Transkrypt

1 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM NR 4 ( ) WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 847 UDZIA WTÓRNYCH PRZEKA NIKÓW INFORMACJI W ODPOWIEDZI ROŒLIN NA ABIOTYCZNE CZYNNIKI STRESOWE PARTICIPATION OF SECOND MESSENGERS IN PLANT RESPONSES TO ABIOTIC STRESS Krzysztof JAWORSKI, Weronika GRZEGORZEWSKA, Brygida ŒWIE AWSKA, Adriana SZMIDT-JAWORSKA Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Wydzia³ Biologii i Nauk o Ziemi, Zak³ad Fizjologii i Biologii Molekularnej Roœlin, Toruñ Streszczenie: Wiadomo, e stresy wynikaj¹ce z niekorzystnych warunków œrodowiskowych mog¹ mieæ niszcz¹cy wp³yw na roœliny, rzutuj¹c tym samym na plonowanie. Oprócz stresu biotycznego wywo³anego przyk³adowo atakiem patogena, istnieje ca³a gama abiotycznych czynników stresowych, takich jak: ekstremalne temperatury, susza, zasolenie, metale ciê kie, promieniowanie i uszkodzenia mechaniczne, które wywieraj¹ szkodliwy wp³yw na wzrost i rozwój roœlin. Niektóre gatunki wytworzy³y szereg mechanizmów obronnych i adaptacyjnych do takich warunków. Transdukcja sygna³ów i póÿniejsze odpowiedzi s¹ procesami z³o onymi, na które sk³ada siê wiele nastêpuj¹cych po sobie reakcji. Od kilku lat te kaskady sygnalizacyjne i pojawiaj¹ce siê zmiany metaboliczne s¹ w centrum uwagi biologów. Zrozumienie podstaw procesów prowadz¹cych do tolerancji wp³ynie na strategiê uprawy, co bêdzie zapewnia³o lepszy wzrost i zwiêkszenie plonowania w niekorzystnych warunkach. Jednak e im wiêcej uzyskujemy informacji dotycz¹cych transdukcji sygna³ów w odpowiedzi na zmiany w œrodowisku, tym bardziej oczywiste jest, e mamy do czynienia z sieci¹ zale noœci, które podlegaj¹ wielopoziomowej regulacji. Wra liwoœæ roœlin na zmiany zachodz¹ce w œrodowisku wymaga istnienia receptorów, które poprzez aktywacjê kolejnych elementów prowadz¹ do reorganizacji cytoszkieletu, transportu przez b³ony czy aktywacji genów w odpowiedzi na stres. Prowadzone od lat badania wykaza³y, e wtórne przekaÿniki, takie jak: jony wapnia, cykliczne nukleotydy, polifosfoinozytole, s¹ zaanga owane w generowanie odpowiedzi na czynniki abiotyczne. W nastêpstwie pojawienia siê stresora dochodzi do gwa³townych, krótko- lub d³ugotrwa³ych zmian ich stê enia. Pojawiaj¹ siê prace wskazuj¹ce, e tak e bia³ka efektorowe, takie jak: kinazy zale ne od wapnia, kalmodulina, bia³ka kalmodulinopodobne, bia³ka SOS, kana³y kationowe bramkowane cyklicznymi nukleotydami oraz kana³y wapniowe, których aktywacja jest zale na od zmian stê enia fosfoinozytoli, s¹ zaanga owane w procesy adaptacji roœlin do warunków œrodowiska. Badania z zastosowaniem specyficznych mutantów, wprowadzenie transgenów odwracaj¹- *Praca powsta³a podczas realizacji projektu badawczego nr N N finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wy szego.

2 848 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA cych efekt usuniêcia genu, blokowanie genów antysensownym mrna lub mutacje punktowe dostarczy- ³y cennych wyników pozwalaj¹cych na g³êbsze poznanie mechanizmu odpowiedzi roœlin na stres. Niniejsza praca jest przegl¹dem najwa niejszych danych eksperymentalnych wskazuj¹cych na udzia³ wtórnych przekaÿników oraz ich efektorów w procesach nabywania przez roœliny tolerancji na abiotyczne czynniki stresowe. S³owa kluczowe: Ca 2+, cykliczne nukleotydy, fosfoinozytole, stres abiotyczny. Summary: It is known that environmental stresses can have devastating effects on plants and represent the most limiting factors for productivity. Apart from biotic stress caused by plant pathogens, there are a number of abiotic stresses such as extremes in temperature, drought, salinity, heavy metals, radiation and mechanical wounding which have detrimental effects on plant growth and development. Certain plant species have developed various mechanisms to defence or adapt to such stress conditions. Mechanisms of signal perception and subsequent responses to stress are complex and consist of cascades of multiple reactions. For a couple of years these signaling cascades and metabolic responses are of great interest to plant biologists. A better understanding of plant stress responses can lead to improved plant breeding strategies resulting in better plant growth and increased crop yields under disadvantageous conditions. However, as we learn more about the signaling pathways leading to these responses, it is becoming clear that they constitute a network that is interconnected at many levels. Stress signal is first perceived by the receptors, then transduced downstream resulting in the activation of various stress responsive genes, transport across membrane and cytoskeleton reorganization. During the last couple of decades a number of second messengers such as calcium ions, cyclic nucleotides, polyphosphoinositides, that are altered in response to abiotic stressors, have been identified. They act on downstream effectors (decoding elements) that ultimately initiate a multitude of cellular responses. Primary targets of second messengers are calcium-dependent protein kinase, calmodulin, calmodulin-like proteins, SOS proteins in case of Ca 2+, cyclic nucleotide gated cation channels for cnmp and calcium channels and various enzymes for phosphoinositides. The knowledge concerning the role of above proteins in stress is far from comprehensive. The usage of mutants, introduction of transgenes that reverse the effect of gene knock-out, blocking of genes by antisens mrna or point mutations aim in better understanding the mechanisms of adaptation to stress. In this review, we summarize recent progress in abiotic stress studies concerning the participation of second messengers and their effectors in plant adaptation to various abiotic stress factors. Key words: Ca 2+, cyclic nucleotides, phosphoinositides, abiotic stress. WSTÊP Ka dy organizm realizuje w pe³ni swój program genetyczny w odpowiednich warunkach œrodowiskowych, co umo liwia jego prawid³owy wzrost i rozwój. Wiadomo jednak, e roœliny yj¹ce w warunkach naturalnych s¹ ci¹gle nara one na dzia³anie ró norodnych czynników stresowych o charakterze biotycznym, jak i abiotycznym, typu chemicznego lub fizycznego. Przyczyniaj¹ siê one do eliminacji ca³ych populacji roœlin, pewnych odmian i gatunków z danych obszarów. Jedynie od indywidualnej odpornoœci danej roœliny zale ny jest jej dalszy rozwój, wydanie potomstwa oraz plonowanie [23]. Od szeregu lat trwaj¹ badania, których nadrzêdnym celem jest poznanie mechanizmów obronnych roœlin przed skutkami dzia³ania niekorzystnych czynników œrodowiska. Analizy te maj¹ nie tylko charakter poznawczy, lecz tak e znaczenie praktyczne, poniewa poznanie zjawisk le ¹cych u podstaw odpornoœci roœlin pozwoli na otrzymywanie odmian uprawnych o du ej tolerancji na ró nego typu stresy.

3 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 849 Mianem stresu okreœla siê zarówno czynnik stresowy dzia³aj¹cy na organizm, jak równie stan, jaki nastêpuje po zadzia³aniu danego czynnika. Dla odró nienia tych dwóch zjawisk, okreœlanych wspólnym terminem stresu wyró niamy stresor czynnik stresowy dzia³aj¹cy na organizm oraz reakcjê stresow¹ lub stan stresowy, które obejmuj¹ szereg procesów prowadz¹cych do uzyskania odpowiedzi. Za stresor mo na wiêc uwa aæ ka dy czynnik œrodowiska, który ogranicza procesy yciowe poni ej potencjalnych, zdeterminowanych genetycznie mo liwoœci. Na warunki œrodowiska sk³adaj¹ siê ró ne czynniki (tab. 1), które przekraczaj¹c pewn¹ wartoœæ progow¹, prowadz¹ u roœlin do zaburzeñ o charakterze funkcjonalnym i strukturalnym, co oznacza, e staj¹ siê stresorami. Istotne jest, z jak¹ intensywnoœci¹ i jak d³ugo czynnik stresowy dzia³a na roœlinê. Krótka ekspozycja wywo³uje zaburzenia odwracalne, zaœ przed³u aj¹ce siê dzia³anie stresora prowadzi do zaburzeñ nieodwracalnych, a w skrajnoœci do œmierci komórek. Mo e równie przyczyniaæ siê do zwiêkszenia podatnoœci roœliny na patogeny. Roœliny dysponuj¹ strategiami wykorzystuj¹cymi wiele konstytutywnych lub indukowanych, anatomicznych, molekularnych i biochemicznych mechanizmów pozwalaj¹cych na odbiór informacji, uruchomienie reakcji obronnych i/lub wytworzenie tolerancji na dany bodziec. Skuteczna odpowiedÿ jest uzale niona od percepcji sygna³u i jego transdukcji wewn¹trz komórki i/lub miêdzy komórkami roœliny. Konsekwencj¹ uruchomienia kaskady reakcji jest otwarcie kana³ów oraz aktywacja czynników transkrypcyjnych i indukcja ekspresji wielu genów zwi¹zanych ze stresem. Roœliny osi¹gnê³y wielki sukces w dostosowaniu siê do niesprzyjaj¹cych warunków. Wykszta³ci³y one dwie strategie przetrwania: (1) zapobieganie lub opóÿnianie dzia³ania czynnika stresowego w obrêbie komórek i (2) tolerowanie stresora. Pierwsza z nich polega na wykszta³ceniu ró norodnych zabezpieczeñ uniemo liwiaj¹cych zachwianie równowagi termodynamicznej komórki przez dany stresor. Dzieje siê tak TABELA 1. Wykaz czynników biotycznych i abiotycznych wywo³uj¹cych reakcje stresowe u roœlin (na podstawie [48], zmodyfikowane) TABLE 1. A list of biotic and abiotic factors involving stress reactions in plants (based on [48], modified) Czynniki biotyczne Roœliny mikroor - zwierzêta ganizmy Zagêszczenie Allelopatie Roœliny paso ytnicze Czynniki abiotyczne Promieniowanie UV Niedobór Nadmia r grzyby bakterie wirusy temperatura wysoka ch³ód mróz erowanie deptanie zwierzêta paso ytnicze woda antropogeniczn e zanieczyszczenia przemys³owe stosowanie pestycydów promieniowanie jonizuj¹ce pole elektryczne gazy suche powietrze niedobór tlenu susza glebowa gazy zatopienie wulkaniczne zwi¹zki mineraln e niedobór nadmiar zasolenie zakwaszenie metale ciê kie uszkodzenia mechaniczne wiatr pokrywa œnie na pow³oka lodowa

