Uniwersytet Warszawski Wydział Fizyki

Transkrypt

1 Uniwersytet Warszawski Wydział Fizyki Malwina Strenkowska Nr Albumu: Modyfikowane nukleotydy jako narzędzia do otrzymywania terapeutycznych mrna: synteza, właściwości oraz przykładowe zastosowania PRACA DOKTORSKA Praca wykonana pod kierunkiem prof. UW, dr hab. Jacka Jemielitego w Zakładzie Biofizyki Instytutu Fizyki Doświadczalnej Uniwersytetu Warszawskiego Warszawa 2015

2 2

3 Podziękowania Składam serdeczne podziękowania: mojemu Promotorowi, Profesorowi Jackowi Jemielitemu za wszelką pomoc udzieloną w czasie dotychczasowej współpracy, opiekę merytoryczną, cenne wskazówki, zaangażowanie i mobilizację do pracy Doktor Joannie Kowalskiej, Magistrowi Przemysłowi Wanatowi, Magistrowi Marcinowi Ziemniakowi, Magister Katarzynie Wnęk oraz Maciejowi Majewskiemu za owocną współpracę naukową uwieńczoną kilkoma publikacjami Profesorowi Ugurowi Sahinowi dyrektorowi instytutu badawczego Onkologii Translacyjnej (TRON) Uniwersytetu Jana Gutenberga w Mainz w Niemczech za umożliwienie mi przeprowadzenia badań na komórkach dendrytycznych Dokrorowi Andreasowi Kuhnowi za opiekę i cenne wskazówki w trakcie mojego pobytu w Mainz oraz całej grupie RNA za życzliwe przyjęcie i pomoc grupie badawczej Profesora Edwarda Darżynkiewicza, w szczególności Doktor Renacie Grzeli, Doktorowi Maciejowi Łukaszewiczowi oraz Doktor Joannie Żuberek za współpracę i przeprowadzenie części badań biofizyczno-biologicznych, których wyniki wzbogaciły niniejszą pracę Magistrowi Przemysłowi Wanatowi oraz Doktorowi Błażejowi Wojtczakowi za pomoc w sprawdzaniu pracy Magister Mai Cieplak-Rotowskiej, Magister Inżynier Małgorzacie Zarębskiej, Magister Małgorzacie Waszczuk oraz Magistrowi Marcinowi Ziemniakowi za współdzielenie doktoranckiego losu oraz niezapomniane dyskusje przy kawie w pokoju 2101 Koleżankom i kolegom z Laboratorium Chemii Bioorganicznej oraz Zakładu Biofizyki za wspaniałą atmosferę naukową (i nie tylko) Dziękuję także Rodzicom i Bliskim za wszelką pomoc i wsparcie w chwilach zwątpienia Dziękuję również Fundacji na rzecz Nauki Polskiej za wsparcie finansowe w postaci stypendium doktoranckiego oraz stypendium START otrzymane w trakcie doktoratu 3

4 Spis treści SPIS TREŚCI... 4 STRESZCZENIE ABSTRACT WYKAZ SKRÓTÓW I WSTĘP LITERATUROWY I.1. WPROWADZENIE I.2. KWASY RYBONUKLEINOWE JAKO NOWE TERAPEUTYKI I.2.1 Immunoterapia antynowotworowa za pomocą mrna I Komórki dendrytyczne w immunoterapii I Metody dostarczania mrna do komórek DC I Szczepionki mrna przeciw chorobom zakaźnym i alergiom I.2.2 Białkowa terapia zastępcza (ang. protein replacement therapy) I.2.3 Przeprogramowywanie komórek I.2.4 Wydłużanie telomerów I.2.5 Przeszkody na drodze do skutecznych terapii opartych o mrna I.3. MRNA I.3.1 Podstawowe właściwości kwasów nukleinowych I Struktura DNA i RNA I Stabilność DNA i RNA I.3.2 Funkcje i typy RNA I.3.3 Elementy charakterystyczne eukariotycznego mrna I Struktura kapu I Sekwencje UTR I Ogon poli A I Sekwencja kodująca I.3.4 Synteza mrna transkrypcja in vitro I.3.5 Wybrane procesy i białka związane z mrna

5 I I Inicjacja translacji I Oddziaływanie kap eif4e Degradacja mrna u eukariontów I.4. MODYFIKACJE CHEMICZNE MRNA WPŁYWAJĄCE NA STABILNOŚĆ I TRANSLACJĘ MRNA 49 I.4.1 Analogi końca 5 mrna I.4.2 Modyfikacje UTR I.4.3 Modyfikacje sekwencji kodującej I.4.4 Modyfikacje ogona poli A I.5. SYNTEZA I WŁAŚCIWOŚCI NUKLEOTYDÓW MODYFIKOWANYCH W ŁAŃCUCHU OLIGOFOSFORANOWYM I.5.1 Modyfikacje łańcucha oligofosforanowego nukleotydów przykładowe zastosowania w badaniach biologicznych I.5.2 Właściwości strukturalne i elektronowe analogów fosforanu I.5.3 Metody syntezy modyfikowanych nukleotydów I I I I I Metoda Yoshikawy i jej modyfikacje Metoda Ludwiga-Ecksteina i jej modyfikacje Metoda oksatiofosfolanowa Wydłużanie łańcucha fosforanowego aktywne pochodne nukleotydów I Morfolinowe i imidazolowe pochodne w syntezie nukleotydów Mechanizm substytucji nukleofilowej na atomie fosforu I.5.4 Synteza analogów kapu I I Właściwości N7-metyloguanozyny Metody syntezy I.5.5 P-stereochemia nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym II WYNIKI I DYSKUSJA II.1. WPROWADZENIE II.1.1 Uwagi na temat stosowanego nazewnictwa II.2. CELE BADAŃ II.3. TETRAFOSFORANOWE ANALOGI KAPU MODYFIKOWANE POJEDYNCZĄ GRUPĄ TIOFOSFORANOWĄ (4P-S) II.3.1 Wybór modyfikacji

6 II.3.2 Synteza tetrafosforanowych analogów kapu modyfikowanych pojedynczą grupą tiofosforanową (4P-S-ARCA) II Tetrafosforanowe analogi kapu typu ARCA posiadające pojedynczą modyfikację tiofosforanem w pozycji terminalnej α lub δ II Wprowadzanie podstawnika metylowego w pozycję N7 guanozyny II Synteza mononukleotydowych podjednostek P-elektrofilowych II Synteza mononukleotydowych podjednostkek P-nukleofilowych zawierających modyfikację tiofosforanową II Wytworzenie wiązania pirofosforanowego pomiędzy P-elektrofilowym i P-nukleofilowym prekursorem kapu II Tetrafosforanowe analogi kapu typu ARCA posiadające pojedynczą modyfikację tiofosforanem w pozycji terminalnej β lub γ II II II Synteza podjednostek P-elektrofilowych II Synteza podjednostek P-nukleofilowych II Wytworzenie wiązania pirofosforanowego pomiędzy P-elektrofilowym i P-nukleofilowym prekursorem kapu Rozdział na diastereoizomery Właściwości NMR II.3.3 Badania powinowactwa do eif4e II.3.4 Wydajność translacji w systemie bezkomórkowym II.3.5 Podatność na dekapping enzymem Dcp II.3.6 Podsumowanie II.4. OPRACOWANIE NOWEJ METODY SYNTEZY MODYFIKOWANYCH NUKLEOTYDÓW UMOŻLIWIAJĄCEJ OTRZYMANIE PREKURSORÓW KAPU ZAWIERAJĄCYCH UGRUPOWANIE BIS(TIOFOSFORANOWE) II.4.1 Problemy w syntezie modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym mononukleotydów 111 II.4.2 Opracowanie nowej metody wydłużania łańcucha oligofosforanowego II Nowy reagent P-imidazolowa pochodna cyjanoetylofosforanu II Wydłużanie mostka fosforanowego w modyfikowanych terminalnie nukleotydach za pomocą CE-p-Im II Synteza CE-p S -Im oraz jego zastosowanie do wydłużanie mostka fosforanowego w modyfikowanych terminalnie nukleotydach o jednostkę tiofosforanową II Zastosowanie mikrofal w syntezie modyfikowanych nukleotydów II.4.3 Podsumowanie II.5. BIS(TIOFOSFORANOWE) ANALOGI KAPU

7 II.5.1 Synteza II Strategia syntezy II Otrzymywanie mononukleotydowych podjednostek P-elektrofilowych II Otrzymywanie mononukleotydowych podjednostek P-nukleofilowych II Sprzęganie P-elektrofilowych i P-nukleofilowych prekursorów kapu II Diastereoizomery II Właściwości NMR II.5.2 Powinowactwo do eif4e II.5.3 Wydajność translacji in vitro II.5.4 Podatność na hydrolizę w obecności enzymu dekapującego Dcp II.5.5 Translacja w komórkach dendrytycznych II.5.6 Podsumowanie II.6. TRINUKLEOTYDOWE ANALOGI KAPU II.6.1 Wybór modyfikacji II.6.2 Synteza trinukleotydowych analogów kapu II Podjednostki P-nukleofilowe II Podjednostki P-elektrofilowe II Etap sprzęgania mononukleotydowych podjednostek P-elektrofilowych i P- nukleofilowych II.6.3 Wpływ na translację w komórkach dendrytycznych II.6.4 Podsumowanie II.7. NIEHYDROLIZOWALNE ANALOGI ATP PRZEZNACZONE DO STABILIZACJI OGONA POLIA 166 II.7.1 Wybór modyfikacji II.7.2 Synteza ATPαS II.7.3 Synteza ATPαBH II.7.4 Widma 1 H NMR a konfiguracja absolutna ATPαS i ATPαBH II.7.5 Inkorporacja do mrna i wpływ na translację mrna w komórkach dendrytycznych II.7.6 Podsumowanie II.8. PODSUMOWANIE WYNIKÓW BADAŃ III CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA III.1. ROZPUSZCZALNIKI I REAGENTY WYKORZYSTYWANE W SYNTEZIE

8 III.2. TECHNIKI CHROMATOGRAFICZNE III.2.1 Analityczna wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC III.2.2 Półpreparatywna wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC III.2.3 Chromatografia jonowymienna III Izolacja produktów reakcji III Wymiana soli III.3. JĄDROWY REZONANS MAGNETYCZNY NMR III.4. SPEKTROMETRIA MAS III.5. ZASTOSOWANIE MIKROFAL W SYNTEZIE III.6. SYNTEZY CHEMICZNE III.6.1 Metylowanie guanozyny i jej pochodnych w pozycji N III N7-metyloguanozyna (m 7 Guo) III.6.2 Fosforylacja nukleotydów III Procedura ogólna III O-monofosforan N7-metyloguanozyny (m 7 GMP) III.6.3 Wprowadzanie grupy metylowej w pozycję N7 nukleotydów zawierających guaninę III Procedura ogólna III '-monofosforan N7,2'-O-dimetyloguanozyny (m 7,2 -O 2 GMP) III O-difosforan N7-metyloguanozyny (m 7 GDP) III O-difosforan N7,2 -O-dimetyloguanozyny (m 7,2 -O 2 GDP) III.6.4 Tiofosforylacja nukleotydów III Procedura ogólna III O-tiofosforan guanozyny (GMPS) III O-tiofosforan N7-metyloguanozyny (m 7 GMPS) III O-tiofosforan adenozyny (AMPS) III O-tiofosforan urydyny (UMPS) III ,3 -O-cyklotiofosforan-5 -O-tiofosforan urydyny ( 2,3 -cyc- P S -UMPS) III.6.5 Otrzymywanie P-imidazolidów nukleotydów III Procedura ogólna III P-imidazolid 5 -O-fosforanu guanozyny (GMP-Im) III P-imidazolid 5 -O-fosforanu adenozyny (AMP-Im)

9 III P-imidazolid 5 -O-fosforanu N7-metyloguanozyny (m 7 GMP-Im) III P-imidazolid 5 -O-fosforanu N7,2 -O-dimetyloguanozyny (m 7,2 -O 2 GMP-Im) III P-imidazolid 5 -O-difosforanu N7-guanozyny (m 7 GDP-Im) III P-imidazolid 5 -O-fosforanu N7,2 -O-dimetyloguanozyny (m 7,2 -O 2 GDP-Im) III P-imidazolid 5 -O-fosforanu guanozyno-(3 5 )-guanozyny (Im-pGpG) III P-imidazolid 5 -O-fosforanu guanozyno-(3 5 )-2 -O-metyloguanozyny (Impm 2 O GpG) III.6.6 Otrzymywanie P-imidazolidów pochodnych 2-cyjanoetylofosforanu III P-imidazolid 2-cyjanoetylofosforanu III P-imidazolid S-(2-cyjanoetylo)tiofosforanu III.6.7 Otrzymywanie 5 -O-difosforanów nukleozydów III Procedura ogólna III O-difosforan guanozyny (GDP) III.6.8 Otrzymywanie 5 -O-(P2-tiodifosforanów) nukleozydów III Procedura ogólna III O-(P2-tiodifosforan) adenozyny (ADPβS) III O-(P2-tiodifosforan) guanozyny (GDPβS) III O-(P2-tiodifosforan) N7,2 -O-dimetyloguanozyny (m 7,2 -O 2 GDPβS) III.6.9 Fosforylacja za pomocą P-imidazolidów 2-cyjatoetylofosforanu i jego pochodnych III Procedura ogólna synteza tradycyjna (Metoda A) III Procedura ogólna synteza mikrofalowa (Metoda B) III O-(P1-tiodifosforan) guanozyny (GDPαS) III O-(P1-tiodifosforan) adenozyny (ADPαS) III O-(P1-tiodifosforan) urydyny (UDPαS) III O-(P1-tiodifosforan) N7-metyloguanozyny (m 7 GDPαS) III ,3 -O,O-cyklotiofosforan-5 -O-(P1-tiodifosforan) urydyny ( 2 3 -cyc- P S -UDPαS) 198 III O-(P1,P2-ditiodifosforan) adenozyny (ADPαSβS) III O-(P1,P2-ditiodifosforan) guanozyny (GDPαSβS) III O-(P2,P3-ditiotrifosforan) guanozyny (GTPβSγS) III.6.10 Otrzymywanie 5 -O-(P1-tiotrifosforanów) nukleozydów III P1,P2-diimidazolowa pochodna pirofosforanu (Im-pp-Im) III Procedura ogólna III O-(P1-tiotrifosforan) guanozyny, GTPαS

10 III O-(P1-tiotrifosforan) N7,2 -O-dimetyloguanozyny (m 2 7,2 -O GTPαS) III O-(P1-tiotrifosforan) adenozyny, ATPαS III.6.11 Otrzymywanie P-tiotetrafosforanowych analogów kapu typu ARCA III Procedura ogólna III O-[ P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P1-tiotetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 - O Gpppp S G III O-[ P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P2-tiotetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 - O Gppp S pg III O-[ P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P3-tiotetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 - O Gpp S ppg III O-[ P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P4-tiotetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 - O Gp S pppg III.6.12 Otrzymywanie bis(tiofosforanowych) analogów kapu III Procedura ogólna III O-[ P3-(N7-guanozyno)-P1,P2-ditiotrifosforan] guanozyny, m 7 Gpp S p S G III O-[ P3-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P1,P2-ditiotrifosforan] guanozyny, m 2 7,2 -O Gpp S p S G III O-[ P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P2,P3-ditiotetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 -O Gpp S p S pg III O-[ P4-(N7-guanozyno)-P1,P2-ditiotetrafosforan] guanozyny, m 7 Gppp S p S G 211 III O-[ P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P1,P2-ditiotetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 -O Gppp S p S G III.6.13 Synteza trinukleotydowych analogów kapu III Procedura ogólna III O-[P3-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P2-tiotrifosforan] guanozyno-(3 5 )- guanozyny, m 2 7,2 -O Gpp S pgpg (analog typu kap 0) III O-[P3-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P2-tiotrifosforan] guanozyno-(3 5 )- 2 -O-metyloguanozyny, m 2 7,2 -O Gpp S pm 2 -O GpG (analog typu kap 1) III.6.14 Inne III O-[P2-tio-P3-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-trifosforan] guanozyny, m 2 7,2 - O Gpp S pg / β-s-arca III O-[P4-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-tetrafosforan] guanozyny, m 2 7,2 - O GppppG / 4P-S-ARCA III Otrzymywanie 5 -boranofosforanu adenozyny, AMPBH III O-(P1-boranotrifosforanu) adenozyny, ATPαBH

11 III.7. BADANIA BIOLOGICZNE III.7.1 Szczepy bakteryjne III.7.2 Plazmidy III.7.3 Bufory i media do hodowli komórek III.7.4 Transformacja bakterii III.7.5 Sekwencjonowanie III.7.6 Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych III.7.7 Linearyzacja plazmidu III.7.8 Elektroforeza DNA III.7.9 Tranksrypcja in vitro III.7.10 Otrzymywanie i kultywacja niedojrzałych ludzkich komórek dendrytycznych (hidcs) 221 III Kultywacja komórek III Wyznaczanie liczby komórek III Wyprowadzenie hodowli komórkowej niedojrzałych komórek dendrytycznych (hidcs) 222 III Magnetyczna izolacja komórek (MACS) III Zamrażanie i odmrażanie komórek III.7.11 Elektroporacja RNA III.7.12 Oznaczanie ekspresji lucyferazy w hidcs III.8. PUBLIKACJE III.9. PREZENTACJA WYNIKÓW NAUKOWYCH NA KONFERENCJACH NAUKOWYCH III.10. BIBLIOGRAFIA

12 Streszczenie Nowoczesne terapie oparte o mrna, takie jak immunoterapia przeciwnowotworowa czy terapia genowa, budzą coraz większe zainteresowanie jako możliwe opcje terapeutyczne. Wciąż jednak jedną z głównych przeszkód stojących na drodze skutecznego zastosowania terapeutycznego mrna in vivo jest jego niewystarczająca stabilność oraz zbyt niski poziom translacji w warunkach komórkowych. W związku z tym, istnieje potrzeba opracowywania nowych skutecznych metod poprawiających właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne mrna. Celem zrealizowanego przeze mnie projektu była synteza i wykorzystanie niehydrolizowalnych pochodnych nukleotydów do stabilizacji cząsteczki mrna oraz zwiększenia jej potencjału translacyjnego w warunkach komórkowych. Cząsteczki mrna zbudowane są z kilku elementów strukturalnych takich jak 5 kap, region nieulegający translacji 5 UTR, region kodujący, region nieulegający translacji 3 UTR oraz ogon poli A. W pracy podjęto zagadnienie odpowiedniego projektowania i modyfikowania tych elementów za pomocą metod chemicznych jako jednej z potencjalnych metod optymalizacji stabilności i potencjału translacyjnego mrna. Przeprowadzone badania skupiają się na syntezie i ocenie właściwości biologicznych nowych analogów 5 kapu oraz prekursorów ogona poli A zaprojektowanych pod kątem zwiększenia odporności na dekaping i deadenylację oraz zwiększenia potencjału translacyjnego mrna in vivo. W ramach pracy udało się otrzymać szereg oryginalnych związków (nukleotydów zawierających odpowiednie modyfikacje łańcucha oligofosforanowego) łączących się w cztery odrębne typy molekularnych narzędzi przydatnych do stabilizacji mrna. Opracowano również nową metodę syntezy modyfikowanych nukleotydów umożliwiającą otrzymanie wielu cennych biologicznie związków zawierających modyfikacje tio-, borano-, selenofosforanowe, imidodifosforanowe i metylenobisfosfonianowe oraz ich kombinacje. Ponadto, przeprowadzono eksperymenty pozwalające na zbadanie wpływu nowych związków na zachowanie mrna in vitro oraz w ludzkich niedojrzałych komórkach dendrytycznych (hidc) oraz wyselekcjonowano najbardziej obiecujące związki odporne na degradację enzymatyczną oraz stymulujące translację mrna. Jako że podwyższona stabilność i wydajna translacja mrna w hidc są pożądanym efektem w immunoterapiach antynowotworowych, otrzymane związki stanowią cenne potencjalne narzędzie do produkcji użytecznego terapeutycznie mrna. 12

13 Abstract mrna-based therapies such as anti-cancer immunotherapies or gene therapies receive more and more attention as a new potential option of medical treatment. One limiting obstacle for in vivo and therapeutic applications of mrnas is their instability and insufficient translation in the cellular environment. Therefore, mrna-based therapies need simple methods of mrna modification which would improve pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of mrna. The main goal of this work was a synthesis and application of nonhydrolizable nucleotides derivatives to synthesis of stable and efficiently translated mrna in vivo. mrna molecules consist of several important structural elements such as a 5 cap, 5 untranslated region, coding region, 3 untranslated region and polya tail. This work explores the concepts of logic-driven design and engineering of these elements by chemical methods as one potential method to increase stability and translational capabilities of mrna. The research is focused on the synthesis and evaluation of biological properties of novel 5 cap analogs and polya precursors designed to inhibit decapping and deadenylation and enhance mrna potential in vivo. A number of original compounds (nucleotides containing appropriate oligophosphate chain modifications) were obtained and divided in four types of molecular tools useful for mrna stabilization. In addition, a new synthetic method was developed which enabled the synthesis of many biologically important nucleotides containig phosphorothioate, boranophosphate, selenophosphate, imidodiphosphate and methylenebisphosphonate modifications and their combinations. Finally, the influence of new compounds on behavior of mrna in vitro and in human immature dendritic cells (hidcs) were examined and the most promising compounds, resistant to enzymatic hydrolysis and enhancing translation of mrna, were selected. Since increased stability and translatability of mrna in hidcs is a desired effect in anti-cancer immunotherapies, the new compounds become potential tools for therapeutic mrna production. 13

14 Wykaz skrótów Alfabetyczny wykaz najważniejszych skrótów stosowanych w pracy 3 -UTR/5 -UTR Region niekodujący, (ang. untranslated region) znajdujący się na końcu 3 lub 5 mrna 4EBP białka wiążące eif4e, ang. eif4e-binding proteins ARCA Ang. Anti-Reversed Cap Analogs ARE elementy bogate w pary AU, ang. AU-rich elements bn7gtp 5 -O-trifosforan N7-benzyloguanozyny CDI karbonylodiimidazol CE grupa 2-cyjanoetylowa CTP 5 -O-trifosforan cytozyny D diastereoizomer DBU 1,8-Diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en DCC N,N'-dicykloheksylokarbodiimid Dcp1 enzym dekapujący 1, ang. decapping enzyme 2 Dcp2 Enzym dekapujący 2 ang. decapping enzyme 2 DcpS enzym dekapujący Scavenger, ang. Scavenger decapping enzyme DCs komórki dendrytyczne, ang. dendritic cells DEAE grupadietyl-aminoetylowa DMA dimetyloacetamid DMF dimetyloformamid DMSO dimetylosulfotlenek DMTr grupa dimetoksytrytylowa DNA kwas dezoksyrybonukleinowy DNaza deoksyrybonukleaza DTT ditiotreitol eif4e Eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4E, ang. eukaryotic translation Initiation Factor 4E eif4e1b izoforma 1b białka eif4e eif4e2 izoforma 2 białka eif4e eif4e3 izoforma 3 białka eif4e eif4f Eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4F, ang. eukaryotic translation Initiation Factor 4E eif4g Eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4G, ang. eukaryotic translation Initiation Factor 4E GMP 5 -O-monofosforan guanozyny GTP 5 -O-trifosforan guanozyny hnrna heterogenne jądrowe RNA HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa, ang. high-performance liquid chromatography HRMS wysokorozdzielcza spektroskopia mas, ang. high resolution mass spectroscopy idcs niedojrzałe komórki dendrytyczne, ang. immature dendritic cells ipsc Indukowane pluripotentne komórki macierzyste, ang. induced pluripotent stem cells IRES wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów, ang. internal ribosome entry side IVT-RNA transkrybowane in vitro RNA, ang. in vitro transcribed RNA K AS stała asocjacji 14

15 LC-MS LNA m 7 GDP m 7 GpppA m 7 GpppG m 7 GTP m 7 GTPαS mirna mrna NAD + NMD NMP NMR NTP PABP PAP PCR PPi pre-mrna RiPSC RNA RNAza RP-HPLC rrna scrna sirna snorna snrna SpDcp1/2 SPR TEA TEAB TERT trna TRON UTP VEGF spektrometria mas sprzężona z chromatografią cieczową ang. locked nucleic acids 5 -O-difosforan N7-metyloguanozyny 5 -O-[P1-(N7-metyloguanozyno)trifosforan] adenozyny 5 -O-[P1-(N7-metyloguanozyno)trifosforan] guanozyny 5 -O-trifosforan N7-metyloguanozyny 5 -O-(P1-tiotrifosforan) cytozyny mikro RNA informacyjne RNA, ang. messenger RNA forma utleniona NADH (nukleotydu nikotynoamidoadeninowego) ang. Nonsense Mediated Decay 5 -O-monofosforan nukleozydu jądrowy rezonans magnetyczny 5 -O-trifosforan nukleozydu białka wiążące poli A, ang. poly A binding proteins Polimeraza ogona poli A, ang. polya polymerase Reakcja łańcuchowa polimerazy, z ang. polymerase chain reaction pirofosforan precursor informacyjnego RNA Indukowane RNA pluripotentne komórki macierzyste, ang. RNA-induced pluripotent stem cells kwas rybonukleinowy rybonukleaza wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconych fazach, ang. reversedphase high-performance liquid chromatography rybosomalne RNA, ang. ribosomal RNA małe cytoplazmatyczne RNA małe interferujące RNA małe jąderkowe RNA małe jądrowe RNA kompleks Dcp1/Dcp2 ze Schizosacharomyces Pombe Powierzchniowy rezonans plazmonowy trietyloamina wodorowęglan trietyloaminy odwrotna transkryptaza telomerazy ang. telomerase reverse transcriptase transferowe RNA, ang. transfer RNA Instytut Onkologii Translacyjnej (znajdujący się w Mainz, Niemcy) 5 -O-trifosforan urydyny czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, ang. vascular endothelial growth factor 7,2 - β-s-arca 5 -O-[ P3-(N7,2 -O-dimetyloguanozyno)-P2-tiotrifosforan] guanozyny, m 2 O Gpp S pg ε molowy współczynnik ekstynkcji Nieujęte w tabeli skróty wyjaśniono w tekście Uwagi na temat nazewnictwa nukleotydów opisywanych w części Wyniki i dyskusjaomówiono w rodziale II

16 I Wstęp literaturowy I.1. Wprowadzenie Celem niniejszej rozprawy doktorskiej była synteza i wykorzystanie modyfikowanych nukleotydów do poprawy stabilności i właściwości translacyjnych mrna. W ramach zrealizowanego projektu przeprowadzono interdyscyplinarne badania z zakresu chemii, biologii i biofizyki ukierunkowane na stworzenie molekularnych narzędzi do otrzymywania terapeutycznych mrna o podwyższonej stabilności i wydajności translacji w komórkach. W ramach części chemicznej opracowano nowe metody syntezy modyfikowanych nukleotydów oraz otrzymano zestaw nowych związków do badania wpływu poszczególnych modyfikacji na mrna. Następnie przebadano właściwości nowych związków pod kątem ich wpływu na proces translacji, zarówno in vitro jak i w komórkach. Ze względu na rodzaj wykorzystanych komórek do badań, wyniki mogą mieć bezpośrednie przełożenie na zastosowanie do produkcji mrna stosowanego w immunoterapiach. Szeroki zakres badań wymaga przybliżenia czytelnikowi potencjału tkwiącego w mrna jako terapeutyku i wyzwań jakie towarzyszą wzmocnieniu właściwości farmakokinetycznych mrna. We wstępie literaturowym zawarto więc informacje niezbędne do zrozumienia znaczenia badań wykonanych w ramach niniejszej pracy doktorskiej. W pierwszej kolejności przedstawiono zarys aktualnych potencjalnych terapii opartych o mrna i technicznych trudności im towarzyszących będących motywacją do wykonania niniejszych badań. Następnie poświęcono uwagę właściwościom biochemicznym mrna i znanym do tej pory chemicznym modyfikacjom mrna. Sporą część wstępu poświęcono analogom końca 5 mrna tzw. analogom kapu, gdyż to one stanowiły główne narzędzie stworzone i wykorzystane w celu polepszenia właściwości mrna takich jak stabilność i zdolność do wydajnej translacji. Ze względu na rozwój metod syntetycznych w pracy zarysowano również przegląd dostępnych do tej pory metod syntezy modyfikowanych nukleotydów, ich wady i zalety. W części drugiej pracy doktorskiej przedstawiono wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszego projektu oraz ich dyskusję. Część tą podzielono na pięć podstawowych rozdziałów stanowiących odrębne zagadnienia rozwijane w czasie pracy doktorskiej. Każdy z rozdziałów 16

17 stanowi logiczny fragment pracy oraz podstawę do publikacji naukowej. Część eksperymentów została przeprowadzona we współpracy i również one zostały tu opisane, aby w pełni uwypuklić wartość otrzymanych związków. Wyniki zaprezentowano w sposób chronologiczny i często kluczowe wyniki danego rozdziału stawały się motywacją do rozpoczęcia badań nad kolejnym. Jednak przedstawione razem tworzą ostatecznie spójną całość obejmującą różne rodzaje potencjalnych narzędzi molekularnych do syntezy stabilnego mrna o podwyższonym potencjale translacyjnym. I.2. Kwasy rybonukleinowe jako nowe terapeutyki Sześć lat po ustaleniu struktury podwójnej helisy DNA przez Watsona i Cricka (nagroda Nobla z medycyny 1969) eksperymenty Arthura Pardee, Francoisa Jacoba i Jacques a Monoda ujawniły istnienie cząsteczki komplementarnej do DNA, którą określono mianem RNA (ang. ribonucleic acid). W 1969 roku, za sprawą eksperymentów Francois Jacoba, Jacques a Monoda, Sydney a Brennera i Francis a Cricka stało się jasne, że to właśnie RNA stanowi brakujący element ekspresji informacji genetycznej pośredniczący w transporcie informacji genetycznej z jądra do cytoplazmy, gdzie w odpowiedzi uruchamiana jest synteza odpowiednich białek. RNA związane z tą funkcją określono mianem mrna (ang. messenger RNA). Wkrótce pojawiły się pierwsze pomysły wykorzystania kwasów nukleinowych jako narzędzi do manipulacji genetycznych lub dostarczania organizmowi matryc do syntezy odpowiednich białek w celach terapeutycznych. Odkrycie potencjału terapeutycznego zgromadzonego w kwasach nukleinowych takich jak DNA, RNA i ich modyfikowanych pochodnych stało się źródłem wielu przełomowych odkryć w dziedzinie medycyny w ostatnich latach. mrna, ze względu na wyższe bezpieczeństwo stosowania niż DNA wydaje się szczególnie interesującym narzędziem dostarczania informacji genetycznej do komórek. W przeciwieństwie do DNA, mrna nie wymaga dostarczania do jądra a jedynie do cytoplazmy komórek, nie może integrować z genomem gospodarza, a odpowiedź związana z aktywnością mrna jest przejściowa. Wszystko to wskazuje na wyższość stosowania mrna jako narzędzia terapeutycznego. Jednakże, pomimo niezaprzeczalnych zalet mrna, możliwość jego praktycznego wykorzystania przez długi czas spotykała się z powątpiewaniem. Przyczyną wątpliwości była niestabilność mrna utrudniająca jakąkolwiek pracę laboratoryjną i 17

18 praktyczne zastosowania mrna, jak również wysoka immunogenność obcego mrna dostarczanego do organizmu, wywołująca odpowiedź immunologiczną podobną do odpowiedzi towarzyszącej infekcjom wirusowym. Postęp w badaniach nad zniwelowaniem powyższych negatywnych skutków przyczynił się do zaakceptowania mrna jako realistycznej i bezpieczniejszej alternatywy dla DNA i opracowania szeregu potencjalnych terapii. W niniejszym rozdziale przedstawiono wybrane obiecujące terapie oparte o mrna takie jak najbardziej zaawansowana klinicznie immunoterapia antynowotworowa za pomocą mrna, białkowe terapie zastępcze, przeprogramowywanie komórek czy wydłużanie telomerów. I.2.1 Immunoterapia antynowotworowa za pomocą mrna Zainteresowanie mrna jako narzędziem do produkcji szczepionek antynowotworowych sięga 25 lat wstecz. Niestety, ze względu na szybką degradację cząsteczki in situ zastosowanie mrna wydawało się jedynie pozbawioną realizmu ideą i natrafiało na sceptycyzm badaczy. Pierwszym znaczącym krokiem naprzód na drodze do wykorzystywania terapeutycznego mrna była transfekcja ex vivo komórek dendrytycznych (wyspecjalizowanych komórek układu odpornościowego odpowiedzialnych za prezentację antygenów i stymulację układu immunologicznego) [1,2]. Pomysł bezpośredniego zastosowania mrna jako swoistej szczepionki odrodził się jednak ostatnimi laty wraz z rozwojem metod stabilizacji cząsteczki mrna i doskonaleniem technik pracy z tym materiałem. Obecnie mrna jest określane jako idealny wektor do indukcji odpowiedzi odpornościowej przeciwko nowotworom, co potwierdza rosnąca liczba badań i aplikacji klinicznych szczepionek mrna [3]. Jednym z dowodów na przełomowość metod terapeutycznych opartych o mrna może być fakt, że magazyn Science uznał immunoterapię nowotworów mrna za przełom roku 2013 w medycynie jako jedną z najbardziej obiecujących terapii przeciw rakowi [4]. 18

19 Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie podstawy działania immunoterapii Komórki nowotworowe posiadają na swojej powierzchni charakterystyczne markery, nie są one rozpoznawane przez komórki układu immunologicznego jako obce. Dostarczenie danego markera w postaci antygenu zakodowanego w postaci mrna (1) do komórek (2) prowadzi do wytworzenia danego antygenu wewnątrz komórki dendrytycznej (3), jego strawienia i przeniesienia jego fragmentów na powierzchnie komórki. Fragmenty antygenów prezentowane są następnie limfocytom, które uczą się w ten sposób rozpoznawać dany antygen jako obcy i gdy odnajdą w organizmie komórki oznaczone danym markerem uruchamiają mechanizmy prowadzące do zniszczenia komórki (4). Niszczone są więc jedynie komórki nowotworowe, zdrowe komórki pozostają nienaruszone. Ponadto, w kolejnym zetknięciu z tym samym antygenem organizm jest w stanie sam zwalczyć nowotwór. Na czym polega immunoterapia za pomocą mrna i co wyróżnia ją od tradycyjnych metod walki z nowotworami? Immunoterapia nowotworów polega na pobudzeniu układu immunologicznego pacjenta do rozpoznawania i walki z nowotworem. W tym celu stosuje się specjalne szczepionki antynowotworowe. W przeciwieństwie do tradycyjnych szczepionek nie są one podawane w celu zapobiegania chorobie, lecz mają za zadanie powstrzymać rozwój już istniejącej i postępującej choroby nowotworowej. Szczepionki immunologiczne wprowadzają do 19

20 organizmu antygen nowotworowy (fragmenty proteinowe występujące na powierzchni komórki nowotworowej, charakterystyczne dla danego nowotworu), który wywołuje odpowiedź immunologiczną (ang. antigen = antibody generator) (Rysunek 1). Wyboru antygenu dokonuje się na podstawie identyfikacji antygenów na komórkach nowotworowych, przeciwko którym zostają wytworzone przeciwciała wiążące się z tymi konkretnie antygenami. Ze względu na dużą zmienność antygenów pomiędzy chorymi, terapia ma ściśle spersonalizowany charakter i wymaga wcześniejszego identyfikowania chorych, którzy odniosą korzyść z terapii [3]. I Komórki dendrytyczne w immunoterapii Komórki dendrytyczne to jedne z głównych komórek układu odpornościowego odpowiedzialnych za prezentację antygenu. Stymulacja komórek dendrytycznych prowadzi do aktywacji cytotoksycznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenowi. Aktywacja komórek dendrytycznych następuje po dostarczeniu antygenu do wnętrza komórki. Niedojrzałe komórki dendrytyczne nieustannie i z dużą wydajnością absorbują substancje z otoczenia na drodze endocytozy, fagocytozy lub pinocytozy [5][6]. Antygeny te są następnie trawione i fragmenty białka zostają przeniesione na powierzchnię komórki, co określa się mianem prezentacji antygenu. Prezentowane antygeny odczytywane są przez komórki efektorowe limfocyty T (CD4+, CD8+) i limfocyty B. Limfocyty te odnajdują w organizmie komórki oznaczone tym samym antygenem nowotworowym i wywołują przeciwko nim odpowiedź cytotoksyczną, nie uszkadzając jednocześnie zdrowych komórek, jak w przypadku tradycyjnych chemioterapii nowotworów [3]. Ze względu na swoje unikalne właściwości komórki dendrytyczne stały się podstawowym miejscem docelowym dostarczenia antygenu o potencjale immunoterapeutycznym. I Metody dostarczania mrna do komórek DC Jednym z typowych problemów terapii komórkowych jest sposób dostarczenia kwasu nukleinowego do komórek. Kwasy nukleinowe, w tym mrna, jako molekuły silnie polarne o ładunku ujemnym trudno zmusić do przekroczenia silnie niepolarnej błony komórkowej. Dostarczenie terapeutyka w postaci kwasu nukleinowego do komórek wymaga więc opracowania odpowiedniej metody jego dostarczania. 20

21 Metody transfekcji komórek mrna wykorzystują m.in. techniki pozwalające na zabezpieczenie mrna przed gwałtowną degradacją oraz ułatwiające przekroczenie błony komórkowej i wniknięcie do wnętrza komórki. Przykładami stosowanych czynników transfekcyjnych mogą być dodatnio naładowane lipidy, liposomy, modyfikowane nanocząstki złota, polimery. Przykładowo, polietylenoiminę, kationowe polipeptydy lub dendrymery [7,8] stosowano do zamaskowania ujemnego ładunku mrna lub otoczenie mrna niepolarną otoczką rozpuszczającą się w błonie komórkowej i wypuszczającej mrna do wnętrza komórki. Materiały te są dostępne komercyjnie i obecnie obserwuje się coraz większe spektrum dostępnych czynników transfekcyjnych, co przyczynia się do postępu w pracy nad badaniem działania leków wewnątrz komórek. Elektroporacja, po raz pierwszy zastosowana do transferu genów w 1982 roku [9] jest obecnie preferowaną metodą transfekcji komórek hematopoetycznych (pochodzących ze szpiku kostnego, w tym DCs). Elektroporacja to jedna z technik biologii molekularnej, w której po wpływem pola elektrycznego przyłożonego do komórek (impulsy elektryczne), zwiększa się przepuszczalność błony komórkowej i możliwe jest wniknięci do środka komórek pożądanego materiału np. związków chemicznych, leków, kwasów nukleinowych. Ze względu na to, że gwałtowny impuls elektryczny jest dużym stresorem dla komórek, konieczne jest natychmiastowe zapewnienie im odpowiednich warunków do regeneracji (wysokoodżywcze medium, odpowiednia temperatura). Niska wydajność innych metod transfekcji może wynikać z faktu, że metody te wymagają długiego inkubowania mrna z komórkami w środowisku odpowiedniego medium komórkowego, w którym mrna jest bardzo labilne. Elektroporacja natomiast, jest procesem szybkim, w którym długa inkubacja mrna z komórkami nie jest konieczna, pod wpływem pulsu elektrycznego mrna przenoszone jest z medium komórkowego do wnętrza komórek [8]. Jeśli chodzi o dostarczanie mrna in vivo, to warto wyjaśnić, że wiele typów komórek jest w stanie spontanicznie pobierać nagie mrna z przestrzeni międzykomórkowej. mrna jest wchłaniane do środka komórki w procesie endocytozy i akumuluje się w lizosomach, z których tylko niewielka ilość mrna przedostaje się ( przecieka ) do cytoplazmy [10]. Mechanizm wypuszczania mrna do cytoplazmy nie jest jeszcze dokładnie zbadany i może się różnić pomiędzy poszczególnymi typami komórek. Poza tym, mrna jest wymieniane poprzez egzosomy pomiędzy komórkami [11]. W większości komórek pobór mrna jest mało wydajny i osiąga maksimum nawet przy niskich stężeniach mrna. Niedojrzałe komórki dendrytyczne 21

