(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/38 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 4/06 (06.01) C07K 14/70 (06.01) A61K 38/00 (06.01) C07K 14/2 (06.01) C12N 1/62 (06.01) C12N 1/63 (06.01) A61K 38/19 (06.01) C07K 16/40 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Rekombinowane polipeptydy członków rodziny ligandów TNF i ich zastosowanie () Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/49 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/03 (73) Uprawniony z patentu: Universität Stuttgart, Stuttgart, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 KLAUS PFIZENMAIER, Tiefenbronn, DE PETER SCHEURICH, Stuttgart, DE INGO GRUNWALD, Bremen, DE ANJA KRIPPNER-HEIDENREICH, Stuttgart, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 17/P33787PL00 EP Opis 1 2 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu do pozaustrojowej manipulacji, deplecji i/lub usuwania zawartych w płynach ustrojowych składników, np. przy pomocy aferezy. [0002] W przypadku członków rodziny ligandów TNF chodzi o cytokiny prozapalne. Cytokiny ogólnie i zwłaszcza członkowie rodziny ligandów TNF odgrywają ważną rolę przy stymulacji i koordynacji wrodzonego układu immunologicznego oraz humoralnej (angażującej przeciwciała) odpowiedzi immunologicznej, wywoływaniu apoptozy, budowaniu kości, wykształceniu się zalążków dla wzrostu włosów, wzrostu zębów i rozwoju gruczołów potowych, zalążków węzłów limfatycznych i wielu innych (Aggarwal, B.B. (03), Nat. Rev. Immunol. 3, 74-76). Błędna regulacja członków rodziny ligandów TNF może z kolei prowadzić do licznych stanów patologicznych. Należy do nich np. wstrząs septyczny, choroby autoimmunologiczne, jak reumatoidalne zapalanie stawów, lub choroby neurodegeneracyjne. Czynnik martwicy nowotworu (TNF) jest tytułowym i zapewne najważniejszym członkiem tej dużej rodziny cytokin. [0003] Członkowie rodziny ligandów TNF swoje działanie wywierają w swojej formie biologicznie aktywnej, jako homotrimery (Banner, D.W. i wsp., (1993) Cell 73, ). Struktury trimerowe oraz również agregaty wyższego rzędu białek (np. oligomery lub multimetry trimerów) występują licznie w naturze. Przykładami są białko macierzy chrząstki (ang. Cartilage Matrix Protein, CMP), białko tkanki łącznej (Beck i wsp. (1996), J Mol Biol 26, ), białka z

3 3 1 2 rodziny kolagenów, takie jak rodzina Clq, do której należy Clq, kolagen α1 (X), α2 (VII), białko hibernacyjne, ACRP, białko strukturalne ucha wewnętrznego, cellebryna i multimeryna (Kishore i Reid, (1999), Immunopharmacol. 42, 1-21), oraz białka rodziny kolektyn, takie jak białka surfaktanta płucnego (ang. Lung Surfactant Protein A, SP-A) oraz białko wiążące mannozę (MBP) (Epstein i wsp.. (1996), Current Opinion in Immunology, Vol 8 Nr 1, 29-3). [0004] Składanie białek do trimeru następuje na powierzchniach tych białek trimeryzujących w roztworze wskutek wzajemnych oddziaływań, takich jak oddziaływania hydrofobowe, wiązania w postaci mostków wodorowych, wiązania kowalencyjne (np. mostki disiarczkowe), i/lub sił kulombowskich, lecz również wskutek motywów strukturalnych, tzn. charakterystycznych sekwencji aminokwasów, które powodują formowanie się międzycząsteczkowych struktur naddrugorzędowych. W przypadku członków rodziny ligandów TNF trzy monomery w strukturze homotrimerowej utrzymywane są razem niekowalencyjnie przez wiązania hydrofobowe. W swojej formie aktywnej aktywują one z kolei odpowiadających im członków rodziny receptorów TNF, które jako takie nie mają aktywności enzymatycznej. Przykładowo TNF jako członek rodziny ligandów TNF wiąże się do dwóch receptorów błonowych TNFR1 i TNFR2, i pośredniczy w trimeryzacji względnie aktywacji już występujących w postaci trimerów, ale nieaktywnych sygnałowo, receptorów. Przez utworzenie się kompleksu receptorów uruchamiana jest kaskada sygnałowa, z którą m.in. związana jest asocjacja cytoplazmatycznych białek adaptorowych (Wajant, H. i wsp. (03), Cell Death, Differ,, 4-6). Trimerowa struktura TNFR1 i TNFR2 wygląda tak, że receptory każdorazowo wiążą się w przestrzeni pośredniej między dwoma z trzech

4 4 1 2 monomerów TNF homotrimerów TNF (Banner i wsp. (1993) supra). Z tego staje się jasne, że zarówno TNF, jak i inni członkowie rodziny ligandów TNF są biologicznie aktywni tylko w swojej strukturze jako homotrimery. [000] Ze względu na swoją funkcję członkowie rodziny ligandów TNF względnie ich receptory błonowe mogą być różnorodnie stosowani do leczenia licznych chorób, takich jak choroby infekcyjne i zapalne, choroby metaboliczne, choroby u podłoża których leży błędna regulacja apoptozy, choroby neurodegeneracyjne i wiele innych chorób. Szczególnie ważną rolę odgrywa ich zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych, ponieważ w przypadku członków rodziny ligandów TNF chodzi ogólnie o substancje działające przeciwnowotworowo. W szczególności należy w tym kontekście wspomnieć o samym TNF (Eggermont, A.M. i ten Hagen, T.L. (03), Curr. Oncol. Rep., 79-80), TRAIL (TNF releated apoptoses inducing ligand), zwanym również Apo 2L (Weley i wsp.. (199), Immunity 6: ; Petti i wsp. (1996) J Biol Chem 271: ) oraz FasL. Badania in vivo wykazały jednak silne układowe działania uboczne w przypadku TNF i agonistów receptora Fas, a badania in vitro wskazują na podobne działanie toksyczne określonych preparatów TRAIL (Jo i wsp.. (00) Nat Med 6: 64-67, Ichikawa i wsp. (01) Nat Med 7: ; Ogasawara i wsp.. (1993) Nature 364: ). Przykładowo agonistyczne przeciwciała przeciw Fas, receptorowi FasL, wykazują działanie skrajnie hepatotoksyczne (Ogasawara i wsp.. (1993) supra). Dlatego w przypadku aktywujących Fas ligandów/agonistów wykluczano dotychczas zastosowanie kliniczne ze względów bezpieczeństwa. Wskutek dużego znaczenia TNF, TRAIL, FasL i innych członków rodziny ligandów TNF w tym obszarze oraz występujących wraz z ich

