(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 074 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/ EP 074 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 14/33 (06.01) A61K 39/08 (06.01) A61K 3/74 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Rekombinowane, atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka () Pierwszeństwo: US 7923 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/01 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/08 (73) Uprawniony z patentu: INTERVET INTERNATIONAL B.V., Boxmeer, NL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 074 T3 MARK D. COCHRAN, Carlsbad, US GARY PETERSEN, Omaha, US STEVEN V. LAIR, Temecula, US RICHARD SYNENKI, San Diego, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis ODNOŚNIKI DO ZGŁOSZEŃ POKREWNYCH [0001] To zgłoszenie jest zgłoszeniem nie tymczasowym, które zastrzega pierwszeństwo, zgodnie z 119(e) 3 U.S.C, zgłoszenia tymczasowego USA nr seryjny 60/792,3, złożonego 17 kwietnia 06. DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Ten wynalazek dotyczy atenuowanych organizmów Clostridium, sposobów ich wytwarzania i stosowania oraz mutein toksyny alfa i kodujących je kwasów nukleinowych TŁO WYNALAZKU [0003] Beztlenowe patogeny bakteryjne stanowią poważne obciążenie ekonomiczne dla przemysłu rolnego. Bakterie z rodziny Clostridium są szczególnym obciążeniem, ponieważ bakterie te powodują poważne choroby u drobiu i innych ekonomicznie wartościowych zwierząt domowych. Wcześniejsze wysiłki mające na celu zwalczanie tych organizmów opierały się na środkach sanitarnych i podawaniu antybiotyków w paszy dla zwierząt. [0004] Konkretnie, Clostridium perfringens ( C. perfringens ) jest bakterią beztlenową, która znajduje się w glebie, rozkładając substancję organiczną, a po części we florze jelitowej u ludzi i zwierząt. Różne szczepy C. perfringens są oznaczone jakoe biotypy od A do E, w zależności od spektrum wytwarzanych toksyn [Justin i wsp., Biochemistry 41, (02); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS ; F Domer and J Drews (Red.) Pergamon Press, Oxford]. Szczepy biotypu A są szczególnie ważne jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych. Szczególnie poważną chorobą jelitową wywoływaną przez C. perfringens jest nekrotyczne zapalenie jelit (znane również jako martwicowe zapalenie jelit ), zgorzel jelit skutkująca martwicą, posocznicą i hemolizą, zarówno u ludzi, jak i u zwierząt domowych [patrz, Pearson i wsp., J. Am. Vet. Med. 188(11):19- (1986); Al-Sheikhy and Truscott, Avian Dis. 21(2):26-63 (1977)]. W przypadku ptaków, np. kur (Gallus gallus), zgorzelinowe zapalenie jelit to znaczącym problem. C. perfringens zarówno typu A, jak i typu C, może spowodować znaczne straty, zwłaszcza w produkcji brojlerów [Ficken and Wages, Necrotic Enteritis, W Diseases of Poultry, wyd.., str (1997)]. Oprócz strat związanych z wybuchem nekrotycznego zapalenia jelit, istnieją doniesienia o obniżeniu produktywności w stadach z chorobą związaną z C. perfringens [Lovl and Kaldhusdal, Avian Pathology :73-81 (01)]. Jak wspomniano powyżej, środki antybakteryjne dodawane do paszy są najczęściej stosowaną metodą kontroli. Jednak, środki przeciwbakteryjne, np. antybiotyki, są kosztowne i stanowią przedmiot rosnących obaw związanych z promowaniem oporności bakterii. [000] Niedawno podjęto próby dostarczenia szczepionek przeciwko szkodliwym gatunkom Clostridium. Na przykład, Lovland i wsp. [Avian Pathology 33(1):83-92 (04)] przedstawili szczepionki - kandydatów oparte na toksoidach (anatoksynach) C. perfringens typu A i typu C, z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Doniesiono, że szczepienie kur rodzicielskich dostarcza specyficznych przeciwciał dla ochrony potomstwa przed zmianami jelitowymi wywoływanymi przez subkliniczną prowokację C. perfringens. Znane są inne 1

3 1 2 3 szczepionki oparte na toksoidach, wytworzone z detoksyfikowanych toksyn C. perfringens [patrz np., patent USA nr 4,292,7, który opisuje anatoksyny C. perfringens typów A, B i D, Cl. oedematiens i Cl. septicum]. [0006] Zaproponowano również preparaty rekombinowanych anatoksyn. Na przykład, Titball i wsp., [patenty USA nr,81,827, 6,3,094 oraz,817,317] poinformowali o kwasach nukleinowych, które kodują antygenowe peptydy C. perfringens, jak również same peptydy oraz szczepionki wytworzone z peptydów. Opisane są, na przykład, peptydy, które mają reszty aminokwasowe od 261 do 0 z naturalnej toksyny alfa C. perfringens, ale nie mają domen fosfoplipazy C i hydrolizyn sfinogmieliny naturalnej toksyny. Doniesiono również, że te peptydy indukują ochronę immunologiczną przeciwko naturalnej toksynie. Ponadto patent USA nr 6,6,0 opisuje szczepionkę opartą na fragmencie antygenowy mmuteiny toksyny beta C. perfringens. [0007] Jednak bez względu na to, czy szczepionka anatoksynowa pochodzi z organizmu natywnego, czy jest uzyskana rekombinacyjnie, uważa się, że wytwarzanie i podawanie białek anatoksyny zwierzętom wymagających immunizacji jest uciążliwe ekonomicznie, z wyjątkiem szczególnych okoliczności (np. leczenie ludzi, którzy mogliby być uczuleni albo wrażliwi na inne składniki oparte na całych organizmach). Ponadto, szczepionki oparte na białku/anatoksynie zazwyczaj wymagają powtarzanych szczepień przypominających w celu podtrzymania pełnej skuteczności. [0008] Innym proponowanym rozwiązaniem było skonstruowanie antygenowo aktywnego wirusa, który będzie wytwarzać muteinę toksyny alfa, zamiast toksyny typu dzikiego. Na przykład, Bennet i wsp. [Viral Immunol. 