22 (idcs), wyspecjalizowane w nieustannym próbkowaniu otoczenia i pobieraniu wielu różnych potencjalnych antygenów z przestrzeni międzykomórkowej, są tu wyjątkiem, gdyż są one zdolne do pobierania mrna w procesie makropinocytozy dzięki czemu akumulują antygeny, w tym zewnątrzkomórkowe mrna, znacznie efektywniej a absorbcja rośnie przy większych stężeniach potencjalnych antygenów [6]. W konsekwencji, dostarczenie mrna do większości typów komórek wymaga pewnych rozwiązań, które chroniły by IVT-RNA przed atakiem zewnątrzkomórkowych RNaz oraz ułatwiały wniknięcie do komórek. W wypadku niedojrzałych komórek dendrytycznych wnikanie mrna jest możliwe nawet bez stosowania podobnych manipulacji. Za najbardziej efektywną technikę wprowadzania nieosłoniętego mrna uważa się iniekcję mrna podskórnie (pobór mrna przez komórki DCs typ Langerhansa) lub bezpośrednio do węzłów chłonnych (duża koncentracja DCs) [12] (Rysunek 2). Rysunek 2. Dostarczanie mrna do komórek dendrytycznych oraz prezentacja antygenu limfocytom Jedną z najskuteczniejszych technik dostarczania nieosłoniętego mrna do komórek dendrytycznych (DC) jest wprowadzenie mrna do miejsc o dużym zagęszczeniu DC, np. podskórnie lub do węzłów chłonnych (1). mrna ulega syntezie wewnątrz komórki, na skutek czego powstaje pożądane białko (antygen). Białko jest 22

23 następnie procesowane a jego fragmenty trafiają na powierzchnię komórki i są prezentowane odpowiednim limfocytom (limf. T CD4+ i CD8+) (2). Limfocyty uczą się rozpoznawać dany antygen jako obcy i uruchamiają odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom zawierającym go na powierzchni. I Szczepionki mrna przeciw chorobom zakaźnym i alergiom Większość podejść z wykorzystaniem szczepionek mrna skupia się na terapiach antynowotworowych, jednak warto wspomnieć, że metodologia szczepionek mrna została z sukcesem zaadaptowana również przy opracowywaniu metod zwalczania innych chorób, w szczególności alergii typu I, a także chorób zakaźnych wywołanych wirusami, np. wirusem grypy [13] [14]. Koncept immunoterapii wykorzystującej mrna do zwalczania alergii różni się od konwencjonalnych immunoterapii tym, że buduje tolerancję wobec danego antygenu, a nie wywołuje silnej odpowiedzi cytotoksycznej (pobudza inny typ odpowiedzi immunologicznej). mrna kodujące dany alergen lub hipoalergen może być dostarczane transdermalnie (podskórnie) [15]. Immunoterapia za pomocą mrna może być również wykorzystana jako narzędzie do walki z chorobami wirusowymi. Większość tradycyjnych szczepionek przeciwko grypie zawiera hamaglutyninę i neuraminidazę, dwa białka znajdujące się na powierzchni wirusa. Izolacja i otrzymanie dużej ilości tych białek w czystej postaci jest procesem bardzo czasochłonnym, co w wypadku epidemii nie pozwala na szybką reakcję. Wykorzystanie mrna kodującego oba białka i dostarczenie do komórek (dostarczenie podskórne do DCs) wyzwala podobną, a nawet silniejszą odpowiedź immunologiczną niż tradycyjne terapie. Ponadto, zastosowanie mrna ma wiele zalet. Nie ma potrzeby hodowli wirusa, wystarczy znać sekwencje białek produkcja szczepionki trwa więc ok 6-8 tygodni a nie miesiące jak w wypadku tradycyjnych szczepionek, koszt jest więc dużo niższy. Warunki przechowywania nie są tak restrykcyjne jak dla zwykłej szczepionki, co ułatwia dystrybucję. Metoda produkcji pozwala na uniknięcie reakcji alergicznych na składniki zwykłej szczepionki (ślady ovalbuminy). Niestety, podobnie jak tradycyjne szczepionki, szczepionka mrna również wymaga dostosowywania do sezonowych mutacji wirusa [16]. 23

24 I.2.2 Białkowa terapia zastępcza (ang. protein replacement therapy) Jednym z najbardziej oczywistych pomysłów wykorzystania mrna w terapiach jest wykorzystanie mrna do produkcji białek potrzebnych organizmowi, których z jakichś powodów brakuje lub występują w niedomiarze (np. w defektach metabolicznych, takich jak hemofilia). Poważnym ograniczeniem tego prostego w teorii sposobu terapii jest immunogenność mrna, czyli zdolność do uruchamiania silnej odpowiedzi immunologicznej (stan zapalny). Kariko i współpracownicy [17] wykazali, że układ immunologiczny (komórki dendrytyczne i eksprymujące receptory TLR) jest silnie aktywowany przez bakteryjne i mitochondrialne RNA, ale nie przez RNA pochodzące całkowicie od ssaków. Podstawową różnicą pomiędzy tymi rodzajami RNA wskazaną jako przyczynę rozróżnienia ich jako swoje i obce RNA jest obecność wielu modyfikowanych nukleozydów w ssaczym mrna. Autorzy zasugerowali, że system immunologiczny potrafi rozpoznawać tego rodzaju modyfikacje w RNA. Potwierdzeniem badań był fakt, że po wprowadzeniu RNA z chemicznie modyfikowanymi nukleozydami odpowiedź układu odpornościowego znacząco się obniżyła a poziom translacji wzrósł [17]. Jako modyfikowane nukleozydy obniżające immunogenność RNA zidentyfikowano: pseudourydynę Ψ, 5-metylocytydynę (m 5 C), N6-metyloadenozynę (m 6 A), 5-metylourydynę (m 5 U) i 2-tiourydynę (s 2 U). Również usunięcie dsrna z próbek RNA pozwoliło na dodatkowe obniżenie aktywacji mechanizmów obronnych organizmu. Odkrycie, że wprowadzenie chemicznych modyfikacji zasad do mrna pozwala na upodobnienie egzogennego RNA do RNA endogennego poprzez obniżenie jego immunogenności otworzyło drzwi do rozwoju terapii zastępczych za pomocą mrna. Przykładami badań w których IVT-RNA zawierające modyfikowane nukleozydy obniżające immunogenność znalazło zastosowanie są badania dostarczania erytropoetyny do komórek makaków [18], czy czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, VEGF (z ang. vascular endothelial growth factor) do myszy, będących ważnymi białkami terapeutycznymi [19]. Ominięcie problemu immunogenności mrna wywarło duży wpływ również na badania nad przeprogramowywaniem komórek do stanu macierzystego (rozdział I.2.3) Możliwości wykorzystania technologii wprowadzania dowolnych białek naprawczych za pomocą mrna w medycynie wydają się być ogromne, a licencje na technologie związane z produkcją farmaceutycznego IVT-RNA stają się obecnie przedmiotem wielomilionowych umów pomiędzy 24

25 koncernami farmaceutyczno-biotechnologicznymi (np. rekordowy US$240 milionowy kontrakt pomiędzy Astra Zenecą i Moderną). Bardzo szybko powstają nowe firmy (np. Argos Therapeutics, BioNTech, CureVac, etherna, Ethris, Factor Bioscience, Moderna and Onkaido) oraz ośrodki uniwersyteckie (np. the RNA Therapeutic Institute at the University of Massachusetts, USA, the Yale Center for RNA Science and Medicine, USA, the RNA Institute at the University at Albany, State University of New York, USA, TRON-Translational Oncology at the University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, Germany) zajmujące się opracowywaniem technologii produkcji terapeutycznych mrna i ich medycznych zastosowań [20]. Poszukiwanie chemicznych modyfikacji mrna w celu udoskonalenia jego właściwości spotyka się więc z zainteresowaniem zarówno środowiska naukowego jak i farmaceutycznego i szansą komercjalizacji badań. I.2.3 Przeprogramowywanie komórek Termin przeprogramowywania komórek oznacza możliwość zamiany każdej, nawet dojrzałej wyspecyfikowanej komórki, w komórkę macierzystą. Odkrycie przeprogramowywania komórek do tzw. indukowanej pluripotencji dokonane w 2006 roku przez Yamanakę i Takahashi zmieniło raz na zawsze sposób postrzegania komórek macierzystych i otworzyło nowe potencjalne możliwości w medycynie regeneracyjnej i transplantologii [21]. Indukowane pluripotentne komórki macierzyste określane skrótem ipscs (ang. induced pluripotent stem cells) mogą tworzyć każdy rodzaj komórki w organizmie. Tylko embrionalne komórki macierzyste są naturalnie pluripotentne a ich pozyskiwanie wiąże się z wieloma problemami natury etycznej. ipscs mogą zastąpić w badaniach embrionalne komórki macierzyste. Sam proces przeprogramowywania polega na dostarczeniu do komórek genów czterech czynników transkrypcyjnych: (Oct4, Sox2, Klf4 i c-myc), które wywołują powrót komórki do stanu pluripotencji [21]. Do niedawna wytwarzanie komórek ipscs wiązało się z dostarczaniem powyższych czynników transkrypcyjnych w postaci DNA, najczęściej za pomocą wektorów retrowirusowych, co wiązało się z ryzykiem dokonania trwałych zmian wewnątrz komórki sprzyjającym tworzeniu się nowotworów. Dodatkowo niska wydajność przeprogramowywania wynosząca od 0.01 to 0.1% komórek wyjściowych i długi czas hodowli (4 tygodnie) [21] obniżały początkowy entuzjazm naukowców. Badania nad rozwojem technologii otrzymywania 25

26 ipscs nakierowane są więc na podwyższenie bezpieczeństwa, szybkości i wydajności produkcji ipscs. Spośród wielu możliwych kierunków badań największe zainteresowanie wzbudziła praca opublikowana przez Warrena i współpr. na temat reprogramowania komórek za pomocą mrna [22] (Rysunek 3.) Innowacyjne użycie syntetycznego mrna eliminuje ryzyko zmodyfikowania genomu gospodarza towarzyszące użyciu DNA. Metoda jest także łatwiejsza i wydajniejsza niż bezpośrednia transdukcja białek, gdyż mrna ulega wielokrotnej translacji zanim zostanie zdegradowane w cytoplazmie. Białka wyprodukowane wewnątrz komórki na podstawie dostarczonego mrna posiadają odpowiednie modyfikacje post-translacyjne, dzięki którym wykazują większą aktywność i lepszą lokalizację aniżeli egzogenne białka. Bezpieczeństwo dostarczania genów zostało wykazane w testach klinicznych dotyczących mrna [23]. 26

27 Rysunek 3. Przeprogramowywanie komórek do pluripotencji za pomocą mrna W cele przeprogramowania dojrzałych zróżnicowanych komórek (np. fibroblastów) spowrotem do stanu pluripotencji wykorzystywane są czynniki transkrypcyjne zdidentyfikowane przez Tamanakę: KLF4, SOX2, c-myc,nanog, Oct-3/4, Lin-28. Mogą być one dostarczone za pośrednictwem mrna, co obniża ryzyko mutagagenezy komórek, w porównaniu do dostarczania za pomocą DNA (1). W rezultacie otrzymujemy indukowane za pomocą RNA pluripotentne komórki macierzyste (RiPSC), z których można wyprowadzić wiele typów komórek (2) Indukowanie komórek do pluripotencji za pomocą mrna wydaje się właściwym kierunkiem rozwoju technologii reprogramowania. Jednakże metoda ma również swoje ograniczenia. Pierwszym jest krótki czas życia mrna w komórce, podczas gdy wydajne przeprogramowanie komórek wymaga stałej ekspresji czynników transkrypcyjnych przez ok. 2 tygodnie. Problem ten obecnie jest omijany poprzez codzienną transfekcję komórek za pomocą mrna. Wadą tej metody jest wysoka cytotoksyczność wywoływana przez częste transfekcje egzogennego mrna. Redukcja immunogenności mrna za pomocą stosowania odpowiednio metylowanego mrna oraz podwyższenie stabilności mrna za pomocą prostych analogów typu ARCA pozwoliło na 27

28 wypracowanie 35-razy bardziej wydajnego protokołu przeprogramowywania komórek niż ten zaproponowany przez Tamanakę i Takahashi [22]. Nowa technika jest ważnym krokiem w kierunku tworzenia komórek pochodzących z komórek ips, które byłyby bezpieczne dla pacjentów. Konieczne są dalsze badania nad wydajnym wytwarzaniem bezpiecznych komórek RiPSCs, w których modyfikacje wprowadzane za pomocą analogów kapu mogą okazać się bardzo użyteczne jako narzędzie do wydłużenia czasu życia mrna w komórkach i ilości produkowanych czynników transkrypcyjnych. I.2.4 Wydłużanie telomerów Kolejnym potencjalnym zastosowaniem mrna w celach terapeutycznych jest wydłużanie telomerów (fragmentów na końcu chromosomów zabezpieczających DNA przed uszkodzeniem w czasie kopiowania) za pomocą wprowadzenia do ludzkich fibroblastów i mioblastów specjalnie zmodyfikowanego mrna, kodującego odwrotną transkryptazę telomerazy zwaną TERT (ang. telomerase reverse transcriptase) [24]. Ze względu na związek telomerazy i telomerów z procesami starzenia, powyższa metoda stanowi szansę na skuteczną terapię odmładzającą. Metoda jest pierwszą skuteczną i bezpieczną metodą wydłużania ludzkich telomerów. Po wprowadzeniu za pomocą mrna genów TERT aktywność telomerazy w komórkach wzrosła w przeciągu godzin, po trzech transfekcjach telomery zostały wydłużone 0.9 kb a podziały komórkowe stały się bardziej intensywne. Po upływie 2 dni aktywność telomerazy wraca do normalnego poziomu i telomery ulegają dalszemu skracaniu, dzięki czemu nie istnieje ryzyko niekontrolowanego podziału komórek [24]. Wypracowana metoda może doprowadzić do stworzenia terapii, pozwalającej na szybkie cofnięcie długoletnich efektów skracania telomerów. Podobnie jak we wszystkich wcześniej wskazanych terapiach stabilność i wydajność translacji mrna odgrywa duże znaczenie w powodzeniu tej metody. I.2.5 Przeszkody na drodze do skutecznych terapii opartych o mrna Poza wspomnianym w rozdziale I problemie dostarczania kwasów nukleinowych do komórek, dwa inne podstawowe wyzwania wymagają opracowania skutecznych rozwiązań aby 28

29 doprowadzić do pełnego sukcesu terapiie oparte o mrna. Pierwsze wyzwanie dotyczy osiągnięcia wystarczająco wysokiej produkcji białka z dostarczonego mrna, drugie dostarczenia mrna do wystarczającej liczby komórek. Przykładowo, gęstość prezentacji antygenu na powierzchni komórek DC oraz siła wywołanej odpowiedzi immunologicznej zależna jest od dawki dostarczonego antygenu na matrycy mrna [25]. W przypadku niektórych terapii ważniejsze od ilości dostarczonego białka wydaje się dostarczenie go do wystarczająco dużej rzeszy danych komórek [20]. Otrzymanie wydajnej syntezy białka wewnątrz komórki jest wypadkową dwóch procesów: translacji mrna oraz jego degradacji. Procesy te są silnie ze sobą powiązane i często obniżenie wydajności jednego z tych procesów powoduje zwiększenie wydajności drugiego. Eksplorowanym w niniejszej pracy doktorskiej pomysłem na kontrolę procesów translacji i degradacji mrna w komórkach, jest otrzymanie chemicznie modyfikowanego mrna charakteryzującego się większą stabilnością oraz wydajniejszą translacją, tak że po dostarczeniu do komórek obserwowanym oczekiwanym efektem modyfikacji jest zwiększona produkcja białka. Koncept, w jaki sposób modyfikacje mrna mogą mieć wpływ na translację i trwałość mrna zostało wytłumaczone w kolejnych rozdziałach. I.3. mrna I.3.1 Podstawowe właściwości kwasów nukleinowych W centrum uwagi niniejszej rozprawy doktorskiej znajduje się mrna i udoskonalanie jego właściwości translacyjnych metodami chemicznych modyfikacji. Zrozumienie przyczyny problemów ze stabilnością RNA, tak utrudniających jego wykorzystanie terapeutyczne, tkwi w strukturze chemicznej samej cząsteczki. W niniejszym rozdziale przedstawiono więc budowę kwasów nukleinowych i podstawowe różnice pomiędzy DNA i RNA. Przedstawiono także mechanizmy kryjące się za niestabilnością RNA oraz podstawowe zasady pracy z RNA pozwalające uniknąć problemów z przypadkową degradacją próbek. Przedstawione informacje pozwalają na zrozumienie problemu niskiej trwałości RNA i stanowią wyjaśnienie dlaczego przez wiele lat RNA wydawało się mało prawdopodobnym narzędziem terapeutycznym, a cała uwaga skierowana była na DNA jako jedyne możliwe narzędzie do tego celu. 29

30 Następnie skupiono się na roli biologicznej samego mrna, w szczególności na procesach translacji i degradacji mrna, charakterystycznych elementach budowy mrna jako potencjalnych miejsc modyfikacji oraz znanych do tej pory modyfikacjach mrna. W końcowej części rozdziału zaprezentowano przegląd stosowanych do tej pory najpopularniejszych modyfikacji wzmacniających właściwości farmakokinetyczne mrna. I Struktura DNA i RNA Kwas rybonukleinowy nazywany w skrócie RNA jest biopolimerem zbudowanym z rybonukleotydów połączonych ze sobą wiązaniem 3-5 -fosfodiestrowym. RNA w swej budowie przypomina DNA, jednak oba kwasy dzieli wiele różnic strukturalnych, przejawiających się później w różnicach we właściwościach fizykochemicznych i biologicznych obu molekuł. Budowa fragmentu RNA i różnice strukturalne pomiędzy DNA i RNA przedstawione są na rysunku w tabeli (Tabela 1). 30

31 Tabela 1. Porównanie podstawowych różnic pomiędzy RNA i DNA. RNA Głównie jednoniciowe, z wyjątkiem gdy komplementarne sekwencje tworzą dwuniciową drugorzędową strukturę (np. struktura spinki) Resztę cukrową stanowi ryboza (dodatkowa grupa 2 OH nieobecna w deoksyrybozie) DNA Dwuniciowe (z wyjątkiem pewnych wirusowych DNA występujących w formie pojedynczej nici sdna) Resztę cukrową stanowi deoksyryboza Brak tyminy (z wyjątkiem trna), obecność uracylu Obecność tyminy, brak uracylu RNA łatwo ulega degradacji DNA odporne na hydrolizę ze względu na brak grupy 2 OH Głównie obecne w cytoplazmie, ale również niewielkie ilości RNA obecne w jądrze, głównie transkrypty oraz snrna Głównie umiejscowione w jądrze, niewielka część w mitochondriach Wielkość: bp Miliony par zasad, wielkość zależna od organizmu Różne typy RNA: mrna, rrna, trna, snrna, sirna, mirna, hnrna różniące się funkcją Tylko jeden typ DNA, funkcja: przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej Nie znaleziono do tej pory innych form fizjologicznych RNA. Poszczególne typy RNA nie zmieniają swojej formy. Różne formy DNA (od A do E i Z) RNA jest syntetyzowane na podstawie matrycy DNA, nie może samo stać się matrycą do produkcji DNA (z wyjątkiem działania odwrotnej transkryptazy i pewnych wirusów dla których stanowi materiał genetyczny DNA może być syntetyzowane na podstawie DNA w procesie replikacji. DNA może być także matrycą do syntezy RNA w procesie transkrypcji Wiele kopii tego samego jest RNA obecnych w komórce Jedna kopia danego DNA obecna w komórce (z wyjątkiem podziału komórki) I Stabilność DNA i RNA Podczas gdy DNA jest dość odporne na spontaniczną hydrolizę, RNA jest podatne na degradację w roztworach wodnych nawet precyzyjnie buforowanych do neutralnego ph. Nie stanowi to problemu fizjologicznego, gdyż RNA służy jedynie do czasowego przenoszenia informacji genetycznej, podczas gdy zadaniem DNA jest magazynowanie tej informacji przez całe życie organizmu. Stanowi to natomiast problem w efektywnej pracy laboratoryjnej z RNA, jak również ogranicza skuteczność terapeutycznych RNA. 31

32 Dlaczego hydroliza zachodzi znacznie łatwiej i szybciej w przypadku RNA niż w przypadku DNA? Odpowiedź na to pytanie znajduje się w strukturze samego RNA, a mianowicie w obecności grupy hydroksylowej w pozycji 2 reszty cukrowej nieobecnej w deoksyrybozie w DNA. Obecność i ułożenie przestrzenne tej grupy umożliwia jej atak nukleofilowy na atom fosforu wiązania 3-5 fosfodiestrowego, utworzenie cyklicznego diestru fosforanowego, i następcze otwarcie nowoutworzonego pierścienia poprzez hydrolizę [26] (Rysunek 4). 3' 2' 3' 2' 5' 5' Rysunek 4. Hydroliza RNA Grupa 2 OH może działać jako wewnętrzny nukleofil w reakcji transestryfikacji wiązania 3-5 fosfodiestrowego. W etapie przejściowym powstaje atom fosforu połączony z pięcioma atomami tlenu. Przerywane linie wskazują na alternatywne miejsca przerwania wiązania. Następnie atom fosforu zostaje odłączony od atomu tlenu i przyłącza się do najbliższej reszty cukrowej tworząc cykliczną strukturę. W rezultacie, RNA ulega rozcięciu na dwa polinukleotydowe fragmenty, jeden zakończony z 2-3 cyklicznym fosfodiestrem, a drugi z wolną grupą 5 - OH. B = zasada azotowa: A,U,C,G Konsekwencje tego faktu przejawiają się w pracy laboratoryjnej z RNA, która wymaga ostrożności i uwagi. Próbki muszą być przechowywane w niskich temperaturach, najlepiej w formie zliofilizowanej lub wytrącone w etanolu, aby uniknąć hydrolizy. Dodatkowo, przypadkowa hydroliza próbek RNA jest związana z wszechobecnymi RNazami (obecnymi m.in. na skórze człowieka, bardzo stabilnymi, długo-żyjącymi i trudnymi do usunięcia) katalizującymi hydrolizę RNA (Rysunek 5). RNaza A wykorzystuje resztę histydyny, która może służyć jako zasada i akceptor protonu z grupy 2 OH, jednocześnie służąc jako donor protonu dla grupy 5 OH. Reszta lizyny stabilizuje ujemnie naładowane atomy tlenu w stanie przejściowym procesu hydrolizy RNA [27]. 32

33 3' 2'.. H : δ + H: H: δ + ENZYM : ENZYM Rysunek 5. Hydroliza RNA przez rybonukleazy Mechanizm działania rybonukleaz. Inhibitorami działania rybonukleaz są 2'-O-fosforan cytydyny, 3'-O-fosforan cytydyny, dodecylosiarczan sodu, DNA, witamina B12, kwas foliowy. R = reszta RNA, B= zasada azotowa: A,U,G,C. Warto wspomnieć, że hydroliza RNA sama w sobie może być użytecznym procesem, o czym świadczą liczne zastosowania rybozymów, katalizujące reakcję hydrolizy RNA, gdy chcemy je usunąć np. kontrolując prawidłowy splicing fragmentów zawierających mutację [28]. Mimo iż często wspomina się o wysokiej niestabilności RNA należy pamiętać, że przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności i warunków (rękawiczki, środowisko i reagenty wolne od RNaz, sterylność, obniżona temperatura), praca z RNA jest możliwa, a ryzyko niepożądanej hydrolizy niewielkie. Po wyeliminowaniu elementów sprzyjających hydrolizie można nawet stwierdzić, że cząsteczka RNA sama w sobie jest dosyć stabilna. Przykładowo, trudniej ulega depurynacji i depirymidynacji aniżeli DNA, gdyż ta sama sprzyjająca hydrolizie grupa 2 OH destabilizuje przejściowy kation powstający w trakcie depurynacji (Rysunek 6) [26]. 33

34 H 2 O Rysunek 6. Depurynacja DNA Mechanizm katalizowanej kwasem depurynacji i rozcięcia łańcucha DNA. Mechanizm pokazany dla nukleotydu guanozynowego, może również zachodzić dla adenozyny. Protonacja pozycji N7 pozwala na zerwanie wiązania N-glikozydowego. I.3.2 Funkcje i typy RNA We wszystkich organizmach prokariotycznych i eukariotycznych istnieją trzy podstawowe klasy RNA: informacyjne lub matrycowe RNA (ang. messenger RNA, mrna), transportujący (transferowy) RNA (ang. transfer RNA, trna), rybosomalny RNA (ang. ribosomal RNA, rrna). Funkcją mrna jest przenoszenie informacji genetycznej z jądra do cytoplazmy. Kolejność zasad w mrna, komplementarna do nici DNA na podstawie której powstało, stanowi kod dla kolejności aminokwasów białka syntetyzowanego na matrycy mrna w procesie translacji. trna mają za zadanie przyłączać wolne aminokwasy znajdujące się w cytoplazmie (aminoacylo-trna) i transportować je do rybosomów, gdzie zostaną przyłączone do syntetyzowanego polipetydu. rrna wchodzi w skład rybosomów odpowiedzialnych za proces biosyntezy białek. Udział poszczególnych klas RNA w całkowitej puli komórkowego RNA wynosi odpowiednio mrna- 5%, trna 10-12%, rrna 80% [26]. Poza trzema wspomnianymi podstawowymi klasami RNA, możemy wyróżnić wiele dodatkowych klas RNA, występującej w komórkach w znacznie mniejszej ilości, jednak pełniących bardzo ważne funkcje regulacyjne i sygnalizacyjne. Można tu wymienić [26]: heterogenne jądrowe RNA (hnrna lub pre-mrna): obecne w jądrze produkty transkrypcji DNA i obróbki transkryptu do postaci mrna małe jądrowe RNA (snrna) : biorą udział w wycinaniu intronów z transkryptów małe jąderkowe RNA (snorna): pełnią funkcje w chemicznych modyfikacjach premrna 34

35 antysensowne RNA albo interferencyjne RNA (sirna i mirna): funkcje regulacyjne w ekspresji genów kodujących białka małe cytoplazmatyczne RNA (scrna) biorą udział w rozpoznawaniu sygnalizacji komórkowej. I.3.3 Elementy charakterystyczne eukariotycznego mrna Typowe eukariotyczne mrna w swojej dojrzałej formie (po obróbce post-transkrypcyjnej) posiada oprócz sekwencji kodującej charakterystyczne elementy strukturalne takie jak 5 -kap, nieulegające translacji sekwencje 3 -UTR i 5 -UTR oraz ogon poli A (Rysunek 7). W poniższych rozdziałach przedstawiono pokrótce budowę i rolę poszczególnych elementów struktury mrna. Rysunek 7. Struktura typowego dojrzałego mrna eukariotycznego Do elementów strukturalnych eukariotycznego mrna należą: struktura 5 kapu (czapeczki), regiony niekodujące 5 UTR i 3 UTR, ogon poli A. I Struktura kapu W trakcie transkrypcji syntetyzowana jest na końcu 5 unikalna struktura zwana strukturą kapu. Kap zbudowany jest z dodatnio naładowanego nukleozydu N7-metyloguanozyny, 35

36 połączonego łańcuchem 5-5 trifosforanowym z pierwszym transkrybowanym nukleotydem mrna (Rysunek 8) [29]. Rysunek 8. Struktura końca 5 mrna, tzw. kapu Struktura 5 końca mrna zbudowana jest z dodatnio naładowanego nukleozydu, N7-metyloguanozyny, połączonego z mrna za pomocą nietypowego wiązania (mostka) 5,5 -trifosforanowego. Ze względu na stopień metylacji ryboz w pierwszych nukleotydach łańcucha mrna, możemy wyróżnić kap 0 (brak metylacji), kap 1 (metylacja grupy 2 OH pierwszego transkrybowanego nukleotydu) i kap 2 (metylacja grup 2 OH w dwóch pierwszych nukleotydach transkryptu). Kolejne grupy fosforanowe w mostku 5, 5 - trifosforanowym oznaczane są literami alfabetu greckiego tak jak na rysunku. Na proces biosyntezy kapu składają się trzy podstawowe reakcje: najpierw 5 -trifosfataza usuwa 5 -fosforan z końca 5 nowo utworzonego pre-mrna; następnie guanylotransferaza przyłącza resztę GMP poprzez wiązanie 5-5 -trifosforanowe na koniec 5 transkryptu; w ostatnim etapie następuje metylacja pozycji N7 guanozyny przeprowadzana przez enzym Guanylo-N7-metylotransferazę. Cały proces biosyntezy przedstawiono schematycznie na rysunku (Rysunek 9). Dodatkowo, w zależności od organizmu, dochodzi również do metylacji grup 2 - OH w pierwszym (kap 1) i drugim nukleotydzie transkryptu (kap 2) (Rysunek 8). Kap 2 jest typową strukturą kapu spotykaną u człowieka [30]. 36

37 Kap wyróżnia spośród naturalnych nukleotydów wchodzących w skład kwasów nukleinowych zarówno wiązanie 5-5 -trifosforanowe jak i dodatni ładunek umiejscowiony na zasadzie azotowej. Jedynym znanym do tej pory naturalnym nukleotydem podobnym w swej strukturze do kapu (ładunek dodatni, wiązanie 5-5 difosforanowe) jest NAD + (Rysunek 9), który jak odkryto niedawno może pełnić rolę 5 kapu u pewnych bakterii [31]. Kap można znaleźć także w wielu wirusowych mrna. mrna prokariotyczne, pozbawione struktury kapu, nie jest funkcjonalne w aparacie syntetycznym u eukariontów. Kap stanowi fragment mrna o bardzo dużym znaczeniu, gdyż wchodzi w specyficzne interakcje z różnymi czynnikami białkowymi regulującymi ekspresję informacji genetycznej oraz metabolizm RNA. Z punktu widzenia niniejszej pracy, najważniejsze procesy, w które zaangażowany jest kap to inicjacja translacji i ochrona przed degradacją mrna. Rola kapu w tych procesach została szczegółowiej opisana w rozdziale I.3.5. Rysunek 9. A. Biosynteza kapu. B. NAD+ jako analog kapu znaleziony u bakterii. I Sekwencje UTR 37

38 Nie ulegające translacji sekwencje UTR (ang. untranslated region) otaczają obszar zawierający sekwencję kodującą od strony 5 i 3. Funkcja UTR powiązana jest z kontrolą procesu translacji [26]. Sekwencje nukleotydów w UTR mogą zmieniać stabilność mrna [25]. Specjalne sekwencje obecne w UTR wiążące czynniki trans (np. czynniki translacyjne i rybosomy) wpływają na transport, proces inicjacji syntezy, szybkość translacji, dojrzewanie mrna oraz jego degradację. UTR tworzą również wyższe struktury drugo- i trzeciorzędowe, i to właśnie ich budowa odpowiedzialna jest za ich zdolności regulacyjne np. sekwencje IRE (ang. iron responsive elements) tworzące struktury spinki i stabilizujące lub destabilizujące mrna w zależności od stężenia jonów żelaza [32]. Długość 3 UTR u człowieka wynosi ok. 800 nukleotydów, podczas gdy 5 UTR jest mniej więcej czterokrotnie krótszy. Wykazano, że dłuższy UTR koreluje z niższą efektywnością translacji [33], [34]. Skład nukleotydowy również znacznie różni się pomiędzy 3 i 5 UTR 5 UTR charakteryzuje się wyższą zawartością par GC, podczas gdy dla 3 UTR charakterystyczna jest obecność elementów bogatych w pary AU (ARE, ang. AU rich elemets) takich jak np. sygnał poliadenylacji [35]. I Ogon poli A Ogon poli A to sekwencja obecna na końcu 3 dojrzałego mrna złożona z powtarzających się nukleotydów adenozynowych o zróżnicowanej długości od kilkudziesięciu do kilkuset nukleotydów (nawet mrna tego samego typu mogą posiadać poli A o różnej długości). Synteza poli A odbywa się w procesie zwanym poliadenylacją, przebiega w jądrze komórkowym i nie wymaga matrycy. Po zakończeniu syntezy transkryptu mrna jest przecinane przez specyficzną endonukleazę w pewnej odległości od sygnału poliadenylacji AAUAAA, a następnie polimeraza poli A (PAP, ang. poly A polymerase) dołącza (do końca 3') od 50 do 250 nukleotydów adeninowych [36]. Ogon poli A chroni mrna przed degradacją w jądrze komórkowym, jest niezbędny do inicjacji biosyntezy białka, wpływa na wydajność translacji oraz spowalnia degradację mrna w cytoplazmie [37]. I Sekwencja kodująca 38

39 Poza opisanymi w poprzednich rozdziałach sekwencjami regulującymi nadającymi pewną niezbędną stabilność transkryptowi mrna, najważniejszym elementem mrna, niosącym informacje o rodzaju i strukturze białka, jest sekwencja kodująca. Sekwencja kodująca rozpoczyna się od kodonu start (zwykle AUG) znajdującego się w sekwencji Kozak, wymaganego do inicjacji translacji, a kończy się kodonem stop (UAG, UGA lub UAA) sygnalizującym miejsce terminacji translacji [38]. Sekwencja zbudowana jest z trójzasadowych kodonów dających 4 3 = 64 możliwych kombinacji przypisanych do konkretnego aminokwasu lub sygnału stop. I.3.4 Synteza mrna transkrypcja in vitro Jedną z najwygodniejszych metod syntezy dużej ilości mrna jest transkrypcja mrna in vitro (Rysunek 10). Aby otrzymać transkrypt mrna należy posiadać odpowiednią matrycę DNA. Oprócz sekwencji pożądanego genu, musi ona zawierać promotor transkrypcyjny. Do najczęściej wykorzystywanych polimeraz należą polimerazy bakteriofagowe T7, T3 czy SP6 [27]. Promotor można dodać poprzez PCR w którym jeden z primerów posiada fragment kodujący promotor dla polimerazy. Innym sposobem jest wklonowanie interesujących nas sekwencji do plazmidu posiadającego już promotor transkrypcji. Następnie linearyzuje się wektor i przeprowadza transkrypcję [39]. Do transkrypcji oprócz odpowiedniej polimerazy, jonów Mg 2+ i kompatybilnego buforu, niezbędna jest obecność mieszaniny trifosforanów nukleozydów obecnych w RNA (GTP, UTP, CTP, ATP) oraz, jeśli chcemy otrzymać RNA zakończone kapem, analog kapu (w stosunku 4:1 do GTP co zapewnia start transkrypcji od analogu kapu) [40], [41]. Jeśli chcemy uzyskać poliadenylowane mrna wskazane jest wprowadzenie odpowiedniej sekwencji na wektorze DNA lub, alternatywnie, można wykorzystać polimerazę poli A (PAP), jednak jej użycie nie pozwala na kontrolę długości poli A [42]. Po strawieniu matrycy DNA odpowiednią DNazą, IVT-RNA może być wyizolowane np. poprzez wytrącenie roztworem chlorku litu. Osad RNA należy rozpuścić w wodzie wolnej od RNaz lub odpowiednim buforze i w tej formie można przetrzymywać aż do momentu użycia [27]. Schemat transkrypcji in vitro przedstawiony jest na rysunku (Rysunek 10) 39

40 Najczęściej wykorzystywana polimeraza RNA to polimeraza bakteriofaga T7[43]. Jest to białko o masie 99 kda. Jest ona wysokospecyficzna względem promotora i transkrybuje jedynie poniżej promotora T7. Polimeraza T7 wymaga matrycy DNA oraz jonów magnezu jako kofaktora. Zaletą polimerazy T7 jest bardzo niska częstość błędów. Reszty aspartylowe w polimerazie koordynują jony magnezu, co w konsekwencji pozwala rekrutować kolejne rybonukleotydy poprzez koordynację fosforanów z jonem magnezu. To pozwala na atak nukleofilowy grupy 3 OH powstającego transkryptu RNA i dodanie kolejnego NTP do łańcucha. Drugi jon Mg 2+ odbiera pirofosforan powstający w reakcji. Schemat reakcji można opisać równaniem [43]: Rysunek 10. Synteza mrna in vitro W skład mieszaniny reakcyjnej do syntezy mrna wchodzą: DNA (zlinearyzowane) zawierające promotor dla polimerazy T7 oraz określony gen, mieszanina trifosforanów nukleozydów (ATP, UTP, GTP, CTP), polimeraza RNA (najczęściej bakteriofagowa T7), kompatybilny bufor zawierający kofaktorowe dla polimerazy jony magnezu oraz, opcjonalnie, analog kapu. Mieszanina inkubowana jest w 37 o C. Na matrycy DNA polimeraza RNA odnajduje sekwencję promotorową i miejsce startu transkrypcji i syntezyzuje mrna (zaczynając od kapu w stronę końca 3 ) o sekwencji komplementarnej do nici DNA podążając w kierunku 3 5 tejże nici. (NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi W reakcji transkrypcji in vitro możemy uzyskać aż do kilku mg RNA dłuższych niż 20 nt o względnie wysokiej jakości w porównaniu do syntezy chemicznej [41]. I.3.5 Wybrane procesy i białka związane z mrna Poniższy rysunek przedstawia schematycznie najważniejsze zdarzenia towarzyszące metabolizmowi RNA oraz białka zaangażowane w te procesy (Rysunek 11). 40

41 mrna powstaje w jądrze w procesie transkrypcji. Pierwotna wersja transkryptu tzw. pre-mrna musi ulec najpierw odpowiedniej obróbce tzw. dojrzewaniu zanim utworzy funkcjonalny transkrypt [44]. Większość pre-mrna ulega zniszczeniu w jądrze. Część ulega dojrzewaniu polegającym na dodaniu kapu, splicingu (wycięciu niekodujących odpowiedniemu fragmentów i połączeniu fragmentów kodujących) oraz poliadenylacji. transkrypty Dojrzałe zostają eksportowane poprzez odpowiednie czynniki transportujące kompleksy białkowe tworzące pory jądrowe. Po eksporcie do cytoplazmy zakończone kapem mrna jest rozpoznawane przez czynnik inicjacji translacji eif4e i po związaniu kapu, następuje rekrutacja rybosomów i biosynteza białka. Głównym mechanizmem regulacji poziomu ekspresji genu jest degradacja mrna, która przebiega według kilku możliwych równoległych ścieżek kontrolowanych przez odpowiednie hydrolazy: enzymy degradujące kap (Dcp1/Dcp2, Nudt, DcpS), deadenylazy, endo- i egzorybonukleazy [45,46], [47]. W kontekście mojej rozprawy doktorskiej, najważniejsze procesy wpływające na poziom biosyntezy białka z matrycy RNA są inicjacja translacji będąca procesem limitującym całego proces biosyntezy białka oraz kontrola stabilności transkryptu. Bardziej szczegółowy opis tych dwóch procesów znajduje się w poniższych podrozdziałach. Rysunek 11. Procesy przebiegające w trakcie życia cząsteczki mrna oraz maszyneria zaangażowana w przebieg danych procesów 41

42 I Inicjacja translacji Translacja jest bardzo skomplikowanym biologicznie i wciąż nie w pełni zrozumianym procesem. W ciągu ostatnich dekad osiągnięto ogromny postęp w zrozumieniu mechanizmu i regulacji procesu translacji. W mechanizmie translacji, różne białka określane mianem czynników translacyjnych biorą udział w przekształcaniu informacji zawartej w mrna na postać białkową. Proces ten można podzielić na trzy fazy: inicjację, elongację i terminację translacji [48]. Faza inicjacji translacji jest uważana za najbardziej regulowaną. W komórkach eukariotycznych przebiega ona według dwóch możliwych mechanizmów: (a) zależnego od kapu (większość transkryptów) (b) niezależnego od kapu poprzez sekwencje IRES (ang. internal ribosome entry side) (o mniejszym znaczeniu) [32,48,49]. Jak wspominano już wcześniej (rozdział I.3.3), znakomita większość eukariotycznych mrna w komórkach posiada na swoim 5 -końcu strukturę kapu (m 7 GpppN, gdzie N to dowolny nukleotyd) a na 3 końcu ogon poli A oddziałujący z białkami wiążącymi poli A (PABP, ang. poly A binding proteins). Wykazano, że obie struktury pełnią kluczowe role w kontroli wydajności translacji [50]. W mechanizmie translacji zależnym od kapu istotna jest rekrutacja mrna do białkowego kompleksu o nazwie eif4f, składającego się z trzech białek: wiążącego się z kapem eif4e, helikazy eif4a oraz eif4g, który wiąże się m.in. z PABP powodując zapętlenie mrna [51,52], [53]. Całość kompleksu eif4e wiąże małą podjednostkę rybosomalną 40S, które odnajduje kodon start transkrypcji i po przyłączeniu podjednostki 60S tworzy funkcjonalny rybosom gotowy do przeprowadzenia biosyntezy białka na matrycy mrna [48]. Bardziej 42 Rysunek 12. Kompleks inicjujący translację Na rysunku pokazano oddziaływania pomiędzy kompleksem eif4f, 43S I mrna. eif4f jest tworzone przez eif4a, eif4g I eif4e. Kompleks 43S jest zbudowany z eif33, małej podjednostki rybosomowej 40S i eif2, która zbudowana jest z metionino-trna (Met-tRNA) i GTP. mrna jest rekrutowane do kompleksu eif4f poprzez oddziaływanie ogona poli A z białkami wiążącymi poli A (PABP), 5 -kap i eif4e.