4 850 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA dziêki dostosowaniu w³asnego cyklu yciowego do zmieniaj¹cych siê sezonowo warunków œrodowiskowych lub poprzez fizjologiczne przystosowania umo liwiaj¹ce ochronê komórki czy ca³ego organizmu przed stresorem. Druga strategia przetrwania polega na tolerowaniu skutków dzia³ania stresora lub zapobieganiu im. Czynnik stresowy mo e powodowaæ uszkodzenia odwracalne, które po ust¹pieniu tego czynnika czêsto s¹ naprawiane. Tolerowanie polega równie na uruchamianiu alternatywnych dróg metabolicznych oraz na zapobieganiu denaturacji bia³ek czy kwasów nukleinowych [16]. Sprawny mechanizm transdukcji sygna³u jest wymagany do funkcjonowania komórki roœlinnej. Istniej¹ co prawda proste szlaki sygnalizacyjne, lecz wiêkszoœæ z nich jest z³o ona i anga uje szereg cz¹steczek sygnalnych, enzymów, czynników transkrypcyjnych, które musz¹ siê pojawiaæ w okreœlonym czasie w odpowiednim miejscu w komórce. Ogólnie mo na przyj¹æ, e transdukcja sygna³u rozpoczyna siê w momencie percepcji bodÿca przez wyspecjalizowane sensory. Mog¹ one ró niæ siê budow¹, lokalizacj¹ subkomórkow¹ i funkcjonowaniem. S¹ odpowiedzialne za pojawienie siê ca³ej gamy cz¹steczek sygnalnych (wtórne przekaÿniki, fitohormony, tlenek azotu, reaktywne formy tlenu), które uruchamiaj¹ kolejne elementy ³añcucha. Szlaki te zazwyczaj obejmuj¹ procesy fosforylacji i defosforylacji, co mo e skutkowaæ aktywacj¹ czynników transkrypcyjnych i ekspresj¹ genów aktywowanych przez RYCINA 1. Ogólny schemat transdukcji sygna³u stresu abiotycznego (na podstawie [66], zmodyfikowane) FIGURE 1. A generic pathway for the transduction of abiotic stress signals in plants (based on [66], modified)

5 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 851 czynniki stresowe. Transdukcja sygna³u czêsto wymaga obecnoœci dodatkowych sk³adników, które same nie s¹ elementem kaskady transdukcyjnej, lecz spe³niaj¹ nie mniej wa n¹ rolê regulacyjn¹ np. w ³¹czeniu i aktywacji kompleksów sygnalnych, transporcie zwi¹zków do odpowiednich grup komórek, a tak e regulowaniu czasu obecnoœci cz¹steczek sygnalnych w uk³adzie. W wielu przypadkach poziom i aktywnoœæ tych elementów jest regulowana na zasadzie sprzê enia zwrotnego (pêtla regulacyjna) przez elementy ³añcucha transdukcji (ryc. 1) [66]. W niniejszej pracy przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat udzia³u wtórnych przekaÿników informacji i ich efektorów w indukowanych abiotycznymi czynnikami œrodowiskowymi reakcjach stresowych. SZLAK WAPNIOWY Szlak przekazywania sygna³u wapniowego jest jednym z najlepiej poznanych. Uczestniczy on w licznych procesach od podzia³ów komórkowych do odpowiedzi na szerok¹ gamê czynników wewnêtrznych i zewnêtrznych, odgrywaj¹c w nich rolê od mediatora do stymulatora odpowiedzi. Jednym z wa niejszych zjawisk, które jest istotnym etapem wielu kaskad sygnalnych, jest czasowa zmiana stê enia jonów wapnia w cytozolu. Wapñ jest magazynowany w apoplaœcie, wakuoli, endoplazmatycznym retikulum, plastydach i mitochondriach, z których to organelli jest uwalniany do cytozolu. W trakcie spoczynku stê enie wolnego wapnia w cytozolu ([Ca 2+ ] cyt ) utrzymuje siê pomiêdzy nm. Jest to 10 4 razy mniej ni w apoplaœcie i mniej ni w organellach komórkowych. Poziom wapnia jest rygorystycznie regulowany przez koordynacjê biernego transportu (kana³y jonowe) i aktywnego transportu (ATPazy Ca 2+ i antyport Ca 2+ ) przez b³onê plazmatyczn¹ i/lub transport wewn¹trzkomórkowy [24]. W warunkach normalnych (spoczynkowych) utrzymuje siê wysoki gradient Ca 2+ w poprzek b³ony. W wyniku przejœciowego otwarcia kana³u wapniowego, wywo-³anego pojawieniem siê bodÿca, jony Ca 2+ nap³ywaj¹ do cytozolu i aktywuj¹ bia³ka wra liwe na ten kation tzw. czujniki wapnia. Bia³ka te s¹ w stanie rozszyfrowaæ niesion¹ informacjê i same b¹dÿ poprzez modyfikacjê innych peptydów i/lub czynników transkrypcyjnych prowadziæ do wywo³ania koñcowej odpowiedzi roœliny na zmiany zachodz¹ce w jej otoczeniu. Mo na je podzieliæ na tzw. czujniki przekaÿnikowe, do których nale ¹: kalmodulina (CaM), bia³ka podobne do kalcyneuryny B (CBL), bia³ka SOS3 oraz tzw. czujniki odpowiadaj¹ce, takie jak kinazy regulowane bezpoœrednim wi¹zaniem jonów wapnia (CDPK), kinazy spokrewnione z kinazami CDPK (CRK), kinazy wi¹ ¹ce kalmodulinê (CaMK), kinazy aktywowane zarówno przez wi¹zanie wapnia, jak i kalmoduliny (CCaMK) oraz kinazy (SnRK3) wi¹ ¹ce bia³ka podobne do kalcyneuryny B czy SCaBP [18, 22]. Jony wapnia (Ca 2+ ). Stwierdzono, i niektóre czynniki abiotyczne oddzia³uj¹c na ró ne komórki roœlinne wywo³uj¹ nag³e, pojedyncze i krótkotrwa³e skoki poziomu Ca 2+, po których w ci¹gu kilku minut stê enie tych jonów powraca do wartoœci

6 852 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA rejestrowanych w komórkach spoczynkowych. W warunkach przed³u onego dzia³ania czynnika stresowego obserwuje siê pojawienie dwufazowego sygna³u Ca 2+. Przyk³adowo, stres solny, hiperosmotyczny i oksydacyjny wywo³uj¹ najpierw kilkuminutowy wzrost stê enia Ca 2+, po którym dopiero nastêpuje drugi, zdecydowanie d³u szy i utrzymuj¹cy siê nawet przez wiele godzin. Tylko pojawienie siê drugiego maksimum w stê eniu wapnia indukuje ekspresjê genów zaanga owanych w mechanizmy obronne [10]. Z kolei w 4 typach komórek korzeni rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) obni enie temperatury generuje pojedynczy, krótkotrwa³y wzrost stê enia Ca 2+, bez zauwa alnych ró nic w czasie trwania sygna³u, co wskazuje na to, i wszystkie komórki odbieraj¹ zmiany temperatury w ten sam sposób. Wzrost stê enia Ca 2+ jest natomiast zale ny od tempa, w jakim spada temperatura, a najbardziej wra liwymi komórkami s¹ komórki perycyklu. Podniesienie stê enia Ca 2+, nastêpuj¹ce w wyniku gwa³townego obni enia temperatury, ma z kolei wp³yw na ekspresjê genu KIN1, który we wspó³pracy z KIN2 jest odpowiedzialny za proces aklimatyzacji roœlin do obni onej temperatury. Kolejne doœwiadczenia z zastosowaniem inhibitorów szlaku wapniowego wykaza³y nie tylko spadek ekspresji genów KIN, lecz równie ca³kowity brak aklimatyzacji A. thaliana do ch³odu [24]. Tak e w przypadku komórek szparkowych zaobserwowano rytmiczne zmiany poziomu Ca 2+ w nastêpstwie obni enia temperatury. Co ciekawe, zmiany te by³y najlepiej widoczne w po³owie fazy jasnej rytmu dobowego, w przeciwieñstwie do pomiarów wykonywanych na pocz¹tku lub pod koniec dnia [12]. Warto zaznaczyæ, e jest to pierwsze spostrze enie, wskazuj¹ce, i odpowiedÿ jest zale na nie tylko od rodzaju bodÿca, lecz tak e od pory dnia, w której on zadzia³a³. Nie wiadomo jednak, czy obserwowana zale noœæ jest charakterystyczna tylko dla komórek liœcia, czy jest to zjawisko powszechne. Ostatnio, prowadz¹c badania na mchu Physcomitrella patens, odkryto, e szok cieplny indukuje przed³u aj¹ce siê podniesienie [Ca 2+ ] cyt przez prawdopodobn¹ aktywacjê wra liwych na ten bodziec kana³ów wapniowych [44]. Wydaje siê tak e, e stê enie uwolnionych jonów wapniowych jest proporcjonalne do wzrostu temperatury, co przek³ada siê na silniejsz¹ odpowiedÿ (np. ekspresjê genów koduj¹cych bia³ka szoku cieplnego). Poniewa podobne wyniki odnotowano tak e u Arabidopsis uwa a siê, e roœliny reaguj¹ na podniesienie temperatury otwarciem kana³ów wapniowych wra liwych na temperaturê. Istnieje tak e wiele dowodów potwierdzaj¹cych, e czynniki mechaniczne, tj. dotyk, wiatr, zranienie, indukuj¹ podniesienie cytoplazmatycznego poziomu wapnia. Ostatnio, badacze wykazali ró nice pomiêdzy reakcjami indukowanymi dotykiem i wygiêciem. Pod wp³ywem dotyku pojawia siê pojedynczy pik wapniowy w miejscu dzia³ania bodÿca, podczas gdy wygiêcie indukuje uwolnienie jonów Ca 2+ w postaci dwóch fal widocznych po wypuk³ej stronie zgiêcia [38]. Kinazy zale ne od wapnia (CDPK). Najliczniejsz¹ i najlepiej poznan¹ grup¹ czujników wapnia s¹ kinazy zale ne od jonów wapnia, a niezale ne od kalmoduliny (CDPK). Pomimo niezaprzeczalnej roli CDPK jako kluczowego regulatora w wielu szlakach sygna³owych, dotychczas ma³o wiadomo, która z izoform CDPK odgrywa

7 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 853 RYCINA 2. Sieæ wspó³zale noœci pomiêdzy abiotycznymi czynnikami stresowymi a CDPK i fitohormonami (na podstawie [22], zmodyfikowane) FIGURE 2. Cross-talk of signaling pathways involving abiotic stressors, CDPKs and fitohormones (based on [22], modified) rolê w poszczególnych procesach. Dostêpne do chwili obecnej dane zosta³y zebrane na rycinie 2. U ry u siewnego (Oryza sativa) w wyniku pojawienia siê stresora abiotycznego dochodzi do ekspresji 29 genów CDPK. S¹ one aktywowane w odpowiedzi na ró ne czynniki stresowe. Nadekspresja genu OsCDPK7 u transgenicznego ry u zwiêksza tolerancjê na nisk¹ temperaturê, natomiast gen OsCDPK13 jest wra liwy na suszê i zasolenie. Manipulowanie poziomem bia³ka przez uzyskanie nadekspresji tych genów wywo³uje zwiêkszon¹ tolerancjê na wspomniane stresory [63]. W przypadku lucerny siewnej (Medicago sativa) ju temperatura 37 o C indukowa³a wzrost ekspresji genu MsCPK3. Jest to jedyny taki rezultat, poniewa uzyskane do chwili obecnej wyniki wskazuj¹ na wzrost ekspresji CDPK przy wy szej temperaturze [60]. W liœcieniach tytoniu szlachetnego (Nicotiana tabacum) gen NtCDPK1 jest regulowany na poziomie transkryptu nie tylko przez fitohormony (kwas abscysynowy, gibereliny, cytokininy i ester metylowy kwasu jasmonowego), lecz tak e przez szereg czynników stresowych biotycznych (elicytory grzybowe, chitozan) i abiotycznych (NaCl, zranienie). Do indukcji ekspresji NtCDPK1 dochodzi³o niezwykle szybko, a zwiêkszony poziom mrna tego genu jest notowany ju po 1 godzinie od potrak-

8 854 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA towania liœci elicytorami grzybowymi, chitozanem czy NaCl. Okaza³o siê równoczeœnie, e czas utrzymywania siê wysokiego poziomu mrna NtCDPK1 jest zale ny od rodzaju czynnika stresowego, który wywo³uje reakcje. Drugi z analizowanych genów NtCPK4 podlega aktywacji w wysokim stê eniu NaCl, a do maksymalnej akumulacji transkryptu dochodzi w 30 minut. Od tego momentu obserwowany jest jego spadek, a poziom mrna NtCPK4 powraca³ do stê enia wyjœciowego w ci¹gu 2 godzin [71]. Analizy Northern blot ca³kowitego RNA z A. thaliana wskaza³y, e mrna AtCPK1 i AtCPK2 wzrasta w wyniku traktowania roœlin wysokim stê eniem NaCl i susz¹. Efektu tego nie obserwowano w niskiej lub wysokiej temperaturze, co sugeruje, e w tym wypadku jedynie zmiany w potencjale osmotycznym œrodowiska mog¹ dzia³aæ jako w³¹cznik indukcji AtCPK1 i 2. Potwierdzi³y to prowadzone niedawno analizy mutanta cpk23 typu knock-out, który wykazuje znacz¹cy wzrost tolerancji na suszê oraz zasolenie, podczas gdy roœliny z nadekspresj¹ cechuje wiêksza wra liwoœæ [29]. CDPK bierze udzia³ w odpowiedzi na szereg stresorów na szlakach zarówno zale nych, jak i niezale nych od ABA. Wykazano wspó³udzia³ CDPK z ABA w odpowiedzi roœlin na stres temperaturowy. W korzeniach ry u dochodzi do obni enia aktywnoœci 45 kda CDPK w konsekwencji traktowania roœlin nisk¹ temperatur¹. Proces ten by³ odwracany przez egzogenny ABA [9]. AtCPK4/11b, AtCPK3 i AtCPK11 z Arabidopsis s¹ w stanie fosforylowaæ piêæ z siedmiu bia³ek AtDi19. Bia³ka te maj¹ charakterystyczn¹ domenê z palcem cynkowym i prawdopodobnie funkcjonuj¹ w niezale nych od ABA procesach tolerancji na suszê i zasolenie. W badaniach na protoplastach kukurydzy wykazano, e CDPK indukuje geny (RAB16 i HVA1) odpowiedzi na stres, które maj¹ ramki G-box bêd¹ce elementami regulatorowymi cis typu AREB/ABF, czyli typu odpowiedzi na kwas abscysynowy. Nadekspresja domeny katalitycznej fosfataz ABI1 hamowa³a transkrypcjê genu HVA1 indukowan¹ przez ABA i AtCPK1. Sugeruje to, i ekspresja tych genów zachodzi przy udziale CDPK, a ABI1 hamuje ten proces [37]. U przypo³udnika kryszta³kowego (Mesembryanthemum crystallinum) w odpowiedzi na stres solny kinaza zale na od wapnia (McCPK1) fosforyluje bia³ko regulatorowe McCSP1. Kinazê tê, która w fazie spoczynkowej jest przy³¹czona do plazmolemy, cechuje du a ruchliwoœæ po pojawieniu siê stresora. W wyniku stresu osmotycznego dochodzi do jej przy³¹czenia do filamentów aktynowych i transportu do j¹dra. Ta zmiana po³o enia jest mo liwa po interakcji z AtVTI1a, bia³kiem obecnym w Aparacie Golgiego i bia³kiem McCAP, które prawdopodobnie poœredniczy w przy³¹czaniu McCPK1 do elementów cytoszkieletu [43]. CDPK jest tak e zaanga owany w pojawienie siê odpowiedzi systemicznej w nastêpstwie uszkodzenia mechanicznego. U pomidora zwyczajnego (Lycopersicon esculentum) w ci¹gu 4 godzin dochodzi do wzrostu ekspresji LeCDPK1 w miejscu zranienia, natomiast w kolejnych godzinach zwiêkszony poziom transkryptu mo na zauwa yæ w obszarach oddalonych od miejsca ciêcia, takich jak liœcienie (8 12 godzin po zranieniu), czy s¹siednie liœcie (18 godzin po zranieniu). Ten wzrost poziomu mrna LeCDPK1 jest skorelowany ze wzrostem aktywnoœci rozpuszczalnej CDPK w

9 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 855 ekstraktach z liœci pomidora, wskazuj¹c tym samym, e kinaza ta jest czêœci¹ mechanizmu odpowiedzi roœlin na abiotyczne czynniki stresowe [50]. U kukurydzy potwierdzono istnienie podobnej zale noœci. W wyniku mechanicznego uszkodzenia dochodzi do szybkiej (w ci¹gu kilku minut) aktywacji ZmCPK11 i akumulacji transkryptu w miejscu uszkodzenia, a nastêpnie w obszarach oddalonych, co sugeruje, e kinaza ta uczestniczy we wczesnych etapach lokalnej i systemowej odpowiedzi na zranienie. Poniewa zarówno kwas jasmonowy, jak i jego metylowa pochodna oraz prekursor (kwas linolenowy) indukuj¹ ekspresjê tego genu, sugeruje siê, e kinaza ta jest zaanga owana w przekazywanie sygna³u zranienia na szlaku zale nym od kwasu jasmonowego [49]. Bia³ka SOS. Do grupy odbiorców informacji zawartych w zmianach stê enia jonów wapniowych nale ¹ tak e bia³ka SOS (ang. Salt-Overly-Sensitive). Identyfikacja szlaku bia³ek SOS u Arabidopsis pozwoli³a na okreœlenie komponentów i mechanizmów zaanga owanych w odpowiedÿ roœlin na stres solny [32, 61]. Pierwsze roœlinne SOS zidentyfikowano podczas poszukiwania mutantów Arabidopsis wykazuj¹cych zmienion¹ reakcjê na stres osmotyczny. Obecne nazewnictwo opisuje je jako SOS1, CBL4 (SOS3) i CIPK24 (SOS2). Szereg szczegó³owych badañ dowiod³o, e CBL4 i CIPK24 oddzia³uj¹ ze sob¹ i bior¹ udzia³ w odpowiedzi roœlin na stres solny przez regulacjê zlokalizowanego w plazmolemie wymiennika sodowoprotonowego (SOS1). Mutacje w genach koduj¹cych te bia³ka powoduj¹ nadwra - liwoœæ roœlin na zasolenie. Ponadto, roœliny z takimi mutacjami gromadz¹ wiêcej proliny w czasie stresu solnego, a jej iloœæ jest proporcjonalna do rozmiaru szkód wywo³anych przez stres [7]. Zwi¹zane z b³on¹ bia³ko CBL (SOS3) jest istotnym sensorem wapnia zaanga owanym w transdukcjê stresu solnego oraz generowanie tolerancji na zasolenie u Arabidopsis. Gen CBL koduje bia³ko wi¹ ¹ce Ca 2+, z jednym motywem N-mirystoilacji i trzema motywami EF wi¹ ¹cymi Ca 2+. Zmiany w motywach EF uniemo liwiaj¹ wydajne wi¹zanie jonów wapnia, przez co roœlina staje siê bardziej wra liwa na zasolenie. Bia³ko CBL wi¹ e Ca 2+ ze stosunkowo niskim powinowactwem w porównaniu z innymi bia³kami efektorowymi, co mo e byæ czynnikiem warunkuj¹cym rozró nianie sygna³ów wapniowych. Okaza³o siê równie, i mirystoilacja CBL ma istotne znaczenie w tolerancji wysokiego zasolenia. Mutanty z niepe³nym motywem mirystoilacji wykazuj¹ nadwra liwoœæ na podwy szone stê enie soli. Uwa a siê wiêc, e przy³¹czenie do b³on jest wymagane do prawid³owej aktywacji bia³ka CBL, a jest to mo liwe jedynie po przy³¹czeniu kwasu mirystynowego [32]. Gen CIPK24 koduje serynowo-treoninow¹ kinazê bia³kow¹, która na N-koñcu ma domenê katalityczn¹ podobn¹ do bia³ek SNF1/AMPK oraz unikaln¹ regulatorow¹ domenê na C-koñcu. Zlokalizowany w domenie regulatorowej CIPK24 motyw NAF jest niezbêdny do interakcji z bia³kami SOS3. W obecnoœci Ca 2+, CBL aktywuje kinazê CIPK24. Mutacje genu CIPK24 powoduj¹ u roœlin nadwra liwoœæ na stres wywo³any NaCl, natomiast nadekspresja aktywnej formy CIPK24 odwraca efekt wra liwych na zasolenie fenotypów sos2 i sos3 potwierdzaj¹c, e bia³ka CBL i

10 856 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA CIPK24 s¹ elementami tego samego, zale nego od wapnia szlaku sygnalizacyjnego podczas stresu solnego [75]. Gen SOS1 koduje wymiennik Na + /H + zlokalizowany w b³onie. Kompleks kinaz SOS2-SOS3 kontroluje zarówno ekspresjê genu SOS1, jak i aktywnoœæ powstaj¹cego enzymu. Wykazano, e aktywnoœæ SOS1 ulega redukcji u mutantów cbl i cipk24, któr¹ mo na przywróciæ dodaj¹c zaktywowanej kinazy CIPK24 w warunkach in vitro. Wykazano tak e, e kompleks CBL-CIPK24 bezpoœrednio fosforyluje bia³ko SOS1 [7, 32]. Powy sze badania pozwoli³y funkcjonalnie zrekonstruowaæ szlak bia³ek SOS (ryc. 3), demonstruj¹c, e indukowany stresem solnym sygna³ wapniowy jest odbierany przez bia³ka CBL, które aktywuj¹ kinazê CIPK24 fosforyluj¹c¹ bia³ko SOS1. Bia³ko to generuje tolerancjê na zasolenie przez usuwanie Na + z cytozolu. Równoczeœnie wydaje siê, e mechanizm ten jest uniwersalny dla wiêkszoœci roœlin. Warto RYCINA 3. Szlak aktywacji bia³ek SOS w odpowiedzi na stres solny (na podstawie [20], zmodyfikowane) FIGURE 3. Pathway showing activation of SOS protein in salt stress (based on [20], modified)

11 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 857 zaznaczyæ, e podczas stresu solnego CIPK24 wspó³dzia³a z innymi transporterami jonów, takimi jak zlokalizowane w tonoplaœcie pompy H + i wymienniki Ca 2+ /H + [3], jednak e rola CBL w regulacji ich aktywnoœci nie zosta³a okreœlona. Niedawno zidentyfikowano równie geny SOS4 i SOS5. Pierwszy koduje kinazê pirydoksalu (PL), bior¹c¹ udzia³ w biosyntezie fosforanu-5-pirydoksalu (PLP), aktywnej formy witaminy B6. Tymczasem gen SOS5 koduje przypuszczalnie bia³ko adhezyjne, uczestnicz¹ce w przyleganiu komórek do siebie, które jest wymagane do ich prawid³owego wzrostu. W warunkach stresu solnego bia³ko to wspomaga utrzymanie struktury w stanie nienaruszonym [60]. Kalmodulina i bia³ka kalmodulinopodobne (CaM/CML). W ci¹gu kilku ostatnich lat poczyniono wyraÿny postêp w kierunku poznania roli kalmoduliny (CaM) oraz bia³ek kalmodulino-podobnych (CML) w stresie abiotycznym u roœlin [10, 33]. Kalmodulina jest kluczowym czujnikiem Ca 2+ podczas odpowiedzi na zmiany temperatury [28]. Konsekwencj¹ podniesienia temperatury otoczenia jest gwa³towny wzrost poziomu mrna AtCaM3. U mutantów Arabidopsis, w których gen ten jest nieaktywny, obserwuje siê spadek tolerancji na wysok¹ temperaturê, natomiast nadekspresja wywo³uje u roœlin zwiêkszenie tolerancji [2]. Sugeruje siê, e AtCaM3 mo e funkcjonowaæ przez oddzia³ywanie z wi¹ ¹c¹ kalmodulinê fosfataz¹ bia³kow¹ AtPP7 i/lub bia³kiem AtCBK3. Zarówno mutanty z nieaktywnym genem AtPP7, jak równie z jego nadekspresj¹ maj¹ fenotyp analogiczny do roœlin transgenicznych AtCaM3 [28, 74]. Podobna sytuacja by³a obserwowana tak e dla AtCBK3, bia³ka wi¹ ¹cego kompleks CaM-Ca 2+, które jest aktywowane w momencie podniesienia temperatury w œrodowisku [27]. Udowodniono e czynnik transkrypcyjny szoku cieplnego AtHSFA1 oddzia³uje z tym bia³kiem in vitro. Kalmodulina uczestniczy tak e w stresie abiotycznym poprzez kaskadê fosforylacji kinaz MAP (ang. Mitogen Activated Protein kinases), kluczowych elementów szla-ków kontroluj¹cych rozwój i odpowiedÿ na stres u roœlin. Fosfatazy kinaz MAP (MKP) reguluj¹ aktywnoœæ tych kinaz. W przypadku trzech homologów MKP: z ry u, rzodkiewnika i tytoniu stwierdzono ich oddzia³ywanie z CaM [20, 25]. U ry u zarówno fosfataza (OsMKP1), jak równie kinazy (OsMPK3 i OsMPK6) ulegaj¹ silnej indukcji w wyniku zranienia. Utrata funkcji przez OsMKP1 powoduje konstytutywn¹ aktywacjê OsMPK3 i OsMPK6, wskazuj¹c na negatywn¹ rolê regulatorow¹ OsMPK1 w sygnalizacji procesu zranienia. Doœwiadczenia wykonane na rzodkiewniku wskazuj¹, e CaM wp³ywa na wzrost aktywnoœci AtMKP1 i pomimo e nieznany jest efektor tego bia³ka, sugeruje siê jego rolê w procesie zranienia [25]. Bia³kiem wi¹ ¹cym kalmodulinê jest tak e czynnik transkrypcyjny (AtMYB2), który reguluje ekspresjê genów odpowiedzi na stres solny i dehydratacyjny. Tempo wi¹zania AtMYB2 do DNA jest wzmacniane w obecnoœci bia³ka ScaM4, bêd¹cego indukowan¹ przez wysokie stê enie soli izoform¹ CaM soi, a proces ten jest hamowany w obecnoœci drugiej izoformy ScaM1 [68]. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób wi¹zanie izoform CaM do AtMYB2 wp³ywa na wydajnoœæ wi¹zania tego czynnika transkrypcyjnego do DNA. Dobrze poznanym szlakiem bior¹cym udzia³ w odpowiedzi na stres abiotyczny jest aktywacja przez CaM dekarboksylazy kwasu glutaminowego (GAD). GAD katalizuje przemianê kwasu glutaminowego do kwasu g-aminomas³owego (GABA), który ulega

12 858 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA szybkiej aktywacji podczas odpowiedzi na stres. Zarówno CaM, jak i Ca 2+ wymagane s¹ do aktywacji enzymu, na co wskazuj¹ analizy prowadzone na mutantach niezdolnych do wi¹zania CaM, a tym samym produkcji GABA. Uwa a siê, e wzrost poziomu GABA jest powszechn¹ odpowiedzi¹ na pojawienie siê stresora, a œcis³a kontrola syntezy przez GAD i CaM jest niezbêdna dla rozwoju roœliny [5]. Równie bia³ka kalmodulino-podobne (CML) uczestnicz¹ w reakcjach stresu solnego i utrzymywaniu homeostazy jonowej. Gen CML24 z Arabidopsis, zidentyfikowany pocz¹tkowo jako gen indukowany dotykiem, podlega tak e regulacji przez zwiêkszone stê enie soli, takich jak: NaCl, CoCl 2, ZnSO 4, i MgCl 2 [11]. U Arabidopsis AtCML18, przez interakcjê ze zlokalizowanym w tonoplaœcie wymiennikiem Na + /H + (AtNHX1), bierze udzia³ w reakcjach uzyskiwania tolerancji na zasolenie [67]. Interakcja, zale na od stê enia jonów Ca 2+ i ph, spada ze wzrostem wartoœci ph. Wi¹zanie AtCML18 do AtNHX1 moduluje selektywnoœæ wymiennika Na + /H + przez obni enie aktywnoœci wymiany jonów. Proponuje siê wiêc, e w warunkach fizjologicznych, kwaœne ph i wysokie stê enie Ca 2+ w wakuoli utrzymuj¹ AtCML18 zwi¹zane z AtNHX1, powstrzymuj¹c w ten sposób aktywnoœæ wymiany Na + /H +. Podniesienie ph w wakuoli, bêd¹ce nastêpstwem stresu solnego, powoduje uwolnienie AtCML18 od AtNHX1 i akumulacjê Na + [47, 67]. Tak e AtCML9 jest zaanga owany w generowanie odpowiedzi na stres osmotyczny. Wskazuj¹ na to wyniki badañ prowadzone na mutantach typu knock-out (Atcml9), które toleruj¹ zarówno suszê, jak i zwiêkszone zasolenie [31]. Kie³kowanie roœlin Atcml9 w obecnoœci mannitolu, jako zwi¹zku osmotycznie czynnego, przebiega prawid³owo, podczas gdy wysokie stê enia NaCl hamuj¹ ten proces. Ponadto siewki Atcml9 wykazuj¹ nadwra liwoœæ na ABA, co mo e wskazywaæ, e bia³ko to funkcjonuje jako negatywny regulator zale nej od ABA tolerancji na zasolenie [31]. Nie potwierdzaj¹ tego jednak analizy aktywnoœci promotora RD29A wra liwego na ABA i zasolenie. Jego aktywnoœæ pozostaje na niskim poziomie w obecnoœci wysokiego stê enia ABA i NaCl. Tak wiêc, aby móc po³¹czyæ ze sob¹ te sprzeczne informacje i zrozumieæ rolê AtCML9 w stresie solnym i osmotycznym, konieczne staje siê wykonanie dodatkowych analiz. Istniej¹ nieliczne dane wskazuj¹ce na zwi¹zek CML z procesami inicjowanymi przez promieniowanie UV. Izoforma AtCML19 jest zaanga owana w proces naprawy uszkodzonego DNA pojawiaj¹cego siê w nastêpstwie dzia³ania UV-C. Œwiadcz¹ o tym dane wskazuj¹ce, e poziom transkryptu AtCML19 jest zale ny od si³y promieniowania, zaœ mutanty z uszkodzonym genem nie s¹ w stanie pokierowaæ napraw¹ DNA [58]. Ponadto AtCML19 oddzia³uje z ATRAD4, elementem kompleksu rozpoznaj¹cego uszkodzone DNA. CYKLICZNE NUKLEOTYDY Cykliczny adenozyno-3':5'-monofosforan i cykliczny guanozyno-3':5'-monofosforan, potocznie znane jako camp i cgmp, s¹ wtórnymi przekaÿnikami informacji, których obecnoœæ zosta³a opisana u wielu organizmów rozpoczynaj¹c od bakterii, a na cz³owieku koñcz¹c. Cykliczne nukleotydy s¹ obecne w komórkach roœlinnych, o czym œwiadcz¹

13 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 859 nie tylko pomiary ich komórkowego poziomu, lecz coraz liczniej prezentowane prace charakteryzuj¹ce enzymy zwi¹zane z ich metabolizmem [4, 35, 53, 69]. Cykliczne nukleotydy bior¹ udzia³ w szeregu reakcji (pato)fizjologicznych. Przyk³adowo, analizuj¹c zmiany w endogennym poziomie cyklicznego AMP stwierdzono, e jest on zaanga owany w transport jonów u rzodkiewnika i marchwi, cykl komórkowy w komórkach BY-2 tytoniu, wzrost ³agiewki py³kowej lilii oraz w reakcje œwietlne u glonów. Cykliczny GMP jest natomiast modulatorem otwierania aparatów szparkowych, elementem bior¹cym udzia³ w reakcjach zachodz¹cych z udzia³em giberelin w warstwie aleuronowej jêczmienia oraz tworzeniu korzeni przybyszowych u fasoli z³otej (Phaseolus aureus). Odgrywa on tak e rolê wtórnego przekaÿnika w szeregu procesach zwi¹zanych z aktywacj¹ fotoreceptorów [26, 45, 52]. Istniej¹ tak e dowody na zaanga owanie cyklicznych nukleotydów w procesy obronne roœliny. Pierwsze dane, œwiadcz¹ce o udziale camp w komórkowych reakcjach obronnych, dotyczy³y udzia³u tego cyklicznego nukleotydu w syntezie fitoaleksyn u wilca ziemniaczanego (Ipomea batata). Podobny efekt zosta³ nastêpnie opisany u marchwi (Daucus carota). Ostatnio wykazano, e cgmp jest zaanga owany w stymulacjê syntezy flawonoidów u soi zwyczajnej (Glycine max). U lucerny siewnej (Medicago sativa) zaobserwowano znacz¹cy wzrost aktywnoœci genu PAL koduj¹cego amoniakoliazê fenyloalaniny. Enzym ten katalizuje pocz¹tkowe reakcje na szlaku syntezy fitoaleksyn. Traktowanie siewek roztworem niehydrolizuj¹cego analogu camp (dibutyryl-camp) zwiêksza aktywnoœæ PAL i syntezê fitoaleksyn. Dodatkowo, stymuluj¹cy wp³yw toksyny cholery na syntezê fitoaleksyn u marchwi i na aktywnoœæ PAL w kulturach komórkowych fasoli sugeruje udzia³ bia³ek G w tych procesach. Równie wystawienie liœci tytoniu na dzia³anie tlenku azotu prowadzi do czasowego wzrostu stê enia cgmp i ekspresji genów zwi¹zanych z procesami obronnymi [34, 52]. W efekcie stresu osmotycznego dochodzi do zmian poziomu cyklicznych nukleotydów w korzeniach Arabidopsis thaliana. Ju dziesiêæ lat temu wykazano, e u Arabidopsis w obecnoœci mikromolowych stê eñ camp lub cgmp po cytoplazmatycznej stronie plazmolemy drastycznie mala³o prawdopodobieñstwo otwarcia kana³u sodowego, prowadz¹c do spadku stê enia jonów sodowych we w³oœnikach. Kolejne badania wykaza³y, i po zastosowaniu niehydrolizuj¹cych analogów cgmp dochodzi nie tylko do zmian w przep³ywie jonów sodowych i potasowych, lecz równie do aktywacji szeregu genów obronnych (R) [30, 41, 60]. Kana³y, których aktywnoœæ jest regulowana przez cgmp (CNGC), s¹ jednym z efektorów sygna³u cyklicznych nukleotydów. CNGC, pocz¹tkowo odkryte u jêczmienia, zosta³y nastêpnie scharakteryzowane u innych roœlin, np. tytoniu, ry u i rzodkiewnika [6, 19]. Cz¹steczki roœlinnych CNGC zawieraj¹ 6 odcinków transb³onowych (S1-6) z porem zlokalizowanym pomiêdzy pi¹t¹ i szóst¹ domen¹. Koñce N i C skierowane s¹ do wnêtrza komórki. Hydrofilowy C-koniec zawiera czêœciowo zachodz¹ce na siebie 2 domeny: wi¹ ¹c¹ cykliczne nukleotydy (CNBD) i wi¹ ¹c¹ kalmodulinê (CaMBD) [6, 46]. Uwa a siê, e cykliczne nukleotydy (camp i cgmp) bior¹ udzia³ w aktywacji kana³u, podczas gdy kalmodulina jest odpowiedzialna za hamowanie transportu kationów (ryc. 4) [8]. W konsekwencji przy³¹czenia kompleksu CaM-

14 860 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA RYCINA 4. Schemat sygnalizacji z udzia³em kana³ów bramkowanych cyklicznymi nukleotydami (CNGC) u roœlin (na podstawie [6], zmodyfikowane) FIGURE 4. Model of CNGC-mediated signaling in plants (based on [6], modified) Ca 2+ dochodzi do inaktywacji kana³u poprzez blokadê domeny wi¹ ¹cej cgmp [1]. Tak wiêc same jony wapnia przez wi¹zanie do kalmoduliny i bia³ek kalmodulinopodobnych (CMLs) mog¹ modulowaæ przep³yw jonów przez CNGC. Badania z wykorzystaniem technik immunocytologicznych, zmierzaj¹ce do okreœlenia subkomórkowej lokalizacji CNGC z jêczmienia (HvCBT1), tytoniu (NtCBP4) i rzodkiewnika (AtCNGC), wykaza³y obecnoœæ tych kana³ów w plazmolemie komórek liœcia i korzenia [46]. Sygna³ by³ obserwowany równie w endoplazmatycznym retikulum, aparacie Golgiego i pêcherzykach zlokalizowanych w okolicy plazmolemy, co wskazuje na jego syntezê w ER i transport pêcherzykami AG do plazmolemy [8, 70]. Badania elektrofizjologiczne, molekularne i genetyczne szeœciu CNGC wykaza³y, e generalnie s¹ to nieselektywne kana³y kationów jedno- i dwuwartoœciowych [1, 13]. Badania fenotypowe mutantów pozbawionych czynnych CNGC wykaza³y ich udzia³ w procesie tolerancji na metale ciê kie, wra liwoœci na stres solny, programowanej œmierci komórki czy odpornoœci na infekcje [8]. Kana³y bramkowane cyklicznymi nukleotydami s¹ zaanga owane w transport jonów Na + i K +, jednak e ich rola w procesach adaptacyjnych w odpowiedzi na stres solny nie zosta³a do koñca poznana. Aktywnoœæ szeregu z nich (AtCNGC1; AtCNGC3 i AtCNGC13) zwiêksza siê w nastêpstwie ekspozycji na wysokie stê enie NaCl, podczas gdy inne nie wykazuj¹ takiej zale noœci, a wrêcz ich aktywnoœæ jest zahamowana [6]. Analiza przypuszczalnej funkcji jednego z bia³ek kana³owych CNGC, tj. AtCNGC2 z Arabidopsis, wykaza³a, e mo e on braæ udzia³ w przep³ywie zarówno jonów

15 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 861 wapnia, jak równie jonów jednowartoœciowych, np. K +. Ich transport jest zale ny od obecnoœci camp lub cgmp, jednoczeœnie wysokie zewn¹trzkomórkowe stê enie Ca 2+ hamuje przep³yw K + [60]. Doœwiadczenia z wykorzystaniem techniki elektrofizjologicznej typu patch-clamp prowadzone na komórkach mezofilu wykaza³y, e przep³yw jonów K + mo e byæ zwiêkszony przez podniesienie poziomu camp, pod warunkiem, e inhibitor fosfodiesterazy jest obecny w badanym uk³adzie. Badania na roœlinach z nieczynnym genem AtCNGC10, które uzyskano z wykorzystaniem techniki anty-sens, wykaza³y, e pêdy tych roœlin charakteryzuj¹ siê wy szym stosunkiem jonów Na + do K + w porównaniu z roœlinami typu dzikiego. S¹ one wra liwsze na wzrost stê enia NaCl, a reakcja stresowa prowadzi do spadku biomasy i iloœci chlorofilu. Autorzy wnioskuj¹, e AtCNGC10 jest zaanga owany w proces pobierania i transport d³ugodystansowy, za³adunek i roz³adunek komórek floemu i ksylemu, reguluj¹c w ten sposób homeostazê jonów jednowartoœciowych, szczególnie utrzymywanie w³aœciwego poziomu Na + /K + podczas adaptacji do stresu solnego [14]. Niezwyk³ym przyk³adem kana³u regulowanego przez cykliczne nukleotydy jest kana³ wykryty podczas badania zale nego od aluminium nap³ywu jab³czanu do komórek w korzeniach pszenicy [72]. W prowadzonych doœwiadczeniach glin (Al 3+ ) inicjowa³ przep³yw anionów przez b³onê, stymuluj¹c tym samym zmianê jej potencja³u elektrycznego. W protoplastach uzyskanych z roœlin wykazuj¹cych tolerancjê na Al 3+ przep³yw K + by³ wzmo ony w obecnoœci tych jonów jedynie wtedy, gdy camp by³ obecny w œrodowisku. POCHODNE FOSFOINOZYTOLI Fosfoinozytole to grupa fosfolipidów, estrów glicerolu i kwasów t³uszczowych oraz szeœciowodorotlenowego alkoholu inozytolu. Wszystkie znane fosfoinozytole powstaj¹ z przekszta³ceñ fosfatydyloinozytolu (PI). PI bêd¹cy sk³adnikiem b³on ulega przekszta³ceniu poprzez fosfatydyloinozytolo(4)fosforan (PIP) do fosfatydyloinozytolo(4,5)bisfosforanu (PIP2). W wyniku stymulacji komórek dochodzi do rozpadu PIP2 do inozytolo(1,4,5)trifosforanu (IP3) i 1,2-diacyloglicerolu (DAG). Reakcja ta katalizowana jest przez fosfolipazê C (PI-PLC). IP3 dyfunduje do cytozolu, gdzie ulega przekszta³ceniu do IP6, który jest zaanga owany w uwalnianie jonów wapniowych z wewn¹trzkomórkowych magazynów. DAG pozostaje w b³onie, gdzie ulega fosforylacji przez kinazê DAG do kwasu fosfatydowego (PA). Kwas fosfatydowy mo e powstawaæ tak e bezpoœrednio z fosfatydylocholiny (PC) w wyniku aktywacji fosfolipazy D. U roœlin kwas fosfatydowy, w wyniku dzia³ania kinazy PA, ulega fosforylacji do pirofosforanu diacyloglicerolu (DAG-PP) (ryc. 5) [36, 60, 64]. U roœlin fosfolipazy s¹ elementami transdukcji sygna³ów w procesach, takich jak: biosynteza lipidów, reorganizacja membran, elongacja komórek, dojrzewanie zarodków, kie³kowanie nasion, jak równie w szeregu procesów zale nych od œwiat³a. Lipidy b³onowe mog¹ byæ bezpoœrednio zaanga owane w reakcje stresowe poprzez ich rolê w modulacji p³ynnoœci b³ony czy zmiany jej w³aœciwoœci fizykochemicznych. Jednak e ich nie mniej wa n¹ funkcj¹ wydaje siê byæ generowanie cz¹steczek sygnalnych [57, 60].

16 862 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA RYCINA 5. Sygnalizacja fosfoinozytoli u roœlin i zwierz¹t: podobieñstwa i ró nice. Elementy, które do chwili obecnej nie zosta³y scharakteryzowane w uk³adach roœlinnych, zosta³y przekreœlone (X). Strza³ki pe³ne wskazuj¹ na przemiany metaboliczne, natomiast strza³ki przerywane na procesy regulacyjne (na podstawie [40], zmodyfikowane) FIGURE 5. Plant PI signaling: differences and similarities to the mammalian paradigms. Some elements have not been characterized in plants, hence, these are striked-out (X). Solid arrows indicate metabolic conversions, dashed arrows represent mechanisms of regulation (based on [40], modified) Od szeregu lat wiadomo, e IP3 i DAG odgrywaj¹ rolê cz¹steczek sygnalnych w procesach transdukcji informacji zarówno w komórkach zwierzêcych, jak i roœlinnych. Jednak e musimy sobie zdawaæ sprawê, e pomimo usilnych badañ prowadzonych na materiale roœlinnym nie uda³o siê zidentyfikowaæ bia³ek, które pe³ni³yby funkcjê receptorów tych zwi¹zków. Tak wiêc pojawiaj¹ siê sugestie, e na szlaki z udzia³em fosfoinozytoli u roœlin musimy spojrzeæ z innej perspektywy. Wydaje siê, e to IP6 oraz kwas fosfatydowy, ufosforylowane pochodne IP3 i DAG funkcjonuj¹ w komórkach roœlinnych jako lipidowe wtórne przekaÿniki [39, 40]. W odpowiedzi na sygna³ stresowy PLC uaktywnia siê i hydrolizuje PIP2 do IP3 (trójfosforan-1,4,5-inozytolu) i DAG. Stwierdzono, e poziomy PIP2, DAG-PP oraz PC wzrastaj¹ gwa³townie w odpowiedzi na stres solny i hiperosmotyczny u Arabidopsis thaliana. Dochodzi równie do 15-krotnego wzrostu poziom IP3, w

17 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 863 odpowiedzi na zasolenie oraz stres osmotyczny. Podobny gwa³towny, krótkotrwa³y i niezale ny od ABA wzrost IP3 zaobserwowany zosta³ w zawiesinach komórkowych Arabidopsis wystawionych na dzia³anie wysokiego stê enia cukrów [59, 60]. Okreœlenie udzia³u IP6 w stresie nastrêcza wielu problemów. Wynika to z faktu, e spoœród wszystkich roœlinnych fosfoinozytoli IP6 wystêpuje w najwy szym stê eniu i poza funkcj¹ sygnaln¹ spe³nia równie rolê zwi¹zku zapasowego. Jest on akumulowany w du ych iloœciach w nasionach, ziarnach py³ku, organach spichrzowych jako donor Pi oraz inozytolu. Stwierdzono, e IP6 jest szybko tworzony w odpowiedzi na podniesienie siê stê enia ABA i jest zaanga owany w uwalnianie jonów Ca 2+ z wewn¹trzkomórkowych magazynów. Wykazano ponadto, e zahamowanie szlaku zale nego od IP6 powoduje zablokowanie kana³ów odpowiedzialnych za przep³yw jonów K +. Potencjalnym i jak dot¹d jedynym efektorem zmian stê enia IP6 u roœlin jest receptor auksyny TIR1 (ang. Transport Inhibitor Response 1), który do swojej aktywacji wymaga przy³¹czenia IP6 [39, 54]. Równoczeœnie stwierdzono, e fosfolipazy s¹ zaanga owane w proces zamykania szparek pod wp³ywem stresu suszy, zasolenia oraz stresu osmotycznego. Zahamowanie aktywnoœci PI-PLC os³abia stymulowane przez ABA zamykanie szparek i hamuje indukowan¹ stresem osmotycznym ekspresjê genów RD29A i COR47 [17]. Tak e fosfolipaza D aktywuje zale ny od ABA proces zamykania szparek. PA mo e hamowaæ aktywnoœæ ABI1, który jest negatywnym regulatorem syntezy ABA. Roœliny z nieczynnym genem PLDa1 s¹ mniej wra liwe na ABA [73]. Co istotne, PLD1 mo e oddzia³ywaæ z bia³kami G (agpa1), tak wiêc PLDa1 i GPA1 mog¹ w rzeczywistoœci funkcjonowaæ razem w kontroli dzia³ania ABA [60]. FIERY (FRY1) jest fosfataz¹ zaanga owan¹ w degradacjê IP3, która jest indukowana przez ABA podczas stresu suszy. Mutanty fry1-1 s¹ bardziej wra liwe na suszê i wykazuj¹ znacznie podwy szony poziom IP3. Ostatnie badania wykaza³y jednak e, e FIERY dzia³a jako endogenny supresor RNA i negatywny regulator tolerancji na stres, elongacji komórek i czasu kwitnienia [15, 21, 65]. Tak wiêc kwestia jej udzia³u w powy szych procesach wymaga dalszych badañ. U wielu roœlin odpowiedzi¹ na pojawienie siê czynników stresowych jest akumulacja proliny. Udowodniono, i aminokwas ten, dziêki swoim w³aœciwoœciom, bierze udzia³ w reakcjach przystosowania roœlin do deficytu wody i zasolenia. Ostatnio wskazano na zwi¹zek pomiêdzy nagromadzeniem siê proliny i uruchomieniem szlaku fosfoinozytoli. Zastosowanie u Arabidopsis inhibitora PLC (U73122) spowodowa³o zahamowanie enzymu P5CS, który jest zwi¹zany z syntez¹ i akumulacj¹ proliny [51]. Ponadto wykorzystuj¹c inhibitory kinazy DAG oraz kana³ów wapniowych bramkowanych IP3 wskazano, i IP3 jest istotn¹ cz¹steczk¹ sygnaln¹ w akumulacji proliny w odpowiedzi na stres solny. Z ostatnich badañ prowadzonych na rzodkiewniku wynika, i w b³onach komórek roœlinnych wystêpuj¹ receptory CAS (ang. CAlcium-Sensing receptor) reguluj¹ce poziom IP3, który z kolei wp³ywa na uwalnianie Ca 2+ z wewn¹trzkomórkowych magazynów. W ten sposób poziom proliny jest regulowany poprzez IP3 i zmiany stê enia jonów wapniowych [42, 55]. Istniej¹ dowody wskazuj¹ce, e kwas fosfatydowy oraz jego ufosforylowana pochodna, pirofosforan diacyloglicerolu, s¹ zaanga owane w sygnalizacjê stresu u

18 864 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA roœlin [57]. Zarówno uszkodzenie mechaniczne, zwi¹zki wywo³uj¹ce stres osmotyczny i oksydacyjny, susza, jak równie pojawienie siê patogena wywo³uj¹ podniesienie poziomu PA. W nastêpstwie tego dochodzi do aktywacji kinazy kwasu fosfatydowego (PAK), która katalizuje konwersjê PA do DAG-PP [62]. Do chwili obecnej nie wiadomo jednak, czy tworzenie DAG-PP jest mechanizmem zmierzaj¹cym do z³agodzenia reakcji uruchamianej przez PA, czy sam DAG-PP dzia³a jako cz¹steczka sygnalna. W wiêkszoœci przypadków PA nie dzia³a samodzielnie, lecz wspó³pracuje z szeregiem cz¹steczek na szlakach transdukcji sygna³u stresowego. Nale ¹ do nich jony wapnia, bia³ka G, kinazy bia³kowe, kinazy MAP oraz reaktywne formy tlenu (RFT). Ostatnio odnotowano, i PA oddzia³uje z CTR1, który jest inhibitorem etylenowego szlaku sygnalizacyjnego [56]. PODSUMOWANIE W ostatnich latach dokona³ siê znacz¹cy postêp w badaniach zmierzaj¹cych do poznania mechanizmów transdukcji sygna³u stresowego. Powoli zaczynamy rozumieæ, w jaki sposób przebiega szlak przekazywania sygna³u w odpowiedzi na pojawienie siê stresora: od jego rozpoznania przez komórkê, transdukcjê, do zmiany aktywnoœci okreœlonych genów, transportu jonów, reorganizacji cytoszkieletu, czego ostatecznym efektem jest powstanie specyficznych przystosowañ morfologicznych, anatomicznych, fizjologicznych i biochemicznych. Skutecznoœæ tych mechanizmów le y u podstawy zachowywania siê roœliny podczas stresu i wp³ywa na plonowanie. Dziêki rozwojowi technik molekularnych oraz wykorzystaniu mutantów i roœlin transgenicznych udowodniono, e w procesy uzyskiwania przez roœliny odpornoœci na czynniki stresowe zaanga owanych jest szereg cz¹steczek sygnalnych. Powy sza praca jest prób¹ podsumowania danych dotycz¹cych wtórnych przekaÿników informacji: jonów wapnia, cyklicznych nukleotydów i fosfoinozytoli oraz ich efektorów. Kluczowym momentem w mechanizmie dzia³ania wtórnych przekaÿników jest precyzyjne dopasowanie i zwi¹zanie siê cz¹steczek z w³aœciwymi bia³kami efektorowymi. Z wyj¹tkiem szlaku wapniowego charakterystyka tych efektorów jest w pocz¹tkowej fazie badañ. Jednak e ju te wyniki wskazuj¹, jak rozleg³y jest to temat. Nie ulega tak e w¹tpliwoœci, e sygnalizacja z udzia³em tych wtórnych przekaÿników musi byæ postrzegana jako z³o ona sieæ zale noœci. Wielorakie punkty zbie noœci i rozbie noœci umo liwiaj¹ integracjê sygna³ów na ró nych poziomach i utrzymuj¹ cz¹steczkow¹ podstawê dla wymaganej odpowiedzi charakteryzuj¹cej dany szlak transdukcji sygna³u. Ze wzglêdu na iloœæ i ró norodnoœæ procesów, w regulacjê których zaanga owane s¹ omawiane zwi¹zki, a tak e ze wzglêdu na istniej¹ce ró nice gatunkowe, osobnicze i tkankowe wiele pytañ dotycz¹cych ich funkcji i mechanizmu dzia³ania pozostaje na razie bez odpowiedzi. Obserwuj¹c jednak wzrost zainteresowania tematyk¹ transdukcji sygna³u z udzia³em wtórnych przekaÿników u roœlin mo na przypuszczaæ,

19 WTÓRNE PRZEKA NIKI W STRESIE ABIOTYCZNYM 865 e w miarê postêpu badañ liczba poznanych elementów wspó³pracuj¹cych z wtórnymi przekaÿnikami bêdzie ci¹gle wzrastaæ, a procesy le ¹ce u podstaw percepcji bodÿca stresowego i generowania adekwatnej odpowiedzi bêd¹ bardziej zrozumia³e. PODZIÊKOWANIE Autorzy serdecznie dziêkuj¹ Panu Profesorowi dr hab. Janowi Kopcewiczowi za cenne wskazówki podczas przygotowywania pracy. LITERATURA [1] ALI R, MA W, LEMTIRI-CHLIEH F, TSALTAS D, LEND Q, Von BODMAN S, BERKOWITZ GA. Heath don't have no mercy and neither does calcium: Arabidopsis cyclic nucleotide-gated channel 2 and innate immunity. Plant Cell 2007; 19: [2] ARISZ SA, TESTERINK C, MUNNIK T. Plant PA signaling via diacylglycerol kinase. Biochim Biophys Acta 2009; 1791: [3] BATELLI G, VERSLUES PE, AGIUS F, QIU Q, FUJII H, PAN S, SCHUMAKER KS, GRILLO S, ZHU JK. SOS2 promotes salt tolerance in part by interacting with the vacuolar H + -ATPase and upregulating its transport activity. Mol Cell Biol 2007; 27: [4] BISWAS KH, SHENOY AR, DUTTA A, VISWESWARIAH SS. The evolution of guanylyl cyclases as multidomain proteins: conserved features of kinase-cyclase domain fusions. J Mol Evol 2009; 68: [5] BOUCHE N, YELLIN A, SNEDDEN WA, FROMM H. Plant-specific calmodulin-binding proteins. Annu Rev Plant Biol 2005; 56: [6] CHIN K, MOEDER W, YOSHIOKA K. Biological roles of cyclic-nucleotide-gated ion channels in plants: What we know and don't know about this 20 members ion channel family. Botany 2009; 87: [7] CHINNUSAMY V, SCHUMAKER K, ZHU JK. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants. J Exp Bot 2004; 55: [8] CHRISTOPHER DA, BORSICS T, YUEN CY, ULLMER W, ANDRME-ONDZIGHI C, ANDRES MA, KANG BH, STAEHLIN LA. The cyclic nucleotide gated channel AtCNGC10 traffics from the ER via Golgi vesicles to the plasma membrane of Arabidopsis root and leaf cells. BMC Plant Biol 2007; 7: 48. [9] DAS R, PANDEY GK. Expressional analysis and role of calcium regulated kinases in abiotic stress signaling. Curr Gen 2010; 1: [10] DeFALCO TA, BENDER KW, SNEDDEN WA. Breaking the code: Ca 2+ sensors in plant signalling. Biochem J 2010; 1: [11] DELK NA, JOHNSON KA, CHOWDHURY NI, BRAAM J. CML24, regulated in expression by diverse stimuli, encodes a potential Ca 2+ sensor that functions in responses to abscisic acid, daylength, and ion stress. Plant Physiol 2005; 139: [12] DODD AN, JAKOBSEN MK, BAKER AJ, TELZEROW A, HOU SW, LAPLAZE L, BARROT L, POETHIG RS, HASELOFF J, WEBB AA. Time of day modulates low-temperature Ca signals in Arabidopsis. Plant J 2006; 48: [13] GOBERT A, PARK G, AMTMANN A, SANDERS D, MAATHUIS FJ. Arabidopsis thaliana cyclic nucleotide gated channel 3 forms a non-selective ion transporter involved in germination and cation transport. J Exp Bot 2006; 57: [14] GUO KM, BABOURINA O, CHRISTOPHER DA, BORSIC T, RENGEL Z. The cyclic nucleotide-gated channel AtCNGC10 transports Ca 2+ and Mg 2+ in Arabidopsis. Physiol Plant 2010; 139: [15] GY I, GASCIOLLI V, LAURESSERGUES D, MOREL JB, GOMBERT J, PROUX F, PROUX C, VAUCHE- RET H, MALLORY AC. Arabidopsis FIERY1, XRN2, and XRN3 are endogenous RNA silencing suppressors. Plant Cell 2007; 19: [16] HIRAYAMA T, SHINOZAKI K. Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era: past, present and future. Plant J 2010; 61:

20 866 K. JAWORSKI, W. GRZEGORZEWSKA, B. ŒWIE AWSKA, A. SZMIDT-JAWORSKA [17] HUNT L, MILLS LN, PICAL C, LECKIE CP, AITKEN FL, KOPKA J, MUELLER-ROEBER B, MCA- INSH MR, HETHERINGTON AM, GRAY JE. Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA. Plant J 2003; 34: [18] JAWORSKI K, SZMIDT-JAWORSKA A, KOPCEWICZ J. Roœlinne kinazy bia³kowe stymulowane wapniem. Post Biochem 2005; 2: [19] KAPLAN B, HERMAN T, FROMM H. Cyclic nucleotide-gated channels in plants. FEBS Lett 2007; 581: [20] KAUR N, GUPTA AK. Signal transduction pathways under abiotic stress in plants. Curr Sci 2005; 11: [21] KIM BH, von ARNIM AG. FIERY1 regulates light-mediated repression of cell elongation and flowering time via its 3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase activity. Plant J 2009; 58: [22] KLIMECKA M, MUSZYÑSKA G. Structure and function of plant calcium-dependent protein kinase. Acta Biochem Pol 2007; 2: [23] KOPCEWICZ J, LEWAK S. Fizjologia roœlin. Wydaw. Nauk. PWN; Warszawa [24] KUDLA J, BATISTIC O, HASHIMOTO K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell 2010; 22: [25] LEE K, SONG EH, KIM HS, YOO JH, HAN HJ, JUNG MS, LEE SM, KIM KE, KIN MC, CHO MJ, CHUNG WS. Regulation of MAPK phosphatase 1 (AtMKP1) by calmodulin in Arabidopsis. J Biol Chem 2008; 35: [26] LI SW, XUE L. The interaction between H 2 O 2 and NO, Ca 2+, cgmp and MAPK during adventitious rooting in mung bean seedlings. In Vitro Cell Dev Biol Plant 2010; 2: [27] LIU HT, GAO F, LI GL, HAN JL, LIU DL, SUN DY, ZHOU RG. The calmodulin-binding protein kinase 3 is part of heat-shock signal transduction in Arabidopsis thaliana. Plant J 2008; 55: [28] LIU HT, LI GL, CHANG H, SUN DY, ZHOU RG, LI B. Calmodulin-binding protein phosphatase PP7 is involved in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell Environ 2007; 30: [29] MA SY, WU WH. AtCPK23 functions in Arabidopsis responses to drought and salt stresses. Plant Mol. Biol 2007; 4: [30] MAATHUIS FJ. cgmp modulates gene transcription and cation transport in Arabidopsis roots. Plant J 2006; 45: [31] MAGNAN F, RANTY B, CHARPENTEAU M, SOTTA B, GALAUD JP, ALDON D. Mutations in AtCML9, a calmodulin-like protein from Arabidopsis thaliana, alter plant responses to abiotic stress and abscisic acid. Plant J 2008; 56: [32] MAHAJAN S, PANDEY GK, TUTEJA N. Calcium- and salt-stress signaling in plants: shedding light on SOS pathway. Arch Biochem Biophys 2008; 471: [33] McCORMACK E, TSAI YC, BRAAM J. Handling calcium signaling: Arabidopsis CaMs and CMLs. Trends Plant Sci 2005; 10: [34] MEIER S, GEHRING C. Emerging roles in plant biotechnology for the second messengers cgmpguanosine 3', 5'-cyclic monophosphate. Afr J Biotech 2006; 19: [35] MEIER S, RUZVIDZO O, MORSE M, DONALDSON L, KWEZI L, GEHRING C. The Arabidopsis wall associated kinase-like 10 gene encodes a functional guanylyl cyclase and is co-expressed with pathogen defense related genes. PLoS ONE 2010; 5: e8904. [36] MICHELL RH. Inositol derivatives: Evolution and functions. Nature Rev Mol Cell Biol 2008; 9: [37] MILLA MAR, UNO Y, CHANG IF, TOWNSEND J, MAHER EA, QUILICI D, CUSHMAN JC. A novel yeast two-hybrid approach to identify CDPK substrates: Characterization of the interaction between AtCPK11 and AtDi19, a nuclear zinc finger protein. FEBS Lett 2006; 3: [38] MONSHAUSEN GB, BIBIKOVA TN, WEISENSEEL MH, GILROY S. Ca 2+ regulates reactive oxygen species production and ph during mechanosensing in Arabidopsis roots. Plant Cell 2009; 21: [39] MUNNIK T, VERMEER JEM. Osmotic stress-induced phosphoinositide and inositol phosphate signaling in plants. Plan Cell Environ 2010; 33: [40] MUNNIK T, TESTERINK C. Plant phospholipid signaling: in a nutshell. J Lipid Res 2009; 50: [41] NEWTON RP, SMITH CJ. Cyclic nucleotides. Phytochem 2004; 65: [42] PARRE E, GHARS MA, LEPRINCE AS, THIERY L, LEFEBVRE D, BORDENAVE M, RICHARD L, MAZARS C, ABDELLY C, SAVOURÉ A. Calcium signaling via phospholipase C is essential for proline accumulation upon ionic but not nonionic hyperosmotic stresses in Arabidopsis. Plant Physiol 2007; 144: [43] PATHARKAR OR, CUSHMAN JC. A novel coiled-coil protein co-localizes and interacts with a calciumdependent protein kinase in the common ice plant during low-humidity stress. Planta 2006; 1: