STRUKTURY CYTOSZKIELETU AKTYNOWEGO FORMOWANE PRZY KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI PODCZAS PIERWSZEGO ETAPU MIGRACJI

Transkrypt

1 STRUKTURY AKTYNOWE KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI 381 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM NR 2 ( ) STRUKTURY CYTOSZKIELETU AKTYNOWEGO FORMOWANE PRZY KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI PODCZAS PIERWSZEGO ETAPU MIGRACJI CYTOSKELETAL ACTIN STRUCTURES FORMED AT THE LEADING EDGE OF THE MIGRATING CELL DURING THE FIRST STEP OF MIGRATION Aleksandra STÊPIEÑ, Alina GRZANKA, Adam SZPECHCIÑSKI Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii, Uniwersytet Miko³aja Kopernika w Toruniu, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Streszczenie: Ekspansja krawêdzi wiod¹cej stanowi pierwszy etap migracji komórek. Zwi¹zany jest on z formowaniem zbudowanych z aktyny struktur cytoszkieletu lamellipodiów oraz filopodiów. Ich reorganizacja, w odpowiedzi na szereg bodÿców zewn¹trzkomórkowych, kontrolowana jest m.in. przez bia³ka nale ¹ce do rodziny WASP (ang. Wiskott-Aldrich syndrome protein), bêd¹ce efektorami GTPaz Rho i poœrednicz¹ce w aktywacji kompleksu Arp2/3 (ang. actin-related protein 2-3 complex). Najnowsze badania z zastosowaniem qfsm (ang. quantitative fluorescent speckle microscopy) wskazuj¹ na istnienie przy krawêdzi wiod¹cej komórki odrêbnego obszaru utworzonego z filamentów aktynowych lamellum, odpowiedzialnego za trwa³e wysuniêcie krawêdzi wiod¹cej w pierwszym etapie ruchu komórki. W pracy przedstawiono charakterystykê powy szych struktur z uwzglêdnieniem poznanych dotychczas mechanizmów oraz szlaków sygna³owych, prowadz¹cych do ich formowania. S³owa kluczowe: lamellipodium, filopodium, lamellum, WASP, WAVE. Summary: Protrusion of the leading edge represents the first step of cell migration. This process is connected with formation of cytoskeletal actin-containing structures called lamellipodia and filopodia. Reorganization of cortical actin filaments in response to extracellular stimuli is controlled by The Wiskott- Aldrich syndrome proteins (WASP), a protein family members that are believed to be important effectors of Rho GTPases and to mediate in activating Arp2/3 (actin-related protein 2-3) complex. Recent studies using quantitative fluorescent speckle microscopy (qfsm) revealed the existence of the second region containing filamentous actin at the leading edge of migrating cells lamellum, responsible for the persistent advancement of the cell. In this paper, characteristics of above-mentioned structures are presented and the mechanisms and signaling pathways leading to their formation, are discussed. Key words: lamellipodium, filopodium, lamellum, WASP, WAVE.

2 382 A. STÊPIEÑ, A. GRZANKA, A. SZPECHCIÑSKI Wykaz stosowanych skrótów: ABPs (actin binding proteins) bia³ka wi¹ ¹ce aktynê; Arp 2/3 (actinrelated protein 2-3 complex) kompleks 2/3 bia³ek spokrewnionych z aktyn¹; Cdc42 (cell-division cycle 42) cykl podzia³u komórkowego 42; CP (capping protein) bia³ko czapeczkuj¹ce; Ena/VASP enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein; EVH1 (Ena-VASP homology domain 1) domena bia³ek homologiczna do domeny 1 Ena-VASP; qfsm quantitative fluorescent speckle microscopy; GBD (GTP-ase binding domain) domena wi¹ ¹ca GTP-azê; GBD/CRIB GTPase-binding domain/cdc42 and Rac interactive binding; PH ( pleckstrin homology) domena bia³ek homologiczna do domeny plekstryny; Rac1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1; Scar/WAVE suppressor of cyclic AMP receptor mutation/wiskott-aldrich verprolin homologous protein; SHD (SCAR homology domain) domena homologiczna do domeny SCAR; WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein; N-WASP (neuronal-wasp) N-WASP WASP w komórkach nerwowych; WH1 (WASP homology domain 1) domena bia³ek homologiczna do domeny 1 WASP; WHD (WAVE homology domain) domena bia³ek homologiczna do domeny WAVE. Migracja komórek