5 1 2 zastosowaniem w postaci klinicznego podania układowego działań ubocznych podjęto jednak kilka prób, aby zminimalizować te działania uboczne. (Eggermont, A.M. and ten Hagen, T.L. (03), Curr. OncoL Rep., 79-80). [0006] Tak więc przykładowo w WO 02/22680 opisano białka fuzyjne, które umożliwiają ukierunkowane i specyficzne względem tkanki względnie komórek działanie cytokin przez fuzję cytokiny z przeciwciałem wiążącym antygen. W ten sposób osiąga się to, że cytokiny nie oddziałują na tkankę względnie komórki, które nie mają kontaktu z tymi białkami fuzyjnymi, oraz to że działania uboczne są względem tych tkanek lub komórek zmniejszane. [0007] W w DE jest ujawniony system niezależny od przeciwciał, który również umożliwia ukierunkowane i specyficzne względem tkanki względnie komórek działanie cytokin. Chodzi w tym przypadku o białka fuzyjne, w których aktywacja zawartego w nich odcinka białka z funkcją biologiczną następuje przez jego związanie z domeną wiążącą cząsteczki powierzchni komórki, która stanowi kolejny odcinek białka fuzyjnego. Prócz zmniejszenia działań ubocznych na tkankę niebędącą tkanką docelową system ten może być korzystnie zastosowany również w przypadku cząsteczek powierzchni komórki na komórkach docelowych, dla których nie istnieją przeciwciała względnie istnieją przeciwciała ze zbyt małą swoistością. [0008] Oprócz wspomnianych działań ubocznych jest jednak również bardzo problematyczny fakt, że aktywne homotrimery członków rodziny ligandów TNF w rozcieńczeniach, i oznacza to również przy fizjologicznie sensownych stężeniach, ulegają dysocjacji. Ta dysocjacja jest co prawda zasadniczo odwracalna, jednakże białko traci szybko swoją bioaktywność, ponieważ ulega denaturacji. Przyjmuje się, że

6 6 1 2 denaturacja ta następuje przez etap niestabilnych monomerów (Smith, R.A. and Baglioni, C. (1987), J. Biol. Chem. 262, ; Narhi, L.O. i Arakawa, T. (1987), Biochem. Biophys. Res. Commun 147, ). [0009] Wskutek odpowiednich obserwacji w przypadku TRAIL, który wykazuje szczególną niestabilność, próbowano uzyskać stabilność białka przez przyłączenie suwaka leucynowego jako modułu trimeryzacji (Cha, S.S. i wsp.., (1999), Immunity. 11, ). W stanie naturalnym TRAIL jest stabilizowany przez jon cynku, który znajduje się w centrum trimerowego ligandu, i który jest koordynowany przez reszty cysteinowe (Hymowitz, S.G. i wsp.. (00), Biochemistry 39, ). W tym przypadku może być jednak niekorzystne, że przez przyłączenie suwaka leucynowego osiągana jest nie tylko zwiększona stabilność, jednak również mogą zostać zakłócone inne właściwości, np. właściwości strukturalne, takie jak zmiany struktury, poziomu aktywności lub właściwości fizjologiczne. [00] W WO 01/37873 przedstawiony jest sposób leczenia chorób, które cechują się produkcją rozpuszczalnych cząsteczek receptorów cytokin, np. rozpuszczalnych receptorów czynnika martwicy nowotworu (stnfr). Choroby obejmują wiele typów raka i określone dalsze choroby, takie jak infekcje HIV. Przy tym w korzystnej postaci wykonania krew pacjenta jest przeprowadzana przez kolumnę, na której unieruchomione są przeciwciała, które wiążą się z cząsteczkami stnfr i je usuwają, a następnie krew odprowadzana jest z powrotem do pacjenta. Proces ten może być przeprowadzony sam lub w połączeniu z innymi formami terapii. [0011] W WO 01/43770 przestawiony jest sposób wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u ssaka, który ułatwia usuwanie

7 7 1 2 przewlekłego stanu chorobowego. Sposób obejmuje usuwanie inhibitorów układu immunologicznego z krwiobiegu ssaka i pozwala przez to na silniejszą odpowiedź immunologiczną na patogen. Usuwanie inhibitorów układu immunologicznego osiągane jest w ten sposób, że wolny od komórek składnik krwi, lub jej frakcja, jest kontaktowany z jednym lub kilkoma partnerami wiązania, które są w stanie związać się z inhibitorami i dzięki temu usunąć je z płynów biologicznych. Szczególnie przydatna w wykonaniu sposobu jest absorbująca matryca, która składa się z obojętnej, biokompatybilnej substancji, która jest związana kowalencyjnie z partnerem wiązania, np. z przeciwciałem, które jest w stanie wiązać się specyficznie z pożądanymi inhibitorami. [0012] W publikacji międzynarodowej WO 99/68 ujawniany jest sposób leczenia raka z zastosowaniem ultra-aferezy, który został polepszony, aby usuwać związki o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1000 Daltonów. Po tym następuje podanie cieczy zastępczej, aby stymulować układ immunologiczny pacjenta, aby atakował guzy lite. W korzystnej postaci wykonania ultra-afereza przeprowadzana jest u pacjenta z zastosowaniem ultrafiltra z rurek kapilarnych o rozmiarze porów 0,02-0,0 mm i z odcięciem masy cząsteczkowej 1000 Daltonów. Korzystną cieczą wymienną jest osocze poddane obróbce w ultra-aferezie. [0013] Istnieje stąd zapotrzebowanie, aby zwiększyć stabilność aktywnych cytokin, w szczególności członków rodziny ligandów TNF, bez negatywnego wpływu na ich naturalne właściwości przez zmianę ich struktury, oraz bez wykazywania przez nie silnych cytotoksycznych lub innych działań ubocznych przy zastosowaniach terapeutycznych. [0014] Podstawą niniejszego wynalazku jest przekonanie, że

8 8 1 2 występujący naturalnie, rozpuszczalni, będący cytokinami członkowie rodziny ligandów TNF wykazują swoją pełną bioaktywność jedynie jako homotrimery, ale z drugiej strony mają tendencję do ulegania denaturacji przez dysocjację na swoje monomery. [001] Dlatego tę dysocjację homotrimerów na monomery należy powstrzymać. Zostało to osiągnięte przez to, że co najmniej trzy monomery członka rodziny ligandów TNF, zwłaszcza TNF, są przez swoje końce C i N połączone ze sobą przy pomocy krótkich łączników peptydowych z utworzeniem cząsteczki jednołańcuchowej (ang. single chain, poniżej "sc"), zwłaszcza sctnf. Zgodnie z tym cała cząsteczka (co najmniej trzy monomery członka rodziny ligandów TNF z dwoma łącznikami peptydowymi) składa się z jednego łańcucha białkowego, tak że nie może już nastąpić dysocjacja na monomery. Stwierdzono, że takie cząsteczki w porównaniu do odpowiadających im rozpuszczalnych członków rodziny ligandów TNF typu dzikiego wykazują tylko bardzo niewielki ubytek swojej bioaktywności. Przeciwnie, wykazano nie tylko, że polipeptydy mają takie same (jakościowe) aktywności jak odpowiadający im rozpuszczalny członek rodziny ligandów TNF typu dzikiego, lecz również, że z powodu swojej znacznie większej stabilności wykazują bioaktywności jeszcze w chwili, gdy rozpuszczalny członek rodziny ligandów TNF typu dzikiego utracił już swoją aktywność, tzn. uległ dysocjacji względnie denaturacji, (w tym zakresie odsyła się do opisanych poniżej różnych testów stabilności, które są opisywane w przykładach oraz na Figurach). [0016] Pod pojęciem rozpuszczalnego członka rodziny ligandów TNF typu dzikiego rozumie się rozpuszczalny pozakomórkowy odcinek związanego z błoną członka rodziny

