PL B1. INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL
|
|
- Krzysztof Duda
- 8 lat temu
- Przeglądów:
Transkrypt
1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/00 ( ) A61K 48/00 ( ) A61K 45/00 ( ) C12N 15/86 ( ) A61K 38/17 ( ) A61K 39/04 ( ) (54) Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 04/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/14 (72) Twórca(y) wynalazku: AGNIESZKA SZCZEPANKOWSKA, Warszawa, PL JACEK BARDOWSKI, Warszawa, PL TAMARA ALEKSANDRZAK-PIEKARCZYK, Warszawa, PL KAJA KASAREŁŁO, Warszawa, PL ANDRZEJ W. LIPKOWSKI, Warszawa, PL BARBARA KWIATKOWSKA-PATZER, Piaseczno, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Iwona Brodowska
2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania syntetycznych genów kodujących niskocząsteczkowe peptydy mielinowe, pochodnych fragmentów białek rdzenia kręgowego ssaków, oraz sposób ich mikrobiologicznego wytwarzania w bakteriach mlekowych, preparaty pojedyncze i skojarzone tych peptydów oraz ich zastosowanie w medycynie do indukcji specyficznej tolerancji pokarmowej. WPROWADZENIE Stwardnienie rozsiane jest chorobą destrukcyjną centralnego układu nerwowego, która dotyka głównie ludzi młodych, między 20 a 40 rokiem życia. Dane dotyczące zachorowalności wskazują, że w Polsce choruje na nią ok osób. Jest to choroba o podłożu autoimmunologicznym, na którą, jak dotąd, nie ma skutecznego leku. Leki immunomodulujące, jak interferon i copaxon, jedynie zmieniają przebieg choroby, zmniejszając ilość rzutów, ale po 6 latach leczenia niepełnosprawność osób ze stwardnieniem rozsianym jest taka sama jak bez leczenia. Ponadto kuracja tego schorzenia jest dość kosztowna, a refundacja kosztów leczenia - sporadyczna. Stąd też potrzeba intensywnych badań nad nowymi skutecznymi i ekonomicznie opłacalnymi metodami leczenia tego przewlekłego schorzenia immunologicznego. Choroby autoimmunologiczne polegają na patologicznym rozpoznawaniu przez układ odpornościowy białek własnych organizmu jako obcych antygenów, co w konsekwencji prowadzi do uruchamiania mechanizmów eliminacji tych antygenów. Fragmenty białek mieliny ośrodkowego układu nerwowego stanowią antygeny patologicznie rozpoznawane przez przeciwciała w stwardnieniu rozsianym. Znany jest mechanizm tolerancji pokarmowej, w którym następuje specyficzne odczulanie układu odpornościowego na składniki pokarmowe. Zaproponowano wykorzystanie tego mechanizmu do wywoływania tolerancji na epitopy białek w chorobach autoimmunologicznych takich jak reumatyzm i stwardnienie rozsiane. W badaniach własnych Autorów wykazano, że hydrolizaty rdzenia kręgowego zwierząt hodowlanych, zawierające niskocząsteczkowe fragmenty peptydowe mieliny, wykazują działanie modulujące przebieg eksperymentalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), w modelu zwierzęcym stwardnienia rozsianego (SM) (1). Podjęcie badań mających na celu opracowanie sposobu wytwarzania peptydów mielinowych w bakteriach mlekowych wiązało się z kilkoma przesłankami: (i) ważna pozycja stwardnienia rozsianego pośród chorób występujących w Polsce; (ii) niska skuteczność i wysokie koszty leczenia tej choroby; (iii) wykazanie skuteczności peptydów w terapii tej jednostki chorobowej; (iv) udokumentowana rola jelita (przewodu pokarmowego) w systemie odporności organizmu; (v) dotychczasowe pozytywne wyniki stosowania bakterii mlekowych, jako producentów czynników immunomodulacyjnych (cytokin i antygenów), w tym także, jako szczepionek doustnych; (vi) dane wskazujące, że bakterie potęgują efekt tolerancji pokarmowej (2). AKTUALNY STAN WIEDZY Rozpoznanym celem ataku na układ odpornościowy w stwardnieniu rozsianym oraz w zwierzęcym modelu zapalenia mózgu i rdzenia EAE są białka składowe mieliny. Głównymi białkowymi składnikami mieliny są trzy białka: (i) zasadowe białko mieliny, MBP (od ang. Myelin basie protein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 13 (3) (ii) białko prolipidowe PLP (od ang. proteolipid protein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 14 (4) (iii) Glikoproteina oligodendrocytów mieliny, MOG (od ang. myelin-oligodendrocyte glycoprotein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 15 (5). Badania ostatniej dekady dostarczają dowodów, że fragmenty peptydowe, będące produktami częściowej hydrolizy białek pokarmowych, również mają zdolność przenikania przez barierę jelitową. Niektóre krótkie peptydy przenikają przez tę barierę łatwiej niż pojedyncze aminokwasy. Aby odróżnić pokarmowe peptydy przenikające do krwi z jelita, od białek inwazyjnych bakterii i wirusów, organizmy wytworzyły specyficzny system prezentacji antygenów pokarmowych. Rezultatem takiej prezentacji jest obniżenie specyficznej immunogenności na konkretne sekwencje peptydowe (jak również inne, niepeptydowe składniki pokarmowe). Zjawisko to nazwano tolerancją pokarmową" (ang. oral tolerance"). Niniejszy wynalazek opiera się na wstępnych badaniach własnych. Zastosowanie preparatu otrzymanego w wyniku hydrolizy rdzenia kręgowego w arbitralnie dobranej dawce, u szczurów z EAE powodowało zmniejszenie objawów zapalnych zarówno przy podawaniu wyprzedzającym jak i po wywołaniu EAE (6).