12(2):97- (1999)] przedstawili rekombinowany wektor wirusa krowianki, który wyraża nietoksyczną domenę C toksyny alfa C. perfringens. Niestety, chociaż podczas ostatnich lat zaproponowano kilka rekombinowanych szczepionek opartych na wirusie krowianki, nadal istnieją długotrwałe obawy dotyczące bezpieczeństwa uwalniania do środowiska żywych, zakaźnych wirusów krowianki, które mogłyby być przekazywane tym osobom, które nie są odporne na tego wirusa. [0009] Wiadomo, że toksyna alfa (gen plc) z C. perfringens posiada wiele aktywności biologicznych, w tym aktywność hemolityczną, fosfolipazy C, sfingomielinazy, fosfodiesterazy, oraz działania letalne. Istnieje wiele doniesień w tej dziedzinie dotyczących mutacji tej toksyny alfa, które zmniejszają toksyczność. Schoepe i wsp. [Infect. and Immun. 69(11): (01)] opisują naturalnie występujący szczep C. perfringens, który wytwarza nietoksyczną toksynę alfa. Jednak, byłoby trudne zmodyfikowanie tego szczepu tak, aby wywołać ochronę immunologiczną przeciw innemu wariantowi - toksycznemu gatunkowi C. perfringens typu dzikiego. [00] Williamson i Titball [Vaccine 11(12): (1993)] wykazali, że region toksyny złożony z aminokwasów 247 do 370 był wystarczający do immunizacji myszy przeciwko zgorzeli gazowej wywołanej eksperymentalnie przez C. perfringens. Alape-Girón i wsp. [Eur. J. Biochem. 267: (00)] donieśli, że podstawienia w pozycjach Asp269, Asp336, Tyr27, Tyr7 i Tyr331 zmniejszają toksyczność toksyny alfa. Nagahama i wsp. [Infect. and Immun. 6: (1997)] donieśli, że podstawienia w pozycjach Asp-6, Asp-1 lub Glu-12 powodowały zmniejszenie toksyczności toksyny alfa. Nagahama i wsp. [J. Bacteriology 177: (199)] donieśli, że podstawienie histydyny w pozycji 68 aminokwasem obojętnym, takim jak glicyna, w toksynie alfa C. perfringens spowodowało całkowitą utratę aktywności hemolitycznej, fosfolipazy C, sfingomielinazy i letalej muteiny toksyny alfa. Uważa się, że ta pojedyncza zmiana aminokwasowa inaktywuje jedną z trzech domen białka wiążących cynk. Domena wiążąca cynk inaktywowana przez podstawienie His68 została później nazwana Zn2 [Justin i wsp., Biochemistry 41: (02)]. 2

4 [0011] Schoepe i wsp., Anaerobe, Londyn, GB, tom. 12, nr 1, luty 06, str donoszą o ochronie myszy przed toksyną alfa Clostridium perfringens przez immunizację przy zastosowaniu wariantu 121A/91- R212H toksyny alfa. [0012] Pomimo powyższego, istnieje zapotrzebowanie w tej dziedzinie na bezpieczny, tani i skuteczny sposób ochrony intensywnie hodowanych zwierząt domowych, w tym, ptaków, takich jak kurczęta, przed zakażeniem gatunkami Clostridium, w tym C. perfringens. [0013] Przytoczenie tu dowolnego odnośnika nie może być interpretowane jako przyznanie, że taki odnośnik jest dostępny jako dokument wcześniejszy względem obecnego zgłoszenia. STRESZCZENIE [0014] W celu podjęcia próby przezwyciężenia opisanych powyżej niedociągnięć w tej dziedzinie, obecny wynalazek dostarcza cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium perfringens. [001] Konkretnie, niniejszy wynalazek dostarcza co następuje: 1. Cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium perfringens, gdzie muteina toksyny alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus 9 kolejnych aminokwasów rozciągających się od Trp62 do Trp Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 1, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której te usunięte dziewięć kolejnych aminokwasów są zastąpione przez pojedynczą resztę leucynową. 3. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 1, zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego z SEK ID NR: 2, w której nukleotydy cząsteczki kwasu nukleinowego są usunięte. 4. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 3, w której usunięte nukleotydy są zastąpione przez sekwencję nukleotydową kodującą pojedynczą resztę Leu.. Zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens, przy czym muteina toksyny alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych, które rozciągają się od Tyr62 do Trp Zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens według pkt., w której dziewięć kolejnych aminokwasów jest usuniętych i zastąpionych przez pojedynczą resztę Leu. 7. Zasadniczo nietoksycznego atenuowanego organizmu Clostridium perfringens uzyskanego przez włączenie cząsteczki kwasu nukleinowego według dowolnego z pkt. 1-4 do chromosomu nieatenuowanego organizmu Clostridium perfringens. 8. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 7, w którym cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego toksynę alfa typu dzikiego obecną w nieatenuowanym Clostridium perfringens. 9. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 7 lub pkt. 8, którym jest Clostridium perfringens typu A. 3