9 9 1 2 ligandów TNF. Do pojęcia "rozpuszczalny typ dziki" stosowane są poniżej zamiennie określenia "typ dziki", "wt", "rozpuszczalny" i "s" (czyli ang. "soluble). W szczególności może chodzić o rozpuszczalny TNF typu dzikiego (jako członka rodziny ligandów TNF), dla którego stosowane są odpowiednio poniżej określenia będące synonimami "TNF typu dzikiego", "wttnf", rozpuszczalny TNF i "stnf". [0017] Komponent A w sensie wynalazku jest monomerem TNF lub jego fragmentem funkcjonalnym lub jego wariantem funkcjonalnym. Pod pojęciem monomer należy rozumieć najmniejszą jednostkę białkową lub polipeptydową, która może zostać oddzielona od oligomerowego białka bez zrywania wiązań kowalencyjnych. [0018] Polipeptyd lub komponent A lub jego fragment lub jego wariant są w sensie wynalazku funkcjonalne, o ile wykazują swoją aktywność biologiczną względnie funkcję, w szczególności swoją właściwość do wiązania się z partnerem interakcji, np. receptorem związanym z błoną, oraz również swoją właściwość trimeryzacji. W przypadku funkcjonalnych fragmentów i funkcjonalnych wariantów według wynalazku te biologiczne funkcje mogą być co prawda zmienione, np. odnośnie swojej specyficzności lub selektywności, jednak zasadnicza funkcja biologiczna jest zachowywana. [0019] W stanie techniki znane są liczne sposoby pomiaru aktywności biologicznej białka, polipeptydu względnie cząsteczki, np. testy białkowe, które wykorzystują znakowane substraty, analizy substratów sposobami chromatograficznymi, jak chromatografia HPLC lub chromatografia cienkowarstwowa, sposoby spektrofotometryczne itd. (patrz np. Maniatis i wsp. (01) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour

10 1 2 Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY). [00] Pod pojęciem fragmentu w sensie wynalazku należy rozumieć zarówno fragment monomeru członka rodziny ligandów TNF, jak również fragment polipeptydu względnie białka według niniejszego wynalazku. Może chodzić przy tym o skrócone N-terminalnie, C-terminalnie lub wewnątrzesekwencyjnie sekwencje aminokwasowe monomeru, polipeptydu względnie białka. W szczególności w przypadku wewnątrzsekwencyjnych skróceń polipeptydu względnie białka może chodzić o skrócenia sekwencji jednego lub kilku z trzech monomerów, które z kolei mogą występować N- terminalnie, C-terminalnie lub wewnątrzsekwencyjnie. [0021] W szczególnie korzystnej postaci wykonania wynalazku fragment monomeru stanowi jego domenę pozakomórkową, która odpowiada całej domenie pozakomórkowej rozpuszczalnego członka rodziny ligandów TNF typu dzikiego lub jej odcinkowi. W szczególności fragment monomeru stanowi jego domenę pozakomórkową, która albo odpowiada rozpuszczalnemu TNF typu dzikiego (aminokwasy ) lub całej domenie pozakomórkowej (aminokwasy 3-233). [0022] Wytwarzanie takich fragmentów jest dobrze znane w stanie techniki i może przez znawcę zostać przeprowadzone z zastosowaniem sposobów standardowych (patrz np. Maniatis i wsp. (01), Molecular cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). W ogólności wytwarzanie fragmentów monomerów, polipeptydów względnie białek może być realizowane przez modyfikowanie sekwencji DNA, która koduje natywny monomer, polipeptyd względnie białko, po czym następuje transformacja tej sekwencji DNA do odpowiedniego gospodarza oraz ekspresja tej zmodyfikowanej sekwencji DNA, przy założeniu, że modyfikacja DNA nie niszczy aktywności funkcjonalnych monomeru, polipeptydu

11 względnie białka. [0023] Identyfikacja fragmentu może następować albo przez sprawdzenie jego funkcjonalności przez pomiar aktywności biologicznej, tak jak opisano powyżej, lub też na podstawie sekwencjonowania fragmentu i następującego później porównania otrzymanej sekwencji z natywną sekwencją. Sekwencjonowanie może nastąpić na podstawie standardowych sposobów, które są liczne i dobrze znane w stanie techniki. [0024] Jako warianty aktywnych biologicznie monomerów, polipeptydów względnie białek lub ich fragmentów lub komponentu A określane są w szczególności takie monomery, polipeptydy względnie białka lub ich fragmenty, które mają różnice sekwencji względem odpowiednich sekwencji natywnych. W przypadku tych odchyleń sekwencji może chodzić o jedną lub kilka insercji, delecji i/lub substytucji aminokwasów, przy czym występuje homologia sekwencji co najmniej 60%, korzystnie 70%, jeszcze korzystniej 80%, jeszcze korzystnej 8%, jeszcze bardziej korzystnie 90% i najkorzystniej 97%. [002] W celu określenia procentowej identyczności dwóch sekwencji kwasu nukleinowego lub aminokwasów, sekwencje można ze sobą przyrównać, a następnie porównać je ze sobą. W tym celu mogą zostać wprowadzone np. przerwy w sekwencji pierwszej sekwencji aminokwasów względnie kwasu nukleinowego oraz mogą zostać porównane aminokwasy względnie nukleotydy na odpowiedniej pozycji drugiej sekwencji aminokwasów względnie kwasu nukleinowego. Gdy pozycja w pierwszej sekwencji jest zajęta tym samym aminokwasem względnie tym samym nukleotydem, jak ma to miejsce w pozycji drugiej sekwencji, to obydwie sekwencje są w tej pozycji identyczne. Identyczność procentowa dwóch sekwencji jest funkcją identycznych pozycji podzielonych

12 przez sekwencje. [0026] Określenie procentowej identyczności dwóch sekwencji może zostać przeprowadzone na podstawie algorytmu matematycznego. Korzystnym, jednakże nieograniczającym, przykładem algorytmu matematycznego, który może zostać wykorzystany do porównania dwóch sekwencji, jest algorytm Karlina i wsp.. (1993), PNAS USA, 90: Taki algorytm jest włączony do programu NBLAST, przy pomocy którego mogą być identyfikowane sekwencje, które mają pożądaną identyczność względem sekwencji według niniejszego wynalazku. Aby uzyskać przyrównanie z przerwami (zwane również "gapped alignment"), jak opisano powyżej, może być użyty program "Gapped BLAST", tak jak opisano w Altschul i wsp.. (1997), Nucleic Acids Res, 2: [0027] Aktywne biologiczne, a więc funkcjonalne warianty monomerów, polipeptydów względnie białek lub ich fragmentów, mogą korzystnie mieć właściwości selektywnego wiązania receptorów, przy czym wariant może być zoptymalizowany np. odnośnie specyficznej bioaktywności lub innych właściwości, w szczególności swojej stabilności. [0028] Pod pojęciem warianty mieszczą się w szczególności takie sekwencje aminokwasowe, które wykazują względem sekwencji fizjologicznych konserwatywną substytucję. Jako substytucje konserwatywne określane są takie substytucje, w których aminokwasy wymieniane są między sobą, i które pochodzą z tej samej klasy. W szczególności istnieją aminokwasy z alifatycznymi łańcuchami bocznymi, naładowanymi dodatnio lub ujemnie łańcuchami bocznymi, grupami aromatycznymi w łańcuchach bocznych lub aminokwasy, których łańcuchy boczne mogą tworzyć mostki wodorowe, np. łańcuchy boczne, które posiadają grupę hydroksylową. Oznacza to, że np. aminokwas z polarnym łańcuchem bocznym