umo liwia zachodzenie wielu procesów fizjologicznych, a tak e zwi¹zana jest z szeregiem zjawisk patologicznych zachodz¹cych w organizmie. W embriogenezie, przemieszczanie siê komórek jest jednym z czynników warunkuj¹cych prawid³owy przebieg procesów morfogenezy. W organizmach dojrza³ych migracja komórek zachodzi m.in. podczas gojenia siê ran, odpowiedzi immunologicznej, angiogenezy oraz w jednym z etapów kancerogenezy metastazie [17]. Ukierunkowany ruch komórek jest procesem z³o onym, wymagaj¹cym integracji i precyzyjnej koordynacji szeregu zjawisk zachodz¹cych w odrêbnych obszarach komórki. Ze wzglêdu na tê czasowo-przestrzenn¹ organizacjê, migracja mo e byæ rozpatrywana jako nieprzerwany cykl sk³adaj¹cy siê z kilku niezale nych etapów: 1) ekspansji krawêdzi wiod¹cej, 2) formowania miejsc przylegania powsta³ych wypustek do pod³o a, 3) generacji naprê eñ w obrêbie nowo utworzonych struktur adhezyjnych, 4) deadhezji tylnej czêœci cia³a komórki i podci¹gniêcie jej do miejsc zakotwiczenia [1, 17, 24, 45]. Niniejsza praca przegl¹dowa ma na celu charakterystykê dynamicznych struktur zbudowanych z aktyny, powstaj¹cych w trakcie migracji przy krawêdzi wiod¹cej komórki oraz szlaków sygna³owych prowadz¹cych do ich powstania. KRAWÊD WIOD CA KOMÓRKI Migracja komórki w kierunku chemoatraktanta wymaga posiadania przez ni¹ przestrzennej asymetrii, której wyrazem jest spolaryzowana morfologia, czyli wyraÿne rozró nienie pomiêdzy obszarami wiod¹cym i tylnym [17]. Obserwacje migruj¹cych komórek pozwoli³y wyodrêbniæ przy ich krawêdziach wiod¹cych dwie strefy lamellipodium i lamellum utworzone przez czêœciowo pokrywaj¹ce siê, ale kinematycznie, kinetycznie, molekularnie oraz funkcjonalnie odrêbne sieci aktynowe. Lamellipodium obejmuje obszar znajduj¹cy siê tu pod b³on¹ komórkow¹, natomiast lamellum zlokalizowane jest pomiêdzy lamellipodium a cia³em komórki [22, 25, 42]. W strefie lamellipodium wyodrêbnia siê rozga³êzion¹ sieæ w³ókien F-aktyny, natomiast lamellum zbudowane jest z d³ugich, nierozga³êzionych filamentów aktynowych [22]. Wiele komórek eksponuje ponadto przy krawêdzi wiod¹cej du ¹ liczbê rozchodz¹cych siê promieniœcie wypustek zbudowanych z wi¹zek filamentów aktynowych, maj¹cych

3 STRUKTURY AKTYNOWE KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI 383 Rycina 1. Model migruj¹cej komórki, uwzglêdniaj¹cy jej kompartmentacjê, wyznaczon¹ przez rodzaj struktury cytoszkieletu aktynowego [8, 22] œrednicê 0,1 0,2 µm i d³ugoœæ do kilku mikrometrów. Terminem mikrowypustki (ang. mikrospikes) okreœla siê te niewykraczaj¹ce poza obszar krawêdzi komórki, natomiast wysuniête poza jej obrêb cienkie, sztywne struktury zbudowane z wi¹zek filamentów nazwane zosta³y filopodiami. Zgodnie z powy sz¹ nomenklatur¹, mikrowypustki s¹ czêœci¹ lamellipodium oraz potencjalnymi prekursorami filopodiów [30] (ryc. 1). LAMELLIPODIA Po zastosowaniu mikroiniekcji oznakowanej fluorescencyjnie G-aktyny do fibroblastów, stwierdzono, e po kilku minutach zostaje ona w³¹czona w sieæ filamentów znajduj¹c¹ siê bezpoœrednio pod b³on¹ komórki, w obszar lamellipodium [24, 29, 45]. Filamenty aktynowe s¹ supramolekularnymi strukturami spolaryzowanymi, maj¹cymi koñce (+) oraz ( ). Monomery aktyny (G-aktyna) do³¹czane s¹ do koñca (+) filamentów w procesie polimeryzacji. Powoduje to ich wyd³u anie, formowanie siê wypustek w strefie wiod¹cej komórki, a w rezultacie jej ukierunkowany ruch [24]. Wykazano, e obszar najwiêkszego natê enia polimeryzacji obejmuje pasmo o szerokoœci ~ 1 µm,

4 384 A. STÊPIEÑ, A. GRZANKA, A. SZPECHCIÑSKI RYCINA 2. Schemat budowy bia³ek (A) WASP/ N-WASP (B) Scar/WAVE [6, 33]: VCA miejsce, do którego przy³¹cza siê monomer aktyny oraz kompleks Arp2/3; PPPP region bogaty w prolinê, zawiera miejsce wi¹zania dla profiliny oraz bia³ek maj¹cych domeny SH3; B odcinek zbudowany z aminokwasów konstytutywnych, poœrednicz¹cy w wi¹zaniu F-aktyny oraz (wy- ³¹cznie bia³ka WASP/N-WASP) PIP 2 ; GBD miejsce wi¹zania Cdc42; WH1 domena charakterystyczna dla WASP/N-WASP; WHD domena charakterystyczna dla Scar/WAVE zlokalizowane wzd³u krawêdzi wiod¹cej komórki, przechodz¹ce w równie w¹skie pasmo depolimeryzacji [25, 42, 44]. Lamellipodia s¹ cienkimi, blaszkowatymi strukturami o gruboœci ~ 200 nm, których szerokoœæ, w zale noœci od typu komórki, waha siê w granicach 1 5 µm (od podstawy do wierzcho³ka) [22, 28]. Klasyczny model opisuj¹cy drogê sygna³ow¹ prowadz¹c¹ do formowania sieci mikrofilamentów lamellipodium oraz wi¹zek filopodium przy krawêdzi wiod¹cej komórki przedstawia siê nastêpuj¹co: Aktywacja wewn¹trzkomórkowych cz¹stek sygna³owych: Rac1 oraz Cdc42, bia³ek nale ¹cych do rodziny GTP-az Rho, stanowi sygna³ do formowania odpowiednio lamellipodiów i filopodiów [10, 37]. Rac1 i Cdc42 wi¹ ¹ siê z bia³kami nale ¹cymi do rodziny WASP [2, 19, 35, 37]. Cdc42 wspólnie z fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanem (PIP 2 ) aktywuje WASP oraz homologiczne: N-WASP, natomiast Rac1 bia³ka zaliczane do Scar/WAVE, wœród których wyodrêbnia siê izomery WAVE1, WAVE2 i WAVE3 [37]. WASP, N-WASP oraz Scar/WAVE, nale ¹ce do rodziny bia³ek WASP, maj¹ wspólne cechy strukturalne oraz wykazuj¹ podobieñstwo pod wzglêdem biochemicznym, umo liwiaj¹ce im poprzez przy³¹czenie monomeru aktyny oraz kompleksu Arp 2/3, formowanie trzyczêœciowej jednostki funkcjonalnej. Powstanie tego trójsk³adnikowego kompleksu jest niezbêdne do aktywacji Arp 2/3 i rozpoczêcia przez niego procesu nukleacji filamentów aktynowych jako odga³êzieñ ju istniej¹cych w³ókien F-aktyny [33]. Zrozumienie tak odmiennych mechanizmów regulacji dwóch g³ównych grup bia³ek nale ¹cych do rodziny WASP: WASP/N-WASP oraz Scar/WAVE [37] wymaga zapoznania siê z budow¹ ich cz¹steczek (ryc. 2), a co siê z tym wi¹ e z szeregiem homologii i rozbie noœci. Zarówno WASP/N-WASP, jak i Scar/WAVE maj¹ na koñcu karboksylowym domenê katalityczn¹ VCA, do której przy³¹czaj¹ siê G-aktyna oraz kompleks Arp2/3, inicjuj¹c tym samym formowanie nowych filamentów aktynowych (proces polimeryzacji). Kolejn¹ cech¹ wspóln¹ dla wszystkich bia³ek rodziny WASP jest wystêpowanie s¹siaduj¹cego z domen¹ VCA regionu bogatego w prolinê, zawieraj¹cego miejsca wi¹zania dla profiliny oraz mog¹cego wchodziæ w interakcjê z bia³kami maj¹cymi domeny SH3. Wspólne jest ponadto wystêpowanie fragmentu z³o onego z aminokwasów konstytutywnych, który poœredniczy w wi¹zaniu trójsk³adnikowego kompleksu z³o onego z cz¹steczki bia³ka rodziny WASP, G-aktyny oraz Arp2/3 do filamentu aktyny. W przypadku bia³ek WASP/N-WASP do tego odcinka przy³¹czany jest tak e PIP 2 [33].

5 STRUKTURY AKTYNOWE KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI 385 W przeciwieñstwie do znacz¹cej homologii odcinka karboksylowego bia³ek rodziny WASP, strukturê koñca aminowego cechuje znaczne zró nicowanie. Region N-terminalny cz¹steczek WASP oraz N-WASP zawiera motyw GBD wi¹ ¹cy Cdc42 [39], okreœlany równie jako domena GBD/CRIB [37], oraz domenê WASP1 (WH1), nosz¹ca tak e nazwy: domena Ena-VASP1 (EVH1) [6], domena plekstrynowa (PH) [35]. Bia³ka Scar/WAVE natomiast maj¹ na koñcu aminowym odrêbny, wysoce specyficzny motyw domenê WAVE (WHD), okreœlan¹ równie jako SCAR (SHD). Brak domen GBD oraz WH1 w cz¹steczkach Scar/WAVE [6]. Aktywacja WASP/N-WASP Oddzia³ywanie pomiêdzy domenami VCA oraz GBD bia³ek WASP i N-WASP prowadzi do zamaskowania regionu VCA, czego nastêpstwem jest inaktywacja danych bia³ek (proces autoinhibicji). Zwi¹zanie siê Cdc42 z domen¹ GBD oraz przy³¹czenie PIP 2 do s¹siaduj¹cego regionu, zbudowanego z aminokwasów konstytutywnych, powoduje zmiany konformacyjne cz¹steczek ods³oniêcie domeny katalitycznej VCA, a w konsekwencji aktywacjê bia³ek, umo liwiaj¹c¹ formowanie kompleksu: WASP monomer aktyny kompleks Arp 2/3 [33, 37] (ryc. 3). RYCINA 3. Model aktywacji bia³ek WASP (N-WASP) [6]. Autoinhibicja bia³ek zachodzi w wyniku zablokowania domeny VCA przez motyw GBD. Zwi¹zanie siê Cdc42 oraz PIP 2 z odpowiednio: domenami GBD i B powoduje zmiany konformacyjne cz¹steczek bia³ek, prowadz¹c do uwolnienia koñca karboksylowego i tym samym aktywacji WASP/N-WASP Aktywacja Scar/WAVE Brak domeny GBD w cz¹steczkach bia³ek nale ¹cych do Scar/WAVE uniemo liwia bezpoœrednie przy³¹czenie Rac1 [9, 37, 39]. Dowiedziono, e bia³ko WAVE1, które zlokalizowane jest bli ej j¹dra [34] i odpowiedzialne najprawdopodobniej za stabilizacjê lamellipodiów poprzez udzia³ w formowaniu struktur adhezyjnych [46], w formie nieaktywnej, w warunkach in vitro tworzy kompleks z bia³kami: PIR 121, Nap1, Abi2 oraz HSPC300 [5, 9]. Dysocjacjê kompleksu inicjuj¹ bia³ka Nck b¹dÿ Rac1, wi¹ ¹ce siê z PIR121 i tym samym powoduj¹ce uwolnienie aktywnego WAVE1, które pozostaje zwi¹zane z HSPC300 [5, 9]. Wyniki innych badañ [15] wskazuj¹, e bia³ko WAVE2, zlokalizowane przy krawêdzi wiod¹cej komórki [34] ulega aktywacji w wyniku przy³¹czenia Rac i utworzenia kompleksu WAVE2-Abi1-Nap1-PIR121. Badacze twierdz¹, e powsta³y kompleks nie ulega dysocjacji po przy³¹czeniu Rac, co pozostaje w

6 386 A. STÊPIEÑ, A. GRZANKA, A. SZPECHCIÑSKI RYCINA 4. Modele aktywacji bia³ek Scar/WAVE: A Nieaktywne bia³ko Scar/WAVE tworzy kompleks z bia³kami PIR121, Nap1, Abi oraz HSPC300. Przy³¹czenie Rac do PIR121 powoduje dysocjacjê kompleksu i tym samym aktywacjê Scar/WAVE, które pozostaje zwi¹zane z HSPC300 [9]. B Zwi¹zanie Rac z PIR121 aktywuje Scar/WAVE. Powsta³y kompleks nie ulega dysocjacji [15] opozycji do przedstawionych powy ej wyników badañ [9] (ryc. 4). Zosta³a dowiedziona tak e mo liwoœæ aktywacji WAVE2 przez bia³ko Rac za poœrednictwem bia³ka IRSp53 [20]. Wnioskuje siê, e WAVE 3 tworzy tego samego rodzaju kompleksy bia³kowe jak izoformy WAVE1 i WAVE2, a zidentyfikowane rozbie noœci maj¹ miejsce na poziomie tkankowym i wynikaj¹ z ró nic w powinowactwie do okreœlonych i niezidentyfikowanych jeszcze bia³ek wi¹ ¹cych [32]. Dendrytyczny model nukleacji filamentów aktynowych (ang. the dendritic nucleation model) opisuje proces formowania rozga³êzionej sieci filamentów lamellipodium w strefie wiod¹cej komórki [7, 22, 23, 24, 31, 35] nastêpuj¹co: Aktywne bia³ka WASP przy³¹czaj¹ monomer aktyny oraz kompleks Arp2/3, co aktywuje Arp 2/3 i stanowi warunek rozpoczêcia przez kompleks procesu nukleacji de novo filamentów aktynowych jako odga³êzieñ wczeœniej istniej¹cych filamentów. W konsekwencji, powstaj¹ rozwidlenia (ang. Y-junctions) pod charakterystycznym dla opisywanych struktur k¹tem ~ 70. Do koñców (+) powsta³ej w ten sposób, rozga³êzionej sieci mikrofilamentów s¹ dodawane nastêpnie monomery aktyny zwi¹zane z ATP (w wiêkszoœci transportowane w kompleksie z profilin¹). Proces elongacji w³ókien F-aktyny kontrolowany jest jednoczeœnie przez bia³ka czapeczkuj¹ce (CP), które wi¹ ¹c koñce (+) filamentów hamuj¹ dalsze ich wyd³u anie. Podczas polimeryzacji lub w krótkim czasie

7 STRUKTURY AKTYNOWE KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI 387 po jej zajœciu, nukleotyd ulega hydrolizie do ADP i Pi. Od³¹czenie fosforanu zmniejsza powinowactwo kompleksu Arp2/3 do F-aktyny ~ 20-krotnie, powoduj¹c dysocjacjê i rozpad filamentów aktynowych. Proces ten wzmacniany jest przez niektóre bia³ka, m.in kofilinê, która przy³¹czaj¹c siê do ADP-aktyny powoduje ciêcie i depolimeryzacjê jej koñca ( ). Monomery aktyny zwi¹zane z kofilin¹, uwolnione w wyniku dysocjacji ³¹cz¹ siê nastêpnie z profilin¹, rywalizuj¹c¹ z kofilin¹ o mo liwoœæ zwi¹zania z G-aktyn¹. Profilina intensyfikuje ponadto wymianê ADP zwi¹zanego z aktyn¹ na obecny w cytoplazmie ATP. Powsta³a w ten sposób pula monomerów aktyny zwi¹zanych z profilin¹ mo e byæ wykorzystana do elongacji rosn¹cego koñca (+) (ryc. 5). RYCINA 5. Dendrytyczny model nukleacji filamentów aktynowych [23, 24]: 1 monomery ATPaktyny transportowane w kompleksie z profilin¹, 2 przy³¹czenie cz¹stek G-aktyny do rosn¹cego koñca (+) filamentu w procesie polimeryzacji, 3 aktywny kompleks Arp2/3 formuj¹cy odga³êzienia filamentów aktynowych, 4 wyd³u anie w³ókien F-aktyny, 5 przy³¹czenie siê bia³ek CP do koñców (+) filamentów zablokowanie polimeryzacji, 6 hydroliza zwi¹zanego z monomerem aktyny ATP do ADP i Pi, 7 przy³¹czenie kofiliny do ADP-aktyny, ciêcie i depolimeryzacja koñca ( ) filamentu, 8 kataliza wymiany ADP na ATP zachodz¹ca przy udziale profiliny

8 388 A. STÊPIEÑ, A. GRZANKA, A. SZPECHCIÑSKI FILOPODIA RYCINA 6. Modele regulacji powstawania lamellipodiów i filopodiów. A Niezale ne szlaki sygna³owe: aktywacja bia³ek Scar/WAVEs poprzez przy³¹czenie Rac prowadzi do formowania lamellipodiów; zwi¹zanie Cdc42 z bia³kami WASPs inicjuje tworzenie filopodiów [10, 37]. B Szlak kaskadowy: aktywacja bia³ek Scar/ WAVEs oraz WASPs przez odpowiednio: Rac i Cdc42, prowadzi do formowania lamellipodiów, które po zadzia³aniu dodatkowych sygna³ów s¹ transformowane w filopodia [4] Filopodia obecne s¹ przy krawêdzi wiod¹cej pewnych typów komórek. Sto ki wzrostu komórek nerwowych oraz wiêkszoœæ fibroblastów wykszta³ca te struktury, natomiast nie stwierdzono ich wystêpowania w keratynocytach ryb i neutrofilach ssaków [22]. Filopodia, w przeciwieñstwie do rozga³êzionej sieci filamentów aktynowych lamellipodium, zbudowane s¹ z d³ugich, dorastaj¹cych w pewnych typach komórek do 50 µm [12] wi¹zek F-aktyny [7, 17, 35, 36]. Liczba filamentów aktynowych buduj¹cych filopodium oraz towarzysz¹cych im bia³ek sieciuj¹cych (ang. cross linking proteins) determinuje elastycznoœæ wypustki [41]. Twierdzi siê, e podstawa filopodium, zakotwiczona jest w sieci w³ókien F-aktyny w obszarze lamellipodium [36, 40]. Mechanizm reguluj¹cy powstawanie tych struktur jest obecnie przedmiotem dyskusji. Czêœæ grup badawczych [4, 36, 43] podwa a s³usznoœæ paradygmatu, który zak³ada wystêpowanie dwóch równoleg³ych i niezale - nych szlaków sygna³owych, prowadz¹cych od WASP do lamellipodiów oraz od Scar/WAVE do filopodiów [37] (ryc. 6a). Biyasheva i wspó³pracownicy [4] wysunêli hipotezê, która zosta³a nazwana szlakiem kaskadowym (ang. the cascade pathway model) (ryc. 6b). Wed³ug niej, aktywacja bia³ek WASP oraz Scar/WAVE prowadzi do formowania lamellipodium stanowi¹cego jednoczeœnie fundament, w obrêbie którego, przy udziale dodatkowych sygna³ów, zachodzi reorganizacja cytoszkieletu i formowanie filopodiów. Równolegle, ta sama grupa badawcza zaproponowa³a bêd¹cy dope³nieniem poprzedniego model, okreœlany jako konwergentne wyd³u anie siê (ang. convergent elongation) [36, 43]. Zak³ada on mianowicie, e bia³ka kompleksu Arp2/3 bior¹ udzia³ w powstawaniu rozga³êzionej sieci filamentów aktynowych, która poprzez formowanie struktur poœrednich, podlega nastêpnie reor-

9 STRUKTURY AKTYNOWE KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI 389 ganizacji w równoleg³e wi¹zki F-aktyny. Wyniki wczeœniej przepro-wadzonych badañ [3] dowodz¹, e bia³ka Ena/VASP oraz bia³ka czapeczkuj¹ce rywalizuj¹ o wi¹zanie z koñcem (+) nowo powsta³ych, przy udziale Arp 2/3, filamentów aktynowych, a funkcj¹ Ena/VASP jest podtrzymanie dalszego ich wyd³u ania. Autorzy omawianego modelu twierdz¹, e dziêki niewyjaœnionemu do tej pory mechanizmowi, prekursory filopodiów zwi¹zane w regionie rosn¹cym (+) filamentu z grup¹ bia³ek, najprawdopodobniej z Ena/VASP, trac¹ zdolnoœæ tworzenia rozga³êzieñ i formuj¹ równoleg³e wi¹zki, stabilizowane przez bia³ko sieciuj¹ce fascynê. Badacze sugeruj¹, e rekrutacja i/lub aktywacja fascyny w czêœci szczytowej prekursorów powoduje sieciowanie zlokalizowanych tam filamentów i tym samym formowanie u³o onych równolegle wi¹zek F-aktyny. Przeprowadzenie kolejnych doœwiadczeñ, umo liwi³o dalsz¹ analizê opisywanego procesu oraz udoskonalenie wczeœniejszych za³o eñ. Stwierdzono [18], e decyzja o formowaniu wi¹zek filamentów filopodiów b¹dÿ kontynuowaniu tworzenia rozga³êzionej sieci F-aktyny lamellipodium zale na jest od aktywnoœci bia³ek czapeczkuj¹cych (CP). Autorzy sugeruj¹, e CP funkcjonuje w cytoszkielecie jako negatywny regulator filopodiów oraz pozytywny lamellipodiów. Mechanizm regulacji CP nie zosta³ do koñca wyjaœniony. Zidentyfikowano dotychczas dwa bia³ka oddzia³uj¹ce z CP: V-1, formuj¹cy stabilny kompleks z CP i tym samym hamuj¹cy jego wi¹zanie z F-aktyn¹ [38] oraz CARMIL, wyizolowany z Dictyostelium i Acanthamoeba [16, 27], którego wp³yw na CP pozostaje przedmiotem badañ. W procesie regulacji wyd³u ania koñców (+) filamentów podkreœla siê tak e udzia³ bia³ek dzia³aj¹cych antagonistycznie w stosunku do CP, którymi s¹ wspomniane wczeœniej Ena/VASP [3] oraz zidentyfikowane niedawno forminy. W warunkach in vitro, forminy wi¹ ¹ siê z koñcem (+) filametnów aktynowych [11, 26] zabezpieczaj¹c je przed czapeczkowaniem przez CP i tym samym umo liwiaj¹c dalsz¹ elongacjê polimerów aktyny [11, 14, 21, 26, 47]. LAMELLA Badania przeprowadzone z zastosowaniem qfsm dowiod³y, e wiêkszoœæ (80 95%) filamentów aktynowych, powsta³ych w procesie polimeryzacji w obszarze lamellipodium, ulega depolimeryzacji w odleg³oœci 1 3 µm od krawêdzi komórki, w strefie przejœciowej pomiêdzy lamellipodium a lamellum [25, 42, 44]. Lamellum zbudowane jest z d³ugich i nierozga³êzionych w³ókien F-aktyny, obejmuj¹cych obszar mieszcz¹cy siê w granicach 3 15 µm (licz¹c od krawêdzi komórki) [25], przestrzeñ pomiêdzy lamellipodium a cia³em komórki [22]. Przypuszcza siê, e filamenty aktynowe lamellum nie s¹ formowane poprzez reorganizacjê sieci filamentów lamellipodium, ale powstaj¹ w wyniku niezale nej asocjacji [25, 42]. Charakterystyczne dla rozga³êzionej sieci filamentów lamellipodium bia³ka kompleksu Arp2/3 oraz ADF/kofilina [23] nie s¹ aktywne w obszarze lamellum. Zidentyfikowano tam natomiast miozynê II oraz tropomiozynê [8, 24]. Opisywane struktury ró ni ponadto natê enie procesów polimeryzacji i depolimeryzacji filamentów aktynowych, które w obszarze lamellipodium jest wy sze ~ 10- krotnie w stosunku do lamellum [25, 42], a cykl zachodzi w sposób ci¹g³y [25, 44].

10 390 A. STÊPIEÑ, A. GRZANKA, A. SZPECHCIÑSKI Lamellum cechuje wolniejsze tempo reorganizacji cytoszkieletu, a procesy polimeryzacji i depolimeryzacji wystêpuj¹ punktowo [25, 42]. Po³¹czenia pomiêdzy filamentami lamellum i lamellipodium cechuje wystêpowanie struktur adhezyjnych, utworzonych przez transmembranowe kompleksy integryn oraz bia³ek wi¹ ¹cych aktynê (ABPs), odpowiadaj¹cych za prze³o enie aktomiozynowego skurczu powsta³ego w lamellum na si³ê ci¹gn¹c¹ komórkê po powierzchni macierzy pozakomórkowej (zewn¹trzkomórkowego matriks) [25]. Wyniki najnowszych badañ [13, 25] wskazuj¹, e miêdzy innymi lamella, a nie lamellipodia powoduj¹ce bez³adne wypychanie i cofanie krawêdzi wiod¹cej komórki [25], odpowiadaj¹ za jej efektywe i trwa³e wysuniêcie. Sugeruje siê [13], e funkcj¹ lamellipodium jest analiza œrodowiska oraz zapewnienie natychmiastowej odpowiedzi na ró norodne bodÿce kierunkowe, natomiast lamellum odpowiedzialne jest za efektywny ruch komórki w pierwszym etapie migracji. PODSUMOWANIE Pierwszy etap migracji komórki polega na wysuniêciu jej krawêdzi wiod¹cej. Proces ten zwi¹zany jest z dynamiczn¹ reorganizacj¹ cytoszkieletu aktynowego i formowaniem takich struktur cytoszkieletu, jak: lamellipodia, filopodia czy zidentyfikowane niedawno lamella. Drogi sygna³owe, prowadz¹ce do powstania powy szych struktur s¹ wci¹ przedmiotem dyskusji. Czêœæ grup badawczych odrzuca za³o enie mówi¹ce o wystêpowaniu niezale nych szlaków sygna³owych, prowadz¹cych od N-WASP do lamellipodiów oraz od Scar/WAVE do filopodiów. Sugeruje siê natomiast formowanie filopodiów poprzez reorganizacjê sieci filamentów lamellipodium, w której decyduj¹c¹ rolê pe³ni¹ bia³ka CP oraz Ena/VASP. Interesuj¹cych wyników dostarczy³y badania prowadzone przez Ponti [25] i Vallotton [42] wskazuj¹ce na fakt wystêpowania przy krawêdzi wiod¹cej komórek d³ugich, nierozga³êzionych w³ókien F-aktyny, ró ni¹cych siê istotnie od rozga³êzionej sieci filamentów lamellipodium. Wyniki ostatnich eksperymentów [13], w których zahamowano tworzenie siê lamellipodiów, pozwalaj¹ przypuszczaæ, e s¹ one zbêdne w procesie generacji ruchu komórki. Sugeruje siê, e za trwa³e wysuniêcie krawêdzi wiod¹cej komórki w pierwszym etapie jej ruchu odpowiedzialne jest lamellum. Uzyskane w wyniku powy szych doœwiadczeñ informacje nasuwaj¹ wiele pytañ. Czy filopodia powstaj¹ w wyniku reorganizacji filamentów lamellipodium czy lamellum? Jaki jest mechanizm powstawania filamentów lamellum? Co determinuje szerokoœæ lamellipodium? OdpowiedŸ na te i wiele innych pytañ dostarcz¹ kolejne badania w tym zakresie. LITERATURA [1] BAILLY M, CONDEELIS J. Cell motility: insights form the backstage. Nat Cell Biol 2002; 4: E [2] BEAR JE, KRAUSE M, GERTLER FB. Regulating cellular actin assembly. Curr Opin Cell Biol 2001; 13: [3] BEAR JE, SVITKINA TM, KRAUSE M, SCHAFER DA, LOUREIRO JJ, STRASSER GA, MALY IV, CHAGA OY, COOPER JA, BORISY GG, GERTLER FB. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell 2002; 109:

11 STRUKTURY AKTYNOWE KRAWÊDZI WIOD CEJ KOMÓRKI 391 [4] BIYASHEVA A, SVITKINA T, KUNDA P, BAUM B, BORISY G. Cascade pathway of filopodia formation downstream of SCAR. J Cell Sci 2004; 117: [5] BLAGG SL, INSALL RH. Solving the WAVE function. Nat Cell Biol 2004; 6: [6] BOMPARD G, CARON E. Regulation of WASP/WAVE proteins: making a long story short. J Cell Biol 2004, 166: [7] BORISY GG, SVITKINA TM. Actin machinery: pushing the envelope. Curr Opin Cell Biol 2000; 12: [8] DesMARAIS V, ICHETOVKIN I, CONDEELIS J, HITCHCOCK-DeGREGORI SE. Spatial regulation of actin dynamics: a tropomyosin-free, actin-rich compartment at the leading edge. J Cell Sci 2002; 115: [9] EDEN S, ROHATGI R, PODTELEJNIKOV AV, MANN M, KIRSCHNER MW. Mechanism of regulation of WAVE1-induced actin nucleation by Rac1 and Nck. Nature 2002; 418: [10] ETIENNE-MANNEVILLE S, HALL A. Rho GTPases in cell biology. Nature 2002; 420: [11] EVANGELISTA M, ZIGMOND S, BOONE C. Formins: signaling effectors for assembly and polarization of actin filaments. J Cell Sci 2003; 116: [12] FRIEDL P, WOLF K. Tumor-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev Cancer 2003; 3: [13] GUPTON SL, ANDERSON KL, KOLE TP, FISCHER RS, PONTI A, HITCHCOCK-DeGREGORI SE, DANUSER G, FOWLER VM, WIRTZ D, HANEIN D, WATERMAN-STORER CM. Cell migration without a lamellipodium: translation of actin dynamics into cell movement mediated by tropomyosin. J Cell Biol 2005; 168: [14] HARRIS ES, LI F, HIGGS HN. The mouse forming, FRLalpha, slows actin filament barbed end elongation, competes with capping protein, accelerates polymerization from monomers, and severs filaments. J Biol Chem 2004; 279: [15] INNOCENTI M, ZUCCONI A, DISANZA A, FRITTOLI E, ARECES LB, STEFFEN A, STRADAL TE, DI FIORE PP, CARLIER MF, SCITA G. Abi1 is essential for the formation and activation of WAVE2 signalling complex. Nat Cell Biol 2004; 6: [16] JUNG G, REMMERT K, WU X, VOLOSKY JM, HAMMER JA. 3RD The Dictyostelium CARMIL protein links capping proteins and Arp 2/3 complex to type I myosins through their SH3 domains. J Cell Biol 2001; 153: [17] LAUFFENBURGER DA, HORWITZ AF. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell 1996; 84: [18] MEJILLANO MR, KOJIMA S, APPLEWHITE DA, GERTLER FB, SVITKINA TM, BORISY GG. Lamellipodial versus filopodial mode of the actin nanomachinery: pivotal role of the filament barbed end. Cell 2004; 118: [19] MIKI H, TAKENAWA T. Regulation of actin dynamics by WASP family proteins. J Biochem 2003; 134: [20] MIKI H, YAMAGUCHI H, SUETSUGU S, TAKENAWA T. IRSp53 is an essential intermediate between Rac and WAVE in the regulation of membrane ruffling. Nature 2000; 408: [21] MOSELEY JB, SAGOT I, MANNING AL, XU Y, ECK MJ, PELLMAN D, GOODE BL. A conserved mechanism for Bni1- and mdia1-induced actin assembly and dual regulation of Bni1 by Bud6 and profilin. Mol Biol Cell 2004; 15: [22] NICHOLSON-DYKSTRA S, HIGGS HN, HARRIS ES. Actin dynamics: growth from dendritic branches. Curr Biol 2005; 15: R346 R357. [23] POLLARD TD, BLANCHOIN L, MULLINS RD. Actin dynamics. J Cell Sci 2001; 114: 3 4. [24] POLLARD TD, BORISY GG. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell 2003; 112: [25] PONTI A, MACHACEK M, GUPTON SL, WATERMAN-STORER CM, DANUSER G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science 2004; 305: [26] PRUYNE D, EVANGELISTA M, CHANGSONG Y, BI E, ZIGMOND S, BRETSCHER A, BOONE C. Role of formins in actin assembly: nucleation and barbed-end association. Science 2002; 297: [27] REMMERT K, OLSZEWSKI TE, BOWERS MB, DIMITROVA M, GINSBURG A, HAMMER JA. 3RD CARMIL is a bona fide capping protein interactant. J Biol Chem 2004; 279: [28] SMALL JV, RESCH GP. The comings and goings of actin: coupling protrusion and retraction in cell motility. Curr Opin Cell Biol 2005; 17: [29] SMALL JV, ROTTNER K, KAVERINA I, ANDERSON KI. Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. Biochim Biophys Acta 1998; 1404:

12 392 A. STÊPIEÑ, A. GRZANKA, A. SZPECHCIÑSKI [30] SMALL JV, STRADAL T, VIGNAL E, ROTTNER K. The lamellipodium: where motility begins. Trends Cell Biol 2002; 12: [31] STÊPIEÑ A, GRZANKA A, OSTROWSKI M. Bia³ka kompleksu ADF/kofilina: regulacja dynamiki filamentów aktynowych. Kosmos 2005; 54: [32] STOVOLD CF, MILLARD TH, MACHESKY LM. Inclusion of Scar/WAVE3 in a similar complex to Scar/ WAVE1 and 2. BCM. Cell Biol 2005; 6: 11. [33] STRADAL TE, ROTTNER K, DISANZA A, CONFALONIERI S, INNOCENTI M, SCITA G. Regulation of actin dynamics by WASP and WAVE family proteins. Trends Cell Biol 2004; 14: [34] SUETSUGU S, YAMAZAKI D, KURISU S, TAKENAWA T. Differential roles of WAVE1 and WAVE2 in dorsal and peripheral ruffle formation for fibroblast cell migration. Dev Cell 2003; 5: [35] SVITKINA TM, BORISY GG. Progress in protrusion: the tell-tale scar. Trends Biochem Sci 1999; 24: [36] SVITKINA TM, BULANOVA EA, CHAGA OY, VIGNJEVIC DM, KOJIMA S, VASILIEV JM, BORISY GG. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol 2003; 160: [37] TAKENAWA T, MIKI H. WASP and WAVE family proteins: key molecules for rapid rearrangement of cortical actin filaments and cell movement. J Cell Sci 2001; 114: [38] TAOKA M, ICHIMURA T, WAKAMIYA-TSURUTA A, KUBOTA Y, ARAKI T, OBINATA T, ISOBE T. V-1, a protein expressed transiently during murine cerebellar development, regulates actin polymerization via interaction with capping protein. J Biol Chem 2003; 278: [39] THRASHER AJ. WASp in immune-system organization and function. Nat Rev Immunol 2002; 2: [40] TSENG Y, AN KM, ESUE O, WIRTZ D. The bimodal role of filamin in controlling the architecture and mechanics of F-actin networks. J Biol Chem 2004; 279: [41] TSENG Y, FEDOROV E, McCAFFERY JM, ALMO SC, WIRTZ D. Micromechanics and ultrastructure of actin filament networks crosslinked by human fascin: a comparison with α-actinin. J Mol Biol 2001; 310: [42] VALLOTTON P, GUPTON SL, WATERMAN-STORER CM, DANUSER G. Simultaneous mapping of filamentous actin flow and turnover in migrating cells by quantitative fluorescent speckle microscopy. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: [43] VIGNJEVIC D, YARAR D, WELCH MD, PELOQUIN J, SVITKINA T, BORISY GG. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. J Cell Biol 2003; 160: [44] WATANABE N, MITCHISON TJ. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science 2002; 295: [45] WEBB DJ, PARSONS JT, HORWITZ AF. Adhesion assembly, disassembly and turnover in migrating cells over and over again. Nat Cell Biol 2002; 4: E [46] YAMAZAKI D, FUJIWARA T, SUETSUGU S, TAKENAWA T. A novel function of WAVE in lamellipodia: WAVE1 is required for stabilization of lamellipodial protrusions during cell spreading. Genes Cells 2005; 10: [47] ZIGMOND SH, EVANGELISTA M, BOONE C, YANG C, DAR AC, SICHERI F, FORKEY J, PRING M. Formin leaky cap allowing elongation in the presence of tight capping proteins. Curr Biol 2003; 13: Otrzymano: r. Przyjêto: r. ul. Kar³owicza 24, Bydgoszcz a_stepien@cm.umk.pl Redaktor prowadz¹cy Janusz Kubrakiewicz