5 Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 9-7, przy czym nieatenuowany Clostridium perfringens, z którego został uzyskany, wyizolowano ze zwierzęcia gospodarza, którym jest albo ssak albo ptak. 11. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt., przy czym ten ssak jest wybrany z grupy składającej się z bydła, owiec i świń. 12. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt., przy czym tym zwierzęciem jest kura, indyk, gęś, kaczka, łabędź, gołąb (ang. dove, pigeon), głuszcowaty lub kuropatwa. 13. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 7-12, który zawiera co najmniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostridium perfringens. 14. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 13, gdzie ten polipeptyd nie z Clostridium perfringens jest polipeptydem niebakteryjnym. 1. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 14, gdzie polipeptydem niebakteryjnym jest polipeptyd ptasi lub ssaczy. 16. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 1, gdzie polipeptydem niebakteryjnym jest polipeptyd ptasi. 17. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 1, gdzie polipeptydem niebakteryjnym jest cytokina. 18. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 17, gdzie cytokiną jest kurza IL Atenuowanego Clostridium perfringens, jak określony w poprzednich pkt. 7-18, do zastosowania jako szczepionka w sposobie wywoływania odporności na choroby powodowane przez zakażenie Clostridium perfringens u zwierząt, przy czym ten Clostridium perfringens podaje się w dawce skutecznej immunologicznie.. Atenuowanego Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, przy czym szczepionka jest do podawania drogą doustną, domięśniową, dożylną, doskórną, podskórną lub donosową. 21. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, gdzie szczepionka jest umieszczana na wierzchu paszy dla zwierzęcia. 22. Atenuowanego Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, przy czym szczepionka jest do podawania w postaci spray u zwierzętom do dostarczania do podawania doustnego. 23. Organizmu Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 36-04, mający nr depozytu ATCC PTA Organizmu Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 36-03, mający nr depozytu ATCC PTA Szczepionki zawierającej atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 7-18, 23 lub Szczepionki według pkt. 2, zawierającej ponadto jedną lub więcej z następujących: farmaceutycznie dopuszczalny bufor, substancję pomocniczą lub adiuwant. 27. Paszy dla zwierząt, która zawiera szczepionkę według pkt. 2 lub 26. [0016] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 18 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 12 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usu- 4

6 1 2 3 niętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 9 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 6 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 3 kolejne reszty aminokwasowe, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. [0017] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, która koduje muteinę, w której nie więcej niż 48 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie więcej niż 36 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie więcej niż 24 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie więcej niż 18 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. [0018] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca muteinę, w której dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej SEK. ID. NR: 3, z których jedną jest His 68. W konkretnym wykonaniu tego typu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciąga się od Tyr 62 do Trp 70 w SEK. ID. NR: 3. W dalszym konkretnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której tych usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucynową. [0019] W innym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową z SEK. ID. NR: 2, w której usunięte są nukleotydy W konkretnym wykonaniu tego typu, nukleotydy z sekwencji nukleotydowej SEK. ID. NR: 2 są zastąpione przez trzy nukleotydy, które kodują pojedynczą resztę leucynową. [00] Jak opisano powyżej, wynalazek dostarcza również zasadniczo nietoksycznych mutein toksyny alfa Clostridium perfringens. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 18 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 12 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 9 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 6 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 3 kolejne reszty aminokwasowe, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His 68. [0021] Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 48 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 36 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujaw-

7 1 2 3 niona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 24 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 18 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. [0022] Ujawniona jest ponadto zasadniczo nietoksyczna muteina, w której dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej SEK. ID. NR: 3, z których jedną jest His 68. W bardziej konkretnym wykonaniu tego typu, usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciągało się od Tyr 62 do Trp 70 w SEK. ID. NR: 3. W dalszym konkretnym wykonaniu, w sekwencji aminokwasowej muteiny tych usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucynową. [0023] Wynalazek dostarcza ponadto atenuowanych organizmów Clostridium perfringens, które mają cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium perfringens włączoną do ich chromosomów. Korzystnie, włączona cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do lokalizacji cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje toksynę alfa typu dzikiego w organizmie Clostridium perfringens typu dzikiego. Zatem, atenuowany organizm Clostridium perfringens według wynalazku może być