13 jest zastępowany przez inny aminokwas również z polarnym łańcuchem bocznym lub przykładowo charakteryzujący się hydrofobowym łańcuchem bocznym aminokwas jest podstawiany przez inny aminokwas również z hydrofobowym łańcuchem bocznym (np. seryna (treonina) przez treoninę (serynę) względnie leucyna (izoleucyna) przez izoleucynę (leucynę)). Insercje i substytucje są możliwe w szczególności w takich pozycjach sekwencji, które nie wywołują zmiany struktury trójwymiarowej lub dotyczą obszaru wiązania. Zmiana struktury trójwymiarowej przez insercję (insercje) lub delecję (delecje) może być łatwo sprawdzona przy pomocy widm CD (widma dichroizmu kołowego) (Urry, 198, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modem Physical Methods in Biochemistry, Neuberger i wsp. (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam). [0029] Odpowiednie sposoby wytwarzania wariantów, np. monomerów, polipeptydów względnie białek lub ich fragmentów z sekwencjami aminokwasów, które mają względem natywnych sekwencji substytucje, są ujawnione np. w US 4,737,462, US 4,88,8, US 4,99,314, US,116,943, US 4,879,111 i US,017,691. Wytwarzanie wariantów jest ogólnie również opisane w szczególności przez Maniatis i wsp., (01), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Kodony mogą być przy tym opuszczane, uzupełniane lub wymieniane. Warianty mogą być w szczególności również takim białkami lub polipeptydami, które są stabilizowane, aby uniknąć degradacji fizjologicznej, np. przez stabilizację szkieletu białkowego przez podstawienie wiązania typu amidowego, np. również przez zastosowanie ß-aminokwasów. [00] Warianty mogą być również wytwarzane poprzez wprowadzanie zmian w kwasach nukleinowych, które kodują

14 warianty, np. insercji, delecji i/lub substytucji jednego lub kilku nukleotydów. W stanie techniki są znane liczne sposoby do takich zmian sekwencji kwasu nukleinowego. Jedną z najczęściej stosowanych technik jest kierowana przez oligonukleotydy mutageneza specyficzna względem miejsca (patrz Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, , Ausubel F. i wsp., Wyd. 1991). W technice tej syntetyzowany jest oligonukleotyd, którego sekwencja ma określoną mutację. Ten oligonukleotyd jest wtedy poddawany hybrydyzacji z matrycą, która zawiera sekwencję kwasu nukleinowego typu dzikiego. Korzystnie w tej technice stosowana jest matryca jednoniciowa. Po hybrydyzacji oligonukleotydu i matrycy (annealing), stosowana jest zależna od DNA polimeraza DNA, aby syntetyzować drugą nić oligonukleotydu, która jest komplementarna względem nici DNA matrycy. W rezultacie uzyskiwana jest cząsteczka hetero-dupleksowa, która ma błędne sparowanie, która powstaje przez wspomnianą wyżej mutację w oligonukleotydzie. Sekwencja oligonukleotydowa wprowadzana jest w odpowiedni plazmid, ten wprowadzany jest do komórki gospodarza i w tej komórce gospodarza DNA oligonukleotydu poddawany jest replikacji. Tą techniką uzyskuje się sekwencje kwasu nukleinowego z celowymi zmianami (mutacjami), które mogą zostać zastosowane do wytwarzania wariantów według wynalazku. [0031] Komponenty A objęte przez polipeptyd mogą być identyczne lub różne. Przykładowo, polipeptyd może zawierać 4,, 6 lub więcej komponentów A, które tworzą tetramer, pentametr, heksametr itd. Również szczególnie korzystnie polipeptyd zawiera całkowitą wielokrotność trimeru komponentu A, tak jak go opisano wcześniej, np. dwa, trzy, cztery lub więcej ustawionych jeden po drugim trimerów.

15 1 1 2 Zawarte w polipeptydach komponenty A mogą być oddzielone od siebie przez łączniki (patrz poniżej). Gdy są przy tym, tak jak opisano powyżej, umieszczone jeden za drugim dwa, trzy cztery lub więcej trimerów komponentów A, to łączniki, które łączą różne trimery ze sobą, mogą być ewentualnie dłuższe, niż łączniki, które łączą ze sobą komponenty A w pojedynczym trimerze. [0032] Komponenty A mogą pochodzić z tego samego organizmu lub z różnych organizmów. Może chodzić przy tym o kręgowce, zwłaszcza o ssaki, przykładowo o mysz, szczura, świnię i przede wszystkim o człowieka. [0033] Według wynalazku w przypadku komponentów A polipeptydu chodzi każdorazowo o monomer lub fragment funkcjonalny lub wariant funkcjonalny TNF (czynnik martwicy nowotworu, GenBank nr dostępu NM_00094). [0034] W szczególnie korzystnej postaci wykonania w przypadku zdefiniowanego jak powyżej komponentu A polipeptydu chodzi o monomer TNF, który jest odporny na enzym przekształcający TACE. TACE jest członkiem rodziny proteaz ADAM i stanowi fizjologiczny, specyficzny wobec TNF enzym przekształcający TNF występujący naturalnie w błonie komórkowej. TNF jest zazwyczaj odcinany od błony komórkowej i uwalniany do otoczenia. Komponentowi A według wynalazku, odpornemu na TACE, brakuje korzystnie miejsca cięcia Ala- Val (np. AA przy sctnf według nomenklatury SWISSPROT dla ludzkiego TNF, nr PO137). Miejsce cięcia może być przy tym według wynalazku usunięte przez delecję jednego lub obu istotnych aminokwasów Ala lub Val. Alternatywnie lub dodatkowo według wynalazku może zostać całkowicie lub częściowo poddana delecji sekwencja rozpoznawania dla TACE (np. AA w sctnf według nomenklatury SWISSPROT dla ludzkiego TNF, nr PO137). Następuje to korzystnie przez

16 delecję dwóch, trzech, czterech lub większej liczby aminokwasów, np. wszystkich aminokwasów sekwencji rozpoznawania TACE. W przypadku sctnf sekwencja odporna na TACE znajduje się przykładowo w obszarze aminokwasów (AA ) sctnf według nomenklatury SWISSPROT dla ludzkiego TNF, nr PO137. Taka delecja w komponencie A zapobiega potencjalnemu odcinaniu komponentu przez TACE, np. sctnf, blisko miejsc łączenia komponentów A w obszarze łączników (komponent B, patrz poniżej), i zwiększa tym samym stabilność polipeptydów in vivo. Powstające ewentualnie przez delecję odpowiednie skrócenie sekwencji może być kompensowane przez odpowiednie wydłużenie łączników. Opisana przykładowo dla sctnf delecja sekwencji komponentu A może zostać zastosowana do każdego z wyżej wymienionych komponentów. Gdyby sekwencja TACE miała nie być usuwana lub miałaby zostać usunięta tylko częściowo, to korzystnie zwraca się uwagę na to, żeby przy zastosowaniu dodatkowych komponentów B lub C (patrz poniżej) w polipeptydzie według wynalazku nie została odtworzona sekwencja rozpoznawania TACE oraz miejsce cięcia TACE. [003] W kolejnej szczególnie korzystnej postaci takie jak zdefiniowane powyżej komponenty A polipeptydu wynalazku zmodyfikowane są tak, żeby polipeptydy według wynalazku mogły ulegać kowalencyjnie sprzęganiu do powierzchni. To sprzęganie następuje korzystnie do płaskich powierzchni lub do cząstek sferycznych, jak np. do kulek magnetycznych ( magnetbeads ), lub do nanocząstek/mikrocząstek, korzystnie jako mimetyczny względem komórek, terapeutyczny reagent z właściwościami podobnymi do właściwości TNF związanego z błoną. W celu sprzęgania do N-końcowego obszaru co najmniej jednego komponentu A polipeptydu wprowadzana jest grupa sprzęgająca, korzystnie grupa SH