3 PL B1 3 Wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej, jako fabryk biologicznych produkujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych jest bardzo atrakcyjne naukowo i aplikacyjnie i prezentuje wiele korzystnych cech medyczno-farmakologicznych. Bakterie fermentacji mlekowej, zwane inaczej bakteriami kwasu mlekowego lub bakteriami mlekowymi (ang. Lactic Acid Bacteria, LAB), stanowią dużą i bardzo zróżnicowaną taksonomicznie grupę bakterii gramdodatnich. Niewątpliwą zaletą tych bakterii jest nadany im status GRAS (ang. Generalny Regarded As Safe), tj. bakterii niechorobotwórczych i bezpiecznych dla człowieka i zwierząt. Bakterie mlekowe stanowią bardzo ważny przedmiot zastosowań biotechnologicznych i obiekt badań podstawowych i aplikacyjnych. Biotechnologia z udziałem bakterii mlekowych jest stosowana w różnych gałęziach przemysłu (7) - spożywczym (np. produkcja fermentowanych artykułów mleczarskich, żywności oraz pasz i dodatków do pasz), chemicznym (np. produkcja polimerów i enzymów) i farmaceutycznym (np. preparaty pro biotyczne typu Lakcid czy Lactovaginal). W ostatnich latach duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem tych bakterii do produkcji tzw. żywności funkcjonalnej, preparatów probiotycznych oraz leków o charakterze szczepionek doustnych (7, 8, 9). Wśród tych ostatnich duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania bakterii mlekowych jako wektorów szczepionkowych (10-12). Również podczas ostatnich kilku latach obserwuje się na świecie nasilenie badań nad wykorzystaniem bakterii mlekowych do produkcji różnych białek o znaczeniu terapeutycznym lub profilaktycznym. Bakterie fermentacji mlekowej próbuje się wykorzystać w profilaktyce i zwalczaniu zespołu chorobowego, zwanego IBD (ang. Inflammatory Bowel Disease - przewlekłym, nieswoistym zapaleniu jelita), który obejmuje także chorobę Leśniowskiego-Crohna (w skrócie zwaną chorobą Crohna) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (ang. ulcerative colitis). Przedmiotem wynalazku jest opracowanie układu biologicznego, opartego o bakterie fermentacji mlekowej, wytwarzającego fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, do stworzenia preparatu przeznaczonego do wywoływania tolerancji pokarmowej. Wyboru fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych do zastosowania w wynalazku dokonano na podstawie badań własnych, które wskazały, iż u chorych na stwardnienie rozsiane identyfikowany jest antygen HLA-DR2 rozpoznający fragment białka MBP (13). Przeciwciała do innych fragmentów trzech zasadniczych białek są również identyfikowane (14, 15) a w miarę postępu choroby następuje zwiększanie się liczby rozpoznawanych antygenów pochodzących z trzech podstawowych białek mieliny. Powyższe obserwacje wiążą się prawdopodobnie z dostępnością zarówno tych białek jak i ich fragmentów u chorych. Immunogenność wybranych peptydowych fragmentów naturalnych białek mielinowych potwierdzona została również na zwierzęcych modelach EAE (16, 17, 18). Nieoczekiwanie, okazało się, że w wyniku realizacji wynalazku, możliwe jest: a) wytwarzanie syntetycznych genów kodujących wybrane fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych metodą PCR; b) klonowanie, w komórkach wybranych szczepów gramdodatnich bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus otrzymanych genów rekombinowanych z odpowiednimi wektorami do klonowania; c) ekspresja w wybranych rodzajach bakterii mlekowych (Lactococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus) genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych; d) klonowanie genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych w komórkach bakterii gramujemnej (Escherichia coli); e) optymalizacja biosyntezy peptydów mielinowych w bakteriach mlekowych. Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, według wynalazku, charakteryzują się tym, że zawierają co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka mielinowego, wybraną z grupy obejmującej: sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP21-40, przedstawioną wzorem 1, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MOG35-55, przedstawioną wzorem 2, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 2a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP85-97, przedstawioną wzorem 3, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 3a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP , przedstawioną wzorem 4, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 4a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP , przedstawioną wzorem 5, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 5a. Sposób wytwarzania genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku polega na zsyntetyzowaniu metodą PCR syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, z wykorzystaniem specyficznych dla każdego pep-
4 4 PL B1 tydu 2 komplementarnych starterów ( LONG") przedstawionych w Tabeli 1, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus lactis. Dodatkowo do sekwencji nukleotydowej starterów FLONG" (forward LONG) dla peptydów MBP85-97, PLP oraz PLP wprowadza się sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie końce 5' starterów FLONG_peptyd" zawierają dodatkową, typową dla bakterii Lactococcus lactis sekwencję RBS (ang. ribosome-binding site; miejsce wiązania rybosomów), rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencje 'spacer' (sekwencję łącznikową) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem START translacji. Startery LONG" stosuje się jako matrycę, na której techniką PCR przeprowadza się syntezę syntetycznych genów przy użyciu krótkich starterów ( SHORT") homologicznych do 5' końców starterów FLONG_peptyd" i RLONG_peptyd", przy czym końce 5' starterów SHORT" niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie SaII (dla startera forward SHORT) oraz PstI (dla startera reverse SHORT), natomiast końce 5' starterów revshort_peptyd" (reverse SHORT) posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodonowi STOP translacji (TAA) (Tabela 2). Przedmiotem wynalazku są także, otrzymane w wyniku przeprowadzenia powyższej reakcji PCR, z zastosowaniem zaprojektowanych starterów LONG" i SHORT", fragmenty DNA, o sekwencjach nukleotydowych, według wynalazku, w obrębie których zawarte są sekwencje syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych (sekwencje podkreślone), według wynalazku, przedstawione wzorem 6, wzorem 7, wzorem 8, wzorem 9 i wzorem 10. Sposób klonowania wytworzonych fragmentów DNA zawierających syntetyczne geny, według wynalazku, polega na tym, że poddaje się je trawieniu enzymami restrykcyjnymi, korzystnie PstI i SaII, a następnie łączy z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus zwłaszcza z wektorem pil253, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych, w których orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) jest zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze, po czym zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. W sposobie klonowania według wynalazku, korzystnie jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium. Sposób wytwarzania wybranych peptydów w układzie bakteryjnym, korzystnie, według wynalazku, polega na ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus poprzez ich hodowle na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce Μ17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDN (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5% lub też na mleku, serwatce czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20 C-30 C, preferencyjnie 30 C. Sposób klonowania syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych w bakteriach gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, według wynalazku, polega na tym, że łączy się syntetyczny gen amplifikowany odpowiednimi starterami 'SHORT' (Tabela 2) z wektorem, preferencyjnie z komercyjnie dostępnym plazmidem pgemt-easy lub innym wektorem, zdolnym do replikacji w komórkach bakterii gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych. Zrekombinowane DNA wprowadzane jest znaną metodą, np. elektroporacji, do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