zasadniczo nietoksyczny z powodu braku działającego genu plc typu dzikiego. Jak tu przedstawiono przykładowo, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens może być Clostridium perfringens typu A. [0024] W konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens jest Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin (nr depozytu ATCC PTA7364). W innym konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens jest Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin (nr depozytu ATCC PTA736). [002] Organizm Clostridium perfringens, który jest atenuowany sposobami według niniejszego wynalazku może być wyizolowany od zwierzęcia gospodarza, którym jest bądź ssak, bądź ptak. Takie ssaki mogą obejmować: bydło, owce i świnie. Przykłady odpowiednich ptaków obejmują kury, indyki, kaczki, gołębie (ang. pigeons i doves), gęsi, łabędzie, kuropatwy i głuszcowate. [0026] Niniejszy wynalazek dostarcza również szczepionek. Takie szczepionki mogą zawierać atenuowane organizmy Clostridium perfringens według wynalazku. Szczepionki według wynalazku mogą również zawierać dopuszczalne farmakologicznie bufory, substancje pomocnicze i/lub adiuwanty. [0027] Wynalazek dostarcza ponadto sposobów indukowania odporności na Clostridium perfringens u zwierzęcia. Jedno z takich wykonań obejmuje podawanie zwierzęciu skutecznej immunologicznie dawki szczepionki według niniejszego wynalazku. Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być podawane wieloma drogami, w tym: doustnie, domięśniowo, dożylnie, doskórnie, podskórnie, donosowo. Szczepionka według niniejszego wynalazku może być nałożona na paszę dla zwierząt i/lub rozpylona na zwierzęta w celu jej dostarczenia do podawania doustnego. Wynalazek dostarcza ponadto paszy zwierzęcej, która zawiera szczepionkę według niniejszego wynalazku. [0028] Niniejszy wynalazek dostarcza również atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według niniejszego wynalazku, który, dodatkowo, wyraża co najmniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostridium perfringens. W jednym z takich wykonań jeden lub więcej polipeptydów nie z Clostridium perfringens to polipeptydy bakteryjne, takie jak białka antygenowe z E. coli, Salmonella, Lawsonia lub Campylobacter itd. i/lub ich kombinacje. Alternatywnie albo łącznie z tym, polipeptydem nie z Clostridium perfringens może być polipeptyd niebakteryjny. Przykłady takich polipeptydów niebakteryjnych obejmują białka ssacze lub ptasie, 6

8 1 np. cytokiny, takie jak kurza IL-18, wirusów takich jak rotawirus lub koronawirus; oraz pasożytów, takich jak Eimeria, Isospora i Cryptosporidium. [0029] Ponadto ujawnione jest przeciwciało, które wiąże się swoiście z epitopem, którego brakuje w zasadniczo nietoksycznej muteinie toksyny alfa Clostridium perfringens. Takie przeciwciała mogą odróżnić zasadniczo nietoksyczną muteinę od toksyny alfa Clostridium perfringens typu dzikiego. [00] Ujawnione są też zastawy testowe, które zawierają ujawnione przeciwciała do stosowania w identyfikowaniu, czy dane zwierzę było szczepione lub alternatywnie, zostało naturalnie zakażone organizmem Clostridium perfringens. [0031] A zatem, dostarczone są również sposoby identyfikowania i/lub odróżniania zwierzęcia, które zostało naturalnie zakażone organizmem Clostridium perfringens od tego, które zostało zaszczepione atenuowanym organizmem Clostridium perfringens. W jednym z takich wykonań sposób obejmuje doprowadzenie do kontaktu próbki płynu od zwierzęcia z przeciwciałem, które wiąże się wybiórczo z epitopem znajdującym się w toksynie alfa Clostridium perfringens typu dzikiego, który został usunięty z zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens według niniejszego wynalazku. Zatem, przy pomocy przeciwciała można odróżnić te zwierzęta, które zostały zaszczepione zasadniczo nietoksyczną muteiną toksyny alfa Clostridium perfringens według wynalazku (i/lub atenuowanym organizmem Clostridium perfringens wyrażającym muteinę) od tych, które są zakażone lub były zakażone toksyną alfa Clostridium perfringens typu dzikiego. Następnym krokiem jest określenie, czy przeciwciało reaguje z próbką płynu, np., wiąże się z antygenem zawartym w próbce płynu. Zwierzę identyfikuje się jako takie, które jest/było naturalnie zakażone organizmem Clostridium perfringens, gdy przeciwciało reaguje z próbką płynu. 2 3 KRÓTKI OPIS FIGUR [0032] Fig. 1 przedstawia mapę genomową regionu kodującego toksynę alfa C. perfringens. Pokazane jest położenie, odpowiednio, dwóch dużych fragmentów (1182 par zasad i 1746 par zasad), które były wykorzystywane do wytworzenia CPERF001. Wskazane jest również położenie uzyskanej delecji 27 par zasad. Yplc oznacza gen yplc (CPE003), plc oznacza gen kodujący toksynę alfa (fosfolipazę C), a CobW oznacza gen leżący poniżej. Fig. 2A przedstawia sekwencję części genu plc ze szczepu CP6 C. perfringens [SEK. ID. NR: 4; jest to część SEK. ID. NR: 22, (tj., nukleotydy 262-0) z fragmentu genu plc z CP6] i odpowiadającą mu sekwencję peptydową (SEK ID NR: ), w której podkreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI stosowane przy tworzeniu delecji. Fig. 2B przedstawia sekwencję startera (SEK. ID. NR: 6) stosowaną do utworzenia delecji w rodzicielskim szczepie 12 C. perfringens, z uzyskaniem szczepu z delecją CPERF001. Podkreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI zawarte w starterze dla ułatwienia konstruowania delecji. Przedstawiony jest również odpowiadający temu peptyd (SEK. ID. NR: 7). Figura. 2C przedstawia sekwencję uzyskanej delecji w CPERF001 (SEK. ID. NR: 8; nukleotydy 3-117) i w odpowiadającym temu peptydzie (SEK. ID. NR: 9). Podkreślenie wskazuje przywrócone miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej BamHI. Fig. 3A przedstawia ponownie sekwencję części genu plc ze szczepu CP6 C. perfringens [SEK. ID. NR: 4, nukleotydy 262-0] i odpowiadającą jej sekwencję peptydową (SEK. ID. NR: ), w której podkreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI stosowane przy tworzeniu delecji. 7

