ANNALES UNIVERSITATIS MARIAE CURIE-SKŁ ODOWSKA LUBLIN POLONIA

Transkrypt

1 ANNALES UNIVERSITATIS MARIAE CURIE-SKŁ ODOWSKA LUBLIN POLONIA VOL. LXIV (3) SECTIO E 2009 Instytut Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, ul. Akademicka 15, , agnieszka.gradzielewska@up.lublin.pl AGNIESZKA GRĄDZIELEWSKA Identyfikacja introgresji materiału genetycznego Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy do żyta z zastosowaniem markerów molekularnych RAPD i STS Identification of Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy genetic material introgression to rye using RAPD and STS molecular markers Streszczenie. Celem pracy było potwierdzenie translokacyjnego charakteru rodów żyta ozimego otrzymanych w wyniku krzyżowania odmiany Amilo z dzikim gatunkiem Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy. Próbę identyfikacji introgresji materiału genetycznego D. villosum do żyta podjęto, stosując metodę RAPD oraz powielenie fragmentu sekwencji powtarzalnej p380 z Dasypyrum villosum metodą PCR. U 18 z 19 badanych rodów potwierdzono obecność DNA D. villosum. Każdy z rodów zidentyfikowano na podstawie charakterystycznego profilu prążkowego. Jednocześnie u badanych rodów nie stwierdzono obecności sekwencji powtarzalnej p380 z D. villosum, co sugeruje, że introgresja DNA pochodzi spoza odcinków telomerowych chromosomów 1V-6V lub z chromosomu 7V. Słowa kluczowe: Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy, żyto, krzyżowanie oddalone, markery molekularne, RAPD, STS WSTĘP Poszerzanie zmienności genetycznej odmian uprawnych jest jednym z głównych celów hodowli roślin. Dzikie gatunki traw powszechnie wykorzystywane do ulepszania zbóż należą do rodzaju Triticum, Aegilops, Dasypyrum czy Secale [Lucas i Jahier 1988; Gruszecka 1997]. U żyta w celu zwiększenia zróżnicowania genetycznego stosuje się krzyżowania międzygatunkowe i międzyrodzajowe. Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy (Haynaldia villosa (L.) Schur) (Triticeae, Poaceae) jest diploidalnym (2n = VV = 14), jednorocznym, obcopylnym gatunkiem, występującym w rejonie Morza Śródziemnego i Kaukazu [Friebe i in. 1987; De Pace i in.

2 30 A. Grądzielewska 2001]. Genom D. villosum jest źródłem genów odporności na mączniaka prawdziwego, głownię pyłkową, łamliwość źdźbła, fuzariozę, septoriozę, zgorzel podstawy źdźbła, rdzę brunatną i źdźbłową, liściozwój pszenicy (WCM) oraz wirus żółtej karłowatości jęczmienia (BYDV) [Qualset i in. 1993; Li in. 2002]. Posiada również geny obniżające wysokość roślin [Li i in. 1991; Gruszecka i Pietrusiak 2001], wykazuje znaczną odporność na czynniki stresowe, tj. suszę, stres wodny, wymarzanie, zasolenie, a jego ziarniaki charakteryzują się dużą zawartością białka zapasowego i lizyny [Zhong i Qualset 1993; Bothmer i Claesson 1998; De Pace i in. 1990, 2001]. Próby krzyżowania żyta z Dasypyrum villosum podejmowane były bardzo rzadko. Mieszańce D. villosum z Secale fragile uzyskał i opisał Sando [1935], a mieszańce z S. cereale Nakajima w 1950 r. [za Friebe i in. 1987]. Tetraploidalne płodne mieszańce otrzymał i badał Łapiński [Łapiński i Gruszecka 1997], a diploidalne, wykorzystywane w programach hodowlanych, Gruszecka [1997]. Z kolei w hodowli pszenicy D. villosum jest jednym z dzikich gatunków wykorzystywanych najczęściej, co związane jest zapewne z większym znaczeniem gospodarczym pszenicy niż żyta. Wielokrotnie otrzymano mieszańce i amfidiploidy D. villosum z różnymi gatunkami di-, tetra- i heksaploidalnymi z rodzaju Triticum [Sando 1935; Sears 1953; Blanco i in. 1983; Stefani i in. 1983; Bothmer