17 reszty cysteinowej (Dalsze korzystne według wynalazku grupy sprzęgające opisane są poniżej). Może to nastąpić szczególnie korzystnie przez wprowadzenie reszty cysteinowej w postaci addycji i/lub substytucji w pożądanej pozycji. Grupa sprzęgająca może znajdować się w dowolnej pozycji N-końcowego obszaru komponentu A, korzystnie blisko końca N. Szczególnie korzystnie grupa sprzęgająca znajduje się w obszarze pierwszych 1-1, i jeszcze korzystniej w obszarze pierwszych 1- N-końcowych aminokwasów. Przykładowo modyfikacja w przypadku poddawanego prokariotycznej ekspresji sctnf może zostać wprowadzona po początkowej metioninie (pozycja 2) sekwencji aminokwasowej, lub w poddawanym eukariotycznej ekspresji sctnf bezpośrednio za odcinaną sekwencją sygnałową, które stanowią więc N-końcowe aminokwasy komponentu A. Alternatywnie w stosowanym według wynalazku znaczniku, np. znaczniku His, znaczniku Flag (patrz np. Figura 18) według wynalazku, wprowadzana jest grupa sprzęgająca, np. skutkująca znacznikiem CysHis z cysteiną w pozycji 9 aminokwasu. Kolejna alternatywa obejmuje wprowadzenie grupy sprzęgającej w jeden względnie obydwa komponenty B (łączniki) polipeptydu. [0036] Korzystnie, w polipeptydzie jedynie zlokalizowany przy N-końcu komponent A względnie znacznik położony dalej w kierunku N-końca jest zaopatrywany/modyfikowany grupą sprzęgającą jak opisano powyżej. W kolejnej postaci wykonania w przypadku polipeptydu, który zawiera 3 komponenty A, przykładowo 2 lub 3 z komponentów A modyfikowane są każdorazowo jedną grupą sprzęgającą, tak że cała cząsteczka (polipeptyd według wynalazku) może być przez dwa względnie 3 wiązania kowalencyjne sprzęgana z odpowiednią do tego matrycą. Sprzęganie polipeptydu przez

18 jedną lub kilka grup sprzęgających wszystkich komponentów A polipeptydu korzystnie nie wpływa negatywnie na funkcję pojedynczych komponentów A należących do TNF, lecz umożliwia raczej polepszenie unieruchomienia sctnf na powierzchniach i/lub cząstkach. Tak jak wcześniej wyjaśniono, każdy z polipeptydów według wynalazku korzystnie zawiera konieczne dla funkcji biologicznej podjednostki (komponenty A) w rozmieszczeniu istotnym pod względem funkcjonalnym. Przez sprzęganie polipeptydu do powierzchni/cząstki według wynalazku możliwe jest utworzenie powierzchni względnie cząstki ze sprzęgniętymi np. homo- lub heterotrimerami względnie multimerami TNF. Na tych powierzchniach/cząstkach sprzężone homotrimery lub heterotrimery względnie multimetry TNF są unieruchamiane w sposób stabilny i bioaktywny. Dzięki zasadzie jednołańcuchowości stabilizowany jest istotny pod względem funkcjonalnym stan trimerowy komponentów A przez komponenty B, przez co zapewnione jest to, że po sprzęganiu kowalencyjnym do powierzchni/cząstki jest wykluczona dysocjacja pojedynczych komponentów A i tym samym zapobiega się utracie aktywności biologicznej. [0037] Korzystną właściwością takich sprzężonych do powierzchni lub cząstek polipeptydów jest ich aktywność biomimetyczna, która odpowiada aktywności naturalnych, związanych z błoną ligandów rodziny TNF. Przykładowo unieruchomiony sctnf uzyskuje wysokie powinowactwo do TNFR2 i tym samym wysoką zdolność sygnałową. [0038] Polipeptydy, które zawierają zmodyfikowane grupą sprzęgającą komponenty A, jak opisano powyżej, i są sprzężone do powierzchni i/lub do cząstek, mogą być według wynalazku zastosowane do wykrywania, jak również do manipulacji, deplecji i/lub usuwania partnerów wiązania dla

19 TNF i również związanych z nim związków. Głównym punktem zainteresowania są przy tym sposoby do pozaustrojowej manipulacji, deplecji i/lub usuwania zawartych w cieczach ustrojowych składników, np. przy pomocy aferezy. [0039] Poniższe wykonania odnośnie przedmiotów wynalazku odnoszą się do TNF, członka rodziny ligandów TNF. [0040] Polipeptydy niniejszego wynalazku obejmują obok opisanych komponentów A co najmniej dwa komponenty B, przy czym komponent B ma właściwość łącznika peptydowego. Jako łącznik peptydowy jest w sensie wynalazku możliwa każda sekwencja peptydowa, która może zostać poddana ekspresji w układzie biologicznym. Łączniki peptydowe stanowią w konstruktach polipeptydowych np. elastyczne połączenie, które korzystnie jednak nie wpływa negatywnie na właściwe dla TNF właściwości trimeryzacji TNF. Korzystnie wybierane są łączniki z takimi właściwościami, zwłaszcza elastycznością i długością, które mogą stabilizować spontanicznie utworzone homotrimery danego ligandu (pochodnej). [0041] W korzystnej postaci wykonania wynalazku w przypadku komponentu B chodzi więc o łączniki peptydowe składające się z 2 do, korzystnie między 4 a 16, i szczególnie korzystnie między 4 a 12 aminokwasów, które korzystnie zawierają powtarzające się struktury glicyna-seryna, bardzo korzystnie moduły Gly-Gly-Gly-Ser (moduły GGGS) w powtarzającym się ułożeniu. [0042] W przypadku łączników peptydowych według wynalazku chodzi więc o bogate w glicynę (G) łączniki peptydowe, tzn. że sekwencja aminokwasowa łącznika peptydowego ma duży udział glicyny, korzystnie 60 do 80%, szczególnie korzystnie 7%. [0043] W szczególnie korzystnych postaciach wykonania