9 Fig. 3B przedstawia sekwencję startera (SEK. NR. ID: ) stosowanego do utworzenia delecji w rodzicielskim szczepie 29 C. perfringens, dającej początek szczepowi CPERF002 z delecją. Przedstawiony jest również odpowiedni peptyd (SEK. ID. NR: 11). Fig. 3C przedstawia sekwencję uzyskanej delecji w CPERF002 (SEK. ID. NR: 12) i odpowiedni peptyd (SEK. ID. NR: 13). SZCZEGÓŁOWY OPIS [0033] Zatem, wynalazek dostarcza zmodyfikowanych organizmów i hodowli organizmów Clostridia, które wyrażają jedną lub więcej toksyn Clostridia, np. toksyn alfa, takich jak muteiny, które nie mają wykrywalnej toksyczności i/lub mają zasadniczo niską toksyczność w porównaniu z toksynami Clostridia natywnymi lub typu dzikiego. Korzystnie, zmutowane organizmy C. perfringens według wynalazku można łatwo podawać zwierzętom jako żywą szczepionkę. Dostarczone są również muteiny toksyn alfa C. perfringens według wynalazku, wraz z cząsteczkami kwasu nukleinowego, które kodują muteiny, wektorami do ekspresji toksyn alfa i sposobami ich stosowania. [0034] W celu dostarczenia jasnego opisu wynalazku, kilka terminów jest zdefiniowanych jak następuje. Szczepionka jest kompozycją, która zawiera immunogen i inne ewentualne dopuszczalne farmaceutycznie składniki, obejmujące, w niektórych wykonaniach, odpowiednie adiuwanty. Stosowany tu termin immunogen opisuje kompozycję, substancję lub wektor, który po wprowadzeniu do organizmu zwierzęcia, stymuluje odpowiedź odpornościową. Dla celów niniejszego wynalazku, przyjmuje się, że immunogen obejmuje dowolny wektor zdolny do ekspresji lub wprowadzania muteiny toksyny alfa według wynalazku do zwierzęcia, które ma być immunizowane. Wektor obejmuje, np., C. perfringens według wynalazku lub inny odpowiedni drobnoustrój, który wyraża muteinę toksyny alfa według wynalazku, gdy wektor jest wprowadzony do zwierzęcia. Wektor obejmuje również cząsteczki kwasu nukleinowego znane w tej dziedzinie, np. plazmidy i tym podobne, które ulegają ekspresji do muteiny toksyny alfa według wynalazku, gdy są wprowadzone bezpośrednio do zwierzęcia, np. przez wniknięcie do komórki zwierzęcia i wyrażenie muteiny toksyny alfa u zwierzęcia. Immunogenem jest również białko, takie jak toksyna alfa według wynalazku, zastosowane samo lub jako część odpowiedniej kompozycji szczepionki. [003] Stosowane tu terminy immunizować i szczepić, o ile nie zaznaczono, że jest inaczej, są synonimami i są stosowane zamiennie dla opisania wprowadzania immunogenu do zwierzęcia w celu wzbudzania odpowiedzi odpornościowej u zwierzęcia. Wzbudzona odpowiedź odpornościowa dostarcza traktowanemu zwierzęciu ochronnej odporności, która ogranicza lub zmniejsza oznaki kliniczne choroby, np., zgorzeli gazowej i/lub śmiertelności u zaszczepionych zwierząt, które są później prowokowane wirulentną dawką gatunku C. perfringens, dla których szczepionka według wynalazku jest ochronna. [0036] Termin adiuwant jest zdefiniowany jako jedna lub więcej substancji, które powodują stymulację układu odpornościowego. W tym kontekście, adiuwant jest stosowany do wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej wobec jednego lub większej liczby antygenów/izolatów szczepionkowych. Adiuwant można podawać docelowemu zwierzęciu przed, w kombinacji z lub po podaniu szczepionki. Adiuwanty według wynalazku można uzyskać z dowolnego z wielu źródeł, w tym ze źródeł naturalnych, źródeł rekombinowanych i/lub są one syntetyzowane chemicznie, itd. Przykłady związków chemicznych stosowanych jako adiuwanty obejmują, ale nie wyłącznie, związki glinu, metabolizowane i niemetabolizowane oleje; polimery blokowe; ISCOM (kompleksy immunostymulujące); witaminy i minerały (w tym, ale nie wyłącznie: witaminę E, witaminę A, 8

10 1 2 3 selen, witaminę B12); Quil A (saponiny); usieciowane polimery oparte na kwasie akrylowym (np. polimery kwasu prop-2-enowego), usieciowane do różnych poziomów z polieterem polialkenylowym, jak sprzedawane pod znakiem towarowym CARBOPOL ; i/lub jednorodnie zdyspergowane, rozmiarów mikronowych, kropelki emulsji wodnej, np., jak sprzedawane pod znakiem towarowym Emulsigen. [0037] Dodatkowe przykłady adiuwantów, które są niekiedy konkretnie określane wyraźnie jako immunostymulatory, obejmują składniki ściany komórkowej bakterii i grzybów (np. lipopolisacharydy; lipoproteiny, glikoproteiny, muramylopeptydy, beta-1,3/1,6-glukany), różne węglowodany złożone pochodzące z roślin (np. glikany, acemannany), różne białka i peptydy pochodzące ze zwierząt (np. hormony, cytokiny, czynniki kostymulujące) i nowe kwasy nukleinowe pochodzące z wirusów i innych źródeł (np. dwuniciowy RNA, CpG). Ponadto, dowolna liczba kombinacji wyżej wymienionych substancji może dostarczyć działania adiuwantowego, a zatem może stanowić adiuwant według niniejszego wynalazku. [0038] Stosowany tu termin przeciwciało, ma