i Claesson 1990; Jiang i in. 1992; Bothmer i Claesson 1998]. Jedną z metod molekularnych najczęściej wykorzystywanych w celu szybkiej oceny materiałów hodowlanych jest RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) [Williams i in. 1990; Matos i in. 2001]. Metoda ta jest stosunkowo prosta, nie wymaga znajomości sekwencji analizowanego DNA i może być wykonana w oparciu o niewielką ilość matrycy [Williams i in. 1993]. U żyta markery RAPD wykorzystywane były m.in. do oceny polimorfizmu i identyfikacji rodów i linii wsobnych [Iqbal i Rayburn 1994; Myśków i in. 2001], do wzbogacania map genetycznych [Loarce i in. 1996; Masojć i in. 2001; Myśków i in. 2001], jako znaczniki cech, takich jak męska sterylność [Börner i in. 1998; Masojć i in. 1999], tolerancja na wysokie stężenie jonów glinu [Gallego i in. 1998], odporność na porastanie [Masojć i in. 1999] czy odporność na muchę heską [Seo i in. 1997]. Zidentyfikowano również markery RAPD specyficzne dla chromosomu 1RS [Iqbal i Rayburn 1995] oraz 2RL [Brunell i in. 1999]. W przypadku Dasypyrum villosum zidentyfikowano marker RAPD specyficzny dla ramienia 6VS [Qi i in. 1996] użyteczny w selekcji materiałów hodowlanych z genem odporności na mączniaka prawdziwego Pm21, a także udowodniono przydatność tego typu markerów w badaniu mieszańców somatycznych D. villosum z T. aestivum [Xia i in. 1998]. Celem niniejszej pracy było potwierdzenie obecności materiału genetycznego Dasypyrum villosum w badanych rodach przy zastosowaniu metody RAPD oraz amplifikacji sekwencji powtarzalnej p380 z D. villosum, która jest silnie specyficzna dla genomu V i nie występuje w genomie żyta ani innych gatunków z rodzaju Triticeae. Z tego powodu może być z powodzeniem wykorzystywana do identyfikacji chromosomów D. villosum w tle genetycznym gatunków z rodzaju Triticeae [De Pace i in. 1992; Frediani i in. 1994]. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań było 19 translokacyjnych rodów (tab. 1) żyta ozimego otrzymanych w wyniku krzyżowania Secale cereale L. odmiany Amilo (2n = RR = 14) z dzikim gatunkiem Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy (2n = VV = 14) (Krym, Ukraina) oraz

3 IDENTYFIKACJA INTROGRESJI MATERIAŁU GENETYCZNEGO formy rodzicielskie. W doświadczeniu brały udział rody charakteryzujące się ciekawymi cechami morfologicznymi lub cechami rolniczo użytecznymi (tab. 1). Pozostałe rody włączono do doświadczenia w oparciu o analizę ich pochodzenia, biorąc pod uwagę schemat krzyżowań wstecznych i pokolenie. Badane rody żyta uzyskano w wyniku kilkakrotnego wstecznego zapylania roślin mieszańcowych rodzicielską odmianą żyta lub D. villosum, a następnie rozmnażania w izolacji. Pokolenia B 1 /F 5, B 2 /F 7, B 3 F 2, B 3 F 4, B 3 F 6 otrzymano w wyniku jedno-, dwu- lub trzykrotnego wstecznego zapylania mieszańców pyłkiem odmiany Amilo, a następnie rozmnażania w izolacji. Pokolenia opisane jako F 2 i F 6 uzyskano, krzyżując wstecznie rośliny pokolenia B 2 z D. villosum, a otrzymane w ten sposób mieszańce rozmnażano przez kolejne lata w izolacji. DNA izolowano z koleoptyli kilkudniowych siewek w dwóch niezależnych powtórzeniach dla każdego genotypu, zgodnie z metodą Milligana [1992]. Tabela 1. Materiał badań Table 1. The material studied Forma Form Pokolenie Generation Cechy charakterystyczne Characteristics Amilo - - Dasypyrum villosum - - mała wysokość roślin 1 B 3 /F 2 small height of the plants 2 F 2-3 B 3 /F 2 duża zawartość białka ogólnego high protein content 4 B 1 /F 5-5 B 1 /F 5-6 F 6 - żółta wstawka na dokłosiu 7 B 3 /F 4 yellow insertion in the peduncle 8 B 3 /F 4 omszone dokłosie pubescent peduncle 9 B 3 /F 4 żółta wstawka na dokłosiu yellow insertion in the peduncle 10 B 3 /F 6-11 F 6-12 F 6-13 F 6-14 B 3 /F 6-15 F 6-16 B 2 /F 7-17 B 2 /F 7-18 B 1 /F 5 forma karłowa dwarf form 19 B 1 /F 5 brak omszenia roślin lack of the plants pubescence 1 19 badane rody translokacyjne 1 19 the translocation strains studied