5 PL B1 5 W sposobie klonowania według wynalazku korzystnie jako gramujemne szczepy bakteryjne, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się bakterie z gatunku Escherichia coli, korzystnie szczep TG1. Sposób optymalizacji ekspresji syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych, według wynalazku, korzystnie polega na zastąpieniu wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym, replikującym się w komórkach L. lactis, promotorem regulowanym, korzystnie regionem promotorowym genu pochodzącego z genomu bakterii L. lactis lub innego gatunku czy z genomu bakteriofaga, preferencyjnie regionem promotorowym genu ptcb, zaangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, który jest regulowany poprzez obecność w pożywce różnych cukrów, takich jak: celobioza, galaktoza, salicyna, eskulina, glukoza. Sposób zoptymalizowanej produkcji peptydów w układzie bakteryjnym, według wynalazku, korzystnie polega na hodowli komórek niosących rekombinowany wektor plazmidowy (ze sklonowanym syntetycznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcb z genomu bakterii z rodzaju Lactococcus) na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na podłożu zdefiniowanym typu CDM (chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu 0.5%, lub też na mleku, serwatce czy innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach C, preferencyjnie 30 C. Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcb, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona wzorem 11, do stosowania w optymalizacji produkcji syntetycznych genów, kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku. Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcb z L. lactis oraz sposób zastąpienia nim wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym replikującym się w komórkach L. lactis, przez region promotorowy genu ptcb z L. lactis, według wynalazku, polega na tym, że region promotorowy genu ptcb wytwarza się w reakcji PCR, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. lactis IL1403 oraz pary starterów (ptcbfor i ptcbrev) o sekwencjach komplementarnych do sekwencji DNA okalających region promotorowy chromosomalnego genu ptcb oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera ptcbfor) oraz NciI (dla startera ptcbrev) (Tabela 3). W wyniku reakcji PCR, używając tak zaprojektowanych starterów, według wynalazku, otrzymuje się fragment DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 12, w obrębie których zawarta jest sekwencja regionu promotorowego genu ptcb (podkreślona). Tak uzyskany produkt poddaje się działaniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie VspI i NciI a następnie łączy się go z rekombinowanymi wektorami niosącymi syntetyczne geny, kodującymi wybrane fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, z których usunięto oryginalny region promotorowy (np. poprzez działanie tych samych restryktaz). Zrekombinowane DNA wprowadzane jest metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność fragmentu DNA o oczekiwanej długości, odpowiadającej długością wybranemu regionowi promotorowemu genu ptcb. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją nukleotydową regionu promotorowego genu ptcb, według wynalazku, potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie bakterii produkujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według wynalazku, do wywołania efektu tolerancji pokarmowej. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcb, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawionej wzorem 11, według wynalazku, do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według wynalazku, do wywołania efektu tolerancji pokarmowej. Oczekuje się, że bakterie produkujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku, będą wywoływać efekt tolerancji pokarmowej podobny jak ten opisany w literaturze dotyczącej doustnego podania mieszaniny peptydów w postaci hydrolizatu rdzenia kręgowego pochodzenia zwierzęcego, opublikowany w wyniku badań własnych (1, 6). Materiały i metody Szczepy bakteryjne, warunki hodowlane i stosowane plazmidy Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w niniejszych badaniach przedstawiono w Tabeli 4. Szczepy Lactococcus lactis hodowano na podłożach M17 (Oxoid, Anglia) z dodatkiem 0.5% glukozy
6 6 PL B1 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem glukozy lub cellobiozy (0.5%-1%), w temperaturze 20 C-30 C. Szczepy Escherichia coli hodowano na podłożu Luria-Bertani (LB), w temperaturze 37 C. Gdy zachodziła potrzeba, w celach selekcyjnych, stosowano następujące antybiotyki: erytromycynę 5 g ml -1 dla L. lactis oraz ampicylinę 100 g ml -1 dla E. coli. Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku. P r z y k ł a d I Syntetyczne geny zsyntetyzowano metodą PCR używając jako matrycy dla każdego peptydu 2 komplementarnych starterów (for/rev LONG") oraz 2 krótkich starterów (for/rev SHORT") homologicznych odpowiednio do skrajnych sekwencji starterów LONG" (Tabela 1). W wyniku reakcji amplifikacji PCR otrzymywano produkty o oczekiwanej długości, które następnie trawiono enzymem SaII oraz PstI i łączono z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus - pil253, trawionym uprzednio również tymi samymi enzymami. Kolejno obydwa DNA zrekombionowano ze sobą i wprowadzano metodą elektroporacji do komórek wybranych szczepów Lactococcus lactis, które hodowano na podłożu stałym M17 agar z dodatkiem 0.5% glukozy oraz erytromycyną o końcowym stężeniu 5 g ml -1, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. Otrzymane prawidłowe rekombinowane plazmidy wyizolowano znaną metodą z komórek bakterii Lactococcus i wprowadzano poprzez elektroporację do komórek innych rodzajów bakterii mlekowych, tj. Bifidobacterium i Lactobacillus. Komórki szczepów L. lactis transformowano znaną techniką elektroporacji (19). Komórki Bifidobacterium i Lactobacillus transformowano znaną techniką elektroporacji według wcześniej ustalonych procedur (20, 21). Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22). T a b e l a 1 Sekwencje starterów ( LONG ) użytych jako matryca do amplifikacji sztucznych genów neuropeptydów Nazwa neuropeptydu MBP21-40 Nazwa startera FLONG_ MPB21 Sekwencje starterów (forward/reverse) 5 GAGTATTTCTATGGATCA- TGCTCGTCATGGTTTTTTACCACGTCATCGTGATACTGGTATTTTAGATTCA 3 RLONG_ MPB21 5 TGAATCTAAAATACCAGT- ATCACGATGACGTGGTAAAAAACCATGACGAGCATGATCCATAGAAATACTC 3 MOG35-55 FLONG_ MOG35 5 GTATTTCTATGGAAGTTG- GATGGTATCGTTCACCATTTTCACGTGTTGTTCATTTATATCGTAATGG 3 RLONG_ MOG35 5 CCATTACGATATAAATGA- ACAACACGTGAAAATGGTGAACGATACCATCCAACTTCCTAGAAATAC 3 MBP85-97 PLP FLONG_ MPB85 RLONG_ MPB85 FLONG_ PLP139 RLONG_ PLP139 5 GTATTTCTATGCCAGGATCACGTCCACATTTAATTCGTTTATTTTCACGT 3 5 ACGTGAAAATAAACGAATTAAATGTGGACGTGATCCTGGCATAGAAATAC 3 5 GTATTTCTATGCATTCATTAGGAAATGGTTAGGACATCCAGATAAATTT 3 5 AAATTTATCTGGATGTCCTAACCATTTTCCTAATGAATGCATAGAAATAC 3
7 PL B1 7 PLP FLONG_ PLP178 RLONG_ PLP178 cd. tabeli 1 5 GTATTTCTATGAATACATGGACAACATGTCAATCAATTGCTTTTCCATC 3 5 GATGGAAAAGCAATTGATTGACATGTTGTCCATGTATTCATAGAAATAC 3 P r z y k ł a d II Produkcja wybranych peptydów w komórkach bakterii mlekowych polegała na ekspresji syntetycznych genów w komórkach bakteryjnych poprzez ich hodowlę na podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5%, w temperaturze w granicach 20 C-30 C, preferencyjnie 30 C, do osiągnięcia gęstości optycznej OD P r z y k ł a d III Badanie ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych na poziomie transkrypcji przeprowadzano wykorzystując metodę RT-PCR. Z bakteryjnych szczepów niosących rekombinowane plazmidy izolowano całkowite RNA, które po odpowiedniej obróbce poddawano reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu starterów reverse (revshort_peptyd) komplementarnych do końca 3' nici kodującej syntetyczny gen (Tabela 2). Otrzymane cdna podawano następnie reakcji amplifikacji techniką klasycznego PCR, wykorzystując dwie pary starterów (forshortuniv i revshort_peptyd) (Tabela 2). W wyniku eksperymentu otrzymywano fragmenty DNA, o długości odpowiadającej długości każdego z genów. T a b e l a 2 Sekwencje starterów SHORT użytych do amplifikacji sztucznych genów neuropeptydów Nazwa neuropeptydu