20 1 2 wynalazku łącznik peptydowy (komponent B) obejmuje sekwencję aminokwasową GGGSGGGSGGGS, zwaną również (GGGS) 3, lub L short, lub sekwencję aminokwasową GGGSGGGSGGGSGGS, zwaną również (GGGS) 4 lub L long. Łączniki peptydowe są według wynalazku określane m.in. jako L1 i L2, tak że uzyskuje się określenia takie jak L1 short, L2 short, L1 long i/lub L2 long. Do stabilizacji cząstki trimerowej możliwe jest zastosowanie dwóch różnych łączników. [0044] Korzystnie łączniki peptydowe według wynalazku, a więc komponenty B, łączą ze sobą każdorazowo dwa z co najmniej trzech komponentów A. To łączenie następuje kowalencyjnie przez koniec C komponentu A i koniec N kolejnego komponentu A. Polipeptyd stanowi cząsteczkę jednołańcuchową (zwaną również sc). Oznacza to, że wszelkie komponenty A i komponenty B, które obejmuje polipeptyd, leżą na jednej nici polipeptydowej względnie nici białkowej. [004] W korzystnej postaci wykonania wynalazku komponenty A i komponenty B tworzą trimerową strukturę białkową. Korzystnie chodzi przy tym o homotrimerową strukturę białkową, jednakże objęte wynalazkiem są również heterotrimerowe struktury białkowe. [0046] Utworzenie tej trimerowej struktury białkowej korzystnie powodowane jest przez komponent B i/lub jest przez niego wzmacniane. Ze względu na to, że prowadzący do trimeryzacji komponent B względnie wzmacniający trimeryzację komponent B polipeptydu zasadniczo nie powinien tworzyć wyższych agregatów, komponent B zazwyczaj nie powinien mieć reszty cysteinowej, która może utworzyć międzycząsteczkowy mostek disiarczkowy. Korzystnie komponent B w polipeptydzie nie będzie więc posiadał reszty cysteinowej lub będzie miał tylko takie reszty cysteinowe,

21 które tworzą wewnątrzcząsteczkowy mostek disiarczkowy, a więc w samym polipeptydzie, aby uniknąć tego, by w warunkach utleniających mogło wystąpić łączenie kowalencyjne z co najmniej jedną resztą cysteinową białka fuzyjnego innego trimeru. [0047] Sekwencje natywnych polipeptydów lub fragmentów tych natywnych polipeptydów, które są stosowane według wynalazku jako łączniki peptydowe, mogą występować również w postaci ich aktywnych biologicznie funkcjonalnych wariantów w sensie tego wynalazku i według powyższej definicji. [0048] W przypadku komponentów B według wynalazku może chodzić o identyczne lub różne występujące naturalnie sekwencje peptydowe. Mogą one pochodzić z tego samego lub z różnych organizmów. W przypadku organizmów może chodzić o kręgowce, zwłaszcza ssaki, przykładowo o mysz, szczura, świnię lub przede wszystkim o człowieka. [0049] Polipeptyd może obok komponentów A i B mieć dodatkowe odcinki sekwencji. Korzystne są w tym kontekście tak zwane sekwencje znacznikowe, przykładowo co najmniej jeden znacznik Flag, a więc ciąg aminokwasów DYKDDDDK, i/lub przykładowo co najmniej jeden znacznik His (zawierający kilka następujących po sobie histydyn, np. co najmniej ) i/lub kolejne sekwencje znacznikowe lub antygenowe. Szczególnie korzystnym dodatkowym odcinkiem sekwencji jest sekwencja peptydu sygnałowego. Korzystnie ta sekwencja peptydu sygnałowego stanowi sygnał do sekrecji polipeptydu względnie białka w komórkach eukariotycznych. Ta sekwencja peptydu sygnałowego jest korzystnie umiejscowiona na N-końcu. [000] W korzystnej postaci wykonania wynalazku polipeptyd obejmuje kolejny komponent C, przy czym charakteryzuje się on specyficznym wzajemnym oddziaływaniem z komplementarną

22 cząsteczką powierzchni komórki ("antygenem"). Zasada działania konstruktów polipeptydowych jest w szczególności słuszna dla wszystkich tych członków rodziny ligandów TNF, które działają jako cząsteczka błonowa wyłącznie dla określonych receptorów lub w szczególnie dobrym stopniu. Należą do nich, oprócz TRAIL (TNFSF), FasL (INFSF6) i TNF (TNFSF2), np. również immunomodulatory CD40L (TNFSF) i CDL (TNFSF8). Komponent C ma tym samym funkcję ukierunkowywania. Zgodnie z tym komponent C jest fragmentem przeciwciała, korzystnie jednołańcuchowym fragmentem przeciwciała, tzw. scfv, lub pochodną przeciwciała, która rozpoznaje specyficzną cząsteczkę docelową na powierzchni komórki. W kolejnej postaci wykonania komponent C jest białkiem względnie peptydem nienależącym do przeciwciał, które jednak analogicznie do oddziaływania przeciwciało-antygen względnie oddziaływania receptor-ligand również selektywnie rozpoznaje specyficzną cząsteczkę docelową na powierzchni komórki. W szczególnie korzystnej postaci wykonania niniejszy wynalazek obejmuje polipeptyd, jak opisano powyżej, zawierający jako komponent A co najmniej jednego członka rodziny sctnf, np. sctnf, i jako komponent C fragment przeciwciała, jak opisano powyżej, np. scfv. Przez to powstają mniejsze polipeptydy z każdorazowo jedną domeną do ukierunkowywania". Takie mniejsze polipeptydy są korzystnie mniej podatne na np. agregację. [001] Korzystnie w przypadku komponentu C chodzi o wiążący antygen fragment przeciwciała lub wiążącą antygen pochodną przeciwciała ssaka, zwłaszcza pochodzenia mysiego lub ludzkiego, lub chodzi o humanizowany fragment przeciwciała lub humanizowaną pochodną przeciwciała, np. pochodzącego od ssaków. W przypadku derywatyzacji i/lub humanizacji

23 komponent C składa się z wytworzonej według stanu techniki jednołańcuchowej pochodnej Fv, humanizowanego metodą przeszczepiania CDR mysiego komponentu C lub chodzi o komponent C całkowicie ludzkiego pochodzenia, który został odpowiednio przekształcony w pochodną scfv. [002] W kolejnej korzystnej postaci wykonania w przypadku komponentu C chodzi o ligand białkowy lub peptydowy, który jako monomer tworzy specyficzne wiązanie z receptorem błonowym. [003] W kolejnej korzystnej postaci wykonania w przypadku komponentu C chodzi o białko lub peptyd ze specyficznością względem cząsteczek powierzchni komórkowej, którą jest w szczególności receptor cytokiny, receptor czynnika wzrostu, integryny lub cząsteczka adhezji komórkowej. Szczególnie korzystnie chodzi o receptor cytokiny, który jest wybrany z grupy rodziny genowej TNFR. [004] Komponent C polipeptydu ma korzystnie specyficzność względem antygenu ulegającego ekspresji w tkance nowotworowej selektywnie względnie w sposób dominujący. Taki antygen nowotworowy może ogólnie ulegać ekspresji na samych komórkach złośliwych lub też może ulegać ekspresji w niezłośliwej części guza, komórkach zrębu lub śródbłonka nowotworowego. Takie antygeny niezłośliwych części tkanki guza litego (raka złośliwego) są z jednej strony genetycznie niezmienne, a z drugiej strony występują przy najróżniejszych jednostkach nowotworowych i stąd są uniwersalnymi markerami nowotworowymi. Przykładami takich ligandów do asocjacji nowotworów, przeciw którym może być skierowany komponent C polipeptydu, są kompleks VEGFR względnie VEGFR/VEGF oraz integryna a v β 3 oraz izoforma fibronektyny β Fn jako w znacznym stopniu selektywne struktury docelowe śródbłonka nowotworowego oraz białka

