do wszystkich komórek diploidalnych zwierzęcia, która to pierwsza sekwencja DNA umożliwia ekspresję białka z genu będącego pod kontrolą promotora tetracyklinowego (Tet-promotor); b) druga sekwencja DNA jest wprowadzona za pomocą iniekcji lentiwirusa ją obejmującego do zakrętu zębatego hipokampa zwierzęcia otrzymanego w (a), lub jego potomstwa, które posiada pierwszą sekwencję DNA, przy czym druga sekwencja DNA umożliwia wyrażanie genu rtta pod kontrolą promotora specyficznego dla zakrętu zębatego hipokampa. [0010] Korzystnie etap wprowadzania pierwszej sekwencji DNA dotyczy mikoroiniekcji DNA do przedjądrza zygoty. [0012] Korzystnie promotorem specyficznym dla zakrętu zębatego jest promotor EF1alfa. 3

4 [0013] Korzystnie białkiem kodowanym przez pierwszą sekwencję DNA jest EGFP. [0014]Opis niniejszego wynalazku uzupełniono następującymi figurami: Figura 1 przedstawia schemat doświadczenia uzyskania indukowalnej ekpresji genu EGFP w zakręcie zębatym hipokampa szczurów TetP-EGFP. (A) TetP-EGFP/hip-LV-EF1a-rtTA szczury transgeniczne TetP-EGFP z wprowadzonym wektorem lentiwirusowym LV-EF1a-rtTA do zakrętu zębatego hipokampa. DOX doksycyklina (2 mg/ml) podawana zwierzętom w wodzie do picia przez 14 dni. (B) przekrój poprzeczny mózgu szczura na wysokości Bregma -3,14 (Paxinos i Watson, 1998). Czerwoną strzałką oznaczono miejsce iniekcji wektora lentiwirusowego; Figura 2 przedstawia indukowalną ekspresję genu EGFP w zakręcie zębatym szczura TetP- EGFP/hip-LV-EF1α-rtTA. (A) Przedstawiono zdjęcia skrawków poprzecznych mózgu szczura TetP- EGFP z wprowadzonym wektorem lentiwirusowym LV-EF1α-rtTA. Szczurom podawano doksycyklinę (2mg/ml, 14 dni) (dolny panel). Na panelu górnym przedstawiono zdjęcia skrawków szczurów kontrolnych (bez doksycykliny). (B) Powiększenie z obszaru zakrętu zębatego hipokampa szczurów TetP-EGFP/hip-LV-EF1α-rtTA (z doksycykliną) zaznaczonych w (A) (panel górny). Barwienie fluorescencyjne na marker neuronalny NeuN oraz marker dla komórek astrogleju GFAP (panel dolny). Skrawki barwiono DAPI w celu uwidocznienia jąder komórkowych. Przykład 1 - Otrzymanie szczurów transgenicznych [0015] W celu otrzymywania szczurów transgenicznych wykorzystano ulepszoną metodę mikroiniekcji DNA do przedjądrza zygoty, opisaną w zgłoszeniu patentowym PL zgłoszonym w Urzędzie Patentowym RP (Kaczmarek i wsp., 2002). Do doświadczeń używano szczurów rasy Wistar oraz rasy Brown Norway (BN). W celu pozyskania dużej liczby zygot służących do mikroiniekcji DNA 5-6 tygodniowym samicom szczurów rasy Wistar podawano dootrzewnowo 20 IU hormonu PMSG (gonadotropina z surowicy ciężarnych klaczy) w celu stymulacji wzrostu pęcherzyków jajnikowych. Po upływie 52 godz. podawano 35 IU drugiego hormonu hcg (ludzka gonadotropina kosmówkowa) w celu wywołania dojrzewania i owulacji oocytów. Następnie samice łączono z dorosłymi samcami rasy Wistar. Następnego dnia z samic, u których stwierdzono obecność plemników w wymazie z pochwy, izolowano zapłodnione oocyty z bańki jajowodu. Wyizolowane komórki umieszczano w roztworze hialuronidazy (150 u/ml w PBS) w celu uwolnienia komórek pęcherzykowych otaczających oocyt, które to przenoszono do kropli pożywki M2, znajdującej się na plastikowej szalce pod płynną parafiną. Zygoty inkubowano w. 37,5 C w atmosferze 5% CO 2. Przygotowane odpowiednio preparaty DNA wstrzykiwano do jednego z przedjądrzy zygot (zwykle większego, męskiego) w kropli M2 za pomocą mikropipety szklanej przy użyciu mikromanipulatorów elektromechanicznych 4