43 szczegółowe odziaływanie pomiędzy białkami w kompleksie przedstawiono na rysunku (Rysunek 12). Już ten krótki i uproszczony opis pokazuje jak wiele białek zaangażowanych jest w proces translacji i jak skomplikowany jest to proces. Wszystkie wspomniane czynniki translacyjne pełnią istotną rolę, jednak głównym punktem regulacji jest tworzenie kompleksu eif4f poprzez eif4e wiążące kap. Wiązanie kapu przez eif4e zostało wskazane jako etap limitujący cały proces formacji kompleksu eif4f, a przez to pośrednio translacji [54], [55,56]. I Oddziaływanie kap eif4e W warunkach fizjologicznych dostępność eif4e w komórce jest ściśle regulowana. Można wyróżnić kilka mechanizmów poprzez które eif4e kontroluje formację kompleksu eif4f i interferują z translacją w komórkach. Jednym z mechanizmów jest fosforylacja seryny 209 przeprowadzane przez odpowiednie kinazy. Badania wykazują, że eif4e jest fosforylowane jedynie, gdy jest częścią kompleksu eif4f, podczas gdy defosforylacja koreluje z inhibicją zależnej od kapu translacji w warunkach stresu komórkowego [57], [58]. Inny mechanizm opisuje regulację eif4e poprzez białka wiążące eif4e tzw. 4EBP (ang. eif4e-binding proteins) [56]. Białka te uważane są za represory translacji, przykładowo hiperfosforylacja białka 4EBP-1 zaburza tworzenie kompleksu eif4f [59]. Jako kolejny mechanizm regulacji jest związany z ilością dostępnego eif4e, który występuje w najmniejszej ilości spośród wszystkich składników kompleksu. Ilość eif4e limituje więc tworzenie się całego kompleksu eif4e [54]. Co interesujące, zaobserwowano, że nadekspresja eif4e powoduje zwiększoną translację protoonkogenów sprzyjając transformacji nowotworowej [60] (Rysunek 13). Inhibicja inicjacji translacji poprzez wyeliminowanie części eif4e stała się celem o potencjalnym znaczeniu terapeutycznym w chorobach nowotworowych [61]. Szerokie znaczenie zyskały tu analogi kapu o wysokim powinowactwie do eif4e wykazujące silne właściwości inhibitorowe (przykładowe zastosowania analogów kapu są przedstawione w rozdziale I.4.1) [62]. 43

44 Rysunek 13. Zależność poziomu translacji silnych i słabych mrna w zależności od ilości dostępnych Czynników Inicjacji Translacji (eif4e) Podwyższony poziom eif4e korelowany jest z procesami nowotworzenia. W obecności nadmiaru dostępnego eif4e translacji mogą ulegać geny, które w zwykłych warunkach nie ulegają translacji. Są to tzw. słabe mrna, które ze względu na wyżej ustrukturyzowany 5 UTR w porównaniu do silnych mrna (ulegających konstytutywnej translacji) są mniej konkurencyjne wobec eif4e. Do słabych mrna należą onkogeny (np. czynniki kontrolujące proliferację komórkową i apoptozę), stąd uruchomienie ich translacji sprzyja nowotworzeniu. Na podstawie [61] W literaturze można odnaleźć kilka struktur przestrzennych kompleksu eif4e z analogami struktury kapu takimi jak m 7 GDP, m 7 GTP, m 7 GpppA czy m 7 GpppG [63 67]. Struktury zaproponowano na podstawie badań krystalograficznych i NMR. Badania te wykazały istnienie i budowę miejsca wiążącego kap w eif4e. Specyficzność wiązania kapu względem eif4e polega na interkalacji N7-metyloguanozyny pomiędzy dwoma resztami tryptofanu (Trp56 i Trp102) poprzez oddziaływania kation-π (tzw. stacking) oraz stabilizujące wiązania wodorowe pomiędzy atomem N2 N7-metyloguanozyny i grupami NH i karboksylowymi od Glu103 [63]. Struktury eif4e pomiędzy różnymi organizmami eukariotycznymi wykazują duże podobieństwo ale i pewne istotne różnice, które mogą być istotne dla zrozumienia procesu inicjacji translacji dla poszczególnych gatunków. Przykładowo 44

45 struktury m 7 GDP z eif4e drożdżowym i mysim zachowują stacking m 7 G pomiędzy tryptofanami, ale różnią się obecnością dwóch helis, długością łańcuchów beta oraz położeniem łańcuchów bocznych tryptofanów [66,67]. Poza eif4e posiada również izoformy należące do tej samej rodziny potrafiące wiązać kap. Są to eif4e1b, eif4e2 i eif4e3, mają one jednak ok. 200 razy słabsze powinowactwo do kapu niż podstawowa forma eif4e [68]. Ponadto podobne oddziaływania stackingowe kation π pomiędzy kapem a białkiem wykazują inne białka wiążące kap: Vaccinia virus caping enzyme VP39 oraz DcpS [69,70]. Badania strukturalne tych białek mogą ułatwić projektowanie ligandów wiążących się silnie z eif4e. Oddziaływanie pomiędzy eif4e i analogami kapu jest przedmiotem intensywnych badań wykorzystujących zjawisko wygaszania fluorescencji pochodzącej od tryptofanów podczas wiązania kapu. Opracowano również inne metody badania oddziaływań z eif4e korzystające z SPR (surface plasmon resonance), kalorymetrii i NMR [63], [65]. Difosforanowe i trifosforanowe analogi kapu używane były jako narzędzie w badaniu oddziaływań kap-eif4e. Mechanizm wiązania kapu nie jest do końca zrozumiany. Według jednych badań prawdopodobny jest mechanizm dwu-etapowy wiązania kapu [52]. W pierwszym etapie dominuje wiązanie ligandu poprzez trifosforan z zasadowymi resztami aminokwasów (Ag157, Lys162). W drugim etapie wiązaniu reszty m 7 G do kieszeni tryptofanowej towarzyszy spadek fluorescencji. Inne badania (Rhoads i wpółpr. [71]) sugerują jednak mechanizm jednoetapowy. Wspomniana wcześniej rola eif4e w rozwoju nowotworowym stała się motywacją do rozwoju terapii nakierowanych na eif4e. Jedna z metod skupia się na tworzeniu selektywnych i silnych inhibitorów kap-zależnej translacji blokujących nadmiar dostępnego eif4e w komórkach [62,72,73]. W czasie ostatnich dekad, wiele inhibitorów, mononukleotydowych analogów kapu, pochodnych m 7 GTP zostało zsyntetyzowanych i przebadanych. Darżynkiewicz i współpr. oraz Jemielity i współpr. badali wpływ modyfikacji w pozycjach N7, N2, oligofosforanu oraz rybozy na powinowactwo kapu do eif4e oraz właściwości inhibitorowe nowych analogów kapu (IC50) [72,74]. Jako jedne z najwydajniejszych zidentyfikowanych przez nich inhibitorów eif4e można wskazać bn 7 GTP, m 7 GTPαS [64],[75]. Powinowactwo kapu do eif4e wyznaczano metodą miareczkowania fluorescencyjnego obserwując wygaszanie fluorescencji podczas wiązania kapu i na podstawie wyników wyznaczając stałe asocjacji kompleksu K AS (eif4e-cap analog) [65,76]. Podobną metodykę zaadaptowano do przewidywania efektów wzmacniania poziomu translacji mrna połączonego z badanym analogiem kapu. 45

46 I Degradacja mrna u eukariontów Proces degradacji mrna uważany jest za główny proces kontroli ekspresji genu. Regulacja ekspresji na sposób kontroli poziomu degradacji transkryptów przejawia się m.in. w różnicach w czasie życia pomiędzy różnymi mrna (Rysunek Rysunek 14. Zróżnicowanie połowicznych czasów życia (czasów półtrwania) mrna w komórkach. Wykres przedstawia rozkład czasów życia różnego rodzaju mrna (czasów półtrwania) w komórkach. Wykres wykonano na podstawie badań genów otrzymanych z pluripotentnych i embrionalnych komórek macierzystych myszy. Mediana czasu półtrwania dla mrna wynosi 7,1 h. Najkrótsze czasy życia posiadają mrna kodujące cytokiny, najdłuższe czasy życia przypadają na mrna kodujące geny, które muszą być eksprymowane w sposób ciągły ( housekeeping genes ) posiadają czas życia ok. 24 h. Wykres zmodyfikowano na podstawie [77] 46 14). Przykładem transkryptu o wysokiej stabilności metabolicznej jest mrna globiny, której wysoka stabilność powoduje wręcz tendencję do akumulacji w organizmie [33], [78], [79,80]. Wysoko niestabilne mrna o czasie życia min można przypisać np. cytokinom i wielu proonkogenom. Średni czas życia przeciętnego mrna w komórkach wynosi kilka godzin [77]. mrna ulega degradacji na kilka możliwych, często równolegle zachodzących procesów [47]. Jako główne ścieżki rozpadu wyróżnić możemy degradację od końca 5 w kierunku końca 3, degradację od końca 3 w kierunku końca 5 oraz mniej prawdopodobną ścieżkę NMD (ang. nonsense mediate decay) odpowiedzialną za rozpad mrna od środka [45,81]. Procesy degradacji mrna schematycznie przedstawiono na rysunku (Rysunek 15). Zdecydowana większość mrna ulega hydrolizie na skutek działania egzonukleaz na obu końcach mrna. Cały proces z reguły rozpoczyna się od skrócenia końca poli A [82]. Do tej pory, zidentyfikowano trzy główne rybonukleazy odpowiedzialnych za polideadenylację: PAN2- PAN3, multikompleks deadenylujący CCR4-NOT z dwiema katalitycznymi podjednostkami Ccr4 and Caf1/Pop2 oraz rybonukleazę-deanenylazę poli A (PARN, ang. poly A ribonuclease)

47 (co kieruje wyborem odpowiedniej rybonukleazy nie jest jeszcze do końca zrozumiałe) [83]. Dodatkowo zidentyfikowano u ssaków wiele mniej poznanych poliadenylaz [83]. Enzymy zaangażowane w proces poliadenylacji jak i sam proces deadenylacji zostały szczegółowo przedstawione w pracy przeglądowej autorstwa Shoenberga i współpr. [82]. Następnie, mrna ulega trawieniu poprzez egzosom zawierający kompleks egzonukleaz 3 5 i inne czynniki wspomagające hydrolizę mrna [84] lub zostaje poddany dekapingowi i następczej hydrolizie od strony końca 5 [81]. W dekaping zaangażowany jest głównie enzym dekapujący Dcp2, przy czym do rozpoznania substratu wymaga obecności ok 25 nt w łańcuchu [49]. Stymulacja dekapingu zachodzi przy udziale ko-aktywatora Dcp1 [45]. Innym niedawno odkrytym enzymem odpowiedzialnym za hydrolizę kapu jest NUDT16 [85]. Po utracie ochronnej czapeczki, mrna staje się dostępne dla ataku egzonukleaz od końca 5 (egzonukleaza XRN1) [86]. Rysunek 15. Ścieżki degradacji mrna i enzymy zaangażowane w degradację mrna. A. Degradacja egzonukleolityczna. B. degradacja endonukleolityczna 47

48 Tabela 2. Enzymy zaangażowane w degradacje mrna aktywność enzym substrat dekaping DCP2 deadenylowane mrna NUDT16 deadenylowane mrna deadenylacja PAN2 poli A mrna CNOT6 (CCR4A) poli A mrna CNOT6L (CCR4B) poli A mrna CNOT7 (CAF1A) poli A mrna CNOT8 (CAF1B lub POP2) poli A mrna PARN poli A mrna degradacja egzonukleolityczna 5 3 XRN1 dekapowane mrna, przecięte endonukleolitycznie mrna degradacja egzonukleolityczna 3 5 RRP44 (DIS3L) Deadenylowane mrna, przecięte endonukleolitycznie mrna EXOSC10 (RRP6 lub PM/Scl-10) Deadenylowane mrna, przecięte endonukleolitycznie mrna degradacja endonukleolityczna PMR1 Ulegający translacji poli A mrna ZC3H12A (MCPIP1) poli A mrna IRE1 poli A mrna związane z retikulum endoplazmatycznym SMG6 mrna zawierające przedwczesny kodon STOP (Nonsense Mediated Decay, NMD) Dla niektórych mrna rozpad inicjowany jest przez atak endonukleaz rozcinających transkrypt na dwie części od środka [32], [81]. Wytworzone nowe końce 5 i 3 stają się podatne na atak wcześniej wspomnianych egzonukleaz, tj. XRN1 i egzosomu. Ten sposób hydrolizy określany jest mianem Nonsense Mediated Decay (NMD) [87] i stosowany jest przez organizm jako sposób pozbywania się błędnym transkryptów, np. posiadający przedwczesny kodon stop [88]. Enzymy zaangażowane w proces degradacji RNA wypunktowano w tabeli powyżej (Tabela 2). 48

49 I.4. Modyfikacje chemiczne mrna wpływające na stabilność i translację mrna Ten rozdział poświęcono przeglądowi najważniejszych do tej pory znanych modyfikacji wykazujących wpływ na właściwości translacyjne mrna oraz jego trwałość. Optymalizacja poziomu i czasu trwania translacji z transkrybowanego in vitro mrna kodującego antygeny to podstawa do otrzymania efektywnej odpowiedzi immunologicznej w immunoterapii za pomocą mrna. Im wyższa stabilność mrna oraz wydajność translacji, tym więcej antygenu dostępne jest dla komórki DC oraz, jak udowodniono, również większa gęstość prezentowanego antygenu na powierzchni komórek i wyższa efektywność generowanej odpowiedzi immunologicznej [25], [89]. Ze względu na to, że dowiedziono bezpośrednie zależności pomiędzy elementami struktury mrna takimi jak 5 kap, 3 i 5 UTR, region kodujący i poli A na czas półtrwania mrna oraz ilość syntetyzowanego z matrycy białka [25], to właśnie te elementy regulujące poddano dogłębnym badaniom i modyfikacjom, by w pełni zrozumieć ich wpływ na zachowanie mrna, a być może również ulepszyć lub nauczyć się kontrolować jego właściwości. I.4.1 Analogi końca 5 mrna W rozdziale I skupiono się na opisie charakterystycznej struktury obecnej na końcu 5 mrna nazwanej kapem raz jej biologicznych funkcji. Ze względu na mnogość tych funkcji, a przede wszystkim kluczowe znaczenie niektórych oddziaływań pomiędzy enzymami i kapem, stał się on interesującym obiektem badań biochemicznych i biofizycznych. Ponad 30 lat temu pokazano, że zakończone kapem mrna jest bardziej stabilne aniżeli to samo mrna pozbawione kapu na 5 -końcu [90]. Na tej podstawie wnioskowano, że kap odgrywa szczególną rolę w ochronie cząsteczek mrna przed degradacją przez 5 3 egzonukleazy. Kap jest rozpoznawany w cytoplazmie przez eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4E (eif4e) i oddziaływanie to jest niezbędne do wydajnego przebiegu procesu translacji [91]. Konkurencyjnym oddziaływaniem, jest rozpoznawanie kapu przez enzym dekapujący Dcp2, co powoduje odcięcie kapu od mrna, destabilizację kompleksu. 49

50 Odblokowanie końca 5 mrna jako miejsca ataku dla 5 -egzorybonukleaz w konsekwencji prowadzi do degradacji mrna. [92]. Przykładem modyfikacji kapu, których efekt uwidacznia się w czasie translacji mrna oraz w jego czasie życia jest tzw. ARCA (ang. anti-reverse cap analogs). Motywacją do syntezy tych analogów kapu był problem napotykany w czasie transkrypcji in vitro ze standardowym analogiem kapu, m 7 Gp 3 G. Inkorporacja kapu następowała z jednakowym prawdopodobieństwem w prawidłowej orientacji, jak i w nieprawidłowej, co prowadziło do otrzymywania nawet połowy niefunkcjonalnych transkryptów i rzutowało na wyniki wielu badań z mrna (Rysunek 16) [93]. Jako rozwiązanie problemu zaproponowano syntezę analogu kapu z metylowaną pozycją 3 OH lub 2 OH rybozy w N7-metyloguanozynie, pozostawiając jako jedyną dostępną dla polimeryzacji pozycję 3 OH w reszcie guanozyny [94], [95], [96]. Transkrypty otrzymane w reakcji z analogami kapu typu ARCA: m 2, 7,2 -O GpppG i m 2, 7,3 -O GpppG rzeczywiście wykazywały zwiększoną ponad dwukrotnie wydajność translacji w lizacie retikulocytów króliczych (RRL) [94], [95], [96]. Niezależne badania potwierdziły wyniki otrzymywane dla analogów typu ARCA, również w warunkach komórkowych, czyniąc je praktycznych i w tej chwili dosyć powszechnym narzędziem wykorzystywanym przy transkrypcji in vitro mrna [97], [98]. Wydaje się, obok efektu poprawienia technologii produkcji mrna, metylacja rybozy N7- metyloguanozywy wywiera jeszcze dodatkowy dodatni wpływ na poziom translacji [99]. ARCA stała się standardem przy syntezie mrna do badań klinicznych. Od czasu powstania pierwszych analogów kapu typu ARCA pojawiło się kilka modyfikacji wywołujących podobny efekt. Można tu wymienić inne modyfikacje grup OH rybozy m 7 G: 2 - fluoro- 2,3 -izopropylidenową oraz LNA (ang. locked nucleic acids) [95], [100,101]. Innego typu modyfikacją wywołującą podobny efekt jest zastosowanie symetrycznych analogów kapu posiadających dwie reszty N7-metyloguanozyny, m 7 Gpppm 7 G [102] (Rysunek 17). 50

51 Rysunek 16. Analogi kapu typu ARCA i problem inkorporacji kapu do mrna w prawidłowej orientacji Polimeraza RNA (np. bakteriofaga T7) atakuje grupę hydroksylową 3 -OH nukleotydów katalizując reakcję estryfikacji z 5 -fosforanem kolejnego nukleozydu (patrz rozdział I.3.4). Ze względu na nadmiar kapu w mieszaninie polimeraza rozpoczyna syntezę łańcucha mrna od analogu kapu, nie jest w stanie jednak odróżnić grupy 3 OH guanozyny i N7-metyloguanozyny. W rezultacie wśród kapowanych produktów z jednakowym prawdopodobieństwem powstają transkrypty funkcjonalne, zakończone kapem w prawidłowej orientacji, jak i niefunkcjonalne mrna (nie ulagające kap-zależnej translacji) zakończone kapem w orientacji nieprawidłowej [93]. Eleganckim rozwiązaniem tego problemu jest stosowanie analogów kapu typu ARCA, posiadających zawadę steryczną w pozycji 3 -OH lub sąsiedniej 2 -OH, która blokuje polimerazie dostęp do tej pozycji. Kapowane mrna powstałe w trakcie transkrypcji mają więc jedynie prawidłową orientację. Poza modyfikacjami blokującymi odwrotną inkorporację kapu, dinukleotydowe analogi kapu poddawano dalszym modyfikacjom, eksplorując możliwości chemiczne w celach uzyskania jak najlepszego efektu biologicznego. Na drodze do poszukiwań modyfikacji wpływających na zwiększenie stabilności i wydajności translacji mrna zsyntetyzowane i przebadano wiele różnorakich analogów kapu modyfikowanych w mostku 5,5 -trifosforanowym [74]. Jedną z pierwszych takich modyfikacji wywołujących zamierzony efekt wzmocnienia translacji było wydłużenie mostka trifosforanowego kapu o jedną lub więcej grup fosforanowych [103]. Dla łańcucha wydłużonego łańcucha, stała asocjacji kapu do eif4e rosła o rząd wielkości dla każdej kolejnej grupy fosforanowej [103]. Zaobserwowano również wyższą wydajność translacji tetrafosforanowych analogów w porównaniu do kapu trifosforanowego ale już dla pentafosforanowych analogów kapu poziom translacji był niższy, mimo bardzo wysokiego powinowactwa do eif4e[96]. Badania nad zastosowaniem modyfikacji łańcucha fosforanowego w celu ochronny przed niszczącym działaniem enzymów doprowadziły również do kilku ciekawych odkryć. Hydroliza zakończonego kapem mrna prowadzi do uwolnienia m 7 GDP, co sugeruje, że miejsce cięcia 51

52 enzymu Dcp2 w łańcuchu trifosforanowym kapu następuje pomiędzy fosforanem α i β [92]. Na podstawie tej przesłanki, próbowano stabilizować wiązanie trifosforanowe poprzez substytucję jednego z niemostkowych atomów tlenu w grupach fosforanowych α i β [98,104]. Ze względu na pojawienie się nowego centrum P-stereogenicznego indukowanego po wbudowaniu atomu siarki w strukturę kapu, tiofosforanowe analogi kapu występowały w formie dwóch diastereoizomerów oznaczanych jako D1 (diastereoizomer o krótszym czasie retencji na kolumnie RP HPLC) i D2 (diastereoizomer o dłuższym czasie retencji na kolumnie RP HPLC). Oba diastereoizomery analogu kapu posiadającego atom siarki w pozycji β (określane mianem β- S-ARCA) podwyższały trwałość mrna w obecności ludzkiego Dcp2 (Rysunek 17). Przeciwnie, Oba diastereoizomery analogu kapu posiadającego atom siarki w pozycji α (określane mianem α- S-ARCA) nie wykazywały tej właściwości. Co ciekawe, poszczególne diastereoizomery różniły się właściwościami. RNA zakończone diastereoizomerem D2 β-s-arca było mniej podatne na hydrolizę Dcp2, podczas gdy diastereozomer D1 wykazywał wyższe powinowactwo do eif4e [103]. Początkowo niehydrolizowalne analogi kapu wykorzystywano jedynie do badań metabolizmu mrna. Przełomem okazało się wykorzystanie β-s-arca w celu wykorzystania do produkcji antynowotworowych szczepionek mrna dostarczających antygeny. Przeanalizowano wpływ trzech podstawowych analogów kapu, m 7 Gpppm 7 G, ARCA i β-s-arca, na immunobiodostępność w komórkach DC i indukcję odpowiedzi immunologicznej limfocytów T in vivo [99]. Niedojrzałe komórki dendrytyczne nieustannie próbkują otaczające środowisko pod kątem antygenów pochodzących od bakterii, wirusów itd. Po kontakcie z antygenem, DCs dojrzewają, zaprzestają pobierania antygenów z przestrzeni zewnątrzkomórkowej i przemieszczają się do węzłów chłonnych. Tylko w tym stanie komórki DC są w stanie aktywować limfocyty T [105]. Kuhn i współpr.. odkryli, że w niedojrzałych komórkach dendrytycznych, mrna zakończone β-s-arca D1 wykazuje znacznie większą stabilność i wydajność translacji [99]. Poziom zsyntetyzowanego białka jest o rząd wielkości wyższy w porównaniu do mrna zakończonego m 7 GpppG oraz ok 3-razy większy niż dla mrna zakończonego ARCA [99]. W dojrzałych komórkach dendrytycznych efekt nie jest aż tak wyraźny. Najwyższe wydajności translacji zarejestrowano dla RNA kapowanego oboma diastereizomerami β-s-arca, 4-krotnie wyższe niż dla RNA kapowanego m 7 GpppG [99]. Wyniki potwierdzono również na modelu mysim. Zastosowanie szczepionek mrna 52

53 zakończonych β-s-arca D1 potwierdziło, że optymalizacja stabilności i wydajności translacji poprzez modyfikację kapu doprowadziła również do indukcji silniejszej odpowiedzi immunologicznej w myszach [99]. γ β α γ β α β-s-arca m 7 Gpppm 7 G Rysunek 17. Struktury β-s-arca i m 7 Gpppm 7 G Warto dodać, że nie wszystkie modyfikacje mostka fosforanowego wpływają pozytywnie na poziom translacji. Modyfikacje mostkowe, metylenobisfosfonianowa oraz imidodisfosforanowa, wbudowane w odpowiednie pozycje uodparniają łańcuch oligofosforanowy na atak enzymów dekapujących (DcpS, Dcp2) jednakże jednocześnie mogą destabilizować oddziaływanie z eif4e (analogi bisfosfonianowe), co odbija się w poziomie syntezy białka z matrycy kapowanego mrna [76,106], [ ]. I.4.2 Modyfikacje UTR Kolejną strategią optymalizacji właściwości translacyjnych i stabilności IVT-mRNA w komórkach jest wprowadzenie odpowiednich regulatorowych sekwencji do regionów 5 lub 3 UTR. Sekwencje te zostały zidentyfikowane jako modulatory stabilności i translacji endogennego mrna [25,33 35]. Przykładowo, jedną z wykorzystywanych modyfikacji IVT-RNA są specjalnie wprowadzone sekwencje 3 -UTR pochodzące od α- lub β-globiny, których transkrypty znane są z wyjątkowo wysokiej stabilności w komórkach. Dodatkowy stabilizujący efekt osiągnięto poprzez dwukrotne powtórzenie 3 -UTR ludzkiej β-globiny ustawionych w przeciwnych orientacjach. Ponadto, różne regiony wirusowych 5 i 3 UTR są wstanie wzmacniać stabilność i zdolność translacji transkryptów mrna [25]. Inne badania pokazały, że 3 UTR pochodzący z komórkowego transkryptu eukariotycznego czynnika elongacji 1α (EEF1A1) i 5 -UTR obecny w wielu mrna ortopokswirusów są zdolne hamować dekaping i 3 5 degradację mrna [110]. 53

54 Czasem destabilizacja mrna to pożądany efekt, gdy np. chcemy ograniczyć czas produkcji białka. Ten efekt można uzyskać poprzez wprowadzenie do 3 -UTR sekwencji bogatych w AU, co zapewnia szybką degradację transkryptu i krótki czas ekspresji [35]. Modyfikacje UTR to wciąż dość mało zbadany aspekt badań nad stabilnością i translacją mrna. W tej chwili standardem w badaniach klinicznych jest preferencyjne stosowanie UTR pochodzących od β-globiny, które były wykorzystane jako pierwsze w badaniach klinicznych jako najbardziej poznanych sekwencji UTR. I.4.3 Modyfikacje sekwencji kodującej Wykazano, że wpływ na wydajność translacji ma także kompozycja kodonów w sekwencji kodującej. Gęstość rybosomów na matrycy korelująca z ilością produkowanego białka wzrasta dla krótszych rejonów kodujących. Dodatkowo sekwencje bogate w A/U destabilizują mrna podczas gdy większa zawartość sekwencji bogatych w G/C daje efekt stabilizujący transkrypt. Ze względu na fakt, że często kilka kodonów koduje ten sam aminokwas, można manipulować trwałością mrna poprzez wybór alternatywnych kodonów bogatszych w pożądany typ zasad [111], [112]. Inną interesującą grupą modyfikacji mrna wewnątrz sekwencji kodującej, są modyfikacje nukleotydów przypominające modyfikacje post-translacyjne naturalnie występujące u wyższych organizmów eukariotycznych, w tym u człowieka. Znanych jest ok. 100 modyfikacji nukleozydowych naturalnie występujących w RNA [113], postanowiono więc sprawdzić jak kompozycja nukleozydowa mrna wpływa na jego stabilność i translację. Kariko i wpółpr. zasugerowali, że podstawą do rozróżnienia mrna endogennego od egzogennego jest obecność tych właśnie modyfikacji post-translacyjnych i dowiedli, że po dostarczeniu mrna zawierającego pseudourydynę nastąpiła supresja obserwowanego zwykle rozpoznania przez receptory TLR (indukujące stan zapalny) [17,18]. Praktycznym rezultatem tego odkrycia był rozwój metod opartych o mrna, gdzie do tej pory silna immunogenność mrna była przeszkodą. Do modyfikacji o podobnym do pseudourydyny działaniu można zaliczyć przede wszystkim: 2-tiourydynę, 5-metylocytozynę, N6-metyloadenozynę [114]. I.4.4 Modyfikacje ogona poli A 54

55 Ogon poli A również reguluje stabilność i wydajność translacji w synergii z 5 kapem oraz innymi czynnikami. Modyfikacje ogona poli A wydają się być istotnym celem na drodze zrozumienia w pełni procesu ekspresji mrna [115]. Rysunek 18. Modyfikacje elementów strukturalnych mrna wpływających na właściwości biologiczne mrna Wiadomo na przykład, że dekaping następuje dopiero po skróceniu łańcucha poli A do ok 12 nt (co powoduje oderwanie białek PABP od poli A) [116]. Z tego powodu, główną badaną do tej pory modyfikacją ogona poli A było badanie znaczenia jego długości na stabilność mrna i poziom otrzymywanego białka. Dowiedziono, że dłuższy ogon poli A koreluje z większą stabilności mrna oraz wydajniejszą translacją [97], [25], [117]. Otrzymanie ogonu poli A o konkretnej długości jest wyzwaniem samym w sobie. Ogon poli A może być dodawany do syntetyzowanego in vitro mrna albo w sposób bardziej przypominający jego naturalne powstawanie, tzn. w drugim etapie transkrypcji wykorzystując polimerazę ogona poli A (PAP) [25]. Wykorzystując rekombinowane polimerazy PAP udało się wprowadzić do ogona poli A również modyfikowane nukleozydy, które inhibują działanie deadenylaz, np. kordycepinę (3-55

56 deoksyadenozynę) [118]. Jednakże, okazało się, że modyfikacja ta nie wydłuża czasu półtrwania mrna, prawdopodobnie ze względu na to, że stanowi ona terminator elongacji łańcucha, więc jest wbudowana jedynie w ostatniej pozycji ogona poli A [104], [119]. Ograniczeniem enzymatycznej poliadenylacji jest brak kontroli nad długością otrzymywanego ogona poli A, tak więc końcowy produkt składa się z mieszaniny transkryptów o różnej długości. Tymczasem transkrypcja RNA na matrycy DNA z zakodowanym łańcuchem poli A na matrycy pozwala na otrzymanie ogona poli A o zdefiniowanej długości, przez co jest to preferowana metoda produkcji mrna do zastosowań klinicznych. Badania na komórkach DC pokazały również, że koniec poli A nie powinien posiadać dodatkowych nie-adenozynowych nukleotydów na końcu, a jego optymalna długość wynosi pomiędzy 120 a 150 nukleotydami [25,97]. I.5. Synteza i właściwości nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym Estry fosforanów oraz ich bezwodniki można znaleźć wśród wielu cząsteczek o znaczeniu biologicznym, takich jak DNA czy RNA, nukleotydy, nukleotydocukry, polifosforany dinukleotydów, nieorganiczne fosforany, witaminy, fosfolipidy, białka. Reakcja fosforylacji stanowi jedną z najważniejszych biologicznie reakcji będącą w centrum sygnalizacji komórkowej, przez co kontrolującą procesy metaboliczne organizmu i stojącą u podstawy życia. Zrozumienie i kontrola procesów fosforylacji stanowi jedno z największych wyzwań dzisiejszej nauki [120]. Dostępność fosforylowanych związków umożliwia lub ogranicza możliwości ich badania i procesów z nimi związanych. Jako alternatywa lub dopełnienie metod izolacji, czy enzymatycznej syntezy biologicznie ważnych związków fosforu, narzędzie jakim jest synteza organiczna otwiera nowe możliwości tworzenia narzędzi do badań procesów biologicznych. Metody chemiczne umożliwiają przede wszystkim otrzymanie nukleotydów nie występujących w przyrodzie, o ciekawych właściwościach fizykochemicznych i biologicznych. W niniejszym rozdziale przedstawiono przegląd rodzajów, metod otrzymywania i najważniejszych zastosowań modyfikowanych nukleotydów. Przegląd ten ukazuje stan obecnej wiedzy i umiejętności chemicznych pozwalających na dostarczenie molekularnych narzędzi jakimi są modyfikowane w łańcuchu oligofosforanowym nukleotydy. Pomimo tego, że dostępne 56

57 są dobrze opracowane protokoły syntezy bezwodników fosforanowych, które są stosowane rutynowo w syntezie nukleotydów, wciąż istnieją pewne ograniczenia i problemy wymagające kreatywnych rozwiązań. Bariery, które napotyka się przy syntezie modyfikowanych nukleotydów to przede wszystkim niska wydajność niektórych metod, problemy ze stereo-, regio- i chemoselektywnością, skomplikowane procedury, trudne i mało wydajne metody oczyszczania związków. W syntezie bezwodników fosforanowych wiele metod opiera się na sprzęganiu ze sobą odpowiedniego P-nukleofila i P-elektrofila. Często wykorzystuje się tu, choćby w etapie przejściowym, reaktywne związki zawierające fosfor na III stopniu utlenienia (np. analogi trimetofosforanu, H-fosfoniany). Procesy te z reguły mogą być przeprowadzone bez stosowania grup zabezpieczających, jednak wymagają one żmudnego oczyszczania, a zadowalające wydajności uzyskuje się jedynie przy zachowaniu rygorystycznych warunków bezwodnych. Podejście oparte o chemię fosforu (V) wykorzystuje zwykle aktywowane P-elektrofile, takie jak pochodne P-morfolinowe, P-imidazole, naładawane kationy P-imidazoliowe i inne [121][ ]. Niestety nie ma syntezy uniwersalnej, która działałaby dla szerokiego spektrum substratów. Idealna metoda syntezy wymagałaby niewielkich nadmiarów reagentów i aktywatorów, nie wymagałaby grup zabezpieczających oraz drastycznych warunków, byłaby krótka, wydajna i łatwa w oczyszczaniu. Szczególnie istotne wydaje się być opracowywanie efektywnych procesów izolacji związków, gdyż rozdział polarnych produktów od polarnych zanieczyszczeń jest znacznie trudniejszy i bardziej żmudny aniżeli oczyszczanie substancji niepolarnych przez chromatografię kolumnową w normalnych fazach. Ze względu na elucję buforami wodnymi w chromatografii jonowymiennej, lub chromatografii w odwrotnych fazach, konieczne jest również pozbycie się rozpuszczalnika, poprzez czasochłonne odparowywanie i kilkukrotną liofilizację, a długotrwała obróbka często wiąże się z rozpadem labilnych produktów. Każdy z tych aspektów stanowi podstawę do opracowania lepszych, bardziej efektywnych i uniwersalnych metod syntezy różnego rodzaju nukleotydów. Przedstawione w tym rozdziale reakcje zostały wykorzystane w części chemicznej badań stanowiących niniejszą rozprawę doktorską. Prezentowane problemy napotykane w syntezie modyfikowanych nukleotydów stanowiły także inspirację do rozwoju nowej metody syntetycznej przedstawionej w części badań własnych. 57