24 aktywacji fibroblastów (ang. Fibroblast Activation Protein) (jako selektywny marker zrębu guza). Wszystkie wyżej wymienione przykłady mogą być skutecznie uchwycone specyficznymi scfv, dlatego też takie scfv ("jednołańcuchowy Fv") szczególnie nadają się jako komponent C polipeptydu. Jako marker nowotworowy, względem którego jest skierowany komponent C, wchodzi przy tym w rachubę również galektyna. [00] Zgodnie z tym szczególnie preferowane jako komponent C są fragmenty przeciwciał w różnych formatach przeciwciał, np. scfv, zwłaszcza scfv40. [006] W innej postaci wykonania niniejszego wynalazku polipeptyd rozpoznaje przez swój komponent C specyficzną cząsteczkę docelową związaną z błoną komórkową receptora członka rodziny ligandów TNF, korzystnie różniącego się od członka rodziny ligandów TNF komponentu A. Przykładami, które nie stanowią zamkniętego wyliczenia, takich możliwych ligandów to TNFSF1 (LTalfa), TNFSF2 (TNF), TNFSF3 (LTbefa), TNFSF4 (OX40L), TNFSF (CD40L), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27L), TNFSF8 (CDL), TNFSF9 (4-1BBL), TNFSF (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAKL), TNFSF13 (APRIL), TNFSF143B (BLYS), TNFSF14 (LIGHT), TNFSF1 (VEGI), TNFSF16 (CDL), i TNFSF18 (AITRL), oraz EDA, które lub których fragmenty funkcjonalne lub warianty funkcjonalne sekwencji natywnej lub fragmentów mogą również służyć jako komponent A w konstrukcie polipeptydowym. W szczególności odnośnie tego ujawniane są również wszystkie związane z błoną białka typu II (pozakomórkowy koniec C), ich funkcjonalne fragmenty lub funkcjonalne warianty, które warunkują trimerową organizację swoich podjednostek jako warunek dla aktywności biologicznej. [007] Sposoby wytwarzania przeznaczonego do zastosowania

25 2 1 2 według wynalazku polipeptydu zawiera zazwyczaj następujące etapy (a) hodowanie komórki gospodarza w odpowiednich warunkach, (b) ekspresję odpowiedniego konstruktu kwasu nukleinowego w odpowiednich warunkach, oraz (c) izolację polipeptydu z komórek gospodarza i/lub nadsączu hodowli. [008] Hodowanie komórki gospodarza oznacza umożliwienie komórce gospodarza wzrostu w odpowiedniej pożywce hodowlanej, przy odpowiednim ph i w odpowiedniej temperaturze. Takie warunki wzrostu są zależne od każdorazowo stosowanych komórek gospodarza i są dobrze znane znawcy. Wskazówki odnośnie hodowania komórek znajdują się również w Maniatis i wsp.. (01), supra. [009] Ekspresja polipeptydu może przy tym następować zazwyczaj według stanu techniki w odpowiednich systemach ekspresji, korzystnie jako ulegający sekrecji produkt stabilnych transfektantów, np. komórek CHO lub innych komórek zwierzęcych, jak Cos7 lub SF9 (komórki owadów), lub dalszych eukariotycznych systemów komórkowych, przykładowo Pichia pastoris. Korzystnie polipeptydy po ekspresji mają odpowiednie do sekrecji w systemie komórkowym sekwencje sygnałowe. Stąd stosowane do ekspresji wektory będą również zawierać odcinki kodujące, które kodują funkcjonalną sekwencję sygnałową, jak opisano np. w Brocks i wsp. (Immunotechnology 3: , 1997) dla ssaków i komórek owadów lub z zastosowaniem przykładowo wektorów ppic-zalpha (Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy) do ekspresji i sekrecji w drożdżach Pichia pastoris. [0060] Izolacja polipeptydu z komórki gospodarza może nastąpić standardowymi sposobami, takimi jak metody chromatograficzne, strąceniowe itd., które są odpowiednie do oczyszczania polipeptydów i białek (patrz również Maniatis i wsp. (01), supra. Przedmiotem niniejszego

26 wynalazku są sposoby do pozaustrojowej (ex vivo) manipulacji, deplecji i/lub usuwania zawartych w płynach ustrojowych składników, jak np. partnerów wiązania zdefiniowanego jak wyżej komponentu A lub wiążących się z nim lub asocjujących z nim komórek. Takie sposoby pozaustrojowe obejmują korzystnie sposoby, takie jak np. afereza, zwłaszcza podstawowe formy aferezy, jak plazmafereza i cytafereza. [0061] Plazmafereza obejmuje według wynalazku manipulację, deplecję i/lub usuwanie określonych rozpuszczalnych lub zawieszonych składników we frakcji osoczowej krwi, oraz zawracanie tak traktowanej krwi do pacjenta. W tym celu od pacjenta pobierana jest korzystnie przy pomocy maszyny do ferezy krew obwodowa, do krwi dodawane są ewentualnie środki hamujące krzepnięcie i krew dzielona jest na swoje główne składniki frakcje stałe (czerwone krwinki, białe krwinki i płytki krwi) i ciekłe (osocze). Po podzieleniu na te główne składniki, zawarte w tak otrzymanej frakcji osocza rozpuszczalne lub zawieszone składniki krwi mogą zostać w kolejnym etapie sposobu poddane manipulacji, deplecji i/lub usuwaniu, przykładowo z zastosowaniem opisanych według wynalazku polipeptydów. Następnie poddane w ten sposób obróbce osocze krwi może zostać połączone z wcześniej oddzielonymi stałymi składnikami krwi i może być ponownie wstrzykiwane pacjentowi. Uwarunkowana przez plazmaferezę utrata objętości w sposobie według wynalazku może dalej zostać zastąpiona ponadto przez izotoniczny roztwór soli kuchennej. Plazmafereza według wynalazku korzystnie przeprowadzana jest z zastosowaniem sposobów takich jak terapeutyczna wymiana osocza (TPE), immunoabsorpcja (IA), strącanie (HELP), różniczkowa filtracja membranowa lub innymi środkami. Przykładowo