4 32 A. Grądzielewska Amplifikacja metodą RAPD została przeprowadzona według Williams i in. [1990], z niewielkimi modyfikacjami. Reakcję przeprowadzono w mieszaninie reakcyjnej o objętości 15 μl, w której skład wchodziły: 1x bufor do PCR (10 mm Tris ph 8,8, 50 mm KC1, 0,08% Nonidet P40) (Fermentas, Litwa), 100 μm każdego dntp, 2,5 mm MgC1 2, nm startera (GenSet, DNA Gdańsk), 40 ng genomowego DNA, 0,4 0,45 U Taq DNA Polymerase (Fermentas, Litwa). Amplifikację przeprowadzono na termocyklerze T1 Thermocycler (Biometra), stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja w 95 C przez 2 min, następnie 45 cykli: 94 C 45 s, 37 C 45 s, 72 C 45 s oraz końcowa inkubacja w 72 C 10 min. Amplifikację fragmentu sekwencji p380 z Dasypyrum villosum [Frediani i in. 1994] o długości 270 pz przeprowadzono z zastosowaniem pary starterów zaprojektowanych przy wykorzystaniu programu komputerowego PRIMER 0,5. (F3 5 -TGTTGTTGTTGTTGTCGA TG-3 ; R3 5 -CCTCATCCGTATGGTCTGTA-3 ). Reakcję przeprowadzano na termocyklerze T1 Thermocycler (Biometra) w 20 µl mieszaniny reakcyjnej o składzie: 1 bufor do PCR (10 mm Tris ph 8,8, 50 mm KC1, 0.08% Nonidet P40) (Fermentas, Litwa), 100 μm każdego dntp, 3,75 mm MgC1 2, po 50 pm każdego ze starterów (Forward i Reverse) (Proligo, PPH ABO), 120 ng genomowego DNA, 1,25 U Taq DNA Polymerase (Fermentas, Litwa), stosując profil termiczny: wstępna denaturacja w 95 C przez 5 min, następnie 30 cykli: 94 C 45 s, 57 C 30 s, 72 C 45 s oraz końcowa inkubacja w 72 C przez 7 min. Produkty amplifikacji rozdzielano elektroforetycznie w 1,5% żelu agarozowym zawierającym 0,01% bromku etydyny, w buforze TBE (89 mm Tris-borate, 2,5 mm EDTA). Fragmenty DNA uwidaczniano na transiluminatorze UV, fotografowano, skanowano i analizowano przy zastosowaniu programu komputerowego Scion Image Beta 3b. Masę prążków określano przez porównanie z markerem wielkości GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Litwa), stosując program Dnafrag WYNIKI Ze 113 wstępnie testowanych starterów (Operon Technologies) do identyfikacji mieszańców wybrano 7 (6,2%) generujących polimorficzne i powtarzalne fragmenty. Startery te identyfikowały polimorfizm międzyrodzajowy, powielając u badanych form fragmenty nieobecne w DNA żyta odmiany Amilo, a występujące u formy ojcowskiej D. villosum. Wybrane oligonukleotydy amplifikowały łącznie 97 odcinków DNA o wielkości od 281pz do 2368 pz (tab. 2). Liczba fragmentów powielanych w obecności poszczególnych starterów wynosiła od 11 dla V15 do 16 dla A11 i A16, przy czym średnio na starter przypadało 13,8 generowanych fragmentów. Ze wszystkich powielonych fragmentów DNA 56 było polimorficznych (58%). Dla poszczególnych starterów polimorfizm wynosił 48 71%, natomiast liczba polimorficznych prążków/starter wynosiła od 6 do 11, średnio 8/starter. U trzech rodów stwierdzono obecność markerów specyficznych (tab. 2 i 3): OPA u rodu nr 17, OPG u rodu nr 2, i OPG u rodu nr 10. Pozostałe z badanych rodów można rozróżnić za pomocą profili markerów. Liczba profili generowanych przez jeden starter wynosiła od 7 do 17, średnio 12,6. Ze wszystkich 88 profili generowanych łącznie przez startery RAPD 69 było specyficznych dla poszczególnych rodów.