58 I.5.1 Modyfikacje łańcucha oligofosforanowego nukleotydów przykładowe zastosowania w badaniach biologicznych Bezwodniki fosforanowe takie jak oligofosforany (deoksy)rybonukleotydów czy nukleotydocukry znajdują się w centrum wielu reakcji angażujących polimerazy, kinazy, glikozylotransferazy i inne [120]. Analogi bezwodników fosforanowych, gdzie niektóre atomy zostały zastąpione odpowiednimi modyfikacjami mogą pełnić rolę substratów lub inhibitorów oferując wgląd w mechanizmy oddziaływań z białkami. Są one więc cennym narzędziem dla badań biologicznych, biofizycznych i strukturalnych jednak ich synteza i izolacja jest uciążliwa. Warto jednak eksplorować ten kierunek badań, gdyż często niezwykłe odkrycia i zastosowania wynikają otrzymuje się dzięki wykorzystaniu mimetyków naturalnych struktur. Przykładem badań, w których wykorzystano i wykorzystuje się modyfikowane analogi nukleotydów mogą być badania przeprowadzane przez Desai i Rainesa, którzy użyli analogów GTP (GTPαS, GppCH 2 p, GppNHp, GTPγS i GpCH 2 pp do wyznaczenia miejsca cięcia łańcucha fosforanowego w mechanizmie działania niekanonicznej ligazy RNA RtcB (łączy one 3 - fosforan z grupą 5 -OH przy użyciu GTP i jonów Mn 2+ ) [126]. Wyniki tych badań pozwoliły na zaproponowanie mechanizmu, gdzie tworzony jest cykliczny 2,3 -fosforan, który otwierany jest następnie przez atak nukleofilowy grupy 5 -OH. Dodatkowo badania krystalograficzne z udziałem GTPαS pozwoliły na zrozumienie znaczenia układu wiązań wodorowych i koordynacji przez jony Mn 2+ w orientacji substratu w miejscu aktywnym [126]. Innym niezwykle ciekawym przykładem zastosowania modyfikowanych nukleotydów jest badanie stereoselektywności polimerazy DNA β. Badania przeprowadzone przez McKenna i współpr. z wykorzystaniem niehydrolizowanych analogów dntp (np. zsyntetyzowanych przez nich metodami chemo-enzymatycznymi lub z wykorzystaniem pochodnych P-morfolinowych oryginalnych związków dcpcf 2 pp, dtpcf 2 pp) pozwoliły na obserwację ciekawych efektów stereoelektronowych pochodzących od podstawnika halogenowego [127]. Krystalizacja Polβ DNA w obecności diastereoizomerycznych mieszanin dgppchfp, dgppcmefp, dgppcclfp doprowadziła do akomodacji w miejscu aktywnym jedynie diastereoizomerów o konfiguracji, która pozwalała na wytworzenie wiązań wodorowych CX-F-Arg183 [128]. Niespodziewane właściwości modyfikowanych nukleotydów dobrze ilustruje odkrycie, że czyste diastereoizomery ATPαBH 3 wykazują aktywności przeciw wirusowi żółtaczki typu C 58

59 [129] oraz właściwości blokujące receptor P2Y6 [130]. Badania z analogami tiofosforanowymi znalazły zastosowanie w badanie mechanizmów wielu procesów biologicznych [131] [132] jako potencjalne terapeutyki choroby Alzheimera oraz chelatory jonów metali [133][134]. Dzięki postępom syntetycznym wciąż powstają nowe rodzaje analogów np. z grupą azydkową wewnątrz wiązania oligofosforanowego CHN 3 - czy oksometylenową OCH 2 - (wykorzystaną np. do badań degradacji i metabolizmu Ap n A [135]) [136]. Kolejnym istotnym zastosowaniem modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym nukleotydów są analogi kapu. Metoda syntetyczna pozwalająca na otrzymanie wielu różnych analogów końca 5 mrna rozwijana przez ostatnie dziesięciolecia przyczyniła się do badań na kilkoma biotechnologicznie i medycznie ważnymi procesami. Analogi metyleno-, imido-, tio-, -borano- i selenofosforanowe wykorzystywane były do badań nad ważnymi celami terapeutycznymi takimi jak DcpS, Dcp2, eif4e [62,74] jako niehydrolizowalne mimetyki naturalnej struktury kapu, inhibitory, czy narzędzia do kontroli procesów związanych z kapem (translacja, transport dojądrowy, splicing). Analogom kapu poświęcono rozdziały I.4.1 i I.5.4. W następnych rozdziałach skupiono się na cechach strukturalnych i elektronowych najważniejszych modyfikacji fosforanowych, które są przyczyną ich wyjątkowych właściwości. Opisano również metody syntezy pozwalające na wprowadzenie modyfikacji w strukturę związku, co, przy subtelnych modyfikacjach takich jak substytucje jednego atomu w cząsteczce, często okazuje się zadaniem nietrywialnym. Synteza niektórych analogów, nawet tych najbardziej oczywistych jeśli chodzi o późniejsze zastosowania, wciąż stanowi wyzwanie chemiczne. I.5.2 Właściwości strukturalne i elektronowe analogów fosforanu 59

60 a b c d e f Rysunek 19. Przykładowe modyfikacje grupy fosforanowej (fosfodiestrowej) a) Niemodyfikowany fosforan, b) tiofosforan, c) selenofosforan, d) boranofosforan, e) imidodifosforan, e) metylenobisfosfonian Modyfikowane fosforany przedstawione na rysunku powyżej (Rysunek 19) można zaliczyć do grupy bioizosterów fosforanu w nukleotydach. Definicja bioizosterów zaproponowana w 1979 roku przez Thornbera obejmuje grupy lub cząsteczki podobne chemicznie i fizycznie i wykazujące podobne właściwości biologiczne. Thornber zaproponował osiem aspektów, które mogą być rozważane przy określaniu podobieństwa grup i cząsteczek: rozmiar, kształt, struktura/gęstość elektronowa, lipofilowość, hydrofilowość, pk a, reaktywność chemiczna i zdolność do tworzenia wiązań wodorowych [137]. Bardziej nowoczesna definicja podana przez Burgera (1991) do bioizosterów zalicza także związki lub grupy odległe strukturalnie jeśli wykazują podobne właściwości biologiczne [138]. Celem zmiany jednego bioizosteru na inny jest zwykle wzmocnienie pożądanego efektu biologicznego (lub fizykochemicznego) bez drastycznych zmian w strukturze chemicznej np. redukcji toksyczności, zwiększenia aktywności lub biodostępności danej substancji. Modyfikacje grup fosforanowych w nukleotydach omawiane w tym rozdziale dobrze wpisują się w definicję bioizosterów. Modyfikacje te wprowadzają niewielkie różnice, nie zaburzają jednak kluczowych oddziaływań biologicznych, do tego drobna różnica powodują wywołanie pożądanego efektu biologicznego. Wybrane podstawowe właściwości fizykochemiczne dla modyfikacji fosforanowych pojawiających się w badaniach własnych niniejszej pracy doktorskiej zebrano w tabelach (Tabela 3,Tabela 4). 60

61 Tabela 3. Porównanie wybranych właściwości modyfikacji niemostkowych fosforanu X O S BH 3 Se Elektr. X - vs O- - pseudoizoelektronowy izoelektronowy pseudoizoelektronowy Elektroujemność X 3,44 2,58 2,04 (B) 2,55 Długość wiąz. P-X [Å] 1,5 1,9 1,9 2,1 Promień vdw [Å] 1,40 2,00 (B) 1,85 pka1 2,16 1,7 b.d. b.d. pka2 7,2 5,4 7,1 4,6 pka3 12,6 10,1 12,5 8,8 Tabela 4. Porównanie wybranych właściwości modyfikacji mostkowych fosforanu Y O CH 2 NH Elektroujemność Y 3,44 2,55 (C) 3,04 Długość wiąz. P-Y [Å] 1,5 1,8 1,7 promień vdw [Å] 1,80 1,70 1,55 pka (schemat poniżej) 7,1 8,4 7,7 pka Na podstawie powyższych danych można zauważyć, że podstawienie S, Se i BH 3 wpływa na ładunek elektryczny fosforanu, przesuwając pk a w stronę niższych wartości (porównaj Tabela 3). Atomy siarki i selenu ze względu na obecność trzech wolnych par elektronowych mogą tworzyć wiązania wodorowe, sprzyjać delokalizacji ładunku oraz mają dobre właściwości nukleofilowe (podobieństwo do atomu tlenu). Przeciwnie zachowuje się grupa boranowa, która nie posiada wolnych par elektronowych, nie bierze więc udziału w rezonansie elektronowym ani nie wykazuje właściwości nukleofilowych. Podobnie jak kwas fosforowy, jego analogi tio-, borano- i seleno- są kwasami trójprotonowymi o średniej mocy. Wartość pk a spada wraz ze zrostem anionu, co można tłumaczyć większą stabilizacją ładunku. W ph fizjologicznym (ok. 7) fosforan 61

62 oraz wszystkie z przedstawionych analogów fosforanu są więc naładowane ujemnie. Wprowadzenie modyfikacji generalnie obniża stabilność chemiczną nukleotydów. W środowisku kwasowym tiofosforany nukleozydów ulegają hydrolizie do tiofosforanów i nukleozydu, w wypadku boranofosforanu proces hydrolizy jest jeszcze szybszy i bardziej złożony. Tiofosforany i selenofosforany łatwo ulegają alkilacji oraz utlenianiu tworząc wiązania S-S i Se-Se. Dodatkowo w wypadku selenofosforanów obserwuje się wypadanie elementarnego selenu. Jeśli chodzi o modyfikacje mostkowe grupą imidową i metylenową znacznie większe podobieństwo do naturalnego wiązania pirofosforanowego wykazuje wiązanie z grupą imidową. Geometria ugrupowania imidodifosforanowego bardziej przypomina pirofosforan aniżeli grupa metylenobisfosfonianowa. Wyższa elektroujemność atomu azotu, sprawia, że dystrybucja ładunku również jest analogiczna do rozkładu ładunku w pirofosforanie, co również odbija się w wielkości stałych dysocjacji, które dla przykładowych nukleotydów z terminalnymi modyfikacjami NH i CH 2 wynoszą pk a (ATP)= 7,1, pk a (AppNHp) = 7,7 a pk a (AppCH 2 p) = 8,4 [139]. Grupa imidowa jest w stanie tworzyć wiązania wodorowe podobnie jak w przypadku tlenu, natomiast grupa metylenowa nie jest w tanie brać udziału w formowaniu wiązań wodorowych. Jest także bardziej lipofilowa. I.5.3 Metody syntezy modyfikowanych nukleotydów Opracowano wiele metod pozwalających na otrzymanie modyfikowanych nukleotydów. W tym podrozdziale przedstawiono tylko część z nich, ograniczając się do metod chemicznych syntezy, pominięto metody chemoenzymatyczne i enzymatyczne, jako mało praktyczne w syntezie większej ilości związków przeznaczonych do badań biologicznych. W kolejnych rozdziałach opisano dokładniej kilka metod syntezy, szczególnie ważnych w kontekście syntez przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej oraz podano najważniejsze informacje na temat mechanizmu substytucji nukleofilowej na atomie fosforu. I Metoda Yoshikawy i jej modyfikacje 62

63 A B bufor TEAB (MeO) 3 PO C (nbu 3 NH) 2 H 2 P 2 O 7 bufor TEAB (MeO) 3 PO 0 o C D 2,6-lutydyna (MeO) 3 PO 0 o C (nbu 3 NH) 2 H 2 P 2 O 7 bufor TEAB E 1. (MeO) 3 PO 0 o C 2. bufor TEAB alternatywne modyfikowane odczynniki pirofosforylujące: Rysunek 20. Metoda Yoshikawy i jej modyfikacje Oryginalna metoda fosforylacji opracowana przez Yoshikawę stosowana jest do syntezy 5 -O-monofosforanów nukleozydów (A). Regioselektywność fosforylacji tłumaczona jest przez powstanie sterycznie wymagającego adduktu fosforanu trimetylu z POCl 3 (B), który stanowi właściwi czynnik fosforylujący oraz reakcję w obniżonej temperaturze hamującą przebieg konkurencyjnej reakcji fosforylacji pozostałych grup hydroksylowych w rybozie. Modyfikacje reakcji Yoshikawy polegają z reguły na modyfikacjach nukleofila (C wykorzystanie pirofosforanu jako nukleofila prowadzi do powstania trifosforanów) lub czynnika fosforylującego (A -PSCl 3, B chlorek metylenobisfosfonianowy/imidodifosforanowy), co umożliwia wprowadzanie modyfikacji fosforanu. B = zwykła lub modyfikowana zasada azotowa; R = H, OH, lub modyfikacja. Jedną z pierwszych, i wciąż najpopularniejszych metod syntezy trifosforanów nukleozydów jest metoda fosforylacji Yoshikawy (Rysunek 20) [140]. Procedura obejmuje selektywną 5 -Ofosforylację nukleozydu bez grup ochronnych za pomocą elektrofilowego trichlorku fosforylu, co prowadzi do powstania produktu przejściowego reaktywnego dichlorofosforanu nukleozydu. Związek ten może być następnie hydrolizowany w celu uzyskania 5 -O-monofosforanu nukleozydu jako produktu końcowego lub jest następnie poddawany reakcji in situ z nukleofilem, np. pirofosforanem dając cykliczny trimetafosforan, który ostatecznie hydrolizowany jest do końcowego trifosforanu nukleozydu (NTP). Zamiana pirofosforanu na fosforan nie pozwala 63

64 jednak na selektywne uzyskanie difosforanów nukleozydów NDP (zwykle otrzymuje się mieszaninę NDP i NTP). Jedną z głównych zalet metody Yoshikawy jest jej prostota. Selektywność tworzenia 5 - regioizomeru wynika z wykorzystania fosforanu trietylu jako rozpuszczalnika, który tworzy sterycznie wymagający addukt z POCl 3 (Rysunek 20) atakujący w pierwszej kolejności dostępną sterycznie grupę 5. Reakcja pozwala na otrzymanie szerokiej gamy nukleotydów zawierających modyfikacje nukleozydu np. organiczne polimery, aminokwasy, nienaturalne zasady, 2 - i 3 - amino- lub fluororybozydy i linkery etc. [141], [142] [143,144], [145], [146]. Metoda fosforylacji Yoshikawy eksplorowana była także pod kątem wprowadzania modyfikacji do łańcucha oligofosforanowego. Przykładowe modyfikacje metody opierają się na zamianie odczynnika fosforylującego, którym może być PSCl 3 (α-tiofosforany), chlorek pirofosforylu (NTP) analogi chlorku pirofosforylu zawierające modyfikacje mostkowe np. metylenobisfosfonianową i imidobisfosfonianową (Rysunek 20) [76,107,146,147]. I Metoda Ludwiga-Ecksteina i jej modyfikacje Metoda one pot Ludwiga i Ecksteina obejmująca trzy etapy syntezy bez izolacji związków pośrednich należy wciąż do najbardziej popularnych i efektywnych metod syntezy trifosforanów (deoksy)rybonukleozydów [148] (Rysunek 21). W ogólności metoda polega na reakcji substratu 3 -O-zabezpieczonego nukleozydu z salicylową pochodną chlorku fosforylu, który jest wystarczająco aktywny, żeby reagować z wolną grupą 5 -hydroksylową aby otrzymać bardzo reaktywną cykliczną pochodną fosforynu. Pochodna ta w kontakcie z piofosforanem tributyloamoniowym łatwo ulega dwóm następczym substytucjom nukleofilowym, które prowadzą do powstania cyklicznego trimetafosforynu. Cykliczny fosforyn poddaje się utlenianiu (np. I 2 ), by w końcowym etapie uzyskać pożądany trifosforan (deoksy)rybonukleozydu [148]. 64

65 A (nbu 3 NH) 2 H 2 P 2 O 7 utlenianie 1. I2, H2O pirydyna 2. NH3 B (Et)(iPr 2 )N:BH 3 Li 2 S Rysunek 21. Metoda Ludwiga-Ecksteina A. Oryginalna reakcja Ludwiga-Ecksteina syntezy 5 -O-trifosforanów nukleozydów (B = zwykła lub modyfikowana zasada azotowa; R 1 = H, OAc, R 2 = H,OH) B. Modyfikacje nukleofila mogą prowadzić do związków modyfikowanych w pozycji α. (B = zwykła lub modyfikowana zasada azotowa; R 1 = H, OAc, R 2 = H,OH) [149] Zaletą metody Ludwiga i Ecksteina jest mała ilość produktów ubocznych, co znacznie ułatwia późniejszy proces oczyszczania. Ponadto, reakcja prowadzona jest w jednym naczyniu bez potrzeby izolacji związków pośrednich i, mimo to, jest łatwa do monitorowania (np. za pomocą 31 P NMR lub HPLC). Ogromną wadą w porównaniu do metody Yoshikawy jest wydłużona procedura, gdyż nukleozydowy substrat musi być najpierw trytylowany i 3 -O-acetylowany, następnie odbezpieczana jest grupa DMTr. Pomimo tej wady, pozwala ona na syntezę szerokiego spektrum modyfikowanych nukleotydów, przede wszystkim modyfikowanych w reszcie nukleozydowej. Potencjał metody jest jeszcze większy, gdyż jej drobne modyfikacje, takie jak zmiana utleniacza w końcowym etapie, mogą prowadzić to nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym [149,150], [151] (Rysunek 21). I Metoda oksatiofosfolanowa Kolejną interesującą metodą wprowadzania modyfikacji do wiązania oligofosforanowego jest tzw. metoda oksatiofosfolanowa (Rysunek 22). Metoda ta, początkowo wykorzystywana jedynie w syntezie oligonukleotydów zawierających wiązania tiofosfodiestrowe, została zaadaptowana przez Misiurę i współpr. również do syntezy α-tio i α-seleno- di- i trifosforanowych analogów nukleotydów [152]. Metoda, podobnie jak u Ludwiga i Ekcsteina, opiera się wykorzystaniu reaktywnego fosforu na +III stopniu utlenienia, wymaga jednak zabezpieczania reszt 2 i 3 hydroksylowych w rybozie. 65

66 W pierwszym etapie syntezy substrat fosfitylowany jest nietypowym reagentem, chlorkiem oksatiafosfolanowym, następnie poddawany jest on utlenianiu (siarką elementarną lub selenem). Produkt przejściowy poddawany jest reakcji z pirofosforanem w obecności nienukleofilowej zasady tworząc nietrwałą pochodną diestrową, która ulega następczej eliminacji episiarczku [152]. Ograniczeniami metody oksatiofosfolanowej jest konieczność przygotowania odczynnika fosfitylującego, który nie jest dostępny handlowo oraz konieczność pracy w warunkach ściśle bezwodnych. NH 3 (aq) - PCl3 S8 lub Se P i, DBU X = S, Se X = S, Se X = S, Se NH3 (aq) PPi, DBU Rysunek 22. Metoda oksatiofosfolanowa syntezy α-pmodyfikowanych 5 -O-trifosforanów nukleozydów Metoda opracowana przez Misiurę i współpr. [152]. B = zasada azotowa (A,U,C,G,T), R = H,OH, X = S, Se. - I Wydłużanie łańcucha fosforanowego aktywne pochodne nukleotydów Podstawą chemii nukleotydów są również reakcje prowadzące do wydłużenia łańcucha 5 - oligofosforanowego. Większość metod skupia się na uzyskaniu łańcuchów trifosforanowych, gdyż NTP są nukleotydami o największym znaczeniu biologicznym. Zdecydowana większość rekcji pozwalających na wydłużenie łańcucha 5 -oligofosforanowego opiera się na zastosowaniu odpowiedniego P-donora oraz akceptora, którym zwykle jest mono-, di- lub trifosforan nukleozydu. Poszczególne metody różnią się sposobem aktywacji czynnika elektrofilowego. Pomimo tego, że wiele P-elektrofili zostało opisanych w literaturze (Rysunek 23) praktyczne 66

67 zastosowanie znalazło tylko kilka z nich. Do najpopularniejszych P-elektrofili należą pochodne P-morfolinowe i P-imidazolowe. a f b e c d Rysunek 23. Wybrane grupy stosowane do aktywacji fosforanu w nukleotydach A grupa aktywująca w reakcji substytucji nukleofilowej na atomie fosforu: a) Pochodna morfolinowa, b) pochodna amidowa, c) dichloropochodna, d) imidazolowa pochodna, e) N-metyloimidazolowa pochodna, f) pochodna 8-hydroksychinolinowa. I Morfolinowe i imidazolowe pochodne w syntezie nukleotydów Pochodne morfolinowe można otrzymać w reakcji odpowiedniego substratu nukleotydowego z morfoliną w obecności DCC (Rysunek 24) [153]. Proces ten bywa jednak dość problematyczny, gdyż w praktyce trudno uzyskać wysokie wydajności reakcji aktywacji (w wyniku kondensacji morfoliny z DCC może powstawać dodatkowy produkt uboczny, pochodna guanidynowa, która staje się inhibitorem reakcji. Reakcje sprzęgania morfolinowych pochodnych w reakcjach sprzęgania z P-nukleofilami nie są zbyt wysokie a reakcje są długotrwałe. W rezultacie, w syntezie nukleotydów coraz większe zastosowanie znajdują inne pochodne nukleotydowe. Imidazolowe pochodne nukleotydów można otrzymać na kilka sposobów. Jedna z metod jest aktywacja substratu nukleotydowego za pomocą karbodiimidazolu w DMF [154]. Aktywacja 67

68 związków posiadających więcej niż jedno ugrupowanie fosforanowe za pomocą tej metody nie daje zadowalających wyników. Ograniczenie to sprawia, że często najlepszą metodą aktywacji nukleotydów jest reakcja Mukaiyamy i Hashimoto, która wykorzystuje układ aktywujący trifenylofosfosfinę i 2,2 -ditiodipirydynę [122] (Rysunek 24). W wyniku reakcji tworzy się również bardzo stabilny tlenek trifenylofosfiny, co znacznie przesuwa reakcję w stronę produktów (Rysunek 25). Niewątpliwą zaletą reakcji jest to, że można stosować ją do syntezy di-, tri- a nawet dłuższych wiązań oligofosforanowych oraz fakt, że pochodne imidazolowe są dość trwałe i wygodne w przechowywaniu. Mogą jednak ulegać gwałtownej hydrolizie pod wpływem nawet niewielkich ilości wody, której sprzyja protonacja atomu azotu N3, obecność dwuwartościowych jonów metali i podwyższona temperatura. Pochodne imidazolowe wykorzystywane są następnie do sprzęgania z odpowiednim P-donorem w niepolarnym rozpuszczalniku. Sawai i współpr. opisali wpływ kationów metali dwuwartościowych na nukleofilową substytucję pochodnych imidazolowych, wykazując tym samym wyjątkowe właściwości katalityczne soli takich kationów jak Mn 2+ i Cd 2+ na tworzenie wiązania pirofosforanowego (40% wydajność syntezy AppA) [155]. Sekine i wpółpr. używając jonów ZnCl 2 z wydajnością 70% zsyntetyzowali GpppCH 3 [156]. Mechanizm wspomagania syntezy za pomocą kationów metali dwuwartościowych nie jest do końca poznany prawdopodobnie w trakcie reakcji powstaje kompleks jonów metalu z atomami tlenu grupy fosforanowej, co wpływa na zwiększenie elektrofilowości atomu fosforu oraz większą rozpuszczalność nukleotydu. Niedawno Fischer i współpr. pokazali, że w ramach oddziaływań nukleotydów z jonami Zn 2+ powstają trwałe kompleksy i wyznaczyli stałe tworzenia tych kompleksów [157]. 68

69 A B TEA B-1 B-2 C H2O produkt in situ Rysunek 24. Przykładowe syntezy P-aktywowanych pochodnych nukleotydów A. Metoda Khorany wykorzystująca dicykloheksylokarbodiimid (DCC) do kondensacji nukleotydu z morfoliną. B. Metoda Mukaiyamy wykorzystująca układ aktywujący 2,2 -ditiodipirydyny i trifenylofosfiny do syntezy aktywowanych pochodnych np. P-morfolinowych (B-1) i P-imidazolowych (B-2). C. Z wykorzystaniem karbonylodiimidazolu (CDI) możliwe jest generowanie imidazolowych pochodnych in situ i poddawanie ich następczej reakcji z nukleofilem bez uprzedniej izolacji aktywowanej pochodnej. 69

70 Rysunek 25, Mechanizm działania układu aktywującego DTDP/Ph 3 P w metodzie Mukaiyamy i Hashimoto syntezy imidazolowych pochodnych W 2011 roku Mohamady i współpr. opublikowali ciekawą metodę wydłużania łańcucha fosforanowego za pomocą nowego reagenta soli sulfonyloimidazoliowej [124] (Rysunek 26). Wymaga ona uprzedniego przygotowania specjalnego odczynnika soli sulfonyloimidazoliowej, wykazującego znaczną reaktywność, wspomagającym syntezę oligofosforanów, dinukleotydów i nukleotydocukrów. Reakcja nie wymaga stosowania grup ochronnych oraz wydzielania aktywnej pochodnej z reakcji. 70

71 1 TfO - TfO - n=1-3 X = aryl, Y = H, CH3 n=1-3 X-SO3 - n=1-3 TfO - = n=1-5 Rysunek 26. Sprzęganie z wykorzystaniem aktywacji reagentem sulfonyloimidazoliowym (1) R 1, R 2 = nukleozyd W roku 2012 opublikowano metodę wytworzenia wiązania pirofosforanowego w syntezie nukleotydocukrów z wykorzystaniem innej soli imidazoliowej przedstawionej na rysunku (Rysunek 27) generowanej in situ [158]. Najbardziej interesującym aspektem tej syntezy jest możliwość przeprowadzenia reakcji w wodzie, co eliminuje problemy z rozpuszczalnością typowe dla chemii nukleotydów. Syntezy odpowiednich nukleotydocukrów przeprowadzono z wydajnością % 71

72 H 2 O DMC ImIm Im-HCl DMC HO HO H 2 O Rysunek 27. Wytworzenie wiązania pirofosforanowego w nukleotydocukrach w wodzie Synteza przebiega z wykorzystaniem soli imidazoliowej (ImIm) generowanej in situ aktywującej fosforan w reakcji sprzęgania. B = zasada azotowa (A,U,C,G,T) Zupełnie inne podejście stosowane jest w metodzie iteracyjnej, która wykorzystuje chemię fosforu na III stopniu utlenienia (Rysunek 28) [159]. Łańcuch oligofosforanowy wydłużany jest za pomocą odpowiednich amidofosforynów o jedną jednostkę w każdym etapie. Wadą metody jest pracochłonność, konieczność stosowania grup ochronnych. odbezpieczanie oligofosforan nukleozydu amidofosforyn sprzęganie zabezpieczony P(V)-P(V)-bezwodnik mieszany P(III)-P(V)-bezwodnik utlenianie Rysunek 28. Metoda iteracyjna wydłużania łańcucha oligofosforanowego z wykorzystaniem amidofosforynów 72

73 Brak w literaturze przykładów reakcji pozwalających na skuteczną aktywacje terminalnie modyfikowanych fosforanów (np. tiofosforanów, boranofosforanów itd.), które byłyby przydatnymi związkami w wielu syntezach. Brak odpowiednich metod stał się motywacją do opracowania w ramach niniejszej pracy doktorskiej metody pozwalającej na aktywację i efektywne sprzęganie z modyfikowanymi terminalnie nukleotydami. I Mechanizm substytucji nukleofilowej na atomie fosforu W literaturze wskazuje się trzy możliwe mechanizmy chemiczne transferu grupy reszty fosforanowej różniące się w czasie powstawania nowego wiązania oraz odejścia grupy odchodzącej [160]. Hipotetyczny diagram energii dla każdej z możliwych ścieżek został przedstawiony na rysunku (Rysunek 29). Mechanizmy addycji-eliminacji (mechanizm asocjacyjny) oraz dysocjacyjny wymagają powstania związku pośredniego, przeciwnie do mechanizmu jednoetapowego [160]. Mechanizm addycji-eliminacji przewiduje w pierwszym etapie przyłączenie nukleofila i powstanie pięciowiązalnego stanu pośredniego, w drugim etapie odejście grupy odchodzącej (reakcja zachodzi z inwersją konfiguracji (analogia mechanizmu S N 1 dla atomów węgla[160]. W mechanizmie dysocjacyjnym w pierwszym etapie następuje dysocjacja grupy odchodzącej i powstaje trójwiązalny płaski kation podatny na atak nukleofilowy od dowolnej strony (analogia mechanizmu S N 2 dla atomów węgla) [160]. W mechanizmie jednoetapowym wiązanie z grupą odchodzącą ulega rozerwaniu z jednoczesnym utworzeniem nowego wiązania. 73

74 Rysunek 29. Substytucja nukleofilowa na atomie fosforu Mechanizmy substytucji nukleofilowej na atomie fosforu. A jednoetapowy, w którym wiązania z nukleofilem Nu powstaje symultanicznie z zerwaniem wiązania z grupą odchodzącą X. B - addycji-eliminacji w pierwszym etapie następuje addycja nukleofila i powstanie pięciowiązalnego stanu przejściowego, w drugim etapie następuje eliminacja grupy odchodzącej. C mechanizm dysocjacyjny w pierwszym etapie następuje zerwanie wiązania z grupą odchodzącą, co prowadzi do powstania trójwiązalnego dodatnio naładowanego stanu przejściowego, a następnie dochodzi do przyłączenia nukleofila. I.5.4 Synteza analogów kapu Analogi kapu można zdefiniować jako związki chemiczne przypominające niektóre strukturalne i biologiczne funkcje końca 5 mrna (zwykle N7-metyloguanozyna lub łańcuch 5 - O-trifosforanowy) [74]. Można podzielić je na mononukleotydowe i dinukleotydowe analogi kapu, oraz kapowane oligonukleotydy. Synteza analogów kapu przysparza wielu trudności, z których większość wynika z nietypowych dla nukleotydów właściwości reszty N7- metyloguanozyny. I Właściwości N7-metyloguanozyny 74

75 Obecność naładowanej dodatnio reszty N7-metyloguanozyny potęguje problemy z rozpuszczalnością (związki bardzo polarne), stabilnością (oprócz typowej dla nukleotydów podatności na depurynację pierścień N7-metyloguaniny łatwo ulega otwarciu w alkalicznym ph, (Rysunek 30)) i izolacją związków [161]. Z tego względu wachlarz narzędzi i dostępnych metod syntetycznych typowych dla chemii nukleotydów jest dla nukleotydów zawierających N7- metyloguanozynę mocno ograniczony, dopuszczając jedynie reakcje w łagodnych warunkach, bardzo polarnych rozpuszczalnikach i bez znacznych manipulacji środowiskiem reakcji (ph, temperatura eliminuje to użycie większości grup ochronnych wymagających odbezpieczania w warunkach ścisłego ph). Mimo tych ograniczeń, do syntezy kapu zaimplementowano kilka efektywnych metod opisanych w rozdziale. A H 2 O B H 2 O Rysunek 30. Degradacja N7-metyloguanozyny w zależności od ph W ph < 7 N7-metyloguanozyna ulega depurynacji (A). Dla porównania, proces o podobnym mechanizmie dla guanozyny zachodzi dopiero w ph < 2. W środowisku zasadowym pierścień imidazolowy ulega otwarciu (B). Do innych ciekawych właściwości nukleotydów zawierających N7-metyloguanozynę wyróżniających ją spośród typowych nukleotydów należy inna konformacja przyjmowana przez pierścień rybozy [96]. W przeciwieństwie do innych purynowych nukleotydów i nukleozydów N7-metyloguanozyna i jej 5 -fosforylowane pochodne preferują konformację 3 -endo. Dzięki 75

76 oddziaływaniom dodatniego ładunku skupionego na zasadzie z ładunkiem ujemnym rozproszonym na fosforanach nukleotydy N7-guanozynowe przyjmują konformację anti wokół wiązania N-glikozydowego oraz preferują konformację synklinalną sokół osi wiązania C4 -C5. Nietypowa konformacja wspomaga oddziaływania z białkami wiążącymi kap [65]. I Metody syntezy Metody syntezy analogów kapu rozwijane przez dziesięciolecia były wielokrotnie publkowane. Na podstawie tych prac można wyróżnić podstawowe metody stosowane w syntezie kapów. Proste nukleotydy zawierające N7-metyloguanozynę mogą być otrzymywane poprzez alkilowanie za pomocą halogenku alkilu [162],[163],[161] pozycji N7 odpowiednich wyjściowych nukleotydów. W ten sposób możliwe jest też wprowadzenie innych niż metylowy podstawników alkilowych, np. etylu, propylu, benzylu. Do innych często używanych odczynników alkilujących należą siarczan dimetylu [164] czy metanosulfan metylu [165]. Można również alkilować guanozynę i przeprowadzić reakcję fosforylacji Yoshikawy za pomocą chlorku fosforylu, pirofosforylu czy ich analogów (reakcji Yoshikawy fosforylacji nukleozydów poświęcono rozdział I [140,146]. Ta metoda sprawdza się lepiej w wypadku niektórych modyfikowanych nukleotydów, gdyż niektóre modyfikacje (np. tiofosforanowa) ulegają również łatwej alkilacji. Wydłużenie łańcucha realizowane jest najczęściej poprzez przeprowadzenie w aktywną pochodną (najczęściej P-imidazolid, np. za pomocą 1,1 -karbonylodiimidazolu lub metody Mukaiyamy-Hashimoto) i sprzęgnięcie z trialkilową solą amoniową odpowiedniego P-donora (fosforanu, pirofosforanu lub ich analogów) w polarnym rozpuszczalniku (DMF, DMSO) w obecności soli metali dwuwartościowych (np. MgCl 2, ZnCl 2 ). Adaptując metodę Kadokury [156] w 2001 roku Stępiński i wsp. zademonstrowali, że można doprowadzić też do powstania odpowiedniego dinukleotydowego analogu kapu sprzęgając ze sobą dwie jednostki mononukleotydowe, z których jedna jest aktywowana, a druga stanowi odpowiedni P-nukleofil w obceności chlorku cynku jako mediatora [94]. W oparciu o tą metodę powstały pierwsze analogi typu ARCA, dinukleotydowe analogi kapu z wydłużonym mostkiem fosforanowym, a również analogów zawierających modyfikacje metylenobisfosfonianowe, imidodifosforanowe, tiofosforanowe, boranofosforanowe, selenofosforanowe i inne [74]. W wypadku analogów 76

77 modyfikowanych w mostku trifosforanowych często obserwowano niższe wydajności ostatniego sprzęgania i problemy z izolacją związków niepozwalające na otrzymanie produktu o pożądanej czystości. Dodatkowo w analogach tych najczęściej na skutek powstania nowego centrum stereogenicznego na atomie fosforu w trakcie syntezy pojawiają się diastereoizomery, często wymagające stosowania żmudnych metod rozdziału. I.5.5 P-stereochemia nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym Atom fosforu znajdujący się w centrum fosforanu (V) i jego pochodnych (np. estrów fosforanowych) wraz z podstawnikami tworzy strukturę tetraedryczną i w związku z tym stanowi potencjalne centrum stereogeniczne. Właściwość ta wykorzystywana jest często przez naukowców do badania stereochemii reakcji angażujących grupę fosforanową. Przykładowe często spotykane podstawniki mogące spowodować zaburzenie symetrii i powstanie centrum chiralnego to np. atom siarki czy izotopowe atomy tlenu 17 O i 18 O. Również diestry i triestry fosforanu mogą wykazywać czynność optyczną pod warunkiem braku symetrii w powstałej cząsteczce. Synteza nukleotydów (posiadających już kilka chiralnych atomów o zdefiniowanej konfiguracji) modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym często prowadzi do wygnerowania nowego centrum stereogenicznego i tym samym powstaniadwóch diastereoizomerów produktu. Otrzymane diastereoizomery mogą różnić się właściwościami fizykochemicznymi (takimi jak czas retencji na kolumnie HPLC, reaktywność, oddziaływanie z polem magnetycznym itd.) oraz biologicznymi (oddziaływanie z biomolekułami). Przykładowo, enzym fosfodiestraza z jadu węża (SVPDE) preferencyjnie hydrolizuje tiofosforany nukleozydów o konfiguracji R P [166]. Warto zwrócić uwagę, że notacja S P /R P zależy od kolejności podstawników ustalanej według reguł systemu Cahna-Ingolda-Preloga (CIP), a więc związki o tej samej przestrzennej konfiguracji mogą różnić się notacja (patrz Rysunek 31). W wypadku analogów kapu modyfikowanych w mostku 5,5 -O-trifosforanowym zaobserwowano wiele ciekawych różnic w zachowaniu się diastereoizomerów związków posiadających różne modyfikacje niemostkowe (S, BH 3, Se) [74]. Formy diastereoizomeryczne różniły się znacznie właściwościami biologicznymi. Przykładem mogą być różnice zaobserwowane w podatności na hydrolizę przez enzymy dekapujące [98][104] [109], różnice w 77

78 powinowactwie do eif4e [75] czy w wydajności translacji mrna [42,98]. Nie zawsze stwierdzenie konkretnych różnic jest możliwe, gdyż niektóre formy diastereoizomeryczne posiadają niewielkie różnice we właściwościach fizykochemicznych, co utrudnia lub uniemożliwia ich separację. Czasem mimo różnic we właściwościach fizykochemicznych nie obserwuje się różnic we właściwościach biologicznych. A B achiralny fosforan (V) chiralny znakowany ester fosforanu (V) chiralny fosfotriester RP S P kolejność podstawników: S>OR2>OR1>O>B Rysunek 31. A. Achiralny fosforan (V) oraz przykłady jego pochodnych wykazujących czynność optyczną. achiralnych i chiralnych związków. B. Chiralne pochodne fosforanu o tej samej konfiguracji przestrzennej różniące się notacją konfiguracji absolutnej. 78

79 II Wyniki i dyskusja II.1. Wprowadzenie Jak wykazano w przeglądzie literaturowym przedstawionym w pierwszej części pracy, potencjał terapeutyczny mrna jest ogromny, nie dziwi więc, że zainteresowanie wykorzystaniem mrna w celach terapeutycznych od kilku lat jest w centrum uwagi lekarzy i naukowców. Definitywna skuteczność terapeutyczna mrna nie zostanie jednak osiągnięta, jeśli nie uda się przezwyciężyć problemów z jego stabilnością (przejawiających się głównie w problemach z wytwarzaniem, przechowywaniem i pracą z mrna jak i w wydajności osiąganej w czasie translacji, zależnej od czasu życia mrna). W związku z tym, istnieje potrzeba opracowywania nowych skutecznych metod poprawiających właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne mrna. Osiągnięto znaczny postęp jeśli chodzi o poprawę właściwości terapeutycznych mrna, w tym stabilności i wydajności translacji. W części literaturowej podano kilka przykładów możliwych metod modyfikacji mrna metodami chemicznymi i biologicznymi. Jednym z narzędzi do tego celu mogą być modyfikowane chemicznie nukleotydy wbudowywane w strukturę transkryptu mrna, kształtujące jego późniejsze właściwości w pożądanym kierunku. W poniższej pracy opracowano kilka propozycji molekularnych narzędzi do syntezy stabilniejszego i wydajniejszego translacyjnie mrna będących prekursorami 5 kapu lub ogona poli(a). Każdy z poniższych rozdziałów poświęcono odrębnemu zagadnieniu opracowywanemu w ramach pracy doktorskiej, których wspólnym mianownikiem jest nadrzędny cel zwiększenia biologicznego/terapeutycznego potencjału mrna. II.1.1 Uwagi na temat stosowanego nazewnictwa Ze względu na długie i skomplikowane systematyczne nazwy nukleotydów dopuszczalne jest stosowanie notacji skrótowej. W tabeli poniżej omówiono zasady stosowanego w niniejszej pracy nazewnictwa na podstawie wybranych przykładów (Tabela 5). 79