obejmować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne i/lub ich fragmenty lub rekombinowane pochodne, w tym skonstruowane białka wiążące zawierające domeny zmienne przeciwciał. [0039] Stosowana tu numeracja reszt i pozycji reszt aminokwasowych białek toksyny alfa według wynalazku opiera się na systemie numeracji opisanym dla szczepu 13 Clostridium perfringens. Toksyna alfa ze szczepu 13 C. perfringens jest opisana pod numerem dostępu GenBank NC , jak pokazano w SEK. ID. NR: 1. Całe białko ma długość 398 aminokwasów. Toksyna alfa kodowana przez wektory dla muteiny przedstawione tu przykładowo poniżej odpowiadają białku z SEK. ID. NR: 1 mającego delecję reszt aminokwasowych Jest tam 28-aminokwasowa sekwencja sygnałowa, która jest odcinana podczas dojrzewania białka. Zatem przykładowa delecja odpowiada resztom aminokwasowym dojrzałego białka, które ma długość 370 aminokwasów (SEK. ID. NR: 3). [00] Numeracja kodonów w DNA kodującym białka toksyny alfa według wynalazku opiera się na genie plc szczepu 13 Clostridium perfringens, jak opisano w GenBank nr dostępu NP 6092 i jak pokazano w SEK. ID. NR: 2. Sekwencja kodująca dla toksyny alfa rozciąga się od nukleotydu 4890 do w szczepie 13 C. perfringens. Delecja kodonów w przedstawionych tu przykładowo dwóch konstruktach odpowiada nukleotydom 4887 do (włącznie) genu NP Delecja ta znajduje się w obrębie genu toksyny alfa i odpowiada nukleotydom w sekwencji kodującej SEK. ID. NR: 2. [0041] Ponadto, stosowanie terminów w liczbie pojedynczej dla wygody w opisie nie ma na celu stanowienia jakiegokolwiek ograniczenia. Zatem, na przykład, odniesienie się do kompozycji zawierającej komórki C. perfringens obejmuje odniesienie się do jednej lub większej liczby takich komórek. [0042] W konkretnym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczone są nierewertujące mutanty C. perfringens, które są zasadniczo nietoksyczne, tj., organizmy, które wyrażają immunogenną toksynę alfa o małej toksyczności lub bez, co czyni je odpowiednimi do stosowania jako szczepionki ochronne. Organizmy C. perfringens według wynalazku wykazują zatem odpowiednio zmniejszoną toksyczność w stosunku do organizmów C. perfringens typu dzikiego, aby sprawić, że są dopuszczalne jako szczepionka lub antygen, gdy stosuje się je w warunkach skutecznych do wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej anty-toksyna alfa lub anty-c-perfringens u zwierzęcia, które zostało tak zaszczepione. A zatem, organizm C. perfringens według wynalazku jest atenuowany w stosunku do C. perfringens typu dzikiego. [0043] Zwrot zasadniczo nietoksyczny ma mieć również zastosowanie do wyżej wymienionych immunogennych mutein toksyny alfa, które mają wystarczająco niską toksyczność lub brak, co sprawia, że są odpowiednie także do stosowania w szczepionce ochronnej. 9

11 1 2 3 [0044] Zmniejszenie toksyczności mierzy się, np., jednym z następujących testów znanych w tej dziedzinie: aktywności hemolitycznej, aktywności fosfolipazy C, aktywności sfingomielinazy, aktywności fosfodiesterazy i ogólnej aktywności letalnej w grupie badanych zwierząt. Na ogół w takich standardowych testach resztkowa toksyczność nie jest wykrywalna. Jednak obecność minimalnego poziomu jednej lub większej liczby tych aktywności, np., od około -4 do około -2, w odniesieniu do toksyczności równoważnej liczby jednostek zakaźnych toksyny alfa C. perfringens typu dzikiego, z której muteina pochodzi, może okazać się dopuszczalna w warunkach weterynaryjnych. [004] W jednym z wykonań, wynalazek jest wykonywany z zastosowaniem biotypu A szczepów C. perfringens, które mają szczególne znaczenie jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych. Konkretnie, toksyna alfa z C. perfringens jest celem dla delecji-atenuacji, ponieważ osłabienie tej toksyny jest wystarczające dla uczynienia C. perfringens wystarczająco nieletalnym w stosunku do szczepów typu dzikiego. [0046] Ogólnie, gen plc C. perfringens wyraża muteinę toksyny alfa. [0047] Muteina toksyny alfa ma delecję, która obejmuje His z pętli Zn2, razem z resztami flankującymi, w celu znacznego zmniejszenia możliwości jakiegokolwiek mutacji powrotnej do postaci toksycznej. Obecnie stwierdzono, że delecja reszty His z pętli Zn2, np. His 68 z SEK. ID. NR: 3, wraz z delecją dodatkowych reszt flankujących resztę His z pętli Zn2 zapewnia zachowanie dostatecznej immunogenności toksyny alfa dla indukowania ochronnej odporności u zwierząt zaszczepionych C. perfringens według wynalazku, przy czym jest także mało prawdopodobne, aby podlegała mutacji powrotnej do kodowania toksyny alfa typu dzikiego. Dodatkowe reszty, które można usunąć, są usuwane w kierunku końca C i/lub w kierunku końca N, w stosunku do His 68, a ich liczba może wahać się od około 4 do około 60 reszt w obydwu tych kierunkach. Alternatywnie, w podobny sposób mogą być usunięte His 148 i reszty flankujące. [0048] Jedna z mutein toksyny alfa zawiera także, oprócz delecji His 68, delecję co najmniej reszt aminokwasowych, z każdej strony (w kierunku końca C i/lub w kierunku końca N) pozycji His 68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Opisana muteina toksyny alfa zawiera, oprócz delecji His 68, delecję co najmniej reszt aminokwasowych z każdej strony His 68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Opisana muteina toksyny alfa zawiera, oprócz delecji His 68, delecję co najmniej reszt aminokwasowych z każdej strony His 