Starter uniwersalny forward Nazwa startera Sekwencje starterów ForSHORTUniv 5 ACGCGTCGACAAGGAGTATTTCTATG 3 MBP21-40 rev SHORT_MBP21 5 AACTGCAGTTATTATGAATCTAAAATACCAG 3 MOG35-55 rev SHORT_MOG35 5 AACTGCAGTTATTATTTTCCATTACGATA 3 MBP85-97 rev SHORT_MBP85 5 AACTGCAGTTATTAACGTGAAAATAAACG 3 PLP rev SHORT_PLP139 5 AACTGCAGTTATTAAAATTTATCTGG 3 PLP rev SHORT_PLP178 5 AACTGCAGTTATTATTTTGATGGAAAAGC 3 P r z y k ł a d IV Badania ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych na poziomie translacji przeprowadzano metodą immunoblottingu, wykorzystując ekstrakty białkowe, otrzymane znanymi metodami z hodowli komórek bakteryjnych zawierających rekombinowane plazmidy, zawieszone w buforze PBS, ph 7.4 oraz odpowiednie, specyficzne przeciwciała, dostępne komercyjnie. P r z y k ł a d V Region promotorowy genu ptcb zamplifikowano metodą PCR na matrycy genomowego DNA szczepu L. lactis IL1403 przy użyciu odpowiednich starterów (Tabela 3). W wyniku reakcji amplifikacji PCR otrzymywano produkt o oczekiwanej długości, który następnie trawiono enzymami NciI oraz VspI i łączono z plazmidem pil253, zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami. Zrekombionowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek szczepu L. lactis, które hodowano na podłożu stałym M17 agar z dodatkiem 0.5% glukozy oraz erytromycyną o końcowym stężeniu 5 g m -1, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające region promotorowy genu ptcb. Komórki szczepów L. lactis transformowano techniką elektroporacji (19). Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22). T a b e l a 3 Sekwencje starterów użyte do amplifikacji regionu promotorowego genu ptcb Nazwa startera sekwencja starterów ptcbfor 5 GCGATTAATGTCGCCTAAAGGTTGC 3 ptcbrev 5 AATCCCGGCGTTTTATAATTTAACGTTC 3
8 8 PL B1 P r z y k ł a d VI Syntetyczne geny peptydów amplifikowano metodą PCR przy użyciu odpowiednich starterów 'SHORT' (Tabela 2) a następnie łączono z wektorem zdolnym do replikacji w komórkach bakterii Escherichia coli - pgemt-easy. Zrekombinowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek szczepu E. coli, które hodowano na podłożu LB agar z dodatkiem ampicyliny o końcowym stężeniu 100 μg ml -1, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. Komórki E. coli transformowano techniką elektroporacji (22). Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22). P r z y k ł a d VII Strukturę sekwencji nukleotydowej syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych oraz regionu promotorowego genu ptcb, według wynalazku, potwierdzano przez sekwencjonowanie fragmentów DNA przy zastosowaniu zestawu BigDye Terminator (Promega, USA) i sekwenatora ABI377 (Applied Biosystem, USA) oraz stosując rekombinowane plazmidy jako matrycę i startery o sekwencjach komplementarnych do skrajnych sekwencji dla każdej ze wstawek. Uzyskane sekwencje nukleotydowe analizowano przy pomocy programu BLAST (23). T a b e l a 4 Szczepy i plazmidy Szczep genotyp źródło Lactococcus lactis IL1403 IBB360 IBB477 Bifidobacterium Bifidobacterium pseudocatenulatum M115 Lactobacillus laboratoryjny szczep, bezplazmidowy Szczep o potencjalnych właściwościach autolizujących Szczep o potencjalnych właściwościach adhezyjnych, Tc r Human intestinal isolate; plazmid free (24) J. Bardowski - kolekcja własna IBB PAN J. Życka-Krzesińska - kolekcja własna IBB PAN IPLA Laboratory Collection Lactobacillus plantarum NCFB1193 NCFB Collection Escherichia coli TG1 Plazmid pil253 pil253-_p[ptcb] pgemt-easy * Ery r - oporność na erytromycynę Amp r - oporność na erytromycynę supe Q(hsdm-mcrB)(rk-mk-McrB- )thi Q(lac-oroAB)F [trad36 laciq lacz QM15 proa+b+] Ery r, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Lactococcus Ery r, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Lactococcus, z regulowanym regionem promotorowym genu ptcb Amp R, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Escherichia coli (25) (26) ta praca Promega
9 PL B1 9 Literatura 1. Kwiatkowska-Patzer B, Michalkiewicz J, Zielinska J, Kasarello K, Kurzepa K and Lipkowski A.W Pig spinal cord hydrolyzate ameliorates immunological reaction in experimental allergic encephalomyelitis. Acta Neurobiol Exp. 69: Moingeon P, van Overtvelt L and Razafindratsita A. Międzynarodowy patent nr. WO2006/ Compositions for antigen-specific induction of tolerance. 3. Carnegie PR Amino acid sequence of the encephalitogenic basic protein from human myelin. Biochem. J. 123: Stoffel W, Giersiefen H, Hillen H, Schroeder W and Tunggal B Amino-acid sequence of human and bovine brain myelin proteolipid protein (IipophiIin) is completely conserved. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: Hilton AA, Slavin AJ, Hilton DJ and Bernard CCA Characterization of cdna and genomic clones encoding human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J. Neurochem. 65: Kwiatkowska-Patzer B, Baranowska B, Barcikowska-Litwin M and Lipkowski AW. Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis in the rat by oral administration of spinal cord protein hydrolysate, in: Neuroehemistry (Teelken and Korf, eds), Plenum Press, N. York 1997, pp Libudzisz Z, Walczak P and Bardowski J. (eds.)- Lactic acid bacteria - classification, metabolism, genetics, applications (in polish), monograph. Edition of Technical University of Łodz, Łodz 1998, 2003 and Teusink B and Smid EJ. Modelling strategies for the industrial exploitation of lactic acid bacteria Nat Rev Microbiol. 4: Lin DC Probiotics as functional foods. Nutr Clin Pract. 18: Ouwehand AC, Salminen S and Isolauri E Probiotics: an overview of beneficial effects. Antonie Van Leeuwenhoek. 82: Bermudez-Humaran LG, Cortes-Perez NG, Lefevre F, Guimaraes V, Rabot S, Alcocer- Gonzalez JM, Gratadoux JJ, Rodriguez-Padilla C, Tamez-Guerra RS, Corthier G, Gruss A and Langella PA A novel mucosal vaccine based on live Iactococci expressing E7 antigen and IL-12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J Immunol. 175: Vaughan EE, de Vries MC, Zoetendal EG, Ben-Amor K, Akkermans AD and de Vos WM The intestinal LABs. Antonie Van Leeuwenhoek. 82: Barcellos LF, Oksenberg JR, Begovich AB, Martin ER, Schmidt S, Vittinghoff E, Goodin DS, Pelletier D, Lincoln RR, Bucher P, Swerdlin A, Pericak-Vance MA, Haines JL and Hauser SL. Multiple Sclerosis Genetics Group HLA-DR2 dose effect on susceptibility to multiple sclerosis and influence on disease course. Am. J. Human Gen. 72: Steinman L and Zamvil S Transcriptional analysis of targets in multiple sclerosis. Nature Rev. Immun. 3: Pedotti R, DeVoss JJ, Youssef S, Mitchell D, Wedemeyer J, Madanat R, Garren H, Fontoura P, Tsai M, Galli SJ, Sobel RA and Steinman L Multiple elements of the allergic arm of the immune response modulate autoimmune demyelination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: Anderson AC, Nicholson LB, Legge KL,Turehin V, Zaghnanni H and Kuehroo K High frequency of autoreactive myelin proteolipid protein specific T cell in the perophery of naive mice: mechanism of selection of the self-reactive repertoire. J Exp Med. 6: Costa O, Divoux D, Ischenko A, Tron F, Fontaine M Optimisation of an animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis achieved with a multiple MOG (35-55) peptide in C57BL6/J strain of mice. Journal of Autoimmunity. 20: Zamvil SS, Nelson PA, Mitchell DJ, Knobler RL, Fritz RB and Steinman L Encephalitogenic Tcell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recongnition. J Exp Med. 162: Holo H and Nes IF High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris with glycine in osmotically stabillzed media. Appl. Environ. Microbiol. 55: Alvarez-Martin P, Flórez AB, Margolles A, del Solar G and Mayo B Improved cloning vectors for Bifidobacteria, based on the Bifidobacterium catenulatum pbc1 replicon. 74:
10 10 PL B1 21. Aukrust TW, Brurberg MB and Nes IF Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods Mol Biol. 47: Sambrook J., Fritsche EF and Maniatis T Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 23. Altschul SF, Gis W, Miller W, Myers EW and Lipman DJ Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A and Langella P Two plasmid-determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11, Gibson TJ Studies on the Eppstein-Barr virus genome. Ph.D. Thesis, Cambridge University, Cambridge, England. 26. Simon D and Chopin A Construction of a vector plasmid family for molecular cloning in Streptococcus lactis. Biochimie. 70: Zastrzeżenia patentowe 1. Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, zawierają co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka mielinowego, wybraną z grupy obejmującej: sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP21-40, przedstawioną wzorem 1, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MOG35-55, przedstawioną wzorem 2, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 2a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP85-97, przedstawioną wzorem 3, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 3a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP , przedstawioną wzorem 4, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 4a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP , przedstawioną wzorem 5, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 5a. 2. Sposób wytwarzania genów kodujących wybrane fragmenty peptydowe białek mielinowych przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, znamienny tym, że syntetyzuje się metodą PCR syntetyczne geny kodujące wybrane peptydy, z wykorzystaniem specyficznych dla każdego peptydu 2 komplementarnych starterów ( LONG") przedstawionych w Tabeli 1, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus lactis, przy czym do sekwencji nukleotydowej starterów FLONG" (forward LONG) dla peptydów MBP85-97, PLP oraz PLP wprowadza się sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych, a jednocześnie końce 5' starterów FLONG_peptyd" zawierają dodatkową, typową dla bakterii Lactococcus lactis sekwencję RBS (ang. ribosome-binding site; miejsce wiązania rybosomów), rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencję 'spacer' (sekwencję łącznikową) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem START translacji, przy czym startery LONG" stosuje się jako matrycę, na której techniką PCR przeprowadza się syntezę syntetycznych genów przy użyciu krótkich starterów ( SHORT") homologicznych do 5' końców starterów FLONG_peptyd" i RLONG_peptyd", a końce 5' starterów SHORT" niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie SaII (dla startera forward SHORT) oraz PstI (dla startera reverse SHORT), natomiast końce 5' starterów revs- HORT_peptyd" (reverse SHORT) posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodonowi STOP translacji (TAA), w celu otrzymania fragmentu DNA, w obrębie którego zawarta jest sekwencja syntetycznego genu o wzorze 1, wzorze 2, wzorze 3, wzorze 4 lub wzorze 5, kodującego wybrany fragment peptydowy naturalnego białka mielinowego. 3. Fragmenty DNA, zawierające sekwencje syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mieliny (sekwencje podkreślone), przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, o sekwencjach nukleotydowych przedstawionych wzorem 6, wzorem 7, wzorem 8, wzorem 9 i wzorem Sposób klonowania wytworzonych fragmentów DNA zawierających syntetyczne geny, według zastrz. 1, znamienny tym, że poddaje się je trawieniu enzymami restrykcyjnymi, korzystnie PstI i SalI, a następnie łączy z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza z wektorem pil253, trawionym uprzednio tymi
11 PL B1 11 samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych, w których orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) jest zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze, po czym zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny, po czym zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, np. Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że poddaje się ekspresji syntetyczne geny wybranych fragmentów peptydowych w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus, poprzez ich hodowle na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce M17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5% lub też na mleku, serwatce czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20 C-30 C, preferencyjnie 30 C. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że poddaje się ekspresji syntetyczne geny wybranych fragmentów peptydowych w komórkach szczepów bakterii z gatunku Escherichia coli, poprzez połączenie syntetycznego genu amplifikowanego odpowiednimi starterami 'SHORT' z wektorem, preferencyjnie ze zlinearyzowanym komercyjnym plazmidem pgent-easy lub innym, zdolnym do replikacji w komórkach bakterii gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, przy czym zrekombinowane DNA wprowadza się znaną metodą, korzystnie metodą elektroporacji, do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny, po czym zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako gramujemne szczepy bakteryjne, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się bakterie z gatunku Escherichia coli, zwłaszcza szczep TG1. 9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do optymalizacji biosyntezy peptydów w bakteriach mlekowych stosuje się region promotorowy genu ptcb. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że zastępuje się wewnętrzny konstytutywny promotor na wektorze plazmidowym, replikującym się w komórkach L. lactis, promotorem regulowanym, korzystnie regionem promotorowym genu pochodzącego z genomu bakterii L. lactis lub innego gatunku czy z genomu bakteriofaga, preferencyjnie regionem promotorowym genu ptcb, aangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, regulowanym poprzez obecność w pożywce różnych cukrów, takich jak: celobioza, galaktoza, salicyna, eskulina, glukoza. 11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że hoduje się komórki niosące rekombinowany wektor plazmidowy ze sklonowanym syntetycznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcb z genomu bakterii z rodzaju Lactococcus, na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, zwłaszcza na podłożu zdefiniowanym typu CDM (chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu 0.5%, lub też na mleku, serwatce czy innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach C, preferencyjnie 30 C. 12. Sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcb, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona wzorem 11 przeznaczona do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcb z L. lactis oraz sposób zastąpienia nim wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym,
12 12 PL B1 replikującym się w komórkach L. lactis, znamienny tym, że region promotorowy genu ptcb wytwarza się w reakcji PCR, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. lactis IL1403 oraz pary starterów (ptcbfor i ptcbrev) o sekwencjach komplementarnych do sekwencji DNA okalających region promotorowy chromosomalnego genu oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera ptcbfor) oraz NciI (dla startera ptcbrev). W wyniku reakcji PCR, używając tak zaprojektowanych starterów, otrzymuje się fragment DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 12, w obrębie których zawarta jest sekwencja regionu promotorowego genu ptcb (podkreślona), a następnie tak uzyskany produkt poddaje się działaniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie VspI i NciI, a następnie łączy się go z rekombinowanymi wektorami niosącymi syntetyczne geny, kodujące wybrane peptydy, z których usunięto oryginalny region promotorowy, korzystnie poprzez działanie tych samych restryktaz, a zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność fragmentu DNA o oczekiwanej długości, odpowiadającej długości wybranemu regionowi promotorowemu genu ptcb, następnie zgodność sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją nukleotydową regionu promotorowego genu ptcb potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA. 14. Zastosowanie bakterii zawierających syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1, do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej. 15. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcb, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawionej wzorem 11, według zastrz. 12 do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1.
13 PL B1 13 Rysunki
14 14 PL B1
15 PL B1 15
16 16 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)
Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane
Bardziej szczegółowoWYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP
WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE Ewa Waszkowska ekspert UPRP Źródła informacji w biotechnologii projekt SLING Warszawa, 9-10.12.2010 PLAN WYSTĄPIENIA Umocowania prawne Wynalazki biotechnologiczne Statystyka
Bardziej szczegółowoĆwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================
Bardziej szczegółowoWykorzystanie odpadowego wieprzowego rdzenia krêgowego jako cennego Ÿród³a substancji aktywnych biologicznie
364 POLIMERY 12, 57,nr5 KATARZYNA KURZEPA 1), KAJA KASARE O 2), BO ENA BARANOWSKA 1), ANNA GRABOWSKA 1), WIES AWA WALISIEWICZ-NIEDBALSKA 1), KRZYSZTOF RÓ YCKI 1), BARBARA KWIATKOWSKA-PATZER 2), ANDRZEJ
Bardziej szczegółowoKonstrukcja wektora plazmidowego DNA do klonowania genów i/lub wektora plazmidowego do sekrecji w bakteriach mlekowych
Konstrukcja wektora plazmidowego DNA do klonowania genów i/lub wektora plazmidowego do sekrecji w bakteriach mlekowych Łukasz Tranda Promotor: doc. dr hab. Jacek Bardowski, IBB Promotor: dr hab. Edward
Bardziej szczegółowoĆwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================
Bardziej szczegółowoBiologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia
Bardziej szczegółowoPL 204536 B1. Szczepanik Marian,Kraków,PL Selmaj Krzysztof,Łódź,PL 29.12.2003 BUP 26/03 29.01.2010 WUP 01/10
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204536 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 354698 (22) Data zgłoszenia: 24.06.2002 (51) Int.Cl. A61K 38/38 (2006.01)
Bardziej szczegółowoTechniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne
Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów
Bardziej szczegółowoDrożdżowe systemy ekspresyjne
Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli
Bardziej szczegółowoRok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie
Nazwa modułu: Genetyka molekularna Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3 Wydział: Elektrotechniki, Automatyki, Informatyki i Inżynierii Biomedycznej Kierunek: Inżynieria Biomedyczna
Bardziej szczegółowopaździernika 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II
10 października 2013: Elementarz biologii molekularnej www.bioalgorithms.info Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II Komórka: strukturalna i funkcjonalne jednostka organizmu żywego Jądro komórkowe: chroniona
Bardziej szczegółowoNowoczesne systemy ekspresji genów
Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą
Bardziej szczegółowoKLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY
KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny
Bardziej szczegółowoWybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna
Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu np. w porównaniu z analizą trankryptomu:
Bardziej szczegółowoPrzeciwciała poliklonalne przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób ich wytwarzania. (74) Pełnomocnik:
RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201982 (21) Numer zgłoszenia: 361069 (22) Data zgłoszenia: 03.07.2003 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/40 (2006.01)
Bardziej szczegółowoDefinicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)
Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest
Bardziej szczegółowo1. Bakterie mlekowe LAB wykorzystanie w medycynie Bakterie mlekowe LAB (lactic acid bacteria) grupujące mikroorganizmy należące do różnych rodzajów
1. Bakterie mlekowe LAB wykorzystanie w medycynie Bakterie mlekowe LAB (lactic acid bacteria) grupujące mikroorganizmy należące do różnych rodzajów takich jak np. Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Bardziej szczegółowoOcena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF
Agnieszka Gładysz Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Akademia Medyczna Prof.
Bardziej szczegółowoSYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki
SYLABUS 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Biologia molekularna z elementami inżynierii genetycznej Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej kierunek)
Bardziej szczegółowoAgenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa
dr Bartosz Walter Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna Co może byd wynalazkiem Wynalazek biotechnologiczny Ochrona patentowa Procedura zgłoszenia patentowego Gdzie, kiedy i jak warto patentowad
Bardziej szczegółowoPatentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii
chroń swoje pomysły 3 Kongres Świata Przemysłu Farmaceutycznego Poznań, 16-17 czerwca 2011 Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii dr Izabela Milczarek Czym jest biotechnologia? Biotechnologia,
Bardziej szczegółowo1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13
Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane
Bardziej szczegółowoStymulowanie wzrostu bakterii fermentacji mlekowej przez białka mleka. Waldemar Gustaw
Stymulowanie wzrostu bakterii fermentacji mlekowej przez białka mleka Waldemar Gustaw Stymulowanie wzrostu bakterii fermentacji mlekowej Wzrost zainteresowania prozdrowotnym wpływem bakterii fermentacji
Bardziej szczegółowoInżynieria Genetyczna ćw. 3
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019
Bardziej szczegółowoPytania Egzamin magisterski
Pytania Egzamin magisterski Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG i GUMed 1. Krótko omów jakie informacje powinny być zawarte w typowych rozdziałach publikacji naukowej: Wstęp, Materiały i Metody,
Bardziej szczegółowoBiotechnologia jest dyscypliną nauk technicznych, która wykorzystuje procesy biologiczne na skalę przemysłową. Inaczej są to wszelkie działania na
Biotechnologia jest dyscypliną nauk technicznych, która wykorzystuje procesy biologiczne na skalę przemysłową. Inaczej są to wszelkie działania na żywych organizmach prowadzące do uzyskania konkretnych
Bardziej szczegółowoSYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki
SYLABUS 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Biologia molekularna Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej kierunek) Nazwa jednostki realizującej
Bardziej szczegółowoProbiotyki, prebiotyki i synbiotyki w żywieniu zwierząt
.pl Probiotyki, prebiotyki i synbiotyki w żywieniu zwierząt Autor: dr inż. Barbara Król Data: 2 stycznia 2016 W ostatnich latach obserwuje się wzmożone zainteresowanie probiotykami i prebiotykami zarówno
Bardziej szczegółowoTransformacja pośrednia składa się z trzech etapów:
Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie
Bardziej szczegółowoOlimpiada Biologiczna
Olimpiada Biologiczna Informator narzędzia bioinformatyczne Katarzyna Grudziąż, Takao Ishikawa Warszawa, luty 2019 r. Bioinformatyka to dziedzina nauki łącząca w sobie wiedzę z dziedziny biologii z wykorzystaniem
Bardziej szczegółowoTechniki biologii molekularnej Kod przedmiotu
Techniki biologii molekularnej - opis przedmiotu Informacje ogólne Nazwa przedmiotu Techniki biologii molekularnej Kod przedmiotu 13.9-WB-BMD-TBM-W-S14_pNadGenI2Q8V Wydział Kierunek Wydział Nauk Biologicznych
Bardziej szczegółowoOcena pracy doktorskiej mgr Magdaleny Banaś zatytułowanej: Ochronna rola chemeryny w fizjologii naskórka
Profesor Jacek Otlewski Wrocław, 23 lutego 2015 r. Ocena pracy doktorskiej mgr Magdaleny Banaś zatytułowanej: Ochronna rola chemeryny w fizjologii naskórka Rozprawa doktorska mgr Magdaleny Banaś dotyczy
Bardziej szczegółowoMikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie
Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie DEFINICJA Mikroorganizm (drobnoustrój) to organizm niewidoczny gołym okiem. Pojęcie to nie jest zbyt precyzyjne lecz z pewnością mikroorganizmami są: bakterie,
Bardziej szczegółowoSylabus Biologia molekularna
Sylabus Biologia molekularna 1. Metryczka Nazwa Wydziału Program kształcenia Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Analityka Medyczna, studia jednolite magisterskie, studia stacjonarne
Bardziej szczegółowoPL B1. POLITECHNIKA GDAŃSKA, Gdańsk, PL BUP 22/06. JÓZEF KUR, Wejherowo, PL MARTA WANARSKA, Lębork, PL
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 209469 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374767 (22) Data zgłoszenia: 29.04.2005 (51) Int.Cl. C07H 21/04 (2006.01)
Bardziej szczegółowoMapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej
Mapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej rozdzielczości jest sekwencja nukleotydowa -mapowanie fizyczne genomu
Bardziej szczegółowoPL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego
PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.
Bardziej szczegółowo(12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) 159844 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 273721 ( 2) Data zgłoszenia: 14.07.1988 (51) IntCl.5: C12N 15/51
Bardziej szczegółowoPrezentacja Pracowni Ekologii Drobnoustrojów w Katedry Mikrobiologii UJCM
Prezentacja Pracowni Ekologii Drobnoustrojów w Katedry Mikrobiologii UJCM Informacja o Katedrze Rozwój j naukowy młodej kadry naukowców w w kontekście priorytetów badawczych: W 2009 roku 1 pracownik Katedry
Bardziej szczegółowoProteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych
Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać
Bardziej szczegółowoInwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii
Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych dr Małgorzata Kozłowska Ekspert w UPRP dr Ewa Waszkowska
Bardziej szczegółowoLEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE
LEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE PRODUKT LECZNICZY - DEFINICJA Art. 2 pkt.32 Ustawy - Prawo farmaceutyczne Substancja lub mieszanina substancji, przedstawiana jako posiadająca właściwości: zapobiegania
Bardziej szczegółowoInżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka
Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Kolokwium (14pkt) Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN
Bardziej szczegółowoFOCUS Plus - Silniejsza ryba radzi sobie lepiej w trudnych warunkach
FOCUS Plus - Silniejsza ryba radzi sobie lepiej w trudnych warunkach FOCUS Plus to dodatek dostępny dla standardowych pasz tuczowych BioMaru, dostosowany specjalnie do potrzeb ryb narażonych na trudne
Bardziej szczegółowoMetody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA
Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger
Bardziej szczegółowoSkąd się wzięła biologia syntetyczna? Co to są standardowe części biologiczne?