80 Tabela 5. Przyjęta notacja nukleotydów nazwa systematyczna notacja skrótowa objaśnienie 3 -O-monofosforan guanozyny 3 -GMP lub Gp G odnosi się do typu zasady azotowej tu: guanozyny, P oznacza grupę fosforanową, M- jedna grupa (mono-), 3 -sposób wiązania (wiązanie fosfoestrowe z grupą 3 -OH rybozy). Stosuje się również notację gdzie grupy fosforanowe (p) związane wiązaniem 3 zapisuje się po prawej stronie symbolu zasady 5 -O-monofosforan guaozyny 5 -GMP, GMP lub pg jw. oraz: 5 sposób wiązania (wiązanie fosfoestrowe z grupą 5 -OH rybozy). Stosuje się notację gdzie grupy fosforanowe (p) związane wiązaniem 5 zapisuje się po lewej stronie symbolu zasady 5 -O-difosforan guanozyny 5 -GDP, GDP lub ppg jw. oraz D dwie grupy (di-) 5 -O-trifosforan guanozyny 5 -GTP, GTP lub pppg jw. oraz T trzy grupy (tri-) 5 -O-monofosforan N7-metyloguanozyny m 7 GMP, lub pm 7 G jw. oraz modyfikacje zasady azotowej oraz rybozy zapisywane są przed symbolem zasady symbolem małej litery alfabetu łacińskiego (np. m-metyl, bn- benzyl). Indeks górny oznacza miejsce wiązania z zasadą zgodnie z przyjętą numeracją atomów w nukleotydach (tu 7 wiązanie z N7 w guanozynie inne np. 2 -O: wiązanie z grupą 2 -OH w rybozie) 5 -O-monofosforan N7,2 -O-dimetyloguanozyny m 7,2 -O 2 GMP, pm 7,2 -O 2 G lub jw. oraz: w przypadku większej liczby modyfikacji indeks dolny wskazuje na ich liczbę tu: m 2 dwie grupy metylowe 5 -O-monotiofosforan guaozyny GMPS lub p SG jw. oraz: modyfikacje niemostkowe łańcucha oligofosfranowego zapisywane są w indeksie dolnym po prawej stronie fosforanu p S lub bezpośrednio po grupie fosforanowej jak w GMPS). 5 -O-(P1-tiodifosforan) guaozyny, 5 -O-(Pαtiodifosforan) guaozyny GDPαS lub pp SG jw. oraz oznaczenie numeru modyfikowanego fosforanu (numeracja cyframi rzyskimi P1,2,3 lub literami alfabetu greckiego Pα,β,γ itd.) 5 -O-monotiofosforan guaozyny ppnhpg jw. oraz w wypadku modyfikacji mostkowych modyfikacja zapisywana jest pomiędzy fosforanami są połączone z tą modyfikacją. Stosowane są duże litery alfabetu. P-imidazolid 5 -Omonofosforanu guanozyny GMPIm, ImpG, Im-pG GMP-Im, jw. oraz większe modyfikacje fosforanu, np. Grupa imidazolowa zapisywane są po lewej stronie modyfikowanego fosforanu odpowiadającym im symbolem np. Im imidazol 5 -O-(N7-guanozynotrifosforan) guanozyny m 7 GpppG 80 jw. oraz: w zapisie dinukleotydów stosuje się notację, gdzie nukleotyd znajdujący się na 5 końcu znajduje się po lewej stronie (tu m 7 G)

81 II.2. Cele badań Celem zrealizowanego przeze mnie projektu była synteza i wykorzystanie niehydrolizowalnych pochodnych nukleotydów do stabilizacji cząsteczki mrna oraz zwiększenia jej potencjału translacyjnego w warunkach komórkowych. Jest to szczególnie ważne, gdy rozpatrujemy zastosowania mrna w celach terapeutycznych, takich jak immunoterapia nowotworów za pomocą mrna, gdzie trwałość mrna przekłada się bezpośrednio na ilość powstającego w komórkach terapeutyka, a co za tym idzie skuteczność terapii. Do kluczowych elementów mrna wpływających na jego stabilność należą m.in. ogon poli(a) oraz 5 -kap. Na ocenę wpływu odpowiednich chemicznych modyfikacji wprowadzonych w obrębie tych elementów na stabilność całego mrna pozwoliła mi realizacja kolejnych etapów mojej pracy, na które składają się: 1) wybór odpowiednich modyfikacji o potencjalnym działaniu ochronnym przed działaniem enzymów degradujących kap i ogon poli(a) 2) rozwinięcie metod syntetycznych w celu otrzymania nowych modyfikowanych nukleotydów, w tym prekursorów nowych analogów kapu, oraz prekursorów ogona poli(a) 3) przeprowadzenie syntezy nowych analogów kapu oraz prekursorów poli(a) zawierających odpowiednie modyfikacje 4) wstępna ocena właściwości biologicznych analogów kapu, takich jak powinowactwo do eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 4E (eif4e) 5) synteza mrna zakończonego nowymi analogami kapu i ewaluacja efektu jaki wywierają one na stabilność (np. odporność na dekaping Dcp2) i poziom translacji mrna w systemie bezkomórkowym, a także warunkach komórkowych 6) opracowanie metody inkorporacji modyfikowanych nukleotydów w obrębie poli(a) oraz ewaluacja wpływu tych modyfikacji na stabilność i poziom translacji mrna. W poniższych rozdziałach przedstawiono wyniki przeprowadzonych eksperymentów dotyczących poszczególnych części projektu oraz ich dyskusję. 81

82 II.3. Tetrafosforanowe analogi kapu modyfikowane pojedynczą grupą tiofosforanową (4P-S) Chronologicznie pierwszymi nukleotydami powstałymi w związku z opisywanym projektem były tetrafosforanowe analogi kapu zawierające pojedynczą modyfikację tiofosforanową, określane w skrócie serią 4P-S. Wyniki badań biologicznych z ich zastosowaniem stały się punktem wyjściowym do zaplanowania dalszych związków narzędzi do stabilizacji i zwiększenia potencjału translacyjnego mrna. W poniższym rozdziale przedstawiono syntezę analogów 4P-S oraz wstępne badania właściwości nowych analogów kapu takie jak powinowactwo do eif4e i wydajność translacji in vitro wyznaczoną dla mrna posiadających odpowiedni analog kapu na 5 końcu. II.3.1 Wybór modyfikacji Jak przedstawiono w części literaturowej, do jednych z kluczowych elementów mrna wpływających na jego stabilność należy 5 - kap. Modyfikacje 5 -kapu pozwalają na zwiększenie trwałości i wydajności translacyjnej mrna, czego najbardziej znanym i skutecznym przykładem jest modyfikacja grupą tiofosforanową w pozycji β, tzw. β-s-arca (diastereoizomer D1) (patrz rozdział I.4.1). Sukces β-s-arca zachęcił nas do szukania nowych analogów kapu opartych o strukturę β-s-arca, które mogłyby jeszcze bardziej podwyższyć jakość mrna. Pierwszą próbą było wydłużenie łańcucha fosforanowego β-s-arca. W celu uzyskania jak najlepszego efektu zdecydowano się na wydłużenie mostka trifosforanowego kapu jedynie o jedną jednostkę fosforanową, gdyż na podstawie wcześniejszych badań nad analogami kapu wiadome było, że modyfikacja ta pozytywnie wpływa na oddziaływania z eif4e oraz zwiększa wydajność translacji in vitro, natomiast w wypadku dłuższych łańcuchów fosforanowych pomimo zwiększenia powinowactwa do eif4e nie obserwowano dalszego pozytywnego wpływu na wydajność translacji. Związanie jest prawdopodobnie z możliwością niespecyficznych oddziaływań z białkami obecnymi w mieszaninie translacyjnej. W związku z tym wybór łańcucha 5,5-tetrafosforanowego wydawał się wyborem optymalnym. Postanowiono również zachować dodatkową metylację grupy 2 -hydroksylowej w guanozynie (ARCA) gdyż głównym przeznaczeniem związków miało być wykorzystanie do syntezy mrna (znaczenie modyfikacji ARCA dla otrzymywania mrna opisano w Rozdziale I.4.1). Istotne w kontekście pracy wyniki 82

83 wcześniejszych badań, które stały się przesłanką do otrzymania serii analogów kapu 4P-S-ARCA zestawiono w tabeli poniżej (Tabela 6). Tabela 6. Kluczowe wyniki wcześniejszych badań nad analogami kapu, które stały się podstawą do zaprojektowania związków syntezyzowanych w niniejszej pracy. Modyfikacja Wpływ Źródła Modyfikacja ARCA analogi kapu : m 2 7,3 -O GpppG, m 2 7,2 - O GpppG Dodatkowa metylacja grupy 2 OH lub 3 OH rybozy w m 7 G blokuje możliwość nieprawidłowej inkorporacji do trankryptu przez polimerazę RNA w trakcie syntezy mrna in vitro. Efekt ten przekłada się na ok 2.3- to 2.6-krotnie wyższą wydajność translacji ARCA-mRNA w RLL w porównaniu m 7 GpppG-mRNA. [94],[96,167] Wydłużony łańcuch fosforanowy analogi kapu: m 7 GppppG, m 2, 7,2 - O GppppG, m 7,3 -O 2 GppppG, m 2, 7,2 - O GpppppG, m 7,3 -O 2 GpppppG Tetra- i pentafosforanowe analogi kapu wykazują silniejsze oddziaływania z eif4e, są lepszymi inhibitorami translacji i zwiększają wydajność kapowanego nimi mrna aniżeli ich trifosforanowe odpowiedniki. Najwyższy poziom translacji w RRL prezentowało m 2, 7,2 -O GppppGmRNA. [96,103] Modyfikcja tiofosforanowa Analogi kapu: m 7 Gp SppG D1 i D2, m 27 Gpp SpG D1 i D2, m 7 Gpp SpG D1 i D2, m 7,2 -O 2 Gp SppG D1 i D2, m 7,2-2 O Gpp SpG D1 i D2, m 7,2 -O 2 Gpp SpG D1 i D2 Modyfikacja tiofosforanowa kapu generalnie stabilizuje kompleks analog kapu-eif4e, największe powinowactwo wykazywał związek m 7 Gpp SpG D1(4-krotnie wyżśze niż m 7 GpppG). m 7,2 -O 2 Gpp SpG/D1-mRNA i m 7,2 -O 2 Gpp SpG/D2- mrna ulegają 2,8- i 5,1-krotnie wydajniejszej translacji w komórkach HC11 m 7,2 -O 2 Gpp SpG-mRNA, w szczególności m 7,2-2 O Gpp SpG/D1- mrna podnosi stabilność i wydajność translacji w komórkach hidc. m 7,2-2 O Gpp SpG/D1- mrna kodujące odpowiedni antygen ulega wydajnej ekspresji i indukuje silną odpowiedź immunologiczną limfocytów T w [98,99,104] 83

84 myszach II.3.2 Synteza tetrafosforanowych analogów kapu modyfikowanych pojedynczą grupą tiofosforanową (4P-S-ARCA) Syntezę nowych analogów kapu 4P-S-ARCA oparto o typową syntezę analogów kapu, w której dwie podjednostki mononukleotydowe sprzęgane są ze sobą w obecności dwuwartościowych jonów metali w rozpuszczalniku polarnym aprotycznym. Metoda ogólna wymagała jednak odpowiedniego dopasowania do charakteru otrzymywanych związków. Wybór podjednostek mononukleotydowych do syntezy kapów 4P-S uzależniony jest od miejsca wybranej modyfikacji, gdyż uzyskanie odpowiedniej modyfikowanej w łańcuchu fosforanowym podjednostki nukleotydowej jest nie zawsze możliwe. Trzeba więc tak zaplanować dobór substratów do finalnej reakcji sprzęgania, aby były one jak najłatwiejsze do otrzymania. Warto zwrócić też uwagę, że praca z nukleotydami modyfikowanymi grupą tiofosforanową jest wymagająca, gdyż związki łatwo ulegają hydrolizie lub degradacji pod wpływem temperatury. Kolejne etapy syntezy powinny być więc wykonywane w niezbyt długich odstępach czasu, aby uniknąć problemów związanych z używaniem substratów częściowo zanieczyszczonych na skutek powolnej degradacji związku, wymagających rechromatografii. Dodatkowym utrudnieniem była również praca z wysoce polarnymi związkami, tri- i w szczególności tetrafosforanami, które wykazują gorszą rozpuszczalność nawet w bardzo polarnych rozpuszczalnikach. Niemniej jednak zaplanowano syntezę czterech analogów kapu 4P-S-ARCA wykorzystując dwa podejścia, w zależności od tego, czy modyfikacja tiofosforanowa znajdowała się w zewnętrznej części mostka tetrafosforanowego (α lub δ) czy też zajmowała pozycję wewnętrzną (β lub γ). Oba podejścia przedstawiono dokładnie w kolejnych rozdziałach. II Tetrafosforanowe analogi kapu typu ARCA posiadające pojedynczą modyfikację tiofosforanem w pozycji terminalnej α lub δ 84

85 OR = fosforylacja Yoshikawy tiofosforylacja Yoshikawy B = (B 1 lub B 2 ) = G: 4 TBAH + Mukaiyama - Hashimoto m 7 G: Sprzęganie ZnCl 2, DMF m 2 7,2'-O Gp S pppg: B 1 = m 7 G B 2 = G OR 1 = OCH 3 OR 2 = OH m 2 7,2'-O Gpppp S G: B 1 = G B 2 = m 7 G OR 1 = OH OR 2 = OCH 3 R P i S P Rysunek 32. Ogólna koncepcja konstrukcji mostka tetrafosforanowego modyfikowanego grupą tiofosforanową w analogach m 7,2 -O 2 Gp S pppg i m 7,2 -O 2 Gpppp S G Ogólny plan syntezy tetrafosforanowych pochodnych kapu z modyfikacją tiofosforanową w pozycji terminalnej przedstawiono na schemacie (Rysunek 32). Zwracając uwagę, aby uniknąć w miarę możliwości pracy z mało trwałymi nukleotydami zawierającymi modyfikację tiofosforanową na końcu łańcucha fosforanowego mononukleotydu, w końcowym etapie zdecydowano się na sprzęgnięcie ze sobą 5 -O-monofosforanowej podjednostki mononukleotydowej z podjednostkę 5 -O-P1-tiotrifosforanową. Ze względu na to, że jeden z substratów powinien stanowić P-elektrofil, podjednostkę 5 -O-monofosforanową zaplanowano aktywować w postaci imidazolowej pochodnej (aktywacja dłuższych oligofosforanów jest trudniejsza). Kolejne etapy syntezy prowadzące do otrzymania obu prekursorów kapu przedstawiono w następnych podrozdziałach. 85

86 II Wprowadzanie podstawnika metylowego w pozycję N7 guanozyny Zgodnie z przyjętym planem syntezy, wprowadzenie podstawnika metylowego stanowi jeden z pierwszych etapów. Odpowiednia kolejność wprowadzenia tego podstawnika jest szczególnie istotna w wypadku tiofosforanowych nukleotydów, które w reakcji metylowania łatwo ulegają dodatkowej alkilacji na atomie siarki (siarka jest dobrym nukleofilem). Aby uniknąć tej reakcji ubocznej, znacznie lepiej przeprowadzić metylację na wcześniejszych etapach, zanim jeszcze wprowadzimy do związku modyfikację tiofosforanową. Wobec tego zdecydowano się na przeprowadzenie reakcji metylacji wyjściowego nukleozydu 2 -O-metyloguanozyny wykorzystując jako odczynnik alkilujący jodek metylu w DMA. Użycie nadmiaru odczynnika alkilującego (8 eq) pozwoliło na na uzyskanie całkowitej konwersji substratu w N7,2 -Odimetyloguanozynę, którą wydzielono poprzez wytrącenie z roztworu za pomocą acetonu (wydajność 70%). Schemat przeprowadzonej syntezy zaprezentowano na rysunku (Rysunek 33). 1. CH3I, DMA 2. aceton 70% Rysunek 33. Metylacja atomu azotu N7 w 2 -O-metyloguanozynie II Synteza mononukleotydowych podjednostek P-elektrofilowych Następny etap stanowiło otrzymanie P-elektrofilowych podjednostek mononukleotydowych stanowiących zgodnie z planem jedne z pożądanych substratów w finalnym etapie syntezy kapu. Dla analogu α (m 7,2-O 2 Gpppp S G) P-elektrofilową jednostkę stanowi m 7,2-O 2 GMP-Im, natomiast dla analogu δ (m 7,2-O 2 Gp S pppg) jest to GMP-Im. W celu uzyskania m 7,2-O 2 GMP-Im przeprowadzono dwuetapową syntezę wychodząc z N7,2 -O-dimetyloguanozyny. W pierwszym 86

87 etapie substrat poddano fosforylacji Yoshikawy zgodnie ze schematem A (Rysunek 34). Nukleozyd zawieszono w fosforanie trimetylu, ochłodzono do temperatury 0 o C. i dodano POCl3. Po ok. 5 godz. w mieszaninie reakcyjnej można było obserwować jedynie dichloromonofosforan 7,2- N7,2 -O-dimetyloguanozyny, który hydrolizowano za pomocą buforu TEAB otrzymując m 2 O 7,2- GMP. Po izolacji za pomocą chromatografii na złożu DEAE-Sephadex (wydajność 70%) m 2 O GMP poddano reakcji imidazolowania Mukaiyamy-Hashimoto w obecności układu aktywującego 2,2 -ditiodipirydyny i trifenylofosfiny (Rysunek 34). Produkt wytrącono za pomocą rozworu NaClO 4 w zimnym acetonie otrzymując sól sodową m 7,2-O 2 GMP-Im o czystości 97% z wydajnością 87%. Kolejny prekursor kapu, GMP-Im, otrzymano z handlowo dostępnego GMP (sól sodowa) przeprowadzając substrat w lipofilową sól trietyloamoniową na złożu Dowex (forma TEAH + ) a następnie poddając reakcji imidazolowania Mukaiyamy Hashimoto (Schemat B, Rysunek 34). Końcowy produkt, sól sodową GMP-Im otrzymano z wydajnością 80% (czystość 91%). A POCl3 TEAB 0,7 M (MeO)3PO, 0 o C B 1. 2,2'-DTDP, Ph3P,, TEA DMF, rt 2. NaClO4/aceton m2 7,2'-O GMP-Im: R1 = N + -CH3, R2 = CH3 GMP-Im: R1 = N:, R2 = H Rysunek 34. A. Fosforylacja yoshikawy N7,2 -O-dimetyloguanozyny. B. Synteza P-imidazolowych pochodnych m 2 7,2-O GMP i GMP II Synteza mononukleotydowych podjednostkek P-nukleofilowych zawierających modyfikację tiofosforanową W kolejnym kroku podjęto próbę otrzymania α-tiotrifosforanu guanozyny oraz N7,2 -Odimetyloguanozyny. Związki otrzymano modyfikując reakcję Ludwiga (rozdział I.5.3.2). Syntezę przeprowadzono w sposób dwuetapowy. W pierwszym etapie poddano odpowiedni nukleozyd 87

88 tiofosforylacji za pomocą PSCl 3 w warunkach Yoshikawy, otrzymując selektywnie dichloromonotiofosforan nukleozydu (Rysunek 35). W reakcji tiofosforylacji jako produkt uboczny powstaje HCl zakwaszając środowisko reakcji, cosprzyja hydrolizie powstającej grupy tiofosforanowej (a także depurynacji nukleozydów takich jak np. m 7 G). W związku z tym do mieszaniny reakcyjnej dodawano nienukleofilowej zasady, lutydyny, co pozwoliło na wydajne przeprowadzenie reakcji tiofosforylacji. Ze względu na fakt, że dicholoropochodne fosforanów stanowią dość dobre aktywowane P-elektrofilowe pochodne, związek poddano bez izolacji reakcji z pirofosforanem tributyloaminy w DMF. W trakcie reakcji kontrolowanej za pomocą RP- HPLC obserwowano pojawianie się dwóch sygnałów pochodzących od P-diastereoizomerów D1 i D2 5 -O-P1-tiotrifosforanu nukleozydu. Reakcja zachodzi poprzez produkt przejściowy - cykliczny trifosforan, który w zetknięciu z nukleofilem (cząsteczką wody) ulega otwarciu. Reakcja przebiega w ciągu kilku minut, jednak zbyt długie prowadzenie reakcji prowadzi do powstania produktu ubocznego, pochodzącego z reakcji 5 -O-metatrifosforanu z nukleofilem pirofosforanem, takiego jak 5 -O-α-tiopentafosforan nukleozydu. W przypadku syntezy GTPαS, produkt udało się uzyskać z zadowalającą wydajnością 60% przy jedynie niewielkich ilościach produktów ubocznych, które oddzielono za pomocą chromatografii na złożu DEAE-Sephadex. W syntezie drugiego prekursora, m 7,2-O 2 GTPαS (Rysunek 35), zastosowano analogiczną procedurę, kontrolując ph reakcji, aby uniknąć ubocznej depurynacji przy zbyt niskim ph. Problemem pojawiającym się w syntezie m 7,2-O 2 GTPαS, było oddzielenie produktu m 7,2-O 2 GTPαS od nadmiaru użytego w reakcji pirofosforanu. Ze względu na obecność ładunku dodatniego na zasadzie m 7,2-O 2 GTPαS, wypadkowy ładunek m 7,2-O 2 GTPαS jest niższy niż dla GTPαS i porównywalny z ładunkiem pirofosforanu, przez co oddzielenie za pomocą chromatografii jonowymiennej nie jest skuteczne. Zanieczyszczenie finalnego związku pirofosforanem potwierdzono za pomocą widm 31 P NMR. Ze względu na fakt, że pirofosforan przeszkadzałby w kolejnych etapach syntezy, m 7,2-O 2 GTPαS doczyszczono więc za pomocą półpreparatywnego RP- HPLC stosując liniowy gradient metanolu w octanie trietyloaminy. Oba prekursory kapu otrzymano w ostatecznej formie soli trietyloamoniowych, które zwiększają lipofilowość tych bardzo polarnych związków zwiększając jednocześnie ich rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych. Warto dodać, że m 7,2-O 2 GTPαS jest związkiem nowym, nie opisanym wcześniej w literaturze. 88

89 PSCl 3 lutydyna (MeO) 3 PO, 0 o C DMF, rt 4 TBAH + GTPαS: R 1 = N:, R 2 = H m 2 7,2'-O GTPαS: R 1 = N + -CH 3, R 2 = CH 3 TEAB Rysunek 35. Synteza podjednostek P-nukleofilowych GTPαS i m 2 7,2 -O GTPαS II Wytworzenie wiązania pirofosforanowego pomiędzy P-elektrofilowym i P-nukleofilowym prekursorem kapu A α β γ δ ZnCl 2, DMF R P i S P wydajność HPLC > 90% wydajność po izolacji 60% B δ γ β α ZnCl 2, DMF R P i S P wydajność HPLC > 90% wydajność po izolacji 65% Rysunek 36. A. Schemat syntezy m 2 7,2 -O Gpppp S G. B. Schemat syntezy m 2 7,2 -O Gp S pppg W ostatnim etapie syntezy poddano sprzęganiu otrzymane wcześniej prekursory kapu. Zgodnie z przyjętą strategią opisaną na początku rozdziału, wytworzenie wiązania 89

90 pirofosforanowego zrealizowano za pomocą reakcji sprzęgania dwóch podjednostek mononukleotydowych: GTPαS + m 2 7,2-O GMP-Im oraz GMP-Im + m 2 7,2-O GTPαS (Rysunek 36). Reakcje przeprowadzono w DMF w obecności 16 eq ZnCl 2, który ułatwia rozpuszczanie związków oraz pośredniczy w wytworzeniu wiązania pirofosforanowego. W trakcie optymalizacji warunków reakcji najlepsze wyniki uzyskano stosując dodatek ZnCl 2 w dwóch porcjach, na początku reakcji 8 eq, a po całkowitym rozpuszczeniu związków kolejne 8 eq. Dzięki tej procedurze uzyskano najlepsze wyniki. Optymalizując ilość reagentów, najlepsze wydajności uzyskano stosując 1,5-krotny nadmiar imidazolowej pochodnej co zmniejszyło również szansę powstawania produktów ubocznych takich jak GppG lub m 2 7,2-O Gpp(m 2 7,2 -O G). Reakcję kontrolowano za pomocą RP-HPLC obserwując pojawianie się wyraźne od siebie oddalonych sygnałów P-diastereoizomerów produktów (w stosunku ok. 7:10 zauważalny efekt indukcji asymetrycznej) oraz ewentualnych produktów ubocznych sprzęgania. Przykładowy profil HPLC reakcji przedstawiono na rysunku (Rysunek 37). Wydajności HPLC reakcji sprzęgania oraz po izolacji produktów za pomocą chromatografii na złożu DEAE-Sephadex przedstawiono pod schematami reakcji (Rysunek 36). Rysunek 37. Przykładowy profil HPLC reakcji tworzenia m 2 7,2 -O Gpppp S G. Profil HPLC prezentuje postęp reakcji sprzęgania GTPαS z m 7 2 -O 2 GMP-Im obserwowany po upływie 1 godz. Oraz 4 godzin od rozpoczęcia reakcji. Wraz z postępem reakcji zanikają sygnały pochodzące od substratów (m 7 2 -O 2 GMP-Im oraz dwóch diastereoizomerów GTPαS) oraz pojawiają się sygnały pochodzące od powstających dwóch diastereoizomerów analogu kapu 7,2 - m 2 O Gpppp S G. II Tetrafosforanowe analogi kapu typu ARCA posiadające pojedynczą modyfikację tiofosforanem w pozycji terminalnej β lub γ Strategia przyjęta dla syntezy analogów kapu 4P-S-ARCA posiadających modyfikację tiofosforanową w pozycji β lub γ została przedstawiona na schemacie (Rysunek 38). Koncepcja ta wymaga wytworzenia w końcowym etapie mieszanego wiązania bezwodnikowego, pomiędzy terminalną grupą tiofosforanową a terminalną grupą fosforanową pochodzącymi od dwóch 90

91 odrębnych podjednostek mononukleotydowych. Jest to trudniejsze niż utworzenie zwykłego wiązania pirofosforanowego jak np. pomiędzy NppSp i ImpN. Pomimo iż takie rozwiązanie prawdopodobnie było by wygodniejsze do przeprowadzenia, to synteza nukleotydów typu NppSp stanowiła na daną chwilę zadanie trudne, gdyż brakowało doniesień literaturowych na temat metody syntezy tego typu związków (pracując nad kolejnymi etapami projektu udało się opracować metodę umożliwiającą syntezę tego typu trudnych nukleotydów, co opisano w Rozdziale II.4). W związku z tym zdecydowano się na syntezę kapu bazującą na połączeniu ze sobą dwóch difosforanów, jako P-nukleofil stosując P2-tiodifosforan nukleozydu oraz P- imidazolid 5 -O-difosforan drugiego nukleozydu jako jednostkę P-elektrofilową. Za wyborem jednostki P-elektrofilowej przemawia fakt, że niemodyfikowany difosforan nukleozydu jest zdecydowanie łatwiejszym do aktywacji nukleotydem. W kolejnych etapach przestawiono kolejne etapy syntezy z pominięciem etapów wspólnych z syntezą analogów kapu opisanych w poprzednim rozdziale, a więc alkilowanie nukleozydu w pozycji N7 zasady, syntezę monofosforanu nukleozydu. 91

92 OR = Yoshikawa Mukaiyama - Hashimoto B = (B 1 lub B 2 ) = 3 TEAH + DMF 3 TEAH + DMF G: m 7 G: ZnCl 2, DMF m 2 7,2'-OGpp S ppg: B 1 = m 7 G B 2 = G OR 1 = OCH 3 OR 2 = OH m 2 7,2'-OGppp S pg: B 1 = G B 2 = m 7 G OR 1 = OH OR 2 = OCH 3 R P i S P Rysunek 38. Ogólna koncepcja konstrukcji mostka tetrafosforanowego modyfikowanego grupą tiofosforanową w analogach m 2 7,2 -O Gpp S ppg i m 2 7,2 -O Gppp S pg II Synteza podjednostek P-elektrofilowych Dysponując aktywowanymi pochodnymi GMP-Im i m 7,2 -O 2 GMP-Im, których syntezę przedstawiono w rozdziale II , przeprowadzono syntezy prowadzące do uzyskania kolejnych prekursorów kapu: GDP-Im i m 7,2 -O 2 GDP-Im. W tym celu wydłużono mostek oligofosforanowy wyjściowych substratów o jedną jednostkę fosforanową zgodnie z metodą opisaną w I polegającą na sprzęgnięciu imidazolowej pochodnej z lipofilową solą ortofosforanu. Sprzęganie przeprowadzono w DMF w obecności 3-krotnego nadmiaru ortofosforanu trietyloaminy zgodnie ze schematem (Rysunek 39) (aby uniknąć reakcji ubocznej powstawania GppG) 16-krotnego nadmiaru chlorku cynku otrzymując produkty z zadowalającymi wydajnościami 80-85%. 92

93 DMF 3 TEAH + GDP: R 1 = N:, R 2 = H, wyd.prep: 80% m 2 7,2'-O GDP: R 1 = N + -CH 3, R 2 = CH 3, wyd.prep: 85% Rysunek 39. Synteza GDP i m 2 7,2 -O GDP Następnie związki poddano reakcji imidazolowania Mukaiyamy-Hashimoto zgodnie ze schematem poniżej (Rysunek 40) uzyskując pożądane prekursory kapu GDP-Im i m 2 7,2 -O GDP- Im z wydajnością odpowiednio 80% i 87%. 1. 2,2'-DTDP, Ph 3 P,, TEA DMF, rt 2. NaClO 4 /aceton Rysunek 40. Synteza P-imidazolowych pochodnych GDP i m 2 7,2 -O GDP GDP-Im: R 1 = N:, R 2 = H, wyd.prep: 80% m 2 7,2'-O GDP-Im: R 1 = N + -CH 3, R 2 = CH 3, wyd.prep: 87% II Synteza podjednostek P-nukleofilowych Synteza pożądanych podjednostek P-nukleofilowych m 7,2 -O 2 GDPβS i GDPβS wymaga wbudowania modyfikacji tiofosforanowej w strukturę danego nukleotydu. Aby wprowadzić modyfikację zastosowano metodę analogiczną do wydłużania łańcucha oligofosforanowego nukleotydów i jedną jednostkę fosforanową za pomocą sprzęgania z solą lipofilową ortofosforanu, z tym, że tym razem zamiast ortofosforanu zastosowano ortotiofosforan trietyloamoniowy (Rysunek 41). Reakcja przebiega bardzo szybko i już po upływie ok. 15 min na profilach RP-HPLC reakcji obserwowano całkowity zanik sygnału pochodzącego od 93

94 substratu. Za pomocą tej prostej metody udało się (po wydzielaniu za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sephadex) uzyskać pożądane produkty m 7,2 -O 2 GDPβS i GDPβS (sole trietyloamoniowe) z wydajnościami odpowiednio 77% (czystość 75%) i 89% (czystość 80%). Związki te są nietrwałe można przechowywać je w niskich temperaturach w możliwie suchym środowisku jedynie przez kilka dni, najlepiej więc jak najszybciej wykorzystać je do dalszych etapów syntezy. DMF 3 TEAH + Rysunek 41. Synteza GDPβS i m 2 7,2 -O GDPβS. GDPβS: R 1 = N:, R 2 = H m 2 7,2'-O GDPβS: R 1 = N + -CH 3, R 2 = CH 3, II Wytworzenie wiązania pirofosforanowego pomiędzy P-elektrofilowym i P-nukleofilowym prekursorem kapu W ostatnim etapie syntezy przeprowadzono sprzęganie odpowiednich podjednostek P- nukleofilowych i P-elektrofilowych. Zgodnie z przyjętą strategią opisaną na początku rozdziału, wytworzenie wiązania pirofosforanowego zrealizowano za pomocą reakcji sprzęgania dwóch podjednostek mononukleotydowych: GDPβS + m 2 7,2-O GDP-Im oraz GDP-Im + m 2 7,2-O GDPβS (Rysunek 42). 94

95 A α β γ δ ZnCl 2, DMF R P i S P wydajność HPLC: 62% wydajność po izolacji 35% B δ γ β α ZnCl 2, DMF R P i S P wydajność HPLC: 68% wydajność po izolacji 32% Rysunek 42. A. Schemat syntezy m 2 7,2 -O Gppp S pg. B. Schemat syntezy m 2 7,2 -O Gpp S ppg Do reakcji zastosowano warunki analogiczne jak w syntezie analogów 4P-S-ARCA α i δ, tzn. 16 eq ZnCl 2 (dodawany w dwóch porcjach: 8eq do momentu rozpuszczenia substratów + następne 8 eq w celu inicjacji reakcji sprzęgania) oraz DMF jako rozpuszczalnik. Reakcję kontrolowano za pomocą RP-HPLC obserwując pojawianie się dwóch sygnałów P- diastereoizomerów produktów położonych bardzo blisko siebie, o stosunku intensywności ok. 1:1 (przykładowy profil HPLC reakcji przedstawia Rysunek 43). Mniejsza indukcja asymetryczna oraz zróżnicowanie czasów retencji na HPLC mają zapewne związek z większym oddaleniem tworzącego się nowego centrum stereogenicznego przy atomie fosforu od pozostałych aymetrycznych centów obecnych w cząsteczce (reszt rybozy). Jak wspomniano, mieszanego bezwodnikowego, wytworzenie wiązania pomiędzy grupą fosforanową a tiofosforanową, jest dużo trudniejsze niż w wypadku wiązania pirofosforanowego. Rysunek 43. Przykładowy profil HPLC reakcji tworzenia m 2 7,2 -O Gppp S pg. Profil HPLC prezentuje postęp reakcji sprzęgania GDPβS z m 2 7,2 -O GDP-Im obserwowany po upływie 3 dni od rozpoczęcia reakcji. Wraz z postępem reakcji zanikają sygnały pochodzące od substratów ( m 2 7,2 -O GDP-Im oraz GDPβS) oraz pojawiają się nachodzące na siebie sygnały pochodzące od powstających dwóch diastereoizomerów analogu kapu m 2 7,2 -O Gppp S pg. 95

96 Przejawia się to m.in. w znacznym wydłużeniu czasu reakcji do ok. 3 dni. Dłuższy czas reakcji sprzyja niestety tworzeniu produktów ubocznych zhydrolizowanych substratów i możliwych produktom ich dalszego sprzęgania, co skutkuje niższą wydajnością reakcji. Po izolacji za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sephadex udało się otrzymać czyste związki m 7,2-O 2 Gpp S ppg i m 7,2-O 2 Gppp S pg (w postaci mieszanin diastereoiomerów) z wydajnością 32% i 35%. II Rozdział na diastereoizomery Jak przedstawiono w poprzednich rozdziałach, w trakcie syntezy kapu otrzymuje się produkty w postaci mieszaniny dwóch diastereoizomerów. Pojawienie się diastereoizomerów wynika z wytworzenia nowego centrum asymetrii na atomie fosforu połączonym z atomem siarki. Diastereoizomery związków mogą (choć nie muszą) różnić się właściwościami fizykochemicznymi i biologicznymi, co choćby wykazano dla opisanych w części literaturowej badań z wykorzystaniem β-s-arca (rozdział I.4.1). Różnice fizykochemiczne dla analogów kapu 4P-S-ARCA widoczne są choćby w innych czasach retencji na RP-HPLC czy w różnych przesunięciach sygnałów na widmach 31 P NMR. W związku z tym, podjęto się próby rozdzielenia diastereoizomerów za pomocą półpreparatywnego RP-HPLC stosując bardzo łagodne gradienty buforu octanowego w acetonitrylu. Skutecznego rozdziału związków udało się jedynie dla analogów, dla których nowo powstałe centrum stereogeniczne znajduje się bliżej innych elementów symetrii, co manifestuje się m.in. większymi różnicami w czasach retencji, tj. analogu α m 7,2-O 2 Gpppp S G i δ m 7,2-O 2 Gp S pppg. Separacja diastereoizomerów pozostałych dwóch analogów o mniejszym stopniu indukcji asymetrycznej okazała jednak bardzo trudnym zadaniem i nie udało się ustalić warunków rozdziału mimo wielu prób optymalizacji. Dla analogu β udało się uzyskać jedynie po 0,5 mg czystych diastereoizomerów, co wystarczyło jednak do podstawowych badań biologicznych. Analog γ pozostawiono w postaci mieszaniny diastereoizomerycznych związków. II Właściwości NMR 96

97 Jedną z podstawowych technik charakterystyki związków chemicznych jest jądrowy rezonans magnetyczny. Obok typowych widm 1 H NMR, widmami dostarczającymi wielu cennych informacji o strukturze nukleotydów są widma 31 P NMR. Fosfor posiada tylko jeden izotop o masie atomowej 31 u i spinie ½, co czyni go idealnym kandydatem do badań NMR. Widma 31 P NMR są wysoce informatywne i zawierają sygnały w zakresie +300 ppm to -200 ppm dające pogląd o otoczeniu chemicznym jąder fosforu w cząsteczce. Na widmach 1 H NMR analogów kapu można wyróżnić kilka charakterystycznych elementów ułatwiających identyfikację tych związków. Typowe sygnały, które można odnaleźć na widmach kapu zestawione są w tabeli poniżej (Tabela 7). Tabela 7. Charakterystyczne sygnały pojawiające się na widmach 1 H NMR analogów kapu wykonanych w D 2 O Rysunek na górze tabeli prezentuje typową numerację dla protonów (stosowaną zwykle razem z określeniem nukleozydu np. H8 m7g odpowiada sygnałowi protonu w reszcie N7-metyloguanozyny) pojawiających się na widmie 1 H NMR (reszta ulega wymianie). OCH3 2' 1' 8 3' 4' 5' 5'' 5'' 5' 4' 3' 8 1' 2' N7 CH3 sygnał guanozyna N7-metyloguanozyna N7,2 -O-dimetyloguanozyna H8 singlet ok. 8 ppm ulega (przynajmniej częściowej) wymianie. Jeśli nie, singlet ok. 9 ppm N7-CH 3 nie dotyczy ok. 4 ppm singlet o intensywności 3H ulega (przynajmniej częściowej) wymianie. Jeśli nie, singlet ok. 9 ppm ok. 4 ppm singlet o intensywności 3H OCH 3 nie dotyczy nie dotyczy ok. 3,5 ppm singlet o intensywności 3H H2 dublet dubletów ok 4,5 ppm lekko przesunięty w stronę niższych wartości znacznie przesunięty na skutek ekranowania grupy 2 OCH 3 J H1 -H2 6 Hz, głównie konformer 2 - endo 3 Hz, głównie konformer 3 - endo 3 Hz, głównie konformer 3 - endo 97

98 Wszystkie analogi kapu z serii 4P-S-ARCA poddano charakteryzacji za pomocą widm 1 H NMR i 31 P NMR. Na widmach 1 H NMR zidentyfikowano wszystkie sygnały charakterystyczne dla guanozyny in N7,2 -O-dimetyloguanozyny. Modyfikacje wprowadzone do łańcucha polifosforanowego wywierają niewielki wpływ na wygląd widma protonowego, jednak charakterystyczną cechą zaobserwowaną na widmach 1 H NMR dla analogów 4P-S-ARCA była obecność wyraźnego sygnału H8 m7g. Utrudniona wymiana tego protonu wynika prawdopodobnie z obecności modyfikacji w łańcuchu tetrafosforanowym. Atom siarki, ze względu na swój większy rozmiar może blokować dostęp do protonu H8 i hamować wymianę. Ponadto, na widmach analogów kapu α i δ, gdzie atom siarki znajduje się w pobliżu nukleotydu zaobserwowano róznice w przesunięciach chemicznych poszczególnych diastereoizomerów. Dla diastereoizomerów D1 zaobserwowano, że sygnał H8, odpowiednio guanozyny i N7,2 -Odimetyloguanozyny, jest przesunięty ku wyższemu polu aniżeli dla diastereoizomeru D2. Przykładowe widmo 1 H NMR dla reprezentatywnego analogu kapu, z zaznaczeniem charakterystycznych sygnałów przedstawia Rysunek