5 IDENTYFIKACJA INTROGRESJI MATERIAŁU GENETYCZNEGO Starter Primer Sekwencja startera Primer sequence 5-3 Tabela 2. Charakterystyka polimorfizmu markerów RAPD Table 2. Characteristics of RAPD markers polymorphism całkowita total Liczba prążków Number of bands polimorficznych polymorphic specyficznych dla rodu specific for the strain Liczba profili DNA Number of DNA profiles całkowita total specyficznych specific Zakres wielkości prążków (pz) Range of bands size (bp) min. max. GTG ATC OPA10 GCA G CAA TCG OPA11 CCG T AGC CAG OPA16 CGA A GGG AAT OPG01 TCG G AGG GCC OPG10 GTC T CTA CAC OPT2B AGG C CAG TGC OPV15 CGG T Suma Występowanie ojcowskiego DNA u mieszańców potwierdzało 14 z uzyskanych produktów amplifikacji (tab. 3). W większości przypadków zidentyfikowano jeden lub dwa, a w przypadku dwóch starterów G01 i A16 odpowiednio trzy i cztery prążki, występujące zarówno u formy ojcowskiej (D. villosum), jak i u badanych rodów, a jednocześnie nieobecne u gatunku matecznego żyta odmiany Amilo. U poszczególnych rodów zidentyfikowano od 0 (ród 7) do 9 (ród 17) prążków charakterystycznych dla D. villosum gatunku ojcowskiego, które jednocześnie nie były obecne u matecznej odmiany żyta Amilo (tab. 3). Nie stwierdzono prążka pochodzącego od D. villosum, który jednocześnie identyfikowałby wszystkie badane rody jako zawierające DNA dzikiego gatunku, choć produkt o masie 1259 pz powielany z udziałem startera G10 występował u 16 spośród 19 badanych rodów. Nie wytypowano również pojedynczego startera RAPD, umożliwiającego jednoznaczne potwierdzenie obecności ojcowskiego DNA u badanych obiektów, jednak już zastosowanie dwu oligonukleotydów, np. A10 i G10, potwierdziło translokacyjny charakter 18 spośród 19 badanych rodów.

6 34 A. Grądzielewska W wyniku amplifikacji z zastosowaniem starterów specyficznych dla sekwencji p380 z D. villosum obecność fragmentu o długości ok. 270 pz stwierdzono, jak oczekiwano, u D. villosum, natomiast u żyta nie uległ on powieleniu. Niestety, nie otrzymano również produktu amplifikacji u badanych rodów, co wskazuje na brak sekwencji p380 w ich materiale genetycznym. Jako wynik reakcji otrzymano również dodatkowy produkt o masie 290 pz. Tabela 3. Identyfikacja produktów PCR RAPD potwierdzających translokacyjny charakter rodów S. cereale cv. Amilo D. villosum Table 3. Identification of PCR RAPD products confirming the translocational character of S. cereale cv. Amilo D. villosum strains Starter Primer A16 A1 1 T 2B A10 V1 5 G10 G01 Wielkość prążka (pz) Band size (bp) Numer rodu Strain number DYSKUSJA Dasypyrum villosum jako dawca wielu korzystnych cech odpornościowych [Zhong i Qualset 1993; Bothmer i Claesson 1998; De Pace i in. 2001] i jakościowych [Li i in.

7 IDENTYFIKACJA INTROGRESJI MATERIAŁU GENETYCZNEGO ; De Pace i in. 2001] jest gatunkiem szeroko wykorzystywanym w programach hodowlanych pszenicy. Próby otrzymania mieszańców tego gatunku z żytem w większości przypadków nie powiodły się, jednak były podejmowane bardzo rzadko [Friebe i in. 1987; Lucas i Jahier 1988]. Wiele badań morfologicznych, biochemicznych [Baum 1983], cytologicznych i molekularnych [Lucas i Jahier 1988; Uslu i in. 1999] wskazuje na silniejsze pokrewieństwo D. villosum z żytem niż z pszenicą. Zasadna wydaje się zatem możliwość wykorzystania jego potencjału genetycznego również w programach hodowlanych żyta, szczególnie odnośnie do polepszenia jakości ziarna poprzez zwiększenie zawartości białka zapasowego i lizyny oraz obniżenia wysokości roślin i zwiększenia odporności na wyleganie. Obecnie poza Polską nie prowadzi się badań nad mieszańcami D. villosum z żytem. Formy tetraploidalne otrzymane przez Łapińskiego [Łapiński i Gruszecka 1997] nie są użyteczne w uprawie. Translokacyjne, diploidalne, a więc potencjalnie użyteczne rolniczo formy otrzymała Gruszecka [1997] w wyniku krzyżowania żyta odmiany Amilo z Dasypyrum villosum. Rody te cechuje zwiększona zawartość białka ogólnego w ziarniakach, obniżona wysokość roślin i sztywniejsza słoma, co sugeruje wpływ materiału genetycznego D. villosum [Gruszecka 1997; Gruszecka i Pietrusiak 2001]. Barwienie chromosomów metodą Giemsy