Skąd się wzięła biologia syntetyczna? Mało kto zdaje sobie sprawę z tego, że termin "biologia syntetyczna" został ukuty w 1974 roku przez polskiego genetyka i biochemika Wacława Szybalskiego. Biologia
Bardziej szczegółowoMetody analizy genomu
Metody analizy genomu 1. Mapowanie restrykcyjne. 2. Sondy do rozpoznawania DNA 3. FISH 4. Odczytanie sekwencji DNA 5. Interpretacja sekwencji DNA genomu 6. Transkryptom 7. Proteom 1. Mapy restrykcyjne
Bardziej szczegółowoSCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie
SCENARIUSZ LEKCJI OPRACOWANY W RAMACH PROJEKTU: INFORMATYKA MÓJ SPOSÓB NA POZNANIE I OPISANIE ŚWIATA. PROGRAM NAUCZANIA INFORMATYKI Z ELEMENTAMI PRZEDMIOTÓW MATEMATYCZNO-PRZYRODNICZYCH Autorzy scenariusza:
Bardziej szczegółowoE.coli Transformer Kit
E.coli Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli. Metoda chemiczna. wersja 1117 6 x 40 transformacji Nr kat. 4020-240 Zestaw zawiera komplet odczynników
Bardziej szczegółowomikrosatelitarne, minisatelitarne i polimorfizm liczby kopii
Zawartość 139371 1. Wstęp zarys historii genetyki, czyli od genetyki klasycznej do genomiki 2. Chromosomy i podziały jądra komórkowego 2.1. Budowa chromosomu 2.2. Barwienie prążkowe chromosomów 2.3. Mitoza
Bardziej szczegółowoMetody inżynierii genetycznej SYLABUS A. Informacje ogólne
Metody inżynierii genetycznej A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Kod Rodzaj Rok studiów /semestr
Bardziej szczegółowoInstrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia
1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału
Bardziej szczegółowoLeki chemiczne a leki biologiczne
Leki chemiczne a leki biologiczne LEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE Produkt syntezy chemicznej Produkt roślinny Produkt immunologiczny BIOLOGICZNE Produkt homeopatyczny Produkt z krwi/osocza - BIOLOGICZNE
Bardziej szczegółowoEkspresja białek w komórkach ssaczych
Ekspresja białek w komórkach ssaczych Ekspresja białek w komórkach ssaczych Używane powszechnie w laboratoriach ssacze linie komórkowe są zmodyfikowane w celu pełnienia roli gospodarza ekspresji białek
Bardziej szczegółowoMaking the impossible possible: the metamorphosis of Polish Biology Olympiad
Making the impossible possible: the metamorphosis of Polish Biology Olympiad Takao Ishikawa Faculty of Biology, University of Warsaw, Poland Performance of Polish students at IBO Gold Silver Bronze Merit
Bardziej szczegółowoInwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii
Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych aspekty praktyczne dr Małgorzata Kozłowska Ekspert
Bardziej szczegółowoTaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925
TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA
Bardziej szczegółowo2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy
Metody analizy DNA 1. Budowa DNA. 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy 3. Klonowanie in vivo a. w bakteriach, wektory plazmidowe b. w fagach, kosmidy c. w drożdżach,
Bardziej szczegółowoEkspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris
Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Drożdże Pichia pastoris należą do drożdży metanolotroficznych tj. zdolnych do wykorzystywania
Bardziej szczegółowoPowodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji
Bardziej szczegółowoTaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R
TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej
Bardziej szczegółowoZasady oceniania rozwiązań zadań 48 Olimpiada Biologiczna Etap centralny
Zasady oceniania rozwiązań zadań 48 Olimpiada Biologiczna Etap centralny Zadanie 1 1 pkt. za prawidłowe podanie typów dla obydwu zwierząt oznaczonych literami A oraz B. A. ramienionogi, B. mięczaki A.
Bardziej szczegółowoBiologia molekularna
Biologia molekularna 1. Metryczka Nazwa Wydziału Program kształcenia Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Analityka Medyczna, studia jednolite magisterskie, studia stacjonarne i niestacjonarne
Bardziej szczegółowoSylabus Biologia molekularna
Sylabus Biologia molekularna 1. Metryczka Nazwa Wydziału Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Program kształcenia Farmacja, jednolite studia magisterskie, forma studiów: stacjonarne
Bardziej szczegółowoPromotor: prof. dr hab. Katarzyna Bogunia-Kubik Promotor pomocniczy: dr inż. Agnieszka Chrobak
INSTYTUT IMMUNOLOGII I TERAPII DOŚWIADCZALNEJ IM. LUDWIKA HIRSZFELDA WE WROCŁAWIU POLSKA AKADEMIA NAUK mgr Milena Iwaszko Rola polimorfizmu receptorów z rodziny CD94/NKG2 oraz cząsteczki HLA-E w patogenezie
Bardziej szczegółowoGlimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących
Narzędzia ułatwiające identyfikację właściwych genów GLIMMER TaxPlot Narzędzia ułatwiające amplifikację tych genów techniki PCR Primer3, Primer3plus PrimerBLAST Reverse Complement Narzędzia ułatwiające
Bardziej szczegółowoKiedy lekarz powinien decydować o wyborze terapii oraz klinicznej ocenie korzyści do ryzyka stosowania leków biologicznych lub biopodobnych?
Kiedy lekarz powinien decydować o wyborze terapii oraz klinicznej ocenie korzyści do ryzyka stosowania leków biologicznych lub biopodobnych? prof. dr hab. med.. Piotr Fiedor Warszawski Uniwersytet Medyczny
Bardziej szczegółowoPL B1. Polska Akademia Nauk, Instytut Biochemii i Biofizyki,Warszawa,PL BUP 18/04
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 200176 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 358904 (22) Data zgłoszenia: 26.02.2003 (51) Int.Cl. C12N 9/14 (2006.01)
Bardziej szczegółowoSYLABUS DOTYCZY CYKLU KSZTAŁCENIA
SYLABUS DOTYCZY CYKLU KSZTAŁCENIA 2015-2021 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Techniki biologii molekularnej Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej
Bardziej szczegółowoInżynieria genetyczna
Inżynieria genetyczna i technologia rekombinowanego DNA Dr n. biol. Urszula Wasik Zakład Biologii Medycznej Inżynieria genetyczna świadoma, celowa, kontrolowana ingerencja w materiał genetyczny organizmów
Bardziej szczegółowoWybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna
Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu w porównaniu z analizą trankryptomu:
Bardziej szczegółowoPersonalizacja leczenia w hematoonkologii dziecięcej
MedTrends 2016 Europejskie Forum Nowoczesnej Ochrony Zdrowia Zabrze, 18-19 marca 2016 r. Personalizacja leczenia w hematoonkologii dziecięcej Prof. dr hab. n. med. Tomasz Szczepański Katedra i Klinika
Bardziej szczegółowoTematyka zajęć z biologii
Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania
Bardziej szczegółowoWPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ
WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ Replikacja organizacja widełek replikacyjnych Transkrypcja i biosynteza białek Operon regulacja ekspresji genów Prowadzący wykład: prof. dr hab. Jarosław Burczyk REPLIKACJA
Bardziej szczegółowoTECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA
DNA 28SRNA 18/16S RNA 5SRNA mrna Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego
Bardziej szczegółowostarszych na półkuli zachodniej. Typową cechą choroby jest heterogenny przebieg
STRESZCZENIE Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) jest najczęstszą białaczką ludzi starszych na półkuli zachodniej. Typową cechą choroby jest heterogenny przebieg kliniczny, zróżnicowane rokowanie. Etiologia
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych
Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego
Bardziej szczegółowoGeny i działania na nich
Metody bioinformatyki Geny i działania na nich prof. dr hab. Jan Mulawka Trzy królestwa w biologii Prokaryota organizmy, których komórki nie zawierają jądra, np. bakterie Eukaryota - organizmy, których
Bardziej szczegółowoWykład 9: HUMAN GENOME PROJECT HUMAN GENOME PROJECT
Wykład 9: Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) odrębność genetyczna, która czyni każdego z nas jednostką unikatową Prof. dr hab. n. med. Małgorzata Milkiewicz Zakład Biologii Medycznej HUMAN GENOME
Bardziej szczegółowoŻYWNOŚĆ WYSOKIEJ JAKOŚCI W ERZE BIOTECHNOLOGII. Partner merytoryczny
ŻYWNOŚĆ WYSOKIEJ JAKOŚCI W ERZE BIOTECHNOLOGII Probiotyki i prebiotyki dodatki do żywności i pasz mgr inż. Agnieszka Chlebicz dr hab. inż. Katarzyna Śliżewska Mikroflora człowieka Mikroflora skóry Mikroflora
Bardziej szczegółowoWymagania edukacyjne z przedmiotu Biologia. Podręcznik Biologia na czasie wyd. Nowa Era, zakres podstawowy Rok szkolny 2013/2014
Wymagania edukacyjne z przedmiotu Biologia. Podręcznik Biologia na czasie wyd. Nowa Era, zakres podstawowy Rok szkolny 2013/2014 Dział programu I. Od genu do cechy Lp. Temat Poziom wymagań dopuszczający
Bardziej szczegółowoZnaczenie Faecalibacterium prausnitzii oraz Akkermansia muciniphila w chorobach zapalnych jelit
Znaczenie Faecalibacterium prausnitzii oraz Akkermansia muciniphila w chorobach zapalnych jelit Daria Rządkowska Naturalne metody wspierające leczenie chorób przewodu pokarmowego w świetle badań klinicznych
Bardziej szczegółowoAnalizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych???
Analizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych??? Alfabet kwasów nukleinowych jest stosunkowo ubogi!!! Dla sekwencji DNA (RNA) stosuje się zasadniczo*
Bardziej szczegółowoProbiotyki w leczeniu nieswoistych zapaleń jelit
Probiotyki w leczeniu nieswoistych zapaleń jelit Hanna SZAJEWSKA Klinika Gastroenterologii i Żywienia Dzieci Akademii Medycznej w Warszawie hania@ipgate.pl Kim jestem? Specjalista chorób dzieci Zainteresowania
Bardziej szczegółowoLaboratorium Pomorskiego Parku Naukowo-Technologicznego Gdynia.
Laboratorium Pomorskiego Parku Naukowo-Technologicznego Gdynia www.ppnt.pl/laboratorium Laboratorium jest częścią modułu biotechnologicznego Pomorskiego Parku Naukowo Technologicznego Gdynia. poprzez:
Bardziej szczegółowoRT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6
RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy
Bardziej szczegółowoPCR - ang. polymerase chain reaction
PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu
Bardziej szczegółowoWymagania edukacyjne Biologia na czasie zakres podstawowy
Wymagania edukacyjne Biologia na czasie zakres podstawowy Dział programu Temat Poziom wymagań konieczny (K) podstawowy (P) rozszerzający (R) dopełniający (D) I. Od genu do cechy Budowa i funkcje kwasów
Bardziej szczegółowoBloki licencjackie i studia magisterskie na Kierunkach: Biotechnologia, specjalność Biotechnologia roślinna oraz Genetyka
Bloki licencjackie i studia magisterskie na Kierunkach: Biotechnologia, specjalność Biotechnologia roślinna oraz Genetyka INSTYTUT BIOLOGII EKSPERYMENTALNEJ W Katedrze Genetyki Ogólnej, Biologii Molekularnej
Bardziej szczegółowoMożliwości współczesnej inżynierii genetycznej w obszarze biotechnologii
Możliwości współczesnej inżynierii genetycznej w obszarze biotechnologii 1. Technologia rekombinowanego DNA jest podstawą uzyskiwania genetycznie zmodyfikowanych organizmów 2. Medycyna i ochrona zdrowia
Bardziej szczegółowoPL B1. Kwasy α-hydroksymetylofosfonowe pochodne 2-azanorbornanu i sposób ich wytwarzania. POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL
PL 223370 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 223370 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 407598 (51) Int.Cl. C07D 471/08 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia:
Bardziej szczegółowoAcademic year: 2012/2013 Code: EIB-2-303-BN-s ECTS credits: 4. Electrical Engineering, Automatics, Computer Science and Engineering in Biomedicine
Module name: Genetyka molekularna Academic year: 2012/2013 Code: EIB-2-303-BN-s ECTS credits: 4 Faculty of: Electrical Engineering, Automatics, Computer Science and Engineering in Biomedicine Field of
Bardziej szczegółowoZastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych
Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych Wstęp teoretyczny Technika RAPD (ang. Random Amplification of Polymorphic DNA) opiera się na prostej reakcji PCR, przeprowadzanej na genomowym
Bardziej szczegółowoRecenzja pracy doktorskiej Mgr Natalii Sawki. gatunków zespołu Paramecium aurelia
NENCKI INSTITUTE OF EXPERIMENTAL BIOLOGY POLISH ACADEMY OF SCIENCES 3, Pasteur Str, 02-093 Warsaw, Poland Phone: (48-22) 5892357; Fax: (48-22) 822 53 42 Recenzja pracy doktorskiej Mgr Natalii Sawki pt.
Bardziej szczegółowoPromotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. Jacek Bardowski Promotor pomocniczy: dr Urszula Zielenkiewicz
prof. dr hab. Dariusz Bartosik Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Uniwersytet Warszawski Miecznikowa 1 02-096 Warszawa Warszawa, 25.07.2014 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Iwony Brzozowskiej
Bardziej szczegółowoPL B1. POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL BUP 11/12
PL 220965 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 220965 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 392895 (22) Data zgłoszenia: 08.11.2010 (51) Int.Cl.
Bardziej szczegółowoHybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych
Bardziej szczegółowoZDROWE JELITA NOWE SPOSOBY PROFILAKTYKI. Poradnik dla pacjenta o diagnozowaniu i leczeniu chorób jelit
ZDROWE JELITA NOWE SPOSOBY PROFILAKTYKI Poradnik dla pacjenta o diagnozowaniu i leczeniu chorób jelit W przypadku choroby nasze jelita mają niewiele możliwości zwrócenia na siebie naszej uwagi. Typowe
Bardziej szczegółowo