99 Rysunek 44. Fragment widma 1 H NMR związku m 2 7,2 -O Gpppp S G. Wybrany fragment ukazuje wszystkie protony analogu kapu pokazujące się na widmie. Oznaczenia protonów jak w: Tabela 7. W ramkach powiększono fragmenty widma. Więcej informacji o strukturze nowych analogów kapu dostarcza analiza widm fosforowych. Przede wszystkim na widmach wszystkich otrzymanych związków widoczne są cztery sygnały odpowiadające czterem atomom fosforu obecnym w cząsteczce, co potwierdza tetrafosforanową budowę mostka 5,5 -oligofosforanowego. Pozycję siarki w łańcuchu tetrafosforanowym można zidentyfikować przyglądając się przesunięciom chemicznym oraz multipletowości sygnałów. W niemodyfikowanym w łańcuchu oligofosforanowym analogu m 7 GppppG, atomy Pα i Pδ są prawie równocenne magnetycznie i mają praktycznie jednakowe przesunięcia chemiczne δpα= δpδ= -12,00 ppm i rozszczepione są na dwie składowe przez sąsiadujące z nim jądro atomu fosforu β lub γ. Podobnie sygnały jąder Pβ i Pγ również nakładają się na siebie: δpβ= δpγ=-23,74 ppm i występują w postaci dubletu dubletów. W analogach posiadających atom siarki sygnały atomów P bezpośrednio związanych z S ulegają przesunięciu o ok. 50 ppm w dół pola w stosunku do sygnałów obserwowanych dla m 7 GppppG. Efekt ilustruje Rysunek

100 Rysunek 45. Wybrane widma 31 P NMR analogów kapu 4P-S-ARCA. Fragmenty widm 31 P NMR związków m 2 7,2 -O Gpppp S G D2 i m 2 7,2 -O Gpp S ppg D1D2 wraz z przypisaniem sygnałów. II.3.3 Badania powinowactwa do eif4e eif4e jest najrzadziej występującym czynnikiem inicjacji translacji występującym w komórce. W związku z tym, wszystkie cząsteczki mrna obecne w cytoplazmie zmuszone są konkurować o eif4e i w typowych warunkach tylko niektóre ulegną translacji. Prawdopodobieństwo translacji danego mrna znajdującego się w komórce jest tym większe, im większe jest jego stężenie w komórce oraz im większe jest powinowactwo jego końca 5 do białka eif4e. Przykładowo mrna o wysoce ustrukturyzowanym 5 UTR (głównie onkogeny) utrudniającym oddziaływania z eif4e w normalnych warunkach ulegają translacji tylko w niewielkim stopniu (porównaj Rysunek 13). Podobnie mrna pozbawione kapu nie ulegają kapzależnej translacji (mogą jedynie ulegać w pewnym stopniu translacji dzięki sekwencjom IRES, 100

101 ang. internal ribosome etry side, wchodzącym w oddziaływania z rybosomami). Największą skuteczność w konkurowaniu o eif4e mają więc mrna posiadające kap oraz niskoustrukturyzowany 5 UTR. Celem badań było stworzenie mrna o podwyższonym potencjalne translacyjnym. Skuteczną translację w komórkach dla nowowprowadzonego mrna można uzyskać tylko wtedy, gdy zsyntetyzowane mrna będzie miało wystarczająco wysokie powinowactwo do eif4e. Aby sprawdzić czy nowe analogi kapu charakteryzują się wystarczająco wysokim powinowactwem do eif4e (tzn. co najmniej porównywalnym do powinowactwa niemodyfikowanego kapu m 7 GpppG) i będą użyteczne w dalszych badaniach nad translacją mrna zaprojektowano serię eksperymentów pozwalających na wyznaczenie energii swobodnych Gibbsa i stałych asocjacji kompleksów poszczególnych analogów kapu z białkiem eif4e, których porównanie dostarcza cennych wiadomości na temat powinowactwa kapu do eif4e. Do wyznaczenia energii swobodnych Gibbsa i stałych asocjacji analog kapu-eif4e zastosowano metodę miareczkowania fluorescencyjnego [65]. Metoda opiera się na obserwacji wygaszania wewnętrznej fluorescencji białka (pochodzącej głównie od tryptofanów) za pomocą oddziaływań stackingowych pomiędzy dwoma tryptofanami N7-metyloguanozyną kapu. Metoda ta była wielokrotnie stosowana do wyznaczania stałych asocjacji kap-eif4e w wielu różnych badaniach związanych z eif4e [65,75],[168]. Rysunek 46. Przykładowe krzywe miareczkowania fluorescencyjnego. Krzywa przedstawia zmiany fluorescencji wraz ze zwiększającym się stężeniem kapu. Wraz z dodawaniem kapu obserwuje się wygaszanie fluorescjencji białka. Wzrost fluorescencji na końcu krzywej pochodzi od fluorescjencji wolnego niezwiązanego kapu pojawiającej się po wysyceniu białka. Badania zostały przeprowadzone przez dr Joannę Żuberek w Zakładzie Biofizyki IFD UW. Do badań przeznaczono wszystkie nowe analogi kapu z serii 4P-S-ARCA oraz zastosowano kontrolę w postaci niemodyfikowanego analogu kapu m 7 GpppG. We wcześniejszych badaniach 101

102 wykazano, że grupa metylowa w pozycji 2 lub 3 rybozy nie wpływa znacząco na zmianę stałej asocjacji analogów kapu ([96,103]), w przeciwieństwie do modyfikacji zasady azotowej czy oligofosforanu. Wyniki pomiarów oraz ich porównanie z danymi literaturowymi dla wybranych analogów kapu przedstawiono w tabeli (Tabela 8). Przykładowe krzywe miareczkowania prezentuje Rysunek 46. Typowa wartość stałej asocjacji dla niemodyfikowanego w mostku trifosforanowym analogu kapu (seria 3P) wynosi ok 10 μm -1, co w danych warunkach odpowiada zmianie energii swobodnej Gibbsa o 9.4 kcal mol 1. Jak widać modyfikacja typu ARCA nie zaburza w żaden sposób modyfikacji z białkiem eif4e, i wartości stałych asocjacji dla analogów różniących się strukturalnie jedynie obecnością lub brakiem tejże modyfikacji posiadają zbliżone wartości stałe asocjacji do eif4e. Wszystkie nowo zsyntetyzowane analogi kapu posiadają stałe asocjacji wyższe w porównaniu do niemodyfikowanych w mostku trifosforanowym kapów m 7 GpppG. 7,2 - Wydłużenie mostka trifosforanowego o jedną jednostkę fosforanową (seria 4P) np. m 2 O GppppG podnosi wartość stałej asocjacji do 99.8 ± 6.0 μm -1. Włączenie modyfikacji tiofosforanowej do mostka trifosforanowego kapu podnosi wartość stałej asocjacji, w zależności od miejsca umiejscowienia modyfikacji oraz diastereoizomeru. Efekt ten obserwowany był już w badaniach nad β-s-arca (stała asocjacji z tej serii związków o wartości ± 1.57 μm -1 dla diastereoizomeru D1) [104]. W wypadku prezentowanych tu nowych analogów kapu, kombinacja wydłużonego mostka oligofosforanowego oraz modyfikacji tiofosforanowej (seria 4P-S) powoduje dalszy wzrost stałej asocjacji do wartości 282 ± 12 μm -1 wykazując różnice w zależności od miejsca umiejscowienia modyfikacji tiofosforanowej, z najbardziej korzystnym oddziaływaniem dla modyfikacji w pozycji γ (m 7,2 -O 2 Gpp S ppg D1D2mix). Powinowactwo do eif4e wyższe od naturalnej struktury kapu świadczy o tym, że nowe analogi kapu z serii 4P-S-ARCA są efektywniej rozpoznawane przez kluczowy element maszynerii translacyjnej jakim jest eif4e. Jak rozważano wcześniej dobre powinowactwo końca 5 mrna do eif4e jest niezbędne dla wydajnej translacji danego mrna. W związku z tym nowe analogi stanowią potencjalne narzędzia do syntezy mrna o podwyższonych właściwościach translacyjnych, co weryfikowane jest w dalszych badaniach przedstawionych w kolejnych rozdziałach pracy. Wzrost stałej asocjacji dla nowych analogów kapu 4P-S jest wyższy niż w przypadku analogu 4P, oznacza to że zachowany jest pozytywny efekt wydłużonego łańcucha oligofosforanowego na powinowactwo do eif4e, ale mamy tu również doczynienia z 102

103 dodatkowym dodatnim efektem, za który odpowiedzialne są oddziaływania powstałe po wprowadzeniu modyfikacji tiofosfosforanowej. Widać przy tym wyraźnie, że oddziaływania te są najsilniejsze, gdy modyfikacja ta znajduje się w pozycji γ mostka 4P. Zauważalne są też różnice w powinowactwie do eif4e pomiędzy diastereoizomerami poszczególnych związków wykazujące preferencje dla diastereoizomeru D1 z wyjątkiem analogu β, gdzie oba diastereoizomery oddziałują w jednakowym stopniu (dla analogu γ nie udało się rozdzielić diastereoizomerów wynik jest więc wartością otrzymaną dla mieszaniny obu diastereoizomerów). Różnice te również mogą mieć konsekwencje we właściwościach translacyjnych mrna Tabela 8. Wartości stałych powinowactwa i energii swobodnych Gibbsa dla oddziaływań analog kapueif4e analog kapu K AS cap-eif4e (μm -1 ) a ΔG o (kcal M -1 ) b m 7 GpppG 9,4 ± 0,4-9,35 ± 0,05 ApppG < 0,05 > -6,20 m 7,3 -O 2 GpppG 10,2 ± 0,3-9,40 ± 0,02 m 7,2 -O 2 GppppG 99,8 ± 6,0-10,73 ± 0,04 m 7,2 -O 2 Gppp SG D1 120 ± 7-10,83 ± 0,03 m 7,2 -O 2 Gpppp SG D2 109 ± 4-10,78 ± 0,03 m 7,2 -O 2 Gppp SpG D1D2mix 158 ± 2-10,99 ± 0,01 m 7,2 -O 2 Gppp SpG D1 148 ± 2-10,95 ± 0,01 m 7,2 -O 2 Gppp SpG D2 148 ± 3-10,95 ± 0,01 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2mix 282 ± 12-11,33 ± 0,02 m 7,2 -O 2 Gp SpppG D1 258 ± 6-11,28 ± 0,01 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D2 129 ± 4-10,87 ± 0,02 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2mix 180 ± 7-11,07 ± 0,02 a średnie wartości z 3 eksperymentów, b obliczone na podstawie równania ΔG o = RTlnK AS zakończonych danym diastereoizomerem kapu. II.3.4 Wydajność translacji w systemie bezkomórkowym Kolejnym krokiem w celu oceny przydatności nowych analogów kapu w syntezie mrna o podwyższonym potencjale translacyjnym było wprowadzenie nowych analogów kapu do mrna i porównanie wydajności ekspresji białka in vitro. Badania zostały przeprowadzone przez dr Macieja Łukaszewicza w Zakładzie Biofizyki IFD UW. Do badań przeznaczono wszystkie nowe analogi kapu z serii 4P-S-ARCA, gdyż tak jak przedstawiono to w części literaturowej (rozdział I.4.1), taka modyfikacja zapewnia inkorporację kapu wyłącznie we właściwej orientacji dzięki czemu 100% kapowanych transkryptów jest 103

104 funkcjonalnych. mrna kodujące gen lucyferazy syntetyzowano w reakcji in vitro z wykorzystaniem polimerazy RNA SP6stosując nadmiar kapu w stosunku do GTP 4:1. Następnie przeprowadzano reakcję translacji in vitro. Jako modelowy układ bezkomórkowy wybrano lizat z retikulocytów króliczych, który jest powszechnie stosowanym systemem zawierającej wszystkie niezbędne elementy do wydajnej translacji mrna. Metodę zoptymalizowano, tak aby obserwowane białko pochodziło głównie z translacji kap-zależnej (w retikulocytach króliczych prawdopodobieństwo translacji niezależnej od kapu jest dużo wyższe niż w nielizowanych komórkach). Jako kontrolę zastosowano mrna zakończone niemodyfikowanymi analogami kapu m 7 GpppG oraz m 7,2-O 2 GpppG, m 7,3-O 2 GpppG oraz niefunkcjonalnym kapem ApppG (ostatni analog użyto w celu wprowadzenia poprawki na wydajność translacji niezależnej od kapu). Następnie badano luminescencję pochodzącą od lucyferazy wyprodukowanej na matrycy mrna. Wyniki eksperymentów przedstawiono w tabeli (Tabela 9). Wydajność translacji z ApppGmRNA była stosunkowo niska w stosunku do m 7 GpppG-mRNA. Świadczy to o tym, że w trakcie eksperymentu, niezależna od kapu translacja była utrzymywana na niskim poziomie. Po odjęciu wartości pochodzących od kap-niezależnej translacji i normalizacji wyników w odniesieniu do niemodyfikowanego kapu, można porównać poszczególne wartości. Dla wszystkich nowych analogów relatywna wydajność translacji mrna przekroczyła wartość 1, co oznacza, że wszystkie mrna są funkcjonalne i mogą ulegać wydajnej translacji. Wszystkie analogi 4P-S- ARCA charakteryzują się również wyższą wydajnością translacji kapowanego nimi mrna niż trifosforanowy analog typu ARCA m 7,3 -O 2 GpppG (relatywna wartości translacji: 1,79 ± 0,43) a także tetrafosforanowy analog typu ARCA m 7,2 -O 2 GppppG (relatywna wartości translacji: 2,33 ± 0,61). Najwyższą wartość translacji, ponad 4,5-krotnie wyższą niż m 7 GpppG-mRNA, odnotowano w wypadku mrna zakończonego m 7,2-O 2 Gppp S pg D1. Na podstawie wyników można stwierdzić, że udało się stworzyć w pełni funkcjonalne modyfikowane analogi kapu efektywnie rozpoznawane przez maszynerię translacyjną, co prowadzi do wydajnej translacji. Modyfikacja tiofosforanowa prowadzi do zwiększenia wydajności translacji w RRL. Analogi kapu o najwyższych stałych asocjacji do eif4e (analog β i analog γ) wykazują również najwyższe wydajności translacji po wprowadzeniu do mrna, choć zależność nie proporcjonalna oraz różnice dla poszczególnych analogów są mniej wyraźne. Warto jednak pamiętać, że lizaty komórkowe nie oddają dobrze warunków panujących w żywych komórkach. Środowisko reakcji posiada wszystkie czynniki obecne w komórkach niezbędne do 104

105 translacji, jednak zaburzone są procesy regulacji. Oznacza to, że zaburzona jest równowaga pomiędzy procesem translacji i dekapingu. Mimo to badania in vitro stanowią łatwą i szybką metodę dla sprawdzenia ogólnych właściwości translacyjnych analogów kapu przed dużo droższymi i czasochłonnymi testami komórkowymi. Tabela 9. Wydajność translacji kapowanego mrna w lizacie z retikulocytów króliczych. analog kapu Względna wyd.translacji mrna a Względna wyd. kap-zależnej translacji mrna b m 7 GpppG 1 1 ApppG 0,21 ± 0,04 0 m 7,3 -O 2 GpppG 1,62 ± 0,25 1,79 ± 0,33 m 7,2 -O 2 GppppG 2,01 ± 0,43 2,33 ± 0,61 m 7,2 -O 2 Gppp SG D1 2,73 ± 0,84 3,21 ± 1,02 m 7,2 -O 2 Gpppp SG D2 2,24 ± 0,45 2,58 ± 0,55 m 7,2 -O 2 Gppp SpG D1D2mix 2,63 ± 0,40 3,03 ± 0,59 m 7,2 -O 2 Gppp SpG D1 n.o. n.o. m 7,2 -O 2 Gppp SpG D2 3,79 ± 1,12 4,57 ± 1,33 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2mix 3,08 ± 0,69 3,72 ± 0,90 m 7,2 -O 2 Gp SpppG D1 2,15 ± 0,12 2,49 ± 0,23 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D2 2,59 ± 0,53 3,04 ± 0,74 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2mix n.o. n.o. n.o. nie określono, a średnie wartości z 2-3 powtórzeń dla dwóch niezależnie otrzymanych mrna, b wartości z uwzględnieniem korekty na kap niezależną translację (ApppG) II.3.5 Podatność na dekapping enzymem Dcp2 Kompleks enzymatyczny Dcp1/Dcp2, to jeden z głównych enzymów odpowiedzialnych za dekaping mrna w komórkach ludzkich. Dcp2 na leży do hydrolaz z rodziny Nudix posiadającej charakterystyczną domenę Nudix odpowiedzialną za hydrolizę wiązań pirofosforanowych. Dcp2 jest białkiem wiążącym RNA i wymaga RNA o odpowiedniej długości zakończonego kapem (najczęściej podawaną w literaturze minimalną długością mrna jest ok. 25 nt) do pełnej aktywności. Za aktywność hydrolityczną odpowiedzialna jest jednostka Dcp2, natomiast hdcp1 pełni rolę regulatorową. Mechanizm degradacji kapu znajdującego się na 5 -końcu mrna przedstawia Rysunek 47. Dcp2 odcina kap przecinając wiązanie pirofosforanowe w kapie pomiędzy fosforanem α i β, co w rezultacie prowadzi do powstania 5 -O-difosforanu N7- metyloguanozyny (m 7 GDP) i zakończonego 5 -O-monofosforanem mrna. Pozbawione kapu 105

106 mrna staje się łatwym celem dla ryboegzonukleaz obecnych w komórce, takich jak Xrn1 (rozdział I.3.5.2). W 2010 roku odkryto kolejny enzym z rodziny Nudix odcinający m 7 GDP od mrna nazwany Nudt16 [169]. Jego wkład w degradację cytoplazmatycznego mrna wciąż jest obszarem intensywnych badań. Poszukując analogów kapu, które po inkorporacji do mrna byłyby odporne na hydrolizę przez Dcp2 i w ten sposób przyczyniały się do stabilizacji mrna wobec degradacji egzonukleolitycznej od końca 5. Takie analogi mogą służyć dwóm komplementarnym celom: wydłużać czas życia mrna w komórkach oraz zwiększać produkcję białka z dostarczanego do komórek mrna. Aby mrna zakończone kapem charakteryzowało się wysokim potencjałem translacyjnym i odpornością na dekaping, analog kapu musi oddziaływać preferencyjnie z miejscami aktywnymi polimerazy RNA, eif4e oraz Dcp2. Rysunek 47. Mechanizm dekapingu mrna przez Dcp2 oraz zróżnicowanie Dcp2 pomiędzy organizmami. (A) Dcp2 hydrolizuje wiązanie 5,5 -trifosforanowe kapu pomiędzy fosforanami α i β, co prowadzi do m 7 GDP i powstania monofosforylowanego na 5 końcu mrna (prna) stanowiącego dogodny substrat dla egzorybonukleaz. (B) Białko Dcp2 wykazuje silną homologię pomiędzy organizmami (podkreślono trzy regiony o największej zgodności), ilustrację zaczerpnięto z [170]. Spośród przebadanych do tej pory pod względem odporności na enzym Dcp2 w komórkach ludzkich analogów kapu pierwszym zidentyfikowanym analogiem kapu, który podwyższał stabilność mrna wobec Dcp2 oraz zwiększał wydajność translacji w komórkach z linii HC11 w porównaniu do mrna zakończonego m 7,2 -O 2 GpppG był m 7,2 -O 2 Gpp S pg D2[98]. Późniejsze badania wykazały, że w bardziej restrykcyjnych warunkach jest on tylko częściowo stabilny w 106

107 obecności Dcp2 oraz zidentyfikowano trzy analogi kapu o lepszej stabilności, do których należą: m 7,2 -O 2 Gpp BH3 pg, D2, m 7 Gpp BH3 pm 7 G m 7,2 -O 2 GppNHpG[109]. Spośród tych analogów jedynie m 7 Gpp BH3 pm 7 7,2 - G wykazywał wydajność translacji w komórkach HeLa porównywalną do m 2 O Gpp S pg D2. Odporność m 7,2 -O 2 Gpp S pg D2 na dekaping przez hdcp2 można tłumaczyć słabszym oddziaływaniem atomu siarki z dwuwartościowymi jonami metali niezbędnymi do aktywności hdcp2 (Mg 2+ lub Mn 2+ ) w centrum aktywnym hdcp2 lub zaburzeniem geometrii kompleksu enzym-substrat ze względu na większą długość wiązania P-S oraz większy rozmiar atomu siarki w porównaniu do atomu tlenu (bardziej prawdopodobne). Wyższa odporność analogów zawierających grupę boranową może być tłumaczona mniejszą zdolnością do akceptowania wiązania wodorowego oraz wiązania jonów metali w porównaniu do atomu siarki. Mechanizm odporności analogów z modyfikacją mostkową NH- wynika raczej z ich stabilności chemicznej aniżeli ze zmiany oddziaływań w centrum aktywnym substratu. Jednak pomimo ich odporności na dekaping analogi te nie są dobrymi kandydatami do syntezy mrna podwyższonych właściwościach translacyjnych. Co warte podkreślenia, spośród przebadanych analogów kapu jedynie analogi zawierające modyfikacje w pozycji β mostka 5,5 -trifosforanowego oraz α,β w wypadku pozycji mostkowych. Wynik ten jest konsystentny z faktem, że Dcp2 przecina wiązanie pomiędzy fosforanem α i β, a więc wzmocnienie miejsca w pobliżu miejsca cięcia za pomocą modyfikacji zaburzających oddziaływanie z enzymem skutkuje zwiększoną odpornością związku na dekaping. Otrzymane w ninienjszej pracy doktorskiej analogi kapu modyfikowane grupą tiofosforanową (4P-S-ARCA) również poddano badaniom odporności na Dcp2. Znalezienie tetrafosforanowych analogów kapu odpornych na enzym Dcp2 wydaje się bardzo interesujące biorąc pod uwagę ich potencjalne właściwości translacyjne wykazane w testach in vitro (rozdział II.3.4). Być może takie analogi mogłyby charakteryzować się lepszymi translacyjnie właściwościami w komórkach ludzkich niż najlepszy zidentyfikowany do tej pory analog kapu m 7,2 -O 2 Gpp S pg. Badania zostały przeprowadzone przez dr Renatę Grzelę oraz dr Macieja Łukaszewicza w Zakładzie Biofizyki IFD UW z wykorzystaniem kompleksu SpDcp1/2 (Schizosaccharomyces pombe). Kompleks ten jest dobrym modelem ludzkiego kompleksu Dcp1/2, ze względu na silnie podobieństwo strukturalne i funkcjonalne pomiędzy oboma białkami (zob. Rysunek 47 B). 107

108 Badania MS wykazały także, że jednym z produktów hydrolizy m 7 GppppG-RNA przez SpDcp2 jest m 7 GDP. W związku z tym przebadano związki zawierające modyfikację w sąsiedztwie miejsca cięcia Dcp2, czyli m 7,2 -O 2 Gppp S pg-rna i m 7,2 -O 2 Gpp S ppg-rna. W badaniach porównano odporność 37-nukleotydowych mrna zakończonych analogami kapu z serii 3P, 4P, 4P-S, 3P-S. mrna zsyntetyzowano in vitro za pomocą polimerazy T7 inkorporując odpowiednie analogi kapu na 5 koniec mrna. Takie mrna inkubowano z enzymem SpDcp2 w obecności jonów Mg 2+. Następnie mrna poddawano elektroforezie na wysokorozdzielczym żelu sekwencyjnym i obserwowano pojawianie się pasm pochodzących do kapowanych substratów i zdekapowanych produktów. Wyniki eksperymentów zaprezentowano na rysunku (Rysunek 48) i podsumowano również w tabeli poniżej (Tabela 10). Rysunek 48. Reprezentacyjne żele sekwencyjne mrna zakończonego analogami kapu poddanego inkubacji z Dcp2. 108

109 Tabela 10. Poglądowe porównanie odporności mrna na dekaping Dcp2 w zależności od analogu kapu na końcu 5 mrna. analog kapu na końcu 5 mrna odporność mrna na dekaping Dcp2 m 7,2 -O 2 GpppG m 7,2 -O 2 GppppG m 7,2 -O 2 Gpp SpG D1 m 7,2 -O 2 Gpp SpG D2 m 7,2 -O 2 Gpppp SG D1D2 m 7,2 -O 2 Gppp SpG D1D2 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2 m 7,2 -O 2 Gp SpppG D1D2 hydrolizowany niezależnie od warunków hydrolizowany niezależnie od warunków w badaniach z SpDcp1/2 hydrolizowany, w badaniach z hdcp2 mało odporny [98,109] 1 w badaniach z SpDcp1/2 hydrolizowany, w badaniach z hdcp2 częściowo odporny [98,109] 1 hydrolizowany niezależnie od warunków hydrolizowany niezależnie od warunków hydrolizowany niezależnie od warunków hydrolizowany niezależnie od warunków Wyniki pokazują, że mrna zakończone typowym analogiem kapu ulega całkowitemu dekapingowi już po 5 min inkubacji z Dcp2. mrna zakończone analogiem β-s-arca D2 ulega wolniejszej hydrolizie co zgodne jest z wcześniejszymi badaniami. mrna zakończone analogami kapu z serii 4P-S-ARCA w obu przypadkach ulega szybkiemu dekapingowi w czasie 5 min. Obserwacje te prowadzą do wniosku, że mechanizm działania Dcp2 wobec tetrafosforanowych analogów kapu jest nieco inny niż w wypadku analogów trifosforanowych. Zaskakujący jest wynik, że modyfikacja tiofosforanowa w łańcuchu P4 w pobliżu miejsca cięcia Dcp2 (czyli pozycja β -m 2 7,2-O Gpp p S pg oraz pozycja γ - m 2 7,2- OGpp S ppg) nie chroni kapu przed hydrolizą Dcp2 pomimo iż w trifosforanowych 3P-S, ta modyfikacja w pozycji β (m jest wystarczająca aby zapewnić podwyższoną odporność na degradację. Być może większy stopień swobody łańcucha tetrafosforanowego pozwala enzymowi na przesunięcie się i hydrolizę sąsiedniego niezablokowanego wiązania lub też jest on w stanie przeprowadzić hydrolizę dwóch wiązań jednocześnie. Prowadzi to do pomysłu zastosowania podwójnej modyfikacji tiofosforanowej bis(tiofosforanowej), aby sprawdzić poprawność danej hipotezy. Koncepcja ta rozwijana jest w dalszej części niniejszej pracy doktorskiej. Brak odporności na obecny w komórkach Dcp2 niestety ogranicza przydatność nowych analogów kapu w syntezie mrna przeznaczonego do zastosowań in vivo. Analogi mogą wciąż 1 We wcześniejszych badaniach, w których używano ludzkiego enzymu hdcp2, analogi m 2 7,2 -O Gpp S pg D1 i D2 wykazywały zwiększoną odporność na hydrolizę. W naszych badaniach prowadzonych za pomocą SpDcp1/2 (w analogicznych warunkach) analogi te ulegały hydrolizie jednak wolniej niż m 7 GpppG, co świadczy o lekko podwyższonej odporności. Różnice mogą wynikać z użycia innego enzymu, pomimo iż SpDcp1/2 oraz hdcp2 wykazują wysoką homologię, a domena katalityczna jest silnie konserwowana. 109

110 być wykorzystywane w bezkomórkowych systemach translacyjnych do wydajnej produkcji białek. II.3.6 Podsumowanie W pierwszej części projektu przeprowadzono syntezę oraz wstępną charakteryzację biofizyczną i biochemiczną serii analogów końca 5 mrna zaprojektowanych jako reagenty do syntezy mrna o podwyższonych właściwościach translacyjnych in vitro. Otrzymane analogi kapu posiadały trzy modyfikacje w swojej strukturze: a) mostek 5,5 wydłużony do czterech jednostek fosforanowych mający na celu zwiększenie powinowactwa do białka eif4e, b) pojedynczą modyfikację tiofosforanową umiejscowioną w pozycji α, β, γ, lub δ łańcucha tetrafosforanowego w celu zmniejszenia podatności na degradację enzymatyczną, c) grupę 2 -Ometylową wprowadzoną do rybozy N7-metyloguanozyny w celu zabezpieczenia analogu kapu przed nieprawidłową inkorporacją do mrna (modyfikacja typu ARCA). Wykorzystując w syntezie metodę sprzęgania ze sobą dwóch podjednostek monoukleotydowych w obecności ZnCl 2 jako mediatora reakcji otrzymano cztery nowe analogi kapu (m 7,2 -O 2 Gpppp S G, m 7,2 -O 2 Gppp S pg, m 7,2 -O 2 Gpp S ppg, m 7,2 -O 2 Gp S pppg) z dobrymi wydajnościami 30-65%. Wszystkie związki udało się rozdzielić na czyste P-diastereoizomery (D1 i D2). Wstępne badania biologiczne z udziałem czystych diastereoizomerów nowych analogów kapu wykazały, że modyfikacje wprowadzone do kapu przełożyły się na zwiększone powinowactwo do białka eif4e oraz że mrna zakończone nowymi analogami kapu ulega 2,5-4,5 krotnie wydajniejszej translacji w systemie bezkomórkowym (RRL) aniżeli m 7 GpppGmRNA. Wyniki badań sugerowały potencjalne możliwe zastosowanie w zastosowaniu nowych analogów kapu w syntezie terapeutycznych mrna. Jednakże, badania podatności mrna na dekaping za pomocą Dcp2 wykazały jednak, że pojedyncza modyfikacja tiofosforanowa nie chroni łańcucha tetrafosforanowego przed hydrolizą, co może wpływać negatywnie na poziom translacji mrna w komórkach. Wynik ten jest zaskakujący, gdyż pokazuje, że mechanizm działania Dcp2 w wypadku tetrafosforanowych analogów kapu jest inny niż dla typowych kapów trifosforanowych. Rezultaty eksperymentów biologicznych stały się więc punktem wyjścia do zaplanowania nowych związków o oczekiwanych właściwościach, prowadząc do koncepcji 110

111 bis(tiofosforanowych) analogów kapu rozwijanej w kolejnych rozdziałach niniejszej rozprawy doktorskiej (Rozdział II.5), a także na większe zrozumienie działania enzymu Dcp2. Warto podkreślić, że wyniki opisanych w tym rozdziale badań stały się podstawą publikacji naukowej, Towards mrna with superior translational activity: synthesis and properties of ARCA tetraphosphates with single phosphorothioate modifications, Strenkowska M., Kowalska J., Lukaszewicz M., Zuberek J., Su W., Rhoads R. E., Darzynkiewicz E., Jemielity J., New Journal of Chemistry, 2010, 34, ; IF 2013 = 3,159. II.4. Opracowanie nowej metody syntezy modyfikowanych nukleotydów umożliwiającej otrzymanie prekursorów kapu zawierających ugrupowanie bis(tiofosforanowe) II.4.1 Problemy w syntezie modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym mononukleotydów Jedną z najbardziej użytecznych metod wprowadzania modyfikacji do łańcucha oligofosforanowego jest sprzęganie odpowiedniego modyfikowanego fosforanu z aktywowaną pochodną nukleotydu. Modyfikacja zostaje w ten sposób wprowadzona w terminalną pozycję oligofosforanu. Przykład reakcji został przedstawiony na schemacie A na rysunku poniżej (Rysunek 32). Metoda do tej pory pozwoliła na uzyskanie tio-, seleno i boranofosforanowych analogów nukleotydów. Poważnym ograniczeniem tej metody jest fakt, że aktywowana pochodna nukleotydu, do której przyłączana jest modyfikowana jednostka fosforanowa nie może sama zawierać modyfikacji. Znane do tej pory metody aktywacja związków zawierających w pozycji terminalnej modyfikację tio-, seleno- lub boranofosforanową czy też mostkowe imido i metylenową są nieskuteczne (przyczyna tkwi w innym rozkładzie ładunku na fosforanie i mniej elektrofilowym centrum w porównaniu do niemodyfikowanych fosforanów). Schematyczne przykłady tego typu nukleotydów, trudnych lub nieosiągalnych w syntezie, przedstawiono na schemacie B (Rysunek 49). W konsekwencji nukleotydy zawierające modyfikację w wewnętrznej pozycji łańcucha, lub dwie sąsiadujące modyfikacje nie były do tej pory dostępne za pomocą tej metody. Poza nielicznymi przykładami metod enzymatycznych (niezbyt praktycznych przy syntezie 111

112 preparatywnej) w literaturze nie istnieją opisane skuteczne metody syntezy tego rodzaju związków. Oznacza to, że aby otrzymać prekursory pożądanych nowych bis(tiofosforanowych) analogów kapu p S p S G oraz p S p S pg, należało opracować nową metodę syntezy pozwalającą na wprowadzanie modyfikacji w inne pozycje niż terminalna oraz modyfikacje sąsiadujące ze sobą. W związku z tym za jeden z celów niniejszej pracy postawiono sobie opracowanie niniejszej metody, która byłaby wygodnym i uniwersalnym narzędziem do otrzymywania różnego rodzaju niedostępnych do tej pory nukleotydów w łańcuchu fosforanowym. A R2 = zasada azotowa: n MeCl2, DMF n G = X = S, Se, BH3 Me: kation metalu dwuwartościowego terminalny fosforan zawierający modyfikację R1: H, OH A = B m 7 G = n n C = modyfikacja wewnątrz łańcucha oligofosforanowego U = X = S, Se, BH 3 n Y = CH2, NH,... T = możliwe inne Rysunek 49. A. Wprowadzanie modyfikacji w pozycję terminalną oligofosforanu. B. Schematycznie przedstawione przykładowe modyfikowane nukleotydy stanowiące wyzwanie syntetyczne podjęte w niniejszej pracy doktorskiej. II.4.2 Opracowanie nowej metody wydłużania łańcucha oligofosforanowego 112

113 II Nowy reagent P-imidazolowa pochodna cyjanoetylofosforanu Jednym z najprostszych wydawałoby się rozwiązań problemów z aktywacją modyfikowanych terminalnie nukleotydów byłaby zamiana charakteru reagentów w reakcji sprzęgania tzn. unikanie aktywacji modyfikowanego fosforanu (pozostawienie go w postaci P-nukleofilowej) oraz aktywacja drugiego reagenta, w tym wypadku zamiana modyfikowanego wolnego fosforanu PXO - 3, gdzie X = modyfikacja, w jednostkę P-elektrofilową (koncepcję przedstawia schematycznie Rysunek 50 A i B). Niestety, takie podejście nie prowadzi do uzyskania oczekiwanych rezultatów. Podstawowym problemem jest tu aktywacja fosforanu (V), która nie jest możliwa za pomocą typowych metod (metoda Mukaiyamy czy Hashimoto). Nawet jednak, gdyby udało się opracować skutecną metodę aktywacji fosforanu (V), efekt reakcji z aktywowanym fosforanem prowadziłby prawdopodobnie do mieszaniny nukleotydów o różnej długości łańcucha oligofosforanowego, gdyż trudno byłoby kontrolować reakcję, w której powstający produkt może ulegać dalszemu sprzęganiu. 113

114 A R 2 = zasada azotowa: n aktywacja n G = terminalny fosforan zaw ierający modyfikację X = S, Se, BH 3 A = grupa aktywująca: np. Im A = B R 1 : H, OH m 7 G = C = U =... T = możliwe inne Rysunek 50. Problemy przy elongacji łańcucha oligofosforanowego modyfikowanych nukleotydów A. Problemy z aktywacją terminalnie modyfikowanych nukleotydów. B. Schemat teoretycznej reakcji wydłużenia łańcucha oligofosforanowego, w którym nie ma potrzeby aktywacji nukleotydu. Wadą tego podejścia jest brak metody umożliwiającej uzyskanie aktywowanego ortofosforanu oraz prawdopodobne problemy z generowaniem szeregu produktów ubocznych na skutek reakcji następczych. Zaprojektowano więc reagent, który w reakcji prowadziłby do powstawania produktu nie mogącego ulegać powtórnie reakcji sprzęgania. Taki rezultat zapewniałoby zabezpieczenie fosforanu np. pojedynczą łatwo usuwalną grupą alkilową. Ponadto aktywacja monoestrów fosforanu jest możliwa choćby w warunkach reakcji Mukaiamy-Hashimoto. Jako grupę zabezpieczającą wybrano więc grupę cyjanoetylową (Rysunek 51) Zaletami tej grupy są dostępność handlowa 2-cyjanoetylofosforanu (w postaci soli baru) oraz łatwa deprotekcja fosforanu, która w warunkach zasadowych przebiega na skutek β-eliminacji. 114

115 aktywacja (Mukaiyama) Rysunek 51. Koncepcja wydłużenia łańcucha oligofosforanowego modyfikowanych nukleotydów za pomocą nowego reagenta P-imidazolowej pochodnej 2-cyjanoetylofosforanu. 2-cyjanoetylowa pochodna fosforanu (w przeciwieństwie do niemodyfikowanego fosforanu) ulega konwersji w P-imidazolową pochodną za pomocą metody Mukaiyamy i Hashimoto. Grupa cyjanoetylowa uniemożliwia również następcze reakcje prowadzące do produktów ubocznych o dłuższym łańcuchu oligofosforanowym. Eliminacja grupy cyjanoetylowej przebiega w łagodnych warunkach. Syntezę nowego odczynnika, P-imidazolowej pochodnej 2-cyjanoetylofosforanu (CE-p-Im), przeprowadzono wychodząc z soli barowej cyjanoetylofosforanu, którą zamieniono w sól trietyloamoniową na kationicie (Dowex Wx8) w postaci H + wymywając związek (w postaci kwasu) wodą do kolby zawierającą stechiometryczną ilość TEA w metanolu. Następnie związek odparowano, wysuszono w eksykatorze nad tlenkiem fosforu (V) oraz poddano reakcji imidazolowania zgodnie ze schematem (Rysunek 52). Ze względu na problemy z wytrącaniem produktu (wg procedury Mukaiyamy-Hashimoto imidazolowe pochodne wytrącane są zimnym roztworem NaClO 4 w acetonie), procedurę Mukaiyamy zmodyfikowano stosując do wytrącania roztwór LiClO 4 w acetonitrylu. Dzięki tej modyfikacji, po wytrąceniu, odwirowaniu, przemyciu i wysuszeniu nad P 4 O 10 osadu otrzymano czysty P-imidazolid 2-cyjanoetylofosforanu (struktura potwierdzona za pomocą widm 1 HNMR, 31 PNMR oraz MS) z wydajnością 89%. 115

116 1., TEA DMF, rt 2,2'-DTDP, Ph 3 P, 2. LiClO 4 /ACN 89% Rysunek 52. Synteza P-imidazolidu 2-cyjanoetylofosforanu II Wydłużanie mostka fosforanowego w modyfikowanych terminalnie nukleotydach za pomocą CE-p-Im Przydatność nowego reagenta do wydłużania łańcucha oligofosforanowego nukleotydów przetestowano w reakcji z 5 -O-monofosforanem guanozyny. Jako warunki wyjściowe reakcji zastosowano standardowe warunki reakcji sprzęgania stosowane w reakcjach P-imidazolidowych pochodnych nukleotydów tzn. DMF jako rozpuszczalnik i 8 eq bezwodnego chlorku magnezu ułatwiającego rozpuszczanie nukleotydów oraz mediującego wytworzenie wiązań pirofosforanowych (Rysunek 53). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej i badano co ok. 15 min za pomocą RP-HPLC. W trakcie reakcji można było obserwować zanikanie sygnału substratu o czasie retencji ok 4 min (GMP) oraz powstawanie sygnału o czasie retencji ok. 4,5 min. Analiza MS wykazała, że powstający produkt ma masę odpowiadającą 2-cyjanoetylo-GDP (CE-GDP). Całkowita konwersja substratu trwała ok. 1h. 116

117 Rysunek 53. Testowanie działania nowego reagenta CE-p-Im w syntezie GDP W pierwszym etapie reakcji z CE-p-Im poddano GMP otrzymując w wyniku sprzęgania CE-GDP (całkowita konwersja substratu), które następnie poddano in situ reakcji odbezpieczania w warunkach zasadowych. Usunięcie grupy cyjanoetylowej trwało ok. 1h. W prawym dolnym rogu widoczne są profile HPLC pokazujące przebieg reakcji odbezpieczania. Następnie podjęto próby optymalizacji warunków usuwania grupy cyjanoetylowej. Opierając się na przesłankach literaturowych przeprowadzono odbezpieczanie w temperaturze 50ºC w 0,1 M roztworze NaOH. Po ok 1 h ogrzewania obserwowano praktycznie całkowite odbezpieczenie CE-GDP i wyłącznie sygnał pochodzący od GDP (czas retencji 3,5 min) (Rysunek 53). Kolejnym krokiem było sprawdzenie, czy podobna procedura będzie równie skuteczna dla nukleotydów posiadających terminalną modyfikację fosforanową, do tej pory trudnych lub niemożliwych do uzyskania innymi metodami. Badania rozpoczęto od próby przyłączenia grupy 2-cyjanoetylofosforanowej do 5 -O-monotiofosforanu guanozyny (GMPS). GMPS otrzymano z guanozyny za pomocą reakcji tiofosforylacji. Otrzymany związek poddano reakcji z CE-p-Im w tych samych warunkach jak dla GDP. Tym razem reakcja przebiegała znacznie wolniej i po upływie 1 godz. widoczne były jedynie ślady produktów. Niemniej, po upływie 3 dni reakcja osiągnęła wydajność ok. 90%. Na profilu RP-HPLC (Rysunek 54) widać powstawanie dwóch produktów, które pochodzą od dwóch nowopowstających diastereoizomerów GDPαS, co 117

118 potwierdzono za pomocą analizy MS(ESI-), która wykazała masę 511,1 odpowiadającą przewidywanym produktom. Rysunek 54. Test przydatności nowego reaganta P-imidazolowej pochodnej cyjanoetylofosforanu do wydłużania łańcucha oligofosforanowego posiadającego modyfikację w pozycji terminalnej. Schemat prezentuję syntezę CE-GDPαS oraz profil RP-HPLC reakcji po 3 godz. W kolejnym kroku podjęto próbę eliminacji grupy 2-cyjanoetylowej stosując warunki, które były odpowiednie dla odbezpieczania CE-GDP. Niestety, w wypadku CE-GDPαS zastosowanie podwyższonej temperatury i 0,1 M roztworu NaOH prowadziło do pojawienia się głównie produktu ubocznego GMPS na skutek hydrolizy CE-GDPαS. Przeprowadzono więc próbne eksperymenty, które umożliwiłyby eliminację grupy CE w warunkach bezwodnych, najlepiej w DMF, w którym prowadzono całą reakcję. Aby uniknąć podstawienia nukleofilowego wybrano nienukleofilową zasadę rozpuszczalną w DMF DBU (1,8-Diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en). Reakcję rozcieńczono więc dwukrotnie DMF, dodano DBU (do stężenia ok. 7 mm) oraz ogrzewano w temp. 50 o C. Ze względu na trudności w obserwacji postępów reakcji za pomocą RP-HPLC (liczne pary jonowe z kationami protonowanego DBU komplikują interpretację otrzymanego profilu HPLC) zdecydowano się na obserwację reakcji za pomocą HPLC sprzężonego ze spektrometrem mas (LC-MS). Tym razem już po ok 1 godz. obserwowano pojawianie się sygnałów od GDPαS (dwa diastereoizomery) i brak produktów ubocznych. Mechanizm β-eliminacji grupy 2-cyjanoetylowej za pomocą DBU przedstawia Rysunek 55. Reakcję odbezpieczania prowadzono przez 5 godz., aż do momentu pojawienia się znacznych produktów reakcji ubocznych i niewielki przyrost właściwego produktu. Reakcję zakończono 118

119 poprzez rozcieńczenie wodą. DBU usunięto poprzez kilkukrotną ekstrakcję eterem a mieszaninę reakcyjną zobojętniono do ph=7 i rozdzielano na złożu Sephadex, dzięki czemu wyizolowano GDPαS w postaci soli TEA z wydajnością 37%. Warto dodać, że testowano również wpływ innych soli na reakcję sprzęganie z CE-p-Im, pomimo iż jony cynku oraz manganu również działały jako katalizatory tworzenia wiązania pirofosforanowego, to ze względu na większą kwasowość Lewisa, jony te dezaktywowały DBU na kolejnym etapie procedury blokując usunięcie grupy cyjanoetylowej. Z tego względu w dalszych doświadczeniach skoncentrowano się na wykorzystaniu MgCl 2 jako katalizatora pierwszego etapu syntezy... - CE-GDPαS DMF DBU - GDPαS Rysunek 55. Mechanizm β-eliminacji grupy cyjanoetylowej z CE-GDPαS pod wpływej nienukleofilowej zasady DBU w aprotycznym rozpuszczalniku Sprawdzono również uniwersalność procedury względem: innych zasad azotowych obecnych w nukleotydach, gdyż potrafią one znacznie wpływać na reaktywność nukleotydu długości łańcucha oligofosforanowego innych modyfikacji obecnych w łańcuchu oligofosforanowym 119

120 Tabela 11. Syntezy z użyciem CE-p-Im dla nukleotydów o różnych zasadach azotowych. Etap 1 dotyczy reakcji sprzęgania podanych substratów w obecności 8 eq MgCl 2 w DMF, podano czas (d doby, h godziny) i wydajność HPLC etapu. Etap 2 dotyczy następczej reakcji usunięcia CE w warunkach zasadowych (DBU, DMF, 50 o C). Podano również wydajność preparatywną po chromatografii. Produkt Substrat 1 Substrat 2 Etap 1 (czas/wyd) Etap 2 (czas) Wyd.prep. GDP GMP CE-p-Im 0,5 h / 99% 1 h 2 nie izolowany GDPαS GMPS CE-p-Im 3 d / 83% 5 h 37% ADPαS AMPS CE-p-Im 3 d / 95% 5 h 61% UDPαS UMPS CE-p-Im 3 d / 80% 5 h 65% m 7 GDPαS m 7 GMPS CE-p-Im 3 d / 90% 6 h 39% 2,3 -cp S-UDPαS 2,3 -cp S-UMPS CE-p-Im 5 d/ 82% 5 h 59% ATPβS 1 ADPβS CE-p-Im 2 h/ 92 % 12 h 62% Ap 4 ATP + CE-p-Im CE-p-Im 3h / 97% 3 h 82% 1 Synteza przeprowadzona przez mgr Przemysława Wanata 2 waruki reakcji: 0,1 M NaOH(aq), 50 o C Procedura analogiczna jak w syntezie GDPaS została powtórzona więc dla innych nukleotydów różniących się zasadą azotową, a także długością łańcucha oligofosforanowego AMPS, UMPS m 7 GMPS, 2,3 -cp S -UMPS oraz ADPβS. We wszystkich przypadkach zastosowane warunki prowadziły z dobrą wydajnością do produktu sprzęgania oraz powstania pożądanego produktu w etapie końcowym. Wydajności i czasy trwania reakcji sprzęgania oraz odbezpieczania zestawiono w w tabeli powyżej (). Warto zwrócić uwagę, że procedura działa również w wypadku bardzo polarnych i wrażliwych na dekompozycję związków (reakcja z m 7 GMPS posiadającym dodatkowy ładunek dodatni na zasadzie, jak dyskutowano we wstępie literaturowych, N7-metyloguanozyna jest wrażliwa na warunki ph, zbyt zasadowe środowisko może prowadzić do otwarcia pierścienia imidazolowego zasady). Oczekiwany rezultat osiągnięto również dla dłuższego łańcucha oligofosforanowego, biorąc do reakcji ADPβS oraz ATP (). Również nukleotydy modyfikowane na rybozie ulegają reakcji sprzęgania i następczego odbezpieczenia, czego przykładem może być przedstawiony w tabeli () nietypowy nukleotyd 2,3 -cp S -UDPaS (otrzymywany jako produkt uboczy lub główny produkt reakcji tiofosforylacji, w której urydyna wykazuje bardzo dużą reaktywność). 120

121 Z pomocą innych osób zaangażowanych w projekt, udało się przetestować działanie metody także dla innych modyfikacji łańcucha fosforanowego, takich jak modyfikacja boranofosforanowa, selenofosforanowa, imidofosforanowa, metylenobisfosfonianowa. Wybrane przykłady i wydajności przedstawiono w tabeli poniżej (Tabela 12). Tabela 12. Syntezy z użyciem CE-p-Im dla nukleotydów różniących się rodzajem modyfikacji wewnątrz łańcucha oligofosforanowego Etap 1 dotyczy reakcji sprzęgania podanych substratów w obecności 8 eq MgCl 2 w DMF, podano czas (d doby, h godziny) i wydajność HPLC etapu. Etap 2 dotyczy następczej reakcji usunięcia CE w warunkach zasadowych (DBU, DMF, 50 o C). Podano również wydajność preparatywną po chromatografii. Produkt Substrat 1 Substrat 2 Etap 1 (czas/wyd) Etap 2 (czas) Wyd.prep. ADPαBH 3 1 AMPBH 3 * CE-p-Im 24 h / 84% 3 h 65% GTPβSe 2 GDPβSe * CE-p-Im 24 h / 52% 2 h 15% ppnhpg 3 pnhpg CE-p-Im 1,5 h / 93% 4 h 72% ppch 2pG 3 pch 2pG CE-p-Im 1,5 h / 95% 4h 78% ppch 2ppm 7 G 3 pch 2ppm7G CE-p-Im 3 d / 90% 6 h 39% 1 Synteza przeprowadzona przez dr Joannę Kowalską 2 Synteza przeprowadzona przez mgr Przemysława Wanata 3 Synteza przeprowadzona przez mgr Marcina Ziemniaka * Substrat generowany in situ II Synteza CE-p S -Im oraz jego zastosowanie do wydłużanie mostka fosforanowego w modyfikowanych terminalnie nukleotydach o jednostkę tiofosforanową Kiedy metoda była już dość dobrze zoptymalizowana, postanowiono sprawdzić, czy oprócz wydłużania mostka oligofosforanowego o jedną jednostkę fosforanową, możliwa byłaby odpowiednia modyfikacja metody, tak aby wydłużać łańcuch oligofosforanowy o jednostkę tiofosforanową. Do tego celu, podjęto próbę syntezy tiofosforanowego analogu CE-p s -Im. S-2- cyjanoetylotiofosforan nie jest dostępny handlowo, w związku z tym pracę rozpoczęto od syntezy tego związku. Syntezę oparto o metodę opisaną przez Burgers a i współpr. [147], w której akrylonitryl poddaje się addycji Michaela z tiofosforanem sodu rozpuszczonym w wodzie w temperaturze 0 o C (Rysunek 56). Po 10 min wytrąca się etanolem nieprzereagowany tiofosforan. Po oddzieleniu osadu do przesączu dodaje się nadmiar etanolu i pozostawia na ok. 1 godzinę. W 121

122 tym czasie krystalizuje S-2-cyjanoetylotiofosforan sodu. Wydajność całego procesu wynosi ok 60%. Czystość związku wynoszącą 92 % potwierdzono za pomocą widm 1 H NMR i 31 P NMR. Następnie postępowano analogicznie jak w przypadku syntezy CE-p-Im, zamieniając wysuszony nad P 4 O 10 S-2-cyjanoetylotiofosforan na sól trietyloamoniowe oraz poddając ją reakcji imidazolowania metodą Mukaiyamy i Hashimoto (Rysunek 56). Tak otrzymany reagent można przechowywać przez ok. pół roku w temperaturze 4 o C H2O, 0 o C 2. EtOH 2 Dowex, forma TEAH + 2 TEAH ,2'-DTDP, Ph 3 P,, TEA DMF, rt 2. LiClO 4 /ACN 60% Rysunek 56. Schemat syntezy P-imidazolowej pochodnej S-2-cyjanoetylotiofosforanu. Dysponując nowym reagentem przetestowano, czy można go zastosować analogicznie jak CEp-Im we wcześniej opracowanej metodzie wydłużania łańcucha fosforanowego. Pozwoliłoby to na uzyskanie związków posiadających dwie sąsiadujące modyfikację grupą tiofosforanową, a więc prekursory pożądane do dalszej syntezy analogów kapu zaplanowanych w projekcie. Próby rozpoczęto od reakcji z GMPS. Ponownie zastosowano warunki typowe dla reakcji sprzęgania dodatek 8 eq MgCl 2 oraz obecność DMF jako rozpuszczalnika. Okazało się, że w reakcji powstają pożądane produkty dwa diastereoizomery CE-GDPαSβS jednak czas trwania reakcji jest wyjątkowo długi. Aby uzyskać zadowalający stopień konwersji substratu prowadzono reakcję przez 5 dni. Mimo niskiej szybkości wydajność reakcji była wysoka, choć wraz z przedłużającym się czasem reakcji obserwowano zwiększanie się udziału produktów ubocznych pochodzących z procesu desulfurylacji substratu (GMPS nawet w temperaturze pokojowej ulega powolnemu rozkładowi do GMP, proces przyśpiesza w kontakcie ze śladami wilgoci oraz kwaśnym środowiskiem, mogącym pochodzić np. z hydrolizy ZnCl 2, a także może ulegać utlenianiu i dimeryzacji z utworzeniem wiązań disiarczkowych). 122

123 Po uzyskaniu zadowalającego wyniku pierwszego etapu procedury, CE-GDPαSβS bez izolacji poddano reakcji odbezpieczania dodając do reakcji DBU i podgrzewając do temperatury 50 o C. Niestety nawet po kilku godzinach ogrzewania grupa cyjanoetylowa nie ulegała odbezpieczeniu. Za prawdopodobną przyczynę niepowodzeń podejrzewano readdycję akrylonitrylu uwalnianego w reakcji eliminacji grupy 2-cyjanoetylowej z powrotem do nukleotydu. Proces ten jest dużo łatwiejszy w wypadku nukleofila siarkowego w porównaniu do atomu tlenu, jak było to w poprzednich wypadkach. Aby potwierdzić tą hipotezę do reakcji oprócz DBU dodano ditiotreitol (DTT). DTT ze względu na obecność dwóch grup tiolowych jest w stanie wyłapywać akrylonitryl z reakcji, przesuwając jednocześnie równowagę reakcji odbezpieczania CE- GDPαSβS w stronę powstawania GDPαSβS (Rysunek 57). Faktycznie, po dodaniu DTT do mieszaniny reakcyjnej po ok 1 h można było obserwować powstawanie pożądanych produktów. Niestety, mimo nadmiaru DTT i wydłużenia czasu trwania reakcji do 5 godzin, nie udało się osiągnąć wysokiej wydajności, na co prawdopodobnie wpływ miała wrażliwość powstającego produktu na podwyższoną temperaturę, przez co rozkładał się on częściowo do GMPS. Mimo tych trudności, udało się uzyskać GDPαSβS z wydajnością 36%. Za pomocą analogicznej procedury otrzymano również ADPαSβS z wydajnością 20 %. 123

124 Rysunek 57. Schemat syntezy wykorzystującej nowy reagent CE-p S -Im ukazujący rolę DTT w reakcji eliminacji grupy cyjanoetylowej. DTT jest odpowiedzialny za wiązanie akrylonitrylu powstającego w reakcji przez co zapobiega readdycji akrylonitrylu do nukleotydu i przesuwa reakcję w stronę produktów. Produktem syntezy jest GDPαSβS (w postaci dwóch diastereoizomerów), którego powstanie potwierdzono za pomocą m.in. spektroskopii mas (przykładowe widmo ESI MS- w prawym dolnym rogu rysunku). II Zastosowanie mikrofal w syntezie modyfikowanych nukleotydów Długie, mało praktyczne czasy reakcji sprzęgania stały się motywacją do dalszej optymalizacji metody w celu przyśpieszenia reakcji. Jednym z coraz powszechniejszych narzędzi w syntezie organicznej używanych w celu przyśpieszania reakcji chemicznych jest promieniowanie mikrofalowe. Promieniowanie mikrofalowe zaliczane jest do niekonwencjonalnych źródeł dostarczania energii do reakcji. W ciągu ostatnich dwudziestu lat liczba zastosowań mikrofal w syntezie wzrosła ekspotencjalnie, prowadząc do znacznego postępu w przemyśle farmaceutycznym, green chemistry (umożliwiając prowadzenie niektórych reakcji w warunkach bezrozpuszczalnikowych lub w wodzie), czy ułatwienie przeprowadzenia wielu syntez o wysokich energiach aktywacji. Promieniowanie mikrofalowe to promieniowanie o długości fali 0,1 cm cm i odpowiadającej temu zakresowi częstotliwości 300 GHz 300 MHz. Typowe domowe kuchenki mikrofalowe, a także profesjonalne reaktory mikrofalowe operują zwykle na długości fali 2,45 GHz (12 cm). Konwencjonalne sposoby ogrzewania opierają się na dostarczeniu źródła ciepła z 124

125 zewnątrz, powodując najpierw ogrzanie ścianek naczynia, a następnie ciepło transferowane jest powoli do wnętrza rozpuszczalnika i mieszaniny reakcyjnej. To powoduje trudne do kontrolowania gradienty temperaturowe w mieszaninie reakcyjnej i powolną (i nierównomierną) aktywację reagentów. Ogrzewanie za pomocą mikrofal pozwala na dostarczenie energii bezpośrednio do wszystkich cząsteczek znajdujących się w mieszaninie prowadząc do gwałtownego i równomiernego wzrostu temperatury w całej objętości reakcyjnej, pozwalającego nawet na osiągnięcie efektów przegrzewania rozpuszczalnika. Jednak nie każdy rozpuszczalnik lub reagenty są jednakowo podatne na działanie mikrofal. Za efekt ogrzewania mikrofalowego odpowiedzialne są głównie dwa mechanizmy: mechanizm rotacji dipolowej oraz mechanizm jonowy. Kluczowym czynnikiem niezbędnym do wystąpienia wzrostu temperatury pod wpływem mikrofal jest obecność momentu dipolowego w co najmniej jednym ze składników mieszaniny. Dipole, wrażliwe na składową elektryczną promieniowania elektromagnetycznego mikrofalowego starają się ustawić wzdłuż linii pola. Proces zmian pola jest jednak zbyt szybki (częstości zmian 4,9 x 10 9 Hz) i częste zmiany kierunku rotacji dipoli prowadzą do wzajemnych zderzeń z cząsteczkami w mieszaninie i wyzwolenia ciepła (mechanizm rotacji dipoli). To powoduje, że najlepiej ogrzewane są mieszaniny, w których rozpuszczalnik charakteryzuje się wysoką stałą dielektryczną, zawierające polarne substraty lub produkty lub choćby polarny stan przejściowy reakcji. Gdy w mieszaninie obecne są jony metali, także one zmieniają kierunek ruchu wraz ze zmianami pola elektrycznego ponownie wywołując liczne zderzenia międzycząsteczkowe i produkcję ciepła. Homogeniczność rozkładu ciepła, możliwość błyskawicznego uzyskania wysokich temperatur (wyższych nawet od temperatury wrzenia rozpuszczalnika) jest odpowiedzialna za większość efektów związanych z przyśpieszaniem reakcji chemicznych. Istnienie nietermalnych efektów działania mikrofal na reakcje chemiczne jest przedmiotem sporów badaczy i wciąż trudnym do udowodnienia zjawiskiem. W literaturze brak doniesień na temat zastosowania promieniowania mikrofalowego w reakcjach tworzenia wiązania pirofosforanowego Postanowiono jednak przeprowadzić eksperymenty z zastosowaniem promieniowania mikrofalowego w reakcjach z wydłużania wiązania oligosforanowego z udziałem CE-p-Im i CE-p S -Im przy użyciu dostępnej aparatury. W Laboratorium Chemii Bioorganicznej dysponujemy jednomodowym reaktorem mikrofalowym CEM Discover o częstości promieniowania 2450 MHz. Reakcje mogą być prowadzone w 125

126 odpowiednich grubościennych naczyniach szklanych o objętości 10 ml zabezpieczonych antyciśnieniowym zamknięciem ( snap-on caps). W pierwszym eksperymencie we fiolce umieszczono GMPS, Im-pS-EtCN, MgCl 2, DMF oraz element mieszający (reaktor wyposażony jest w mieszadło magnetyczne). DMF jako polarny rozpuszczalnik stanowi idealne medium dla reakcji mikrofalowych (stała dielektryczna ε = 37), ponadto obecność polarnych reagentów oraz jonów metali w mieszaninie sprzyja wystąpieniu gwałtownych efektów termicznych pod wpływem mikrofal. Pierwsze próby syntezy przeprowadzono przy wysokiej mocy mikrofal (100 W) i w temperaturze 50 o C. Już po 5 min ogrzewania obserwowano znaczny przyrost produktu. Zachęcające wyniki były motywacją do lepszej optymalizacji warunków. Najlepsze wyniki otrzymano stosując mod dynamiczny, maksymalne promieniowanie mikrofalowe o mocy 10 W oraz maksymalną temperaturę 45 ± 1 o C. W tych warunkach osiągnięto imponujące skrócenie czasu reakcji sprzęgania z 5 dni do 15 min (Rysunek 58). Technikę z sukcesem zaimplementowano do pozostałych reakcji przeprowadzanych wcześniej w konwencjonalny sposób. Część wyników przedstawiono na rysunku (Rysunek 59) oraz w tabeli (Tabela 13). 126

127 Rysunek 58. Efekt zastosowania mikrofal w syntezie CE-GDPαSβS Porównanie profilów HPLC tej samej reakcji syntezy CE-GDPαSβS (schemat na górze rysunku) przeprowadzonej bez i z obecnością promieniowania mikrofalowego (μw). Reakcja bez mikrofal trwa ok. 5 dni, po 1 h można obserwować pojawianie się pierwszych produktów. W obecności mikrofal ten sam stopień konwersji uzyskiwany jest już po 15 min reakcji. Przetestowano także możliwość wykorzystania promieniowania mikrofalowego do usunięcia grupy 2-cyjanoetylowej. Stosując te same warunki, ponownie uzyskano znaczne skrócenie czasów reakcji oraz pozwoliło na wydajniejsze uzyskanie związków oraz zmniejszyło ilość obserwowanych produktów ubocznych. Czasy reakcji odbezpieczania dla wybranych związków zestawiono w tabeli (Tabela 13). Niektóre reakcje przeprowadzono jedynie ze wspomaganiem mikrofalowym. Otrzymano w ten sposób kolejny prekursor bis(tiofosforanowych) analogów kapu p S p S pg oraz związek zawierający mieszane modyfikacje (metylenobisfosfonianową oraz tiofosforanową) p S pch 2 pg. 127

128 Tabela 13. Reprezentatywne przykłady syntez przeprowadzonych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego (+ μw) wraz z porównaniem tych samych reakcji przeprowadzanych w typowych warunkach (- μw) - μw: Etap 1 dotyczy reakcji sprzęgania podanych substratów w obecności 8 eq MgCl 2 w DMF, podano czas (d doby, h godziny) i wydajność HPLC etapu. Etap 2 dotyczy następczej reakcji usunięcia CE w warunkach zasadowych (DBU, DMF, 50 o C). Podano również wydajność preparatywną po chromatografii. + μw: Etap 1 dotyczy reakcji sprzęgania podanych substratów w obecności 8 eq MgCl 2 w DMF, μw (, podano czas (min) i wydajność HPLC etapu. Etap 2 dotyczy następczej reakcji usunięcia CE w warunkach zasadowych (DBU, DMF, 45 ± 1 o C). Podano również wydajność preparatywną po chromatografii. Produkt Substrat 1 Substrat 2 μw * Etap 1 (czas/wyd) Etap 2 (czas) Wyd.prep. m 7 GDPαS m 7 GMPS CE-p-Im - 3 d / 90% 6 h 39% + 20 min / 92% 20 min 60% ADPαBH 1 3 AMPBH 3 ** CE-p-Im - 24 h / 84% 3 h 65% + 30 min / 76% 20 min 63% GDPαSβS GMPS CE-p S-Im - 5 d / 90% 5 h 36% + 15 min / 85% 30 min 30% ATPβSe 2 ADPβSe ** CE-p-Im + 1,5 h / 95% 4h 78% ppch 2pG 3 pch 2pG CE-p-Im - 1,5 h / 95% 4h 78% + 30 min / 95 % 30 min 80% p SpCH 2pG pch 2pG CE-p S-Im + 30 min / 98% 30 min 70% p Sp SpG GDPβS CE-p S-Im + 30 min / 90% 15 min 24% 1 Synteza przeprowadzona przez dr Joannę Kowalską 2 Synteza przeprowadzona przez mgr Przemysława Wanata 3 Synteza przeprowadzona przez mgr Marcina Ziemniaka * 10W, 45 ± 1 o C, 2450 MHz ** Substrat generowany in situ 128

129 Rysunek 59. Postęp reakcji w czasie przedstawiony przez porównanie odpowiednich profili RP-HPLC dla pierwszego etapu syntez wspomaganych mikrofalami dla związków z tabeli (Tabela 13). 129

130 II.4.3 Podsumowanie Opracowana przeze mnie metoda syntezy przedstawiona w powyższym rozdziale pozwala na uzyskanie w sposób prosty, szybki i wydajny nowych nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym, których otrzymanie za pomocą innych dostępnych do tej pory metod było niemożliwe, mało wydajne lub realizowane jedynie na drodze enzymatycznej. Do takich nukleotydów należą m.in. difosforany nukleozydów modyfikowane w pozycji α (sąsiadującej z resztą nukleozydową,) trifosforany nukleozydów modyfikowane w pozycji β, czy związki zawierające dwie sąsiadujące ze sobą modyfikacje. Metoda opiera się na wykorzystaniu innowacyjnych reagentów: imidazolowej pochodnej cyjanoetylofosforanu, a także jego siarkowego analogu, imidazolowej pochodnej cyjanoetylotiofosforanu. Związki te pozwoliły na wydłużenie łańcucha fosforanowego o jedną resztę fosforanową lub tiofosforanową, również tam, gdzie wcześniej było to niemożliwe (w sposób niezależny od umiejscowienia modyfikacji). W powyższej metodzie kluczową rolę odgrywa zastosowanie promieniowania mikrofalowego (wedle naszej wiedzy jest to pierwszy opisany przypadek zastosowania tej metody w syntezie wiązania pirofosforanowego) pozwalającego na skrócenie przebiegu reakcji z nawet kilku dni do kilkudziesięciu minut. Opracowana metoda pozwoliła na stworzenie biblioteki unikatowych w skali światowej związków niezwykle cennych narzędzi do badań procesów biologicznych. Związki te, są szczególnie interesujące ze względu na możliwość wykorzystania niektórych z nich jako prekursorów do syntezy nowych niehydrolizowalnych analogów kapu np. GDPαSβS oraz p S p S pg. Wyniki stały się już przedmiotem publikacji: Preparation of Synthetically Challenging Nucleotides Using Cyanoethyl P-Imidazolides and Microwaves; Malwina Strenkowska, Przemyslaw Wanat, Marcin Ziemniak, Jacek Jemielity *, Joanna Kowalska *, Org. Lett., 2012, 14 (18), ; IF=6,364 II.5. Bis(tiofosforanowe) analogi kapu 130

131 Kolejnym celem na drodze do uzyskania molekularnych narzędzi do stabilizacji mrna była synteza bis(tiofosforanowych) analogów kapu. Jak wykazano w rozdziale II.3.4 pojedyncza modyfikacja tiofosforanowa w łańcuchu tetrafosforanowym (m 7,2 -O 2 Gp S pppg, m 7,2 -O 2 Gpp S ppg, m 7,2 -O 2 Gppp S pg, m 7,2 -O 2 Gpppp S G) okazała się znacząco podwyższać poziom translacji in vitro (o rząd wielkości), ale w układach in vivo okazały się hydrolizowane przez enzym Dcp2 nie zapewniając tym samym podwyższonej stabilności mrna w warunkach komórkowych (w przeciwieństwie do niehydrolizowalnej przez Dcp2 β-s-arca D1). Na podstawie obecnego stanu wiedzy dotyczącego działaniadcp2 (mechanizm wciąż nie jest do końca wyjaśniony) została wysunięta hipoteza, że do zwiększenia stabilności łańcucha tetrafosforanowego analogów kapu mogłaby przyczynić się dodatkowa, sąsiadująca, modyfikacja łańcucha tetrafosforanowego. Z tego względu zdecydowano się na syntezę serii analogów kapu zawierających modyfikację bis(tiofosforanową). Zaprojektowano i przeprowadzono więc syntezę związków (nazwy serii 3P-2S, 4P-2S) o charakterystyce dinukleotydowego kapu posiadających w swojej strukturze kombinacje modyfikacji (przynajmniej dwóch z poniższych, porównaj Rysunek 60): mostek 5 -O-tri- lub tetrafosforanowy modyfikację bis(tiofosforanową) N7,2 -O-metyloguanozynę (ARCA) Spośród możliwych związków wykluczono analogi kapu z modyfikacją bis(tiofosforanową) w pozycji γ i δ mostka tetrafosforanowego, gdyż nawet jeśli byłyby odporne na hydrolizę enzymem Dcp2, posiadałyby również odporność na hydrolizę enzymem DcpS, który usuwa odcięte od mrna kapy, które w stanie wolnym stanowią dla komórki inhibitory translacji (a więc wywoływałyby efekt przeciwny do oczekiwanego). Następnie zaplanowano przebadanie podstawowych właściwości biologicznych kapu decydujących o ich użyteczności w kontekście stabilizacji mrna: Wyznaczenie stałych asocjacji kompleksów analog kapu-eif4e pozwalających na ocenę powinowactwa poszczególnych analogów kapu do eif4e Wyznaczenie wydajności translacji w lizacie komórkowym (RRL) transkryptów mrna zakończonych nowymi analogami kapu pozwalających na ocenę wpływu modyfikacji bis(tiofosforanowej) na poziom translacji 131

132 Zbadanie szybkości dekapingu mrna zakończonych nowymi analogami kapu przez enzym Dcp2 prowadzących do odpowiedzi na pytanie czy modyfikacja bis(tiofosforanowa) zwiększa odporność kapu na hydrolizę przez Dcp2 i mrna na dekaping Zbadanie procesu translacji (wydajność, ilość wyprodukowanego białka) w warunkach komórkowych (komórki dendrytyczne) mrna zakończonych nowymi analogami kapu, które pozwoliłyby na ocenę rzeczywistego wpływu modyfikacji bis(tiofosforanowej) na zachowanie mrna w komórkach, a także wykazało przydatność nowych analogów kapu do stabilizacji komórkowej terapeutycznego mrna stosowanego w immunoterapiach. γ β α m 7 Gpp S p S G (3): OR=H; m 2 7,2'-OGpp S p S G (4): OR=OCH 3 δ γ β α m 2 7,2'-OGpp S p S pg (5): OR=OCH 3 ; δ γ β α m 7 Gppp S p S G (6): OR=H; m 2 7,2'-OGppp S p S G (7): OR=OCH 3 Rysunek 60. Zaprojektowane bis(tiofosforanowe) analogi kapu (serie 3P-2S, 4P-2S). II.5.1 Synteza 132

133 Typowa synteza analogów kapu, jak przedstawiono w części literaturowej, obejmuje wytworzenie wiązania pirofosforanowego pomiędzy dwoma nukleotydami. Wiązanie tworzone jest pomiędzy P-nukleofilem i P-elektrofilem. Aby nukleotyd działał w reakcji jako P-elektrofil musi być aktywowany np. poprzez podstawienie odpowiednią grupą aktywującą. W reakcji prowadzonej w aprotycznym polarnym rozpuszczalniku pośredniczą jony metali (ułatwiając rozpuszczanie polarnych związków poprzez kompleksowanie oraz ułatwiając sprzęganie ze sobą dwóch nukleotydów). Metodę tą zaadaptowano w naszym Laboratorium do syntezy wielu różnych analogów kapu wykorzystując P-imidazolidy jako P-elektrofile, ZnCl 2 lub MgCl 2 jako mediatory sprzęgania i DMF jako rozpuszczalnik [74]. Jednakże, obecność modyfikacji wewnątrz łańcucha oligofosforanowego często powoduje zmianę właściwości nukleotydów wymuszając tym samym modyfikacje ogólnej procedury w celu dopasowania jej do indywidualnych właściwości związków. Grupa tiofosforanowa jest dobrym bioizosterem grupy fosforanowej w kontekście właściwości elektrodonorowych oraz zdolności do tworzenia wiązań wodorowych. Różnice w strukturze pomiędzy tymi grupami przejawiają się głównie w wielkości (promień van der Waalsa atomu siarki wynosi 180 pm, atomu tlenu 152 pm), rozkładu ładunku oraz polaryzacji wiązań P-S i P-O. Różnice te mogą prowadzić do zaburzenia oddziaływań oddziaływań ligand-białkami w związkach biologicznie aktywnych. Zmianie mogą ulegać także właściwości chemiczne związków z porównaniu do ich niemodyfikowanych prekursorów. Przykładowo dla modyfikacji bis(tiofosforanowej) w pozycji terminalnej łańcucha oligofosforanowego obserwuje się znacznie mniejszą stabilność związków, zwłaszcza w warunkach kwasowych, co stało się jednym z głównych problemów w pracy nad syntezą nowych analogów kapu. II Strategia syntezy Istnieje kilka możliwych opcji doboru substratów w końcowym etapie syntezy bis(tiofosforanowego) analogu kapu. Opcje, w których w końcowym etapie konieczne byłoby wytworzenie wiązania bezwodnikowego pomiędzy dwiema grupami tiofosforanowymi są mało prawdopodobne ze względu na opisywane we wcześniejszych rozdziałach problemy z aktywacją grup tiofosforanowych w nukleotydach. Aby uniknąć tego problemu, najlepszą opcją wydaje się taki dobór nukleotydów, aby wytworzyć mieszane wiązanie bezwodnikowe pomiędzy aktywną grupą fosforanową a tiofosforanową lub zwykłe wiązanie pirofosforanowe (Rysunek 61). 133

134 W tym celu konieczna jest synteza odpowiednich jednostek P-nukleofilowych, które zawierałyby modyfikacje bis(tiofosforanową). Związki były do tej pory niedostępne do otrzymania za pomocą metod chemicznych, jednak dzięki metodzie opracowanej w ramach niniejszego doktoratu opisanej w Rozdziale II.4 uzyskanie takich związków stało się możliwe. Ostateczny plan syntezy analogów kapu zawierających modyfikację bis(tiofosforanową) przedstawia Rysunek 61. Poszczególne etapy syntezy przedstawiono w kolejnych podrozdziałach. m 7 Gpp S p S G: OR = OR 2 = OH n = 0 m = 1 m 2 7,2'-O Gpp S p S G: fosforylacja Yoshikawy OR = (OR 1 lub OR 2 ) OR 1 = OR 2 = tiofosforylacja Yoshikawy gdy OR = OR 2 i B = B 1 OR = OR 1 = OCH 3 n = 0 m = 1 Mukaiyama - Hashimoto m 2 7,2'-O Gpp S p S pg: OR = OR 1 = OCH 3 n = 1 m = 1 m 7 Gppp S p S G: ZnCl 2 B = (B 1 lub B 2 ) = n=1 MgCl 2,μw, n=0 OR = OR 2 = OH n = 0 m = 2 m 2 7,2'-O Gppp S p S G: OR = OR 1 = OCH 3 n = 0 m = 1 ZnCl 2 gdy B = B 2 gdy OR = OR 2 i B = B 1 G: m 7 G: n = 0,1 DBU, μw n n MeCl 2, DMF n = 0,1 m n R P i S P R P i S P Rysunek 61. Ogólna koncepcja konstrukcji mostka oligofosforanowego modyfikowanego grupą bis(tiofosforanową) w nowych analogach kapu 134

135 II Otrzymywanie mononukleotydowych podjednostek P-elektrofilowych Zgodnie z przedstawionym w poprzednim rozdziale planem syntezy, do syntezy 7,2 - bis(tiofosforanowych) analogów kapu typu ARCA potrzebne są dwa różne typy jednostek: m 2 O GMP-Im oraz m 7,2 -O 2 GDP-Im (Rysunek 62). Te same prekursory kapu wykorzystywano przy syntezie analogów kapu z serii 4P-S-ARCA. Synteza obu podjednostek, obejmująca wprowadzenie podstawnika metylowego w pozycję N7-metyloguanozyny, fosforylację nukleozydu, przeprowadzenie w imidazolową pochodną metodą i ewentualne wydłużenie łańcucha oligofosforanowego i ponowną aktywację metodą Mukaiyamy została więc opisana we wcześniejszych rozdziałach II i II Ze względu na to, że niektóre bis(tiofosforanowe) analogi kapu zostały również otrzymane bez modyfikacji ARCA otrzymano także prekursory m 7 GMP-Im i m 7 GDP-Im w sposób analogiczny do m 7,2 -O 7,2-2 GMP-Im i m 2 O GDP-Im wychodząc z m 7 GMP. Szcegóły syntez oraz wydajności poszczególnych etapów opisano w części eksperymentalnej. Rysunek 62. P-elektrofilowe prekursory kapu wykorzystanie w syntezie bis(tiofosforanowych) analogów kapu. II Otrzymywanie mononukleotydowych podjednostek P-nukleofilowych W kolejnym etapie otrzymano wszystkie niezbędne P-nukleofilowe prekursory bis(tiofosforanowych) analogów kapu zawierające modyfikację bis(tiofosforanową). W syntezach wykorzystano dwa bis(tiofosforanowe) nukleotydy, których struktury przedstawione są na rysunku (Rysunek 63 B). Dla związków tych brak było dogodnych metod syntezy opisanych 135