5 pod mikroskopem. Nastrzyknięte zarodki jednokomórkowe hodowano w warunkach opisanych powyżej do dnia następnego (Hogan i wsp., 1986; Murphy i Carter, 1993; Pinkert, 2002). Przykład 2 -Transfer modyfikowanych zarodków [0017] Zygoty otrzymane w przykładzie 2, które rozwinęły się do stadium dwukomórkowego, następnego dnia transplantowano do jajowodów 8-12 tygodniowych samic szczurów matek zastępczych rasy Wistar, znajdujących się w pierwszym dniu ciąży. Samice usypiano poprzez dootrzewnowe podanie mieszaniny ksylazyny oraz ketaminy. Szczurom golono część grzbietu, a następnie nacinano skórę i otrzewną w tylnej, bocznej część ciała. Transfer zarodków do lejka jajowodu wykonywano przy użyciu szklanej pipety. Każdej samicy wszczepiano około 15 zarodków. Do transgenizacji używano samice w ciąży, które otrzymywano poprzez kojarzenie dzień przed transferem z samcami rasy BN (brązowych). Całe potomstwo takiej krzyżówki jest brązowe, natomiast nastrzyknięte zarodki (krzyżówka Wistar x Wistar) są białe (Kaczmarek i wsp., 2002). Wśród urodzonego potomstwa jedynie osobniki białe są potencjalnie transgeniczne. Przykład 3 - Przygotowanie wektorów lentiwirusowych Niereplikujący wektor lentiwirusowy LV-EF1α-rtTA został wyprodukowany w wyniku transfekcji transformowanej linii komórek ludzkiej nerki (HEK293T) trzema odrębnymi plazmidami ekspresyjnymi: (1) plazmidem transferowym (plv-ef1α-rtta), (2) plazmidem pakującym (pδ8.7) oraz (3) plazmidem kodującym glikoproteinę kapsydu wektora (pvsv-g). 48 godzin po transfekcji komórek 293T wyprodukowane i uwolnione do pożywki cząsteczki wirusa zostały zebrane razem z pożywką. Następnie pożywkę wirowano 10 min przy prędkości 1500 obr/min, w celu pozbycia się zanieczyszczeń komórkowych. Pożywkę z wektorami wirusowymi zebrano i inkubowano z DNazą w 37 ºC przez 15 min, po czym preparaty filtrowano przez filtry Millipore o średnicy porów 0,45 μm i zagęszczono przez ultrawirowanie (1,5 godziny; rpm; 4 ºC). Następnie osad zawierający wektory lentiwirusowe zawieszono w buforze PBS i zamrożono w porcjach po 10 μl w temp ºC. Miano wektora lentiwirusowego LV-EF1α-rtTA oceniono za pomocą techniki Real Time-PCR z użyciem starterów rozpoznających krótką sekwencję DNA zawartą w genomie wektorów. Przykład 4 - Iniekcja wektorów wirusowych in vivo [0019] Iniekcje stereotaktyczne wektorami lentiwirusowymi (wektor lentiwirusowy LV-EF1α-rtTA) wykonywano samcom szczurów transgenicznych TR-GFP. Szczury usypiano mieszaniną ksylazyny i ketaminy. Wektor wirusowy: LV-EF1α-rtTA (3 μl; 1,5 107 cząsteczek wektora lentiwirusowego) wstrzykiwano do zakrętu zębatego (Paxinos i Watson, 1998) za pomocą mikrostrzykawki Hamilton z prędkością 0,2 μl/min. 5

6 Przykład 5 Ekspresja miejscowa u transgenicznego szczura z przykładu 4 [0020] Szczury transgeniczne otrzymane w przykładzie 1-4 posiadały w swoim genomie gen EGFP pod kontrolą promotora tetracyklinowego. Obecność aktywatora tetracyklinowego była konieczna do włączenia promotora TetP za pomocą doksycykliny. W celu jego wprowadzenia do wybranej struktury mózgu zastosowano wektor lentiwirusowy. Wektor lentiwirusowy posłużył do wprowadzenia genu rtta do wybranej struktury mózgu tj. zakrętu zębatego hipokampa szczurów TetP-EGFP (Fig. 1). Tak zmodyfikowanym szczurom podawano doksycyklinę (2 mg/ml) w wodzie do picia przez 14 dni (Fig. 1). Następnie szczury uśmiercano i poddawano utrwaleniu 4% paraformaldehydem. Obecność zielonego białka fluorescencyjnego EGFP sprawdzano na skrawkach mózgu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Ekspresję genu EGFP obserwowano jedynie w zakręcie zębatym hipokampa, w miejscu iniekcji wektora lentiwirusowego, u szczurów, którym podawano doksycyklinę (Fig. 2a). Komórki wykazujące obecność EGFP posiadały wypustki charakterystyczne dla neuronów oraz były rozmieszczone zgodnie z położeniem ciał komórek ziarnistych zakrętu zębatego. Ich neuronalny charakter potwierdzono za pomocą markera dla komórek nerwowych NeuN. Nie obserwowano natomiast kolokalizacji fluorescencji EGFP z markerem dla astrogleju GFAP (Fig. 2b). Natomiast u szczurów kontrolnych (bez doksycykliny) nie obserwowano ekspresji genu EGFP. 6

7 Zastrzeżenia 1. Zwierzę transgeniczne nie będące człowiekiem, które zawiera: a) we wszystkich komórkach diploidalnych pierwszą sekwencję DNA umożliwiająca ekspresję białka z genu pod kontrolą promotora tetracyklinowego (Tet-promotor), oraz b) w zakręcie zębatym hipokampa drugą sekwencję DNA, która została wprowadzona do zakrętu zębatego hipokampa za pomocą iniekcji lentiwirusa ją obejmującego, przy czym druga sekwencja DNA umożliwia wyrażanie genu rtta pod kontrolą promotora specyficznego dla zakrętu zębatego hipokampa, tak że wyrażanie rtta indukuje ekspresję białka kodowanego przez pierwszą sekwencję DNA w tej tkance docelowej. 2. Sposób otrzymywania zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, znamienny tym, że do komórek zwierzęcia wprowadza się dwie sekwencje DNA, przy czym: a) pierwsza sekwencja DNA jest wprowadzona do wszystkich komórek diploidalnych zwierzęcia, która to pierwsza sekwencja DNA umożliwia ekspresję białka z genu będącego pod kontrolą promotora tetracyklinowego (Tet-promotor); b) druga sekwencja DNA jest wprowadzona za pomocą iniekcji lentiwirusa ją obejmującego do zakrętu zębatego hipokampa zwierzęcia otrzymanego w (a), lub jego potomstwa, które posiada pierwszą sekwencję DNA, przy czym druga sekwencja DNA umożliwia wyrażanie genu rtta pod kontrolą promotora specyficznego dla zakrętu zębatego hipokampa. 3. Zwierzę według zastrz. 1 albo sposób według zastrz. 2, w którym etap wprowadzania pierwszej sekwencji DNA dotyczy mikoroiniekcji DNA do przedjądrza zygoty. 4. Zwierzę według zastrz. 1 albo sposób według zastrz. 2, w którym promotorem specyficznym dla zakrętu zębatego jest promotor EF1alfa. 5. Zwierzę według zastrz. 1 albo sposób według zastrz. 2, w którym białkiem kodowanym przez pierwszą sekwencję DNA jest EGFP. 7

8 Fig. 1 8

9 Fig 2

10 ODSYŁACZE CYTOWANE W OPISIE PATENTOWYM Poniższa lista referencji cytowanych przez zgłaszającego, załączona jest tylko dla wygody czytelnika. Lista ta nie stanowi części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż bardzo uważnie zestawiano odsyłacze, nie można wykluczyć błędów lub opuszczeń i pod tym względem EPO zrzeka się wszelkiej odpowiedzialności. Dokumenty patentowe cytowane w niniejszym opisie US A [0003] EP A [0004] WO A [0005] PL [0006] [0015] Literatura niepatentowa cytowana w niniejszym opisie HOGAN, B.; BEDDINGTON, R. ; COSTANTINI, F. ; LACY, E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 [0002] Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc, tom 18 [0002] ARMSTRONG, D. T. ; OPAVSKY, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle- stimulating hormone. Biol. Reproduct., 1988, tom39, [0003] 10