27 należy tutaj wymienić kolumny do filtracji osocza (patrz np. US 4,619,639, Asahi Medical Company, tutaj włączone przez odesłanie). Zastosowane mogą zostać również systemy filtracji membranowej (MDF) z zastosowaniem różnych cząstek i powierzchni, np. filtrów jak filtr do krwi PlasmaFlo OP- 0(W)L oraz RheoFilter AR00 (wytworzone przez Asahi Medical Company, Ltd. of Japan). Alternatywnie mogą być w sposobach plazmaferezy według wynalazku stosowane wszystkie odpowiednie powierzchnie i cząstki. [0062] W odróżnieniu do opisanej wcześniej plazmaferezy, w cytaferezie według wynalazku krążące pozaustrojowo we krwi i/lub związane ze szpikiem kostnym komórkowe składniki (czerwone krwinki, białek krwinki, komórki macierzyste lub trombocyty) lub specyficzne subbpopulacje tych komórek mogą być poddawane manipulacji, deplecji i/lub usuwaniu, aby uzyskać efekt kliniczny. Również tutaj korzystnie pobierana jest od pacjenta przy pomocy maszyny do ferezy krew obwodowa. Do krwi dodawane są następnie opcjonalnie środki hamujące krzepnięcie i krew jest dzielona na swoje główne składniki. Następnie we frakcji krwi zawierającej składniki komórkowe te składniki komórkowe mogą być w kolejnym etapie sposobu poddane manipulacji, deplecji i/lub usuwaniu, korzystnie również z zastosowaniem opisanych według wynalazku polipeptydów. Poddana w ten sposób obróbce frakcja może zostać na koniec znowu wstrzyknięta pacjentowi. Korzystnie w cytaferezie według wynalazku następuje rozdzielenie krwi na różne frakcje oraz ewentualnie oddzielenie określonych składników komórkowych krwi przy pomocy sposobów takich jak wirowanie, różniczkowa filtracja membranowa, lub innymi środkami. Ponadto zastosowane mogą być systemy filtracji membranowej (MDF) z zastosowaniem różnych cząstek i powierzchni, np. filtrów,

28 jak filtry do krwi PlasmaFlo OP-0(W)L i RheoFilter AR00 (wytworzone przez Asahi Medical Company, Ltd. Japonia). [0063] W trzeciej alternatywie według wynalazku wyżej opisane sposoby plazmaferezy i cytaferezy mogą zostać ze sobą połączone, przykładowo aby móc poddawać manipulacji, deplecji i/lub usuwaniu zarówno rozpuszczalne lub zawieszone składniki we frakcji osoczowej krwi, jak i krążące we krwi i/lub związane ze szpikiem kostnym składniki komórkowe (czerwone krwinki, białe krwinki, komórki macierzyste lub trombocyty) lub specyficzne subpopulacje tych komórek, aby uzyskać efekt kliniczny. Takie połączenie plazmaferezy i cytaferezy jest wytwarzane z zastosowaniem opisanych polipeptydów. [0064] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu (aferezy) według zastrzeżenia. [006] W szczególnej postaci wykonania sposobu aferezy według wynalazku przed ewentualnie następującym rozdziałem krwi może następować opcjonalnie pobranie krwi od pacjenta. Ponadto, opcjonalnie poddana obróbce sposobem według wynalazku krew lub tak poddana obróbce frakcja krwi może być znowu wstrzyknięta pacjentowi. W tym celu ewentualnie konieczne jest połączenie rozdzielonych wcześniej i ewentualnie poddanych różnej obróbce frakcji krwi z innymi niepoddanymi obróbce składnikami stałymi i/lub ciekłymi krwi. Powstałe przez sposób według wynalazku straty objętości mogą być wyrównane przez dodanie odpowiednich cieczy, np. przez dodanie izotonicznego roztworu soli kuchennej. [0066] W zależności od wymagań zawarty w sposobie aferezy według wynalazku etap wiązania rozpuszczalnych, zawieszonych lub komórkowych składników krwi do sprzęgniętej z polipeptydem według wynalazku powierzchni

29 lub cząstki może być przeprowadzany jednokrotnie lub wielokrotnie, aby uzyskać pożądaną selektywność. [0067] W sposobie aferezy według wynalazku stosowane są takie powierzchnie i/lub cząstki, które zostały sprzęgnięte kowalencyjne z polipeptydem według wynalazku, takim jak zdefiniowano powyżej. W tym celu polipeptyd jest korzystnie sprzęgany przez zawartą (zawarte) w polipeptydzie grupę sprzęgającą (grupy sprzęgające) A kowalencyjnie do powierzchni i/lub cząstki. [0068] Sprzęganie zastosowanych według wynalazku polipeptydów przez pojedyncze komponenty A następuje korzystnie tak jak opisano w DE A1. Sprzęganie zastosowanych według wynalazku polipeptydów następuje przy tym korzystnie do powierzchni lub cząstek (nośnik) poprzez wiązanie pomiędzy pierwszymi grupami funkcyjnymi obecnymi na powierzchni nośnika i w polipeptydzie poprzez zawarte w komponentach A grupy sprzęgające. Te grupy sprzęgające są korzystnie komplementarne względem grup funkcyjnych nośnika i mogą łączyć się z nimi przez powinowactwo, korzystnie poprzez wiązania kowalencyjne. Korzystnie grupa funkcyjna komponentu A jest umieszczona wewnątrz komponentu A tak, że jest umiejscowiona w odpowiednim odstępie od odpowiedzialnych za aktywność biologiczną domen polipeptydu. W ten sposób możliwe jest według wynalazku unieruchamianie TNF na nośniku w sposób ukierunkowany i z zachowaniem jego aktywności biologicznych. Po unieruchomieniu polipeptyd jest umocowany korzystnie na powierzchni nośnika tak, że trójwymiarowa struktura wymaganej (wymaganych) dla aktywności biologicznej domeny (domen) nie jest zmieniona w stosunku do nieunieruchomionego polipeptydu, a domena (domeny) przy kontakcie z komórkowymi partnerami reakcji jest (są) dla

30 1 2 nich swobodnie dostępna (dostępne). W korzystnej postaci wykonania wynalazku grupa funkcyjna powierzchni nośnika jest wybrana z grupy składającej się z grupy aminowej, grupy karboksylowej, grupy epoksy, grupy maleinoimidowej, grupy alkiloketonowej, grupy aldehydowej, grupy hydrazynowej, grupy hydrazydowej, grupy tiolowej i grupy tioestrowej. [0069] Według wynalazku grupy sprzęgające przeznaczone do unieruchomienia komponentów A polipeptydu wybrane są z grupy, która zawiera te same rodzaje jak dla grupy funkcyjnej powierzchni nośnika. Możliwa do zastosowania w sposobie aferezy według wynalazku powierzchnia/cząstka (= nośnik) ma więc na swojej powierzchni grupę funkcyjną, która jest połączona kowalencyjne z grupą sprzęgającą przeznaczonego do unieruchomienia polipeptydu, przy czym grupa sprzęgająca polipeptydu jest inną grupą niż białko funkcjonalne nośnika. Obie tworzące wiązanie grupy sprzęgające i grupy funkcjonalne muszą być przy tym komplementarne względem siebie, to znaczy muszą być w stanie utworzyć ze sobą wiązanie kowalencyjne. Gdy według wynalazku jako grupa funkcjonalna nośnika przykładowo stosowana jest grupa aminowa, grupa sprzęgająca komponentu A polipeptydu według wynalazku jest grupą karboksylową. Odwrotnie, gdy według wynalazku jako grupa funkcjonalna nośnika stosowana jest grupa karboksylowa, to według wynalazku grupa sprzęgająca komponentu A polipeptydu jest grupą aminową. Gdy według wynalazku jako grupa funkcjonalna nośnika jest wybierana grupa tiolowa, to według wynalazku komplementarną grupą sprzęgającą komponentu A polipeptydu jest grupa maleinoimidowa. Odwrotnie, gdy jako grupa funkcjonalna nośnika stosowana jest grupa maleinoimidowa, to według wynalazku komplementarną grupą sprzęgającą