136 w literaturze, stały się więc one motywacją do opracowania nowej metody syntezy modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym nukleotydów. Ze względu, że opracowanie tej metody stanowiło dużą część niniejszego projektu, i doprowadziło do syntezy wielu innych ciekawych związków, w pracy został wydzielony osobny rozdział na ten temat (Rozdział II.4). Opracowanie nowej metody syntezy wydłużania łańcucha oligofosforanowego o jednostkę fosforanową lub tiofosforanową umożliwiło syntezę nowych prekursorów kapu oraz otworzyło drzwi do syntezy bis(tiofosforanowych) analogów kapu. A. B. MgCl 2 MW DMF p S p S G - prekursor analogów kapu: m 7 Gpp S p S G, m 2 7,2'-O Gpp S p S G, m 7 Gppp S p S G, m 2 7,2'-O Gppp S p S G DBU MW DTT DMF p S p S G : n=0, wydajność: 36% p S p S pg n=1, wydajność: 24% p S p S pg - prekursor analogów kapu: m2 7,2'-O GppSpSpG Rysunek 63. A. Synteza P-nukleofilowych bis(tiofosforanowych) prekursorów kapu. B. Bis(tiofosforanowe) mononukleotydy otrzymane w tej pracy. W celu otrzymania związku p S p S G guanozynę poddano tiofosforylacji Yoshikawy za pomocą PSCl 3 dodając do reakcji lutydynę w celu wyłapywania powstającego kwasu solnego i neutralizacji ph panującego w środowisku reakcji. GMPS, wyizolowany w postaci soli trietyloamoniowej za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sephadex, poddano następnie reakcji z CE-pS-Im/Li + w DMF w obecności MgCl 2 i promieniowania mikrofalowego (Rysunek 63 A). Za pomocą RP-HPLC obserwowano pojawianie się dwóch oddalonych od siebie diastereoizomerów CE-p S p S G. Po 15 min, gdy otrzymano maksymalną konwersję substratu w produkty, reakcję rozcieńczono za pomocą DMFu, dodano DBU oraz 136

137 DTT i w obecności promieniowania mikrofalowego przeprowadzono reakcję usunięcia grupy cyjanoetylowej. Sól trietyloaminiową GDPαSβS (w postaci mieszaniny diastereoizomerów) wyizolowano z końcową wydajnością 36% za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sephadex. Syntezę drugiego prekursora p S p S pg (Rysunek 63) rozpoczęto od otrzymania wyjściowego związku, którym był w tym wypadku GDPβS, a następnie zastosowano analogiczną procedurę jak w syntezie p S p S G. GDPβS otrzymuje się poprzez sprzęganie GMP-Im z lipofilowym tiofosforanem (V) (tu wykorzystano dobrze rozpuszczalną w DMF sól trietyloamoniowe) w obecności ZnCl 2. Jako że związek ten wykorzystywany był uprzednio przy syntezie analogów z serii 4P-S-ARCA, szczególy syntezy znajdują się w rozdziale II Następnie, GDPβS poddano reakcji z CE-pS-Im/Li + w tych samych warunkach jak uprzednio GMPS. Co ciekawe, obserwując postęp reakcji na RP-HPLC można zauważyć, że reakcja przebiega dużo szybciej (już po 5 min widoczna jest prawie całkowita konwersja substratu) a różnica w czasach retencji pomiędzy poszczególnymi diastereoizomerami CE-p S p S pg jest znacznie mniejsza niż dla CEp S p S G (zob. Rysunek 64). Jest to za pewne spowodowane większym oddaleniem centrum stereogenicznego od asymetrycznego nukleozydu, a więc mniejszym stopniem indukcji asymetrycznej. Również reakcja usunięcia grupy cyjanoetylowej przebiega znacznie łatwiej i z większą wydajnością w przypadku CE-p S p S pg. Po zakończeniu reakcji i izolacji produktu za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sephadex otrzymano sól trietyloamoniową p S p S pg (w postaci mieszaniny diastereoizomerów) z końcową wydajnością 24%. Rysunek 64. Porównanie profile HPLC syntezy CE-pSpSG (po lewej) i CE-pSpSpG (po prawej) po 5 min od rozpoczęcia reakcji w tych samych warunkach (opisanych w tekście). Otrzymane związki charakteryzują się bardzo niską stabilnością i łatwo ulegają degradacji w podwyższonej temperaturze i niskim ph. Z tego względu w trakcie odparowywania po chromatografii połączonych frakcji zawierających produkt utrzymywano zasadowe ph ok. 8 dodając do roztworu niewielką ilość trietyloaminy (w trakcie odparowywania pod wpływem 137

138 niskiego ciśnienia i dodatku etanolu bufor węglanowy ulega rozkładowi obniżając ph mieszaniny). Dłuższy czas przechowywania związków w temperaturze 20 o C (powyżej dwóch tygodni) prowadzi do rozkładu związków, w związku z tym oba prekursory kapu szybko poddawano kolejnym etapom syntezy. II Sprzęganie P-elektrofilowych i P-nukleofilowych prekursorów kapu Otrzymane P-elektrofilowe i P-nukleofilowe prekursory kapu poddano reakcji sprzęgania w kombinacjach prowadzących do bis(tiofosforanowych) analogów kapu o różnej długości łańcucha oligofosforanowego i umiejscowienia modyfikacji bis(tiofosforanowej). W syntezach wykorzystano pięć kombinacji substratów: p S p S G + m 7,2 -O 2 GMP-Im, p S p S G + m 7 GMP-Im, p S p S G + m 7 GDP-Im, p S p S pg + m 7,2 -O 2 GMP-Im. Pierwsze próby syntezy kapu przeprowadzono z wykorzystaniem kombinacji p S p S G + m 7 GMP-Im. Reakcje sprzęgania próbowano początkowo przeprowadzić w warunkach analogicznych jak dla monotiofosforanowych analogów kapu (patrz rozdział II i II ), czyli w DMF w obecności ZnCl 2, jednak okazało się, że taka metoda postępowania jest nieskuteczna. Pomimo tego, że można było zaobserwować pojawianie się niewielkich ilości bis(tiofosforanowych) analogów kapu, głównym obserwowanym produktem był związek pochodzące z hydrolizy p S p S G, czyli GMPS. Degradacja była prawdopodobnie efektem hydrolizy kwasowej ZnCl 2 w obecności śladów wody. Jednak nawet dodatkowe osuszenie rozpuszczalników i ZnCl 2 nie poprawiało wyników syntezy. W związku z tym postanowiono zbadać czy sprzęganie jest możliwe również przy użyciu innych jonów metali. Pomimo tego, iż do tej pory najbardziej skutecznym mediatorem reakcji był ZnCl 2, co tłumaczono większym powinowactwem do atomów siarki (miękki kwas - miękka zasada, teoria HSAB), w wypadku bis(tiofosforanowych) analogów kapu znacznie lepsze rezultaty uzyskano stosując MgCl 2. Jony magnezu nie zakwaszają środowiska reakcji w wyniku hydrolizy tak, jak jony cynku. Niestety, nawet w obecności 16 eq chlorku magnezu nie udało się zaobserwować powstawania produktów sprzęgania, co było zgodne z wcześniejszymi doświadczeniami w syntezie tetrafosforanowych analogów kapu. Wysunięto hipotezę, że przyczyną takiego stanu rzeczy może być wysoka energia aktywacji tej reakcji. Opierając się więc na doświadczeniu z zastosowaniem promieniowania mikrofalowego w syntezie modyfikowanych nukleotydów (Rozdział II.4.2.4) 138

139 mieszaninę p S p S G + m 7 GMP-Im, MgCl 2 w DMF poddano działaniu promieniowania mikrofalowego stosując warunki takie jak w reakcjach sprzęgania z CE-p S -Im, czyli P max = 10 W, T max = 45 ± 1 o C, 2.45 GHz. Postępowanie to okazało się bardzo skuteczne, gdyż już po 15 min udało się zaobserwować za pomocą RP-HPLC i MS powstawanie znacznych ilości produktów (porównaj profil HPLC Rysunek 65) w postaci sygnałów pochodzących od czterech diastereoizomerów m 7 Gpp S p S G. Warto dodać, że zwykłe ogrzewanie reakcji również prowadziło do podniesienia wydajności reakcji, jednak nadmierna hydroliza substratów w tych warunkach wciąż stanowiła problem. W warunkach mikrofalowych, preferowanym kierunkiem reakcji w obecności MgCl 2 była reakcja sprzęgania, choć wciąż obserwowano powstawanie GMPS, jednak w znacznie mniejszych ilościach. Ponadto, próby przeprowadzenia sprzęgania mikrofalowego w obecności soli innych jonów metali tj. dla Zn 2+, Mn 2+ i Cd 2+ prowadziły jedynie do przyśpieszonej hydrolizy GDPαSβS, nie dając właściwego produktu sprzęgania. Rysunek 65. Profil HPLC wykonany po 15 min od rozpoczęcia reacji syntezy m 7 Gpp S p S G. Kolorem zielonym oznaczono substraty syntezy p S p S G D1 oraz D2 oraz m 7 GMP-Im, natomiast kolorem niebieskim produkt m 7 Gpp S p S G (cztery sygnały pochodzące od diastereoizomerów D1-D4. W tym konkretnym przypadku substrat m 7 GMP-Im był mocno zanieczyszczony m 7 GMP, jednak profil wybrano do prezentacji ze względu na widoczny rozdział wszystkich czterech diastereoizomerów m 7 Gpp S p S G. Za optymalne warunki syntezy uznano więc użycie MgCl 2 w DMF w obecności promieniowania mikrofalowego. Warunki te z sukcesem zaadaptowano do kolejnych syntez bis(tiofosforanowych) analogów kapu, otrzymując po izolacji za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sephadex pięć różnych analogi kapu (w postaci mieszaniny czterech diastereoizomerów każdy) m 7 Gpp S p S G, m 7,2 -O 2 Gpp S p S G, m 7 7,2 - Gppp S p S G, m 2 O Gppp S p S G i m 7,2 -O 2 Gpp S p S pg. Wyniki syntez (czas reakcji, czasy retencji produktów, wydajność sprzęgania, wydajność po izolacji) przedstawiono w tabeli (Tabela 14). Modyfikacja bis(tiofosforanowa) będąca częścią mostka oligofosforanowego w dinukleotydach lub 139

140 mononukleotydach, w których w terminalnej pozycji znajduje się zwykłe ugrupowanie fosforanowe, w przeciwieństwie do mononukleotydów zawierających terminalne ugrupowania tiofosforanowe okazały się być bardzo trwałe. Przykładowo dinukleotydowe analogi kapu zawierające ugrupowanie bis(tiofosforanowe) mogą być bezpiecznie przechowywane w temperaturze 20 o C przez okres co najmniej kilkunastu miesięcy. Tabela 14. Parametry syntez bis(tiofosforanowych) analogów kapu. W tabeli podano końcowy związek (analog kapu) wyjściowe substraty (substrat 1, substrat 2), warunki reakcji, czasy retencji HPLC wszystkich diastereoizomerów powstającego produktu (t r HPLC), wydajność reakcji sprzęgania obliczona na podstawie HPLC po zakończeniu reakcji (wydajność HPLC) oraz po chromatografii na złożu DEAE-Sephadex. analog kapu substrat 1 substrat 2 warunki sprzęgania t ret HPLC (min) wydajność HPLC wydajność po izolacji m 7 Gpp Sp SG m 7 GMP-Im p Sp SG (D1D2) 8-12eq, MgCl 2, μw*, DMF D1 6,4 D2 6,5 D3 6,9 D4 7,5 73% 41% m 7,2 -O 2 Gpp Sp SG m 7,2 -O 2 GDP-Im p Sp SG (D1D2) 8-12eq MgCl 2, μw*, DMF D1,D2 7,0 D3 8,0 D4 8,3 68% 40% m 7 Gppp Sp SG m 7 GDP-Im p Sp SG (D1D2) 8-12eq MgCl 2, μw*, DMF D1,D2 5,5 D3,D4 6,4 55% 24% m 7,2 -O 2 Gppp Sp SG m 7,2 -O 2 GDP-Im p Sp SpG (D1D2) 8-12eq MgCl 2, μw*, DMF D1,D2 7,3 D3,D4 8,4 70% 38% m 7,2 -O 2 Gpp Sp SpG m 7,2 -O 2 GMP-Im p Sp SpG (D1D2) 8-12eq MgCl 2, μw*, DMF D1,D2 7,3 D3,D4 7,4 75% 37% * P max = 10 W, T max = 45 ± 1 o C, 2.45 GHz II Diastereoizomery Należy zwrócić również uwagę na większy stopień skomplikowania stereochemii produktów w porównaniu do syntezy monotiofosforanowych analogów kapu (seria 4S-P). Ze względu na obecność dwóch centrów stereogenicznych w mostku oligofosforanowym, każdy z bis(tiofosforanowych) analogów kapu otrzymywany jest w postaci czterech diastereoizomerycznych produktów (a nie dwóch, jak w wypadku 4S-P). Różnią się one czasami retencji, jednak jedynie w wypadku m 7 Gpp S p S G zróżnicowanie to jest wystarczające dla 140

141 wszystkich czterech diastereoizomerów do ich rozdziału na czyste stereoizomery. Podjęto próbę rozdziału diastereoizomerów za pomocą półpreparatywnego RP-HPLC dobierając eksperymentalnie gradient przy którym różnice w czasach retencji diastereoizomerów pozwalały na ich separację. Jednak tylko w wypadku m 7 Gpp S p S G udało się rozdzielić wszystkie diastereoizomery (oznaczone D1-D4 zgodnie z kolejnością elucji z kolumny RP). W pozostałych przypadkach w większości właściwości fizykochemiczne związków pozwalały jedynie na rozdział par diastereoizomerów. W takiej formie przeznaczono bis(tiofosforanowe) analogi kapu do dalszych badań biologicznych. Analog m 7 Gpp S p S G ze względu na najlepsze różnice we właściwościach fizykochemicznych diastereoizomerów został przeznaczony do badań krystalograficznych z białkiem eif4e, które mogą doprowadzić m.in. do poznania konfiguracji absolutnej poszczególnych centrów stereogenicznych. II Właściwości NMR W celu potwierdzenia struktury bis(tiofosforanowych) analogów kapu wykonano widma 31 P NMR i 1 H NMR końcowych związków. Sygnały na widmach fosforowych nukleotydów ulegają znacznemu przesunięciu gdy atomy tlenu zastępowane są przez atomy siarki. Na wszystkich widmach bis(tiofosforanowych) analogów kapu efekt ten jest widoczny, co stanowi potwierdzenie obecności danych modyfikacji siarkowych w związkach w odpowiedniej pozycji łańcucha oligofosforanowego. Porównanie wartości przesunięć chemicznych δp dla poszczególnych analogów kapu przedstawia Tabela 15). Dla związków modyfikowanych w pozycji α,β (m 7 Gpp S p S G, m 7,2 -O 2 Gpp S p S G, m 7 Gppp S p S G, m 7,2 -O 2 Gppp S p S G) sygnał P α ma przesunięcie 42 ppm, sygnał P β 29 ppm, podczas gdy przesunięciom P α i P β w niemodyfikowanych m 7 GpppG i m 7 GppppG odpowiadają wartości odpowiednio ok. -12 ppm i - 23 ppm. Dla β,γ-modyfikowanych analogów (m 7,2 -O 2 Gpp S p S pg), sygnały P β i P γ nakładają się na siebie wykazując przesunięcie chemiczne 30 ppm. Te same sygnały P β i P γ w niemodyfikowanym m 7 GppppG znajdują się przy -24 ppm. Jak można zauważyć, w każdym wypadku podstawienie siarką przesuwa sygnał od danego jądra fosforu o ok. 50 ppm w dół pola. Rysunek 66 przedstawia reprezentatywne widmo 31 P NMR wybranego bis(tiofosforanowego) analogu kapu. 141

142 Tabela 15. Porównianie wartości przesunięć chemicznych sygnałów na widmie 31 P NMR pochodzących od jąder atomów fosforu Pα Pδ dla bis(tiofosforanowych) analogów kapu i ich niemodyfikowanych odpowiedników. Wytłuszczono przesunięcia dla sygnałów P związanych z atomami siarki analog kapu δ(pα) [ppm] δ(pβ) [ppm] δ(pγ) [ppm] δ(pδ) [ppm] m 7 GpppG * m 7 Gpp Sp SG * m 2 7,2 -O Gpp Sp SG * 42,25 42,50 28,80 29,19-12, ,63 - m 7 GppppG m 7 Gppp Sp SG * 42,45 42,69 29,09 29,53-23, ,08-11, ,32 m 2 7,2 -O Gppp Sp SG * 42,29 42,50 28,84 28,92-24, ,21-11, ,44 m 2 7,2 -O Gpp Sp SpG * -11, ,40 28,38 31,10 28,38 31,10-11, ,40 *podane zakresy przesunięć odnoszą się do zakresów w których pojawiają się na widmie 31 P NMR sygnały δp dla poszczególnych diastereoizomerów D1-D4. Wariacje pomiędzy poszczególnymi diastereoizomerami w wartościach δp są konsekwencją różnic w ich właściwościach fizycznych i w tym wypadku są niewielkie, ±2 ppm 142

143 Rysunek 66. Przykładowe widmo 31 P NMR dla reprezentatywnego bis(tiofosforanowego) analogu kapu. Widmo wykonano dla mieszaniny diastereoizomerów D1 i D2 m 2 7,2 -O Gppp S p S G (sól amonowa). Widoczne są 4 sygnały pochodzące od jąder atomów fosforu łańcucha tetrafosforanowego. Nad sygnałami umieszczono symbole przypisanych im jąder fosforu (α δ). W ramkach zaprezentowano powększenie sygnałów z widoczną strukturą subtelną. W prawym górnym rogu ramki podano multipletowość sygnałów. W związku z tym, że poszczególne diastereoizomery związku wykazują drobne różnice w przesunięciach chemicznych, ich sygnały pokrywają się lub częściowo zachodzą na siebie (fakt nakładania się na siebie np. dwóch sygnałów ot tego samego jądra fosforu, ale innego diastereoizomeru np. PαD1 i PαD2 zaznaczono liczbą 2 przed symbolem multipletowości np. 2d, 2dd). Informacje na temat typowych sygnałów pojawiających się na widmach 1H NMR wprowadzono w rozdziale II (Tabela 7). Widma 1 H NMR bis(tiofosforanowych) analogów kapu przypominają widmo typowej struktury kapu, z wyjątkiem sygnału H8 m7g. Proton ten ulega z reguły wymianie na deuter i nie jest widoczny na widmie. Na wszystkich widmach bis(tiofosforanowych) analogów kapu sygnał od protonu H8 m7g jest widoczny (choć o mniejszej intensywności), co oznacza, że wymiana tego protonu jest utrudniona, prawdopodobnie z powodu zawady sterycznej w postaci dużego atomu siarki znajdującego się w otoczeniu protonu. Efekt ten był już obserwowany na widmach innych pochodnych kapu zawierających grupę tiofosforanową (np. 3P-S-ARCA, 4P-S-ARCA). Na widmach zauważalne są również różnice w przesunięciach chemicznych pochodzących od diastereoizomerów. Na widmach 31 P NMR sygnały od jąder atomów fosforu połączonych z 143

144 atomami siarki wykazują niewielkie różnice w przesunięciu chemicznym dla poszczególnych diastereoizomerów (±2 ppm). Efekty diastereoizomeryczne widoczne są także na widmach 1 H NMR, sygnały protonów oraz jąder fosforu najbardziej podatnych na ten efekt przedstawia Tabela 15. Rysunek 67. Różnice w przsunięciach chemicznych sygnałów na widmach 1 H NMR (A) i 31 P NMR (B) dla diastereoizomerów D1 D 4 na przykładzie bis(tiofosforanowego) analogu kapu m 7 Gpp S p S G. II.5.2 Powinowactwo do eif4e Aby sprawdzić czy nowe analogi kapu charakteryzują się wystarczająco wysokim powinowactwem eif4e (tzn. co najmniej porównywalnym do powinowactwa niemodyfikowanego kapu m 7 GpppG) i będą użyteczne w dalszych badaniach nad translacją mrna zaprojektowano serię eksperymentów pozwalających na wyznaczenie zmian energii swobodnych Gibbsa i stałych asocjacji kompleksów poszczególnych analogów kapu z białkiem eif4e, których porównanie dostarcza cennych wiadomości na temat powinowactwa kapu do eif4e. Znaczenie badań oddziaływań analogów kapu z eif4e oraz metoda miareczkowania fluorescencyjnego wykorzystywanego w tych badaniach zostało omówione już w rozdziale II.3.3. Badania zostały przeprowadzone przez mgr Katarzynę Wnęk w Zakładzie Biofizyki IFD UW. Do badań przeznaczono reprezentatywne bis(tiofosforanowe) analogi kapu. We wcześniejszych badaniach wykazano już, że grupa metylowa w pozycji 2 lub 3 rybozy nie wpływa znacząco na 144

145 zmianę stałej asocjacji analogów kapu ([96][103] oraz Tabela 8), w przeciwieństwie do modyfikacji zasady azotowej czy oligofosforanu. Na podstawie tej wiedzy oraz ze względów praktycznych związanych z ograniczoną ilością związków z serii bis(tiofosforanowych) analogów kapu do badań wyselekcjonowano bardziej dostępne związki, reprezentatywne dla każdego typu modyfikacji oligofosforanu, niekoniecznie zawierające modyfikację ARCA. Dla modyfikacji w pozycji α i β mostka trifosforanowego oraz tetrafosforanowego wybrano więc analogi m 7 Gpp S p S G i m 7 Gppp S p S G, natomiast jako analog reprezentujący modyfikację w pozycji β i γ łańcucha tetrafosforanowego m 7,2 -O 2 Gpp S p S pg. Wyniki pomiarów oraz porównanie z danymi literaturowymi dla wybranych analogów kapu przedstawia Tabela 16. Tabela 16. Stałe asocjacji oraz energie swobodne Gibbsa dla wybranych analogów kapu. Porównanie wartości stałych asocjacji i energii swobodnych Gibbsa dla analogów kapu z prac Jemielity et al 2003, Kowalska et al z mono- i bis(tiofosforanowymi) analogami kapu. Analog kapu seria K as (kap-eif4e) [μm - 1 ] a ΔG energia swobodna (kcal mol 1 ) b m 7 GpppG 3P 9,4 ± 0,4 c 9,35 ± 0,03 c m 7,3 -O 2 GpppG 3P 10,2 ± 0,3 c 9,40 ± 0,02 c m 7,2 -O 2 GpppG 3P 10,8 ± 0,3 d 9,42 ± 0,02 d m 7,2 -O 2 GppppG 4P 99,8 ± 6,0 d 10,73 ± 0,04 d m 7 Gp 5G 5P 543 ± 55 d 11,71 ± 0,06 d m 7,2 -O 2 Gpp SpG D1 3P-S 43,1 ± 1,4 c 10,23 ± 0,02 c m 7,2 -O 2 Gpp SpG D2 3P-S 19,3 ± 2,2 c 9,77 ± 0,07 c m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2mix 4P-S 282 ± 12 e 11,33 ± 0,02 e m 7 Gpp Sp SG D1 3P-2S 42,12 ± 1,57 10,22 ± 0,02 m 7 Gpp Sp SG D2 3P-2S 54,54 ± 2,19 10,37 ± 0,02 m 7 Gpp Sp SG D3 3P-2S 49,68 ± 6,96 10,32 ± 0,08 m 7 Gpp Sp SG D4 3P-2S 34,84 ± 1,72 10,11 ± 0,03 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SpG D1D2mix 4P-2S 504,82 ± 68,59 11,33 ± 0,08 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SpG D3D4mix 4P-2S 918,54 ± 36,60 12,02 ± 0,02 m 7 Gppp Sp SG D1D2mix 4P-2S 180,57 ± 5,20 11,07 ± 0,02 m 7 Gppp Sp SG D3D4mix 4P-2S 227,07 ± 7,06 11,20 ± 0,02 a średnie wartości z 3 eksperymentów, b obliczone na podstawie równania ΔG o = RTlnK AS, c Ref. [104], d Ref. [96] d Tabela 8 Stałe asocjacji wyznaczone dla trifosforanowych analogów kapu zawierających bis(tiofosforanowa) modyfikację w pozycji α,β (z serii 3P-2S) zawierają się w granicach 34,84 ± 1,72 μm -1 54,54 ± 2,19 μm -1 w zależności od formy diastereoizomerycznej. Seria 145

146 bis(tiofosforanowych) analogów kapu o mostku tetrafosforanowym wykazuje duże różnice w wartościach stałych asocjacji pomiędzy analogami α,β a β,γ. Analogi α,β charakteryzują się stałymi asocjacji 180,57 ± 5,20 μm -1 (D1D2) oraz 227,07 ± 7,06 μm -1 (D3D4), natomiast dla analogów β,γ stałe asocjacji są wyjątkowo wysokie i wynoszą 504,82 ± 68,59 μm -1 i 918,54 ± 36,60 μm -1. Porównując powyższe z wynikami uzyskanymi uprzednio dla serii analogów kapu 3P, 3P-S, i 4P-S można zaobserwować: podwyższeniu stałej asocjacji kompleksu kap-eif4e sprzyja wydłużenie mostka oligofosforanowego. Pokazują to zarówno przykłady z serii 4P jak i 4P-S i 4P-2S, gdzie każdorazowo stała asocjacji jest znacznie wyższa w porównaniu do trifosforanowego kapu. I tak, seria 4P wykazuje wyższe stałe asocjacji niż seria 3P, seria 4P-S wykazuje wyższe stałe asocjacji niż seria 3P-S a seria 4P-2S wyższe niż seria 3P-2S. pojedyncza modyfikacja tiofosforanowa wpływa dodatnio na wartość stałej asocjacji z eif4e. Widać to zarówno w porównaniu serii 3P-S z serią 3P jak i w porównaniu serii 4P-S z serią 4P. Obserwuje się w wartościach stałych asocjacji różnice w zależności od miejsca umiejscowienia modyfikacji. Dla serii 3P-S najbardziej wpływową pozycją łańcucha jest pozycja β. Dla serii 4P-S jest to pozycja γ. Wartość stałej zależy również czasami od diastereoizomeru, gdyż obserwuje się pewne różnice w wielkościach pomiędzy diastereoizomerami np. w serii 3P-S dla analogu β diastereoizomer D1 wykazuje znacznie wyższą stałą asocjacji niż diastereoizomer D2. Druga modyfikacja tiofosforanowa również podwyższa wartość stałej asocjacji. Porównując serię 3P-2S (modyfikacje w pozycji α,β) z serią 3P-S (analog α i analog β widać nieznaczny wzrost stałych asocjacji, jednak wartości stanowią wciąż ten sam rząd wielkości (kilkadziesiąt μm -1 ). Efekt podwyższenia wartości stałej asocjacji jest znacznie wyraźniejszy dla łańcucha tetrafosforanowego niż trifosforanowego, co widać przy porównaniu serii 4P-2S i 4P-S. Jest to zmiana o ponad rząd wielkości wyższa i jest ona większa niż w przypadku zwykłego wydłużenia łańcucha (porównanie serii 3P z 4P, 3P-S z 4P-S) jest więc to efekt synergiczny dwóch komplementarnych modyfikacji. W serii 4P-2S możemy zaobserwować również, że modyfikacja pozycji β,γ znacznie bardziej potęguje ten 146

147 efekt niż modyfikacja w pozycji α,β. Analogi w serii 4P-2S posiadają 4 diastereoizomery i widoczne są niewielkie różnice pomiędzy nimi. Widać że w obu zbadanych przypadkach mieszaniny diastereoizomerów D3D4 charakteryzują się wyższymi stałymi asocjacji niż mieszaniny D1D2. Nieznana jest jednak konfiguracja absolutna związków, więc nie jest możliwe porównywanie różnic na poziomie diastereoziomerów pomiędzy seriami 3P-2S i 3P-S. Porównanie wartości stałych asocjacji kompleksu kap-eif4e dla poszczególnych analogów kapu pozwala określić ich wzajemne powinowactwo do eif4e. Jednym z podstawowych wniosków płynących z powyższych obserwacji jest to, że oddziaływaniu z białkiem eif4e sprzyja wydłużony mostek oligofosforanowy oraz odpowiednio umiejscowiona modyfikacja tiofosforanowa. Dodatkowe podjednostki fosforanowe zwiększają ładunek ujemny, co sprzyja silniejszym oddziaływaniom z miejscem wiążącym eif4e zbudowanym z dodatnio naładowanych aminokwasów. Dla trifosforanowych analogów jest to pozycja β, natomiast dla tetrafosforanowych jest to pozycja γ. Kombinacja modyfikacji w tych dwóch pozycjach daje jednak najlepszy efekt, co widać na przykładzie m 7,2 -O 2 Gpp S p S pg. Efekt ten można tłumaczyć większą lokalizacją ładuku ujemnego na atomach siarki, co wydaje się zgodne z. wynikami przeprowadzonych do tej pory badań krystalograficznych kompleksów eif4e z różnymi analogami kapu, w tym β-s-arca. Z Badań tych wynika, że atom siarki dąży do tego, aby znaleźć się w otoczeniu dwóch dodatnio naładowanych reszt aminokwasowych w kieszeni wiążącej eif4e (Warmiński et al., nieopublikowane wyniki). Ze względu na to, że wiązanie z eif4e jest również jedną z form ochrony mrna przed dekapingiem (dopóki kap jest związany z eif4e enzymy dekapujące nie mają dostępu do 5 końca mrna), można oczekiwać, że analogi wykazujące wyższe powinowactwo do eif4e będą wykazywać większą odporność na Dcp2 w komórkach. Aby lepiej zrozumieć znaczenie wyników doświadczeń w kontekście ułożenia kapu w kieszeni wiążącej oraz z oddziaływań ze strukturą eif4e niezbędne są dane na temat ułożenia przestrzennego struktury modyfikowanego kapu w kieszeni wiążącej eif4e. Przeprowadzono więc próbę badań krystalograficznych z wykorzystaniem bis(tiofosforanowych) analogów kapu. Do tej pory udało się uzyskać jedynie strukturę krystalograficzną m 7 Gpp S p S G D1 z eif4e o niezbyt dobrej rozdzielczości (2,35Å). Na podstawie otrzymanych danych i porównania ze strukturą β-s-arca można stwierdzić, że konfiguracja ta jest taka sama jak dla Pβ w 147

148 diastereoizomeru D1 - R P, co odpowiada konfiguracji S P dla bistiofosforanowego analogu (nieopublikowane wyniki) Rysunek 68. Struktura krystalograficzna otrzymana dla kompleksu eif4e z m 2 7,2 -O Gpp S p S G D1 Do tej pory jedyny kompleks eif4e z bis(tiofosforanowymi) analogami kapu dla którego udało się wyznaczyć strukturę krystalograficzną to kompleks m 2 7,2 -O Gpp S p S G/D1 eif4e. Rozdzielczość otrzymanej struktury (2,35 Å) i otrzymane mapy gęstości pozwalają na obserwację N7-metyloguanozyny oraz łańcucha trifosforanowego. Niewidoczny jest drugi nukleozyd a także pozycja drugiego atomu siarki. Kryształ oraz struktura zostały otrzymane przez mgr Marcina Warmińskiego. Rysunek wykonano w programie UCSF Chimera. II.5.3 Wydajność translacji in vitro Kolejnym krokiem w celu oceny przydatności nowych analogów kapu w syntezie mrna o podwyższonym potencjale translacyjnym było wprowadzenie nowych analogów kapu do mrna i porównanie wydajności ekspresji białka in vitro. Badania zostały przeprowadzone prze dr Renatę Grzelę i dr Macieja Łukaszewicza w Zakładzie Biofizyki IFD UW. Do badań przeznaczono wszystkie nowe analogi kapu będące analogami ARCA, gdyż tak jak przedstawiono to w części literaturowej (rozdział I.4.1), modyfikacja zapewnia inkorporację kapu wyłącznie we właściwej orientacji dzięki czemu 100% kapowanych transkryptów jest funkcjonalnych. Wyniki badań przedstawione są w tabeli poniżej (Tabela 17) 148

149 Tabela 17. Wydajność translacji kapowanego mrna w lizacie z retikulocytów króliczych. Wydajność translacji z ApppG-mRNA była stosunkowo niska w stosunku do m 7 GpppGmRNA. Świadczy to o tym, że w trakcie eksperymentu, niezależna od kapu translacja była utrzymywana na niskim poziomie. Po odjęciu wartości pochodzących od kap-niezależnej translacji i normalizacji wyników w odniesieniu do niemodyfikowanego kapu, można porównać poszczególne wartości: Dla wszystkich nowych analogów relatywna wydajność translacji przekroczyła wartość 1., co oznacza, że wszystkie mrna są funkcjonalne i mogą ulegać wydajnej translacji. Wszystkie trifosforanowe analogi monotiofosforanowe i bis(tiofosforanowe) (serie 3P- analog kapu S i 3P-2S) charakteryzują się również wyższą wydajnością translacji niż ARCA m 2 7,2- O GpppG (1,81 ± 0,32) lub m 2 7,3-O GpppG (1,83 ± 0,64). Wszystkie analogi tetrafosforanowe monotiofosforanowe i bis(tiofosforanowe) charakteryzują się również wyższą wydajnością translacji niż ARCA m 2 7,2-O GppppG (1,79 ± 0,43). Serie 3P-S, 4P-S, 3P-2S i 4P-2S wykazują porównywalne wartości translacji (w granicach błędu) seria Względna wyd.translacji mrna a 149 Względna wyd. kap-zależnej translacji mrna b m 7 GpppG 3P 1 1 ApppG ± ± 0.10 m 7,3 -O 2 GpppG 3P 1.83 ± ± 0.81 m 7,2 -O 2 GpppG 3P 1.81 ± ± 0.43 m 7,2 -O 2 GppppG 4P 1.79 ± ± 0.56 m 7,2 -O 2 Gpp SpG D1 3P-S 2.07 ± ± 0.10 m 7,2 -O 2 Gpp SpG D2 3P-S 2.54 ± ± 0.26 m 7,2 -O 2 Gpp SppG D1D2mix 4P-S 2.51 ± ± 0.83 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SG D1D2mix 3P-2S 3.16 ± ± 0.95 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SG D3 3P-2S 1.82 ± ± 0.98 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SG D4 3P-2S 2.77 ± ± 1.18 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SpG D1D2mix 4P-2S 2.52 ± ± 0.65 m 7,2 -O 2 Gpp Sp SpG D3D4mix 4P-2S 2.63 ± ± 0.99 m 7,2 -O 2 Gppp Sp SG D1D2mix 4P-2S 2.83 ± ± 0.81 m 7,2 -O 2 Gppp Sp SG D3D4mix 4P-2S 2.20 ± ± 0.44 a średnie wartości z 2-3 powtórzeń dla dwóch niezależnie otrzymanych mrna, b wartości z uwzględnieniem korekty na kap niezależną translację (ApppG)

150 Na podstawie wyników można stwierdzić, że udało się stworzyć w pełni funkcjonalne modyfikowane analogi kapu efektywnie rozpoznawane przez maszynerię translacyjną, co prowadzi do wydajnej translacji. Modyfikacja tiofosforanowa prowadzi do zwiększenia wydajności translacji w RRL. W danym eksperymencie nie udało się zaobserwować oczekiwanych na podstawie dużych różnic w powinowactwie do eif4e (Rozdział II.3.3) wyraźnych różnic w wydajnościach translacji pomiędzy mrna z monotiofosforanowymi a bis(tiofosforanowymi) analogami kapu. Warto jednak pamiętać, że lizaty komórkowe nie oddają jednak dobrze warunków panujących w żywych komórkach. Środowisko reakcji posiada wszystkie czynniki obecne w komórkach niezbędne do translacji, jednak zaburzone są procesy regulacji. Oznacza to, że zaburzona jest równowaga pomiędzy procesem translacji i dekapingu. Mimo to badania in vitro stanowią łatwą i szybką metodę dla sprawdzenia ogólnych właściwości translacyjnych analogów kapu przed dużo droższymi i czasochłonnymi testami komórkowymi. II.5.4 Podatność na hydrolizę w obecności enzymu dekapującego Dcp2 Otrzymane w ninienjszej pracy doktorskiej analogi kapu modyfikowane grupą bis(tiofosforanową) (3P-2S i 4P-2S) poddano również badaniom odporności na SpDcp1/2. Badania zostały przeprowadzone przez dr Renatę Grzelę oraz dr Macieja Łukaszewicza w Zakładzie Biofizyki IFD UW. Analogiczne badania przeprowadzone dla tetrafosforanowych analogów kapu z pojedynczą modyfikacją tiofosforanową (4P-S) (Rozdział II.3.5), w trakcie których, wbrew uprzednim przewidywaniom, okazało się, że ani analog m 7,2 -O 2 Gpp S ppg ani m 7,2 -O 2 Gppp S pg nie są odporne na działanie Dcp2, pokazały, że wciąż nie rozumiemy w pełni działania Dcp2. Zasugerowano inny możliwy mechanizm hydrolizy łańcucha tetrafosforanowego (np. możliwość przesunięcia enzymu aby shydrolizować bardziej dostępne sąsiadujące wiązanie lub podwójne miejsce cięcia. W związku z tym, głównym celem prezentowanych tu badań było uzyskanie odpowiedzi na pytanie czy podwójna modyfikacja, która jest modyfikacja bis(tiofosforanowa) zapewni ochronę przed Dcp2. Odpowiedź na to pytanie przybliżyłaby nas również do zrozumienia w jaki sposób zachowuje się wobec wiązań 5,5 -tetrafosforanowych, które nie są spotykane naturalnie w komórkach. Znalezienie tetrafosforanowych analogów kapu odpornych na enzym Dcp2 wydaje się bardzo interesujące biorąc pod uwagę ich potencjalne właściwości translacyjne wykazane w testach in vitro (porównaj Tabela 6). Wciąż trwa 150

151 poszukiwanie analogów, które mogłyby charakteryzować się lepszymi translacyjnie właściwościami w komórkach ludzkich niż najlepszy zidentyfikowany do tej pory analog kapu m 7,2 -O 2 Gpp S pg. W badaniach porównano odporność 34-nukleotydowych mrna zakończonych analogami kapu z serii 3P, 4P, 4P-S, 3P-S, 3P-2S i 4P-2S. mrna zsyntetyzowano in vitro za pomocą polimerazy T7 inkorporując odpowiednie analogi kapu na 5 koniec mrna. Takie mrna inkubowano z enzymem Dcp2 w obecności jonów Mg 2+. Następnie mrna poddawano elektroforezie na wysokorozdzielczym żelu sekwencyjnym i obserwowano pojawianie się pasm pochodzących do kapowanych substratów i zdekapowanych produktów. Przykładowe żele sekwencyjne otrzymane po inkubacji oligonukleotydów z Dcp2 oraz wykresy procentu dekapingu zaprezentowano na rysunku poniżej (Rysunek 69). Wyniki podsumowano również w Tabeli (Tabela 18). 151

152 Rysunek 69. Hydroliza oligonukleotydów mrna zakończonych za pomocą SpDcp1/2. Po lewej: Figura prezentuje wynik inkubacji kapowanych oligonukleotydów z SpDcp1/2 przez wskazany okres czasu po którym próbki umieszczani na 15% żelu sekwencyjnym (część eksperymentalna) Próbki oznaczone - nie otrzymały SpDcp1/2. A. Próbki inkubowane z 50 nm SpDcp1/2. B. Najbardziej odporne próbki poddane inkubacji z 200 nm SpDcp1/2. Po prawej: procentowy udział formy pozbawionej kapu w stosunku do początkowej ilości kapowanego mrna na żelu. Wykres A dotyczy żelu A, wykres B dotyczy żelu B. 152