nie potwierdziło jednak jednoznacznie transferu obcego materiału genetycznego do żyta. Nie stwierdzono wyraźnych substytucji czy addycji chromosomowych, ale w jednym z rodów zaobserwowano obecność mostu pomiędzy chromosomem 7R żyta a chromosomem D. villosum, przypominającym pod względem struktury prążkowej chromosom 7A pszenicy [Gruszecka i Apolinarska 1996]. Zarówno chromosomy żyta, jak i D. villosum barwią się w metodzie C-prążkowej głównie w rejonie telomerów [Friebe i in. 1987]. Z tego powodu bardzo trudno zaobserwować zmiany pochodzące od D. villosum, szczególnie w przypadku, jeśli dotyczą one niewielkiej translokacji, która mogła mieć miejsce w niebarwiącej się części chromosomu. Barwienie chromosomów metodą Giemsy może nie być efektywne w wykrywaniu drobnych zmian chromosomowych, szczególnie tych segmentów, w których brak charakterystycznego prążkowania [Chen i in. 1995]. De Pace i in. [1992] stwierdzają ponadto, że wzór prążkowy obcych chromosomów po ich wprowadzeniu do jądra komórkowego biorcy może nie być powtarzalny. Przeprowadzone poza badaniami cytologicznymi analizy cech ilościowych i jakościowych, tj. wysokości roślin, zawartości białka ogólnego czy składników mineralnych, w ziarniakach rodów otrzymanych przez Gruszecką [1997] dodatkowo wskazują na obecność materiału genetycznego D. villosum w ich genomie [Gruszecka i in. 2001; Gruszecka i Pietrusiak 2001]. Z uwagi na to w badaniach własnych uznano za wskazane przeprowadzenie dalszych analiz rodów S. cereale Amilo D. villosum, przy zastosowaniu technik molekularnych. Badania przeprowadzone przez wielu autorów wskazują na to, że dzięki zastosowaniu RAPD można, również u żyta, otrzymać markery specyficzne dla danego gatunku, genomu czy chromosomu, a nawet jego fragmentu [Iqbal i Rayburn 1995; Gallego i in. 1998; Ko i in. 2002]. Jouve i in. [1998] oraz Ko i in. [2002] otrzymali markery RAPD przydatne w selekcji linii addycyjnych i translokacyjnych pszenicy z chromatyną żyta. Co więcej, metoda ta okazała się być bardziej efektywna niż inne stosowane jednocześnie systemy markerowe (izoenzymy, białka, prążki C) [Jouve i in. 1998]. Przydatność metody RAPD do szybkiej identyfikacji DNA Dasypyrum villosum w tle genetycznym pszenicy potwierdzili Qi i in. [1996] oraz Xia i in. [1998], a u żyta Gruszecka i Miąc [2002].

8 36 A. Grądzielewska W badanym w niniejszej pracy materiale zidentyfikowano łącznie 14 fragmentów DNA, nieobecnych u matecznej odmiany żyta Amilo, a ulegających powieleniu u D. villosum. Należy więc sądzić, że pochodzą one od gatunku ojcowskiego. Poszczególne oligonukleotydy inicjowały amplifikację jednego lub dwóch takich produktów, ale w dwóch przypadkach obserwowano odpowiednio trzy i cztery prążki charakterystyczne dla formy dzikiej. Zastosowanie już dwóch starterów pozwoliło na potwierdzenie obecności materiału genetycznego D. villosum u 18 z 19 badanych rodów i ich identyfikację na podstawie charakterystycznych profili prążkowych. Devos i Gale [1992] wykazali, że metoda RAPD może być z powodzeniem stosowana do identyfikacji obcego fragmentu chromosomu, wprowadzonego do genomu biorcy w postaci translokacji. W badaniach dotyczących pokrewieństwa filogenetycznego między odmianami i populacjami miejscowymi żyta Matos i in. [2001] otrzymali 36% produktów polimorficznych RAPD, natomiast Loarce i in. [1996] 45%. Z kolei Iqbal i Rayburn [1994] obserwowali u żyta polimorfizm rzędu 72%, a Persson i in. [2001] aż 97%. Podobnie wysoki poziom polimorfizmu otrzymano w prezentowanej pracy poszczególne startery powielały od sześciu do jedenastu polimorficznych fragmentów, w sumie 66% produktów było polimorficznych. Cytowane wyniki potwierdzają przydatność analizy RAPD w wykrywaniu polimorfizmu u żyta, które podobnie jak inne obcopylne gatunki, charakteryzuje się znacznym polimorfizmem, większym w obrębie populacji niż pomiędzy nimi [Persson i in. 2001]. W badanym przez siebie materiale Aruna i in. [1993] identyfikowali fragmenty obecne w DNA rodziców, a niewystępujące u mieszańców (2,65 8,85%). W niniejszej pracy u rodów translokacyjnych nie obserwowano 60% prążków obecnych u formy ojcowskiej. Wynik ten jest zgodny z oczekiwaniami, jako że formy te zawierają głównie DNA żyta Amilo, wzbogacone o niewielki udział materiału genetycznego D. villosum. Z kolei wszystkie produkty powielane u żyta odmiany Amilo identyfikowano również w potomstwie. W prezentowanej pracy podjęto również próbę identyfikacji materiału genetycznego D. villosum u badanych rodów, z zastosowaniem powielenia fragmentu sekwencji powtarzalnej p380. Obecność tej silnie specyficznej dla genomu V sekwencji bezsprzecznie świadczyłaby o introgresji materiału genetycznego D. villosum [De Pace i in. 1992; Frediani i in. 1994]. Sekwencja p380 występuje na chromosomach 1V-6V w pobliżu telomerów, a jej podstawowy element składa się z 396 pz. W genomie występuje w różnej liczbie kopii, zarówno w obrębie danej populacji, jak i u różnych populacji D. villosum, co może być związane z adaptacją do warunków środowiska lub może być efektem dryftu genetycznego [Frediani i in. 1994]. W niniejszej pracy, jak się spodziewano, nie wykazano obecności powielanego fragmentu w DNA żyta Amilo. U D. villosum otrzymano dwa produkty reakcji: oczekiwany o wielkości 270 pz oraz dodatkowy 290 pz. Obecność dodatkowego produktu można tłumaczyć występowaniem w genomie D. villosum miejsc homologicznych do sekwencji starterów w innym niż sekwencja p380 regionie lub obecnością mutacji typu insercja w obrębie sekwencji powtarzalnej p380. W genomie badanych rodów nie stwierdzono obecności poszukiwanego fragmentu o wielkości 270 pz, co sugeruje, że materiał genetyczny D. villosum pochodzi z innego niż telomery regionu jednego z chromosomów 1V 6V lub z chromosomu 7V. Najbardziej prawdopodobny wydaje się chromosom 7V, jako że w przeprowadzonych wcześniej badaniach metodą Giemsy

9 IDENTYFIKACJA INTROGRESJI MATERIAŁU GENETYCZNEGO stwierdzono obecność mostu pomiędzy chromosomem 7R żyta a chromosomem D. villosum, przypominającym pod względem struktury prążkowej chromosom 7A pszenicy [Gruszecka i Apolinarska 1996]. Homeologię chromosomu 7V do grupy 7 pszenicy potwierdzają dane z literatury [Montebove i in. 1987]. Co więcej, badania przeprowadzone przez Blanco i in. [1988] wskazują na silniejsze pokrewieństwo genomu V D. villosum do genomu A niż do genomu B pszenicy tetraploidalnej. WNIOSKI 1. Wykazano przydatność metody RAPD do identyfikacji obcego materiału genetycznego w tle genetycznym żyta Secale cereale L. odmiany Amilo. Zastosowanie już dwóch z siedmiu wybranych starterów RAPD pozwoliło na potwierdzenie obecności DNA Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy u 18 badanych rodów i identyfikację każdego z nich na podstawie charakterystycznego profilu prążkowego. 2. Nie potwierdzono obecności materiału genetycznego D. villosum w DNA badanych rodów, przy zastosowaniu powielania fragmentu sekwencji powtarzalnej p380 z D.villosum metodą PCR. Świadczy to o tym, że przeniesiony/-e z D. villosum fragment/-y pochodzi/-ą spoza odcinków telomerowych chromosomów 1V 6V lub też z 7V. PIŚMIENNICTWO Aruna M., Ozias-Akins P., Austin M.E., Kochert G., Genetic relatedness among rabbiteye blueberry (Vaccinum ashei) cultivars determined by DANN amplification using single primers of arbitrary sequence. Genome 36, Baum B.R., A phylogenetic analysis of the tribe Triticeae (Poaceae) based on morphological characters of the genera. Can. J. Bot. 61, Blanco A., Perrone V., Simeone R., Chromosome pairing variation in Triticum turgidum L. Dasypyrum villosum (L.) Candargy hybrids and genome affinities. Proc 7 th Wheat Genet. Symp., Cambridge, England, July 13 19, 1, Blanco A., Simeone R., Tanzarella O.A., Morphology and chromosome pairing of a hybrid between Triticum durum Desf. and Haynaldia villosa (L.) Schur. Theor. Appl. Genet. 64, Börner A., Korzun V., Polley A., Malyshev S., Melz G., Genetics and molecular mapping of a male fertility restoration locus (Rfg1) in rye (Secale cereale L.). Theor. Appl. Genet. 97, Bothmer von R., Claesson L., Production and meiotic pairing of intergeneric hybrids of Triticum Dasypyrum species. Euphytica 51, Bothmer von R., Claesson L., The hybrid Triticum turgidum ssp. dicoccum Dasypyrum villosum and the cross and backcrosses to breadwheat, T. aestivum. Hereditas 128, Brunell M.S., Łukaszewski A.J., Whitkus R., Development of arm specific RAPD markers for rye chromosome 2R in wheat. Crop Sci. 39, Chen P.D., Qi L.L., Zhou B., Zhang S.Z., Liu D.J., Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-haymaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. Theor. Appl. Genet. 91,

10 38 A. Grądzielewska De Pace C., Delre V., Scarascia Mugnozza G.T., Qualset C.O., Cremonini R., Frediani M., Cionini P.G., Molecular and chromosomal characterization of repeated and single copy DNA sequences in the genome of Dasypyrum villosum. Hereditas 116, De Pace C., Paolini R., Scarascia-Mugnozza G.T., Qualset C.O., Delre V., Evaluation and utilization of Dasypyrum villosum as a genetic resource for wheat improvement. [In:] Srivastava J.P., Damania A.B. (eds.), Wheat genetic resources: meeting diverse needs. Chichester, UK, , De Pace C., Snidaro D., Ciaffi M., Vittori D., Ciofo A., Cenci A., Tanzarella O.A., Qualset C.O., Scarascia Mugnozza G.T., Introgression of Dasypyrum villosum chromatin into common wheat improves grain protein quality. Euphytica 117, Devos K.M., Gale M.D., The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat. Theor. Appl. Genet. 84, Frediani M., Colonna N., Cremonini R., De Pace C., Delre V., Caccia R., Cionini P.G., Redundancy modulation of nuclear DNA sequences in Dasypyrum villosum. Theor. Appl. Genet. 88, Friebe B., Cermeño M.C., Zeller F.J., C-banding polymorphism and the analysis of nucleolar activity in Dasypyrum villosum (L.) Candargy, its added chromosomes to hexaploid wheat and the amphidiploid Triticum dicoccum-d. villosum. Theor. Appl. Genet. 73, Gallego F.J., López-Solanilla E., Figueiras A.M., Benito C., Chromosomal location of PCR fragments as a source of DNA markers linked to aluminium tolerance genes in rye. Theor. Appl. Genet. 96, Gruszecka D., Otrzymanie i charakterystyka mieszańców Secale cereale L. z Dasypyrum villosum (Haynaldia villosa L.). Hodowla Roślin. I Krajowa Konf., Gruszecka D., Apolinarska B., Cytogenetyczne badania międzyrodzajowych mieszańców Secale cereale (L.) z Dasypyrum villosum (L.). Seminarium Środowiskowe Aktualne badania genetyczne wspierające postęp prac hodowlanych nad pszenżytem i żytem. Inst. Genet. Roślin PAN, Poznań, 18 kwietnia 1996, 16. Gruszecka D., Miąc A., Wykorzystanie metody RAPD w określaniu mieszańcowego charakteru rodów Secale cereale L. Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy. Zesz Probl. Post. Nauk Roln. 488, Gruszecka D., Makarska E., Praczyk M., Miąc A., Wpływ komponentów rodzicielskich na zawartość składników mineralnych translokacyjnej formy żyta z wykorzystaniem Dasypyrum villosum (Krym, USSR). Biul. Magnezol. 6, Gruszecka D., Pietrusiak A., Characterization of translocation rye strains created using Dasypyrum villosum (CRIMEA, USSR). Proc. Eucarpia Rye Meet; Radzików, Poland, July 4 7, Iqbal M.J., Rayburn A.L., Stability of RAPD markers for determining cultivar specific DNA profiles in rye (Secale cereale L.). Euphytica 75, Iqbal M.J., Rayburn A.L., Identification of the 1RS rye chromosomal segment in wheat by RAPD analysis. Theor. Appl. Genet. 91, Jiang H.R., Dai D.Q., Sun D.F., Xiao S.H., New artificial genetic resources of wheat several polyploids of Triticum Dasypyrum. Sci. Agri. Sinica 25(1), 89. Jouve N., Daza L., Bustos E., Rubio P., Ceoloni C., Worland A.J., Marker assisted selection of alien transfer into wheat. EWAC-Newsletter, pp Ko J.M., Do G.S., Suh D.Y., Seo B.B., Shin D.C., Moon H.P., Identification and chromosomal organization of two rye genome specific RAPD products useful as introgression markers in wheat. Genome 45,

11 IDENTYFIKACJA INTROGRESJI MATERIAŁU GENETYCZNEGO Li H.J., Conner R.L., Chen Q., Jia X., Li H., Graf R.J., Laroche A., Kuzyk A.D., Different reactions to the wheat curl mite and wheat streak mosaic virus in various whaet Haynaldia villosa 6V and 6VS lines. Plant Disease 86, Li J.M., Yang Z.M., Tian H.Q., Huang F., Gang P.T., Somatic cell clone establishment and amphiploid synthesis in a Triticum aestivum Haynaldia villosa intergeneric hybrid. Hereditas-Beijing 13(1), 1 3. Loarce Y., Hueros G., Ferrer E., A molecular linkage map of rye. Theor. Appl. Genet. 93, Lucas H., Jahier J., Phylogenetic relationships in some diploid species of Triticineae: cytogenetic analysis of interspecific hybrids. Theor. Appl. Genet. 75, Łapiński M., Gruszecka D., Charakterystyka płodnego mieszańca Secale cereale Haynaldia villosa. Krajowa Konf. Mieszańce oddalone roślin zbożowych, Poznań, 24 kwietnia: 4 5. Masojć P., Łapiński M., Stojałowski S., Milczarski P., Poszukiwanie markerów molekularnych męskiej sterylności i odporności na porastanie u żyta. Biul. IHAR 211, Masojć P., Myśków B., Milczarski P., Extending a RFLP-based genetic map of rye using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and isozyme markers. Theor. Appl. Genet. 102, Matos M., Pinto-Carnide O., Benito C., Phylogenetic relationships among Portuguese rye based on isozyme, RAPD and ISSR markers. Hereditas 134, Milligan B.G., Plant DNA isolation. [In:] Molecular analysis of populations: a practical approach. IRL Press, Oxford, UK, Montebove L., De Pace C., Jan C.C., Sarcascia Mugnozza G.T., Qualset C.O., Chromosomal location of isozyme and seed storage protein genes in Dasypyrum villosum (L.) Candargy. Theor. Appl. Genet. 73, Myśków B., Masojć P., Banek-Tabor A., Szołkowski A., Genetic diversity of inbred rye lines evaluated by RAPD analysis. J. Appl. Genet. 42, 1,14. Persson K., Díaz O., von Bothmer R., Extent and patterns of RAPD variation in landraces and cultivars of rye (Secale cereale L.) from Nothern Europe. Hereditas 134, Qi L., Cao M., Chen P., Li W., Liu D., Identification, mapping, and application of polymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat. Genome 39, Qualset C.O., Zhong G.-Y., De Pace C., Mc Guire P.E., Population biology and evaluation of genetic resources of Dasypyrum villosum. [In:] Damania A.B. (ed.), Biodiversity and wheat improvement. Chichester, UK, Sando W.J., Intergeneric hybrids of Triticum and Secale with Haynaldia villosa. J. Agric. Res. 51, Sears E.R., Addition of the genome of Haynaldia villosa to Triticum aestivum. Am. J. Bot. 40, Seo Y.W., Johnson J.W., Janet R.L., A molecular marker associated with the H21 Hessian fly resistance gene in wheat. Mol. Breed. 3, Stefani A., Meletti P., Onnis A., New data on the experimental intergeneric hybrid Triticum durum Desf. Haynaldia villosa Schur. Z. Pflanzenzücht. 90, Uslu E., Reader S.M., Miller T.E., Characterization of Dasypyrum villosum (L.) Candargy chromosomes by fluorescent in situ hybridization. Hereditas 131, Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski J.A., Tingey S.V., Genetic analysis using Random Amplified Polymorphic DNA markers. Meth. Enzymol. 218,

12 40 A. Grądzielewska Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V., DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids Res. 18, Xia G., Li Z., Wang S., Xiang F., Liu J., Chen P., Liu D., Asymmetric somatic hybridization between haploid common wheat and UV-irradiated Haynaldia villosa. Plant Sci. 137, Zhong G.Y., Qualset C.O., Allelic diversity of high-molecular-weight glutenin protein subunits in natural populations of Dasypyrum villosum (L.) Candargy. Theor. Appl. Genet. 86, Abstract. The aim of the study was to confirm the translocational character of winter rye strains obtained by hybridization of Amilo cultivar with the wild Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy species. Identification of D. villosum genetic material introgression to rye was conducted with RAPD method and with PCR amplification of a part of Dasypyrum villosum p380 repeated sequence. In 18 out of 19 investigated strains the presence of D. villosum DNA was confirmed. Each of the strains was identified, basing on the characteristic banding profile. At the same time, in the investigated strains the presence of the p380 D. villosum repeated sequence was not confirmed, which suggests that DNA introgression is located outside telomeres of chromosomes 1V-6V or from chromosome 7V. Key words: Dasypyrum villosum (L.) P. Candargy, rye, wide hybrids, molecular markers, RAPD, STS