68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Muteina toksyny alfa według wynalazku zawiera delecję od około reszty 62 do około reszty 70, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Ewentualnie, usunięte reszty aminokwasowe są zastąpione przez jedną lub więcej innych reszt, na przykład, przez pojedynczą resztę leucynową. [0049] W jeszcze dalszym, innym aspekcie, muteina toksyny alfa C. perfringens jest wytwarzana i izolowana z C. perfringens lub z alternatywnego rekombinowanego organizmu do zastosowania jako odczynnik do badań i/lub w zestawach diagnostycznych lub testach, np. jako cel dla przeciwciał anty-toksyna alfa. Jeszcze innym zastosowaniem białek mutein toksyny alfa C. perfringens są wyspecjalizowane szczepionki dla zwierząt, np. ludzi, którzy mogą nie tolerować szczepienia atenuowanym organizmem C. perfringens według wynalazku. [000] Ponadto, ujawnione jest przeciwciało, które wiąże się swoiście z toksyną alfa typu dzikiego w stosunku do mutein toksyny alfa według niniejszego wynalazku. [001] Ujawnione jest ponadto przeciwciało, które wiąże się selwktywnie z białkiem toksyny alfa C. perfringens typu dzikiego, wykazując minimalne lub brak wiązania z muteiną toksyny alfa według wynalazku, np. unikając wiązania się z muteiną toksyny alfa, która ma delecję, jak opisano szczegółowo powyżej. Dostar-

12 1 2 3 czone przeciwciało jest zatem przydatne do odróżniania muteiny toksyny alfa z delecją od toksyny alfa typu dzikiego, a zatem jest również przydatne do rozróżniania zwierząt zaszczepionych szczepionką według niniejszego wynalazku od zwierząt, które zostały zakażone C. perftingens typu dzikiego. Sposoby wzbudzania i wyszukiwania takich wybiórczych przeciwciał są znane w tej dziedzinie. Podobnie, można wytwarzać przeciwciała, które rozpoznają muteinę toksyny alfa według niniejszego wynalazku, ale nie białko typu dzikiego. Przeciwciała mogą być poliklonalne, monoklonalne ( mab ) albo fragmentami lub fragmentami uzyskanymi na drodze inżynierii genetycznej lub pochodnymi takich przeciwciał zachowującymi właściwości swoistego wiązania. [002] Techniki wytwarzania i wyszukiwania przeciwciał monoklonalnych zostały obszernie opisane [patrz, np., Stites. i wsp. (red.) Basic and Clinical Immunology (wyd. 4.), Lange Medical Publications, Los Altos, California (1988); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wyd. 2.), Academic Press, New York (1986); i Kohler and Milstein, Nature 26: (197). [003] Na przykład i bez ograniczeń, odpowiedź odpornościowa jest wzbudzana w odpowiednich zwierzętach, takich jak mysz lub kura, przez szczepienie oczyszczonym białkiem toksyny alfa C. perfringens typu dzikiego, np. łącznie z odpowiednim adiuwantem. Na przykład, w celu uniknięcia toksyczności białka alfa typu dzikiego, immunogenem jest peptyd odpowiadający usuniętym resztom i, jeśli to konieczne, immunogenność peptydu jest wzmacniana przez skojarzenie z odpowiednim adiuwantem lub połączenie z odpowiednim białkiem nośnikowym. Łączenie z białkiem nośnikowym jest znane w tej dziedzinie i można je przeprowadzić, np. przez dostarczenie peptydu z końcową cysteiną i przyłączenie go do hemocyjaniny ze skałoczepa (KLH,) lub albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) stosując bądź reakcję chemiczną z użyciem maleimidu, bądź łącznika sulfosukcynimidylo-4-[n maleimidometylo]cykloheksano-1-karboksylowego (od Pierce). Można również zastosować łącznik karbodiimidowy bez wymogu końcowej cysteiny. [004] Aby uzyskać przeciwciała monoklonalne, od immunizowanego zwierzęcia można otrzymać limfocyty śledzionowe, wytworzyć z tych limfocytów hybrydoma i można otrzymać jedną lub większą liczbę tych potencjalnie odpowiednich hybryda wyrażających przeciwciało anty-białko toksyny alfa. Hybrydoma przeszukuje się pod kątem zarówno muteiny, jak i białka alfa typu dzikiego i hybrydoma wyrażające przeciwciało, które wiąże się tylko z toksyną alfa typu dzikiego identyfikuje się, klonuje i wykorzystuje do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się tylko z białkiem toksyny alfa typu dzikiego. Ewentualnie, ze zidentyfikowanej klonalnej linii hybrydoma otrzymuje się cdna i przeciwciała rekombinowane lub fragmenty przeciwciał można wytwarzać w innych, dobrze znanych w tej dziedzinie, układach ekspresyjnych. [00] Jak omówiono powyżej, jedną z potencjalnych wad szczepienia jest na ogól to, że uzyskane szczepione zwierzęta mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie, gdy testuje się je pod kątem zakażenia stosując przeciwciała przeciw naturalnie występującemu szczepowi, co utrudnia identyfikację zwierząt zakażonych. Zatem, ujawniony jest zestaw testowy do odróżniania osobników zwierząt, które zostały zakażone występującym naturalnie organizmem C. perfringens, od tych zaszczepionych muteiną toksyny alfa według niniejszego wynalazku. [006] Jeden z takich zestawów testowych zawiera ilość wybiórczego przeciwciała anty-toksyna alfa typu dzikiego, które wykazuje minimalne lub nie wykazuje wiązania z muteiną toksyny alfa według wynalazku. Zestaw może również zawierać inne odpowiednie odczynniki, wystarczające do przeprowadzenia co najmniej jednego testu diagnostycznego. W dalszym wykonaniu, przeciwciało zawiera znacznik lub jest wyznakowane łatwo wykrywalną resztą markerową, np. dowolnym znanym w tej dziedzinie markerem enzymatycz- 11

13 1 nym, np. peroksydazą; znacznikiem fluorescencyjnym, np. fluoresceiną; kulkami, w tym, kulkami magnetycznymi; i tym podobnymi. Ewentualnie, zestaw może ponadto zawierać znakowane przeciwciało, które wiąże się wybiórczo z wybiórczym przeciwciałem anty-toksyna alfa typu dzikiego. Testy immunologiczne są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują kanapkowy test immunologiczny, konkurencyjny test immunologiczny, enzymatyczne testy immunosorpcyjne (ELISA, testy radioimmunologiczne (RIA) i inne. [007] Dostarczone są również sposoby identyfikacji i odróżniania zwierzęcia, które zostało zakażone przez organizm C. perfringens występujący naturalnie, tj. typu dzikiego, od zwierzęcia zaszczepionego szczepionką zawierającą atenuowany organizm C. perfringens według wynalazku, które przeprowadza się na przykład, w następujących etapach: (a) kontaktowanie próbki płynu od zwierzęcia z opisanym powyżej wybiórczym przeciwciałem antytoksyna alfa typu dzikiego, które wykazuje minimalne lub nie wykazuje wiązania z muteiną toksyny alfa według niniejszego wynalazku; i (b) ustalenie, czy przeciwciało reaguje z próbką płynu; przy czym, gdy przeciwciało reaguje z próbką płynu, zwierzę jest identyfikowane jako to, które zostało zakażone organizmem C. perfringens występującym naturalnie. Wytwarzanie atenuowanych szczepów C. perfringens 2 3 [008] Proces przekształcania izolatu C. perfringens typu dzikiego w szczep atenuowany lub zasadniczo nietoksyczny, odpowiedni do podawania jako szczepionka, można przeprowadzić jak następuje. Gen toksyny alfa (plc) można zastąpić na chromosomie bakteryjnym genem kodującym jedynie muteinę toksyny alfa, nie pozostawiając żadnej zdolności organizmu C. perfringens do wytwarzania toksyny alfa typu dzikiego. Bardzo szeroko, proces wytwarzania organizmu szczepionkowego obejmuje, ale nie wyłacznie, następujące ogólne etapy, niekoniecznie w podanej kolejności. (1) Identyfikacja typu zwierzęcia, które ma być chronione przez szczepienie i jednego lub więcej izolatów klinicznych uzyskanych dla celów badań przesiewowych. Etap ten jest zazwyczaj opcjonalny w przypadku toksyny alfa, ponieważ izolaty z jednego gatunku zwierzęcia prawdopodobnie nie będą zapewniać ochrony innym gatunkom zwierząt. (2) Powielenie genu plc z izolatu lub izolatów C. perfringens, np. przez zastosowanie reakcji PCR lub innej znanej w tej dziedzinie techniki amplifikacji kwasu nukleinowego, z odpowiednimi starterami flankującymi i zastosowanie amplifikacji z odpowiednimi starterami w celu utworzenia żądanej mutacji delecyjnej. Alternatywnie, można przeszukać odpowiednią bibliotekę z użyciem sondy. (3) Wytworzenie wektora samobójczego zawierającego gen plc z delecją, z którego usunięty został początek replikacji C. perfringens i/lub początek replikacji, który może replikować się w C. perfringens po prostu nie jest tam obecny; i w każdym przypadku obejmującego odpowiednie markery selekcyjne, np. markery antybiotykowe, sąsiadujące ze zmutowanym genem plc. Taki wektor można następnie wprowadzić do organizmów C. perfringens, np. przez elektroporację lub innymi metodami znanymi w tej dziedzinie. (4) Selekcjonowanie organizmów C. perfringens, w których gen plc dla muteiny został z powodzeniem włączony do chromosomu bakteryjnego. Dokonuje się tego przez hodowanie organizmów C. perfringens z etapu (3) w obecności czynnika selekcyjnego, np. antybiotyku(ów) odpowiadającego(ych) markerom selekcyjnym. Na przykład, tylko organizm C. perfringens, który rósłby w warunkach selekcji na 12

14 1 2 3 antybiotyk byłby takim, który przez rekombinację homologiczną ma bezpośrednio włączony do chromosomu bakteryjnego wektor samobójczy z jego genem(ami) oporności na antybiotyki. Te rosnące organizmy C. perfringens miałby zatem dwa sąsiadujące geny plc, jeden będący typu dzikiego, podczas gdy drugi miałby mutację delecyjną. () Selekcjonowanie organizmów C. perfringens, w których nastąpiło dalsze zdarzenie rekombinacyjne, które usuwa markery selekcyjne, np. markery antybiotykowe, wraz genem plc typu dzikiego. Dokonuje się tego przez hodowlę organizmów z (4) w nieobecności czynnika selekcyjnego, np. antybiotyku i selekcjonowanie klonów niehemolitycznych na agarze z krwią. [009] Ponieważ wprowadzenie kwasu nukleinowego dla muteiny można osiągnąć na drodze rekombinacji homologicznej, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca muteinę toksyny alfa jest włączana w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej toksynę alfa typu dzikiego, która jest obecna w nieatenuowanym Clostridium perfringens. [0060] Bardziej szczegółowo, izolaty polowe C. perfringens otrzymuje się od chorych zwierząt lub z innych źródeł. Początkowo, genomowy DNA uzyskany z izolatów polowych będących przedmiotem zainteresowania wstawia się do odpowiedniego wektora wahadłowego dla dwóch mikroorganizmów, np. plazmidu wahadłowego z markerami selekcyjnymi, np. markerami antybiotykowymi, w celu zbadania ich zdolności do transformacji. Ogólnie, odpowiedni wektor wahadłowy będzie obejmować jedną, dwie, trzy lub więcej z następujących właściwości: miejsce do klonowania, początek replikacji C. perfringens, początek replikacji E. coli i gen oporności na antybiotyk i/lub marker selekcyjny. Znane w tej dziedzinie wektory odpowiednie do tego celu lub podlegające łatwej adaptacji do tego celu obejmują, na przykład, rekombinowany plazmid wahadłowy phr6 opisany przez Robertsa i wsp., [Appl. Env Mircobiol 4: (1988)]; plazmidy pjir70 i pjir71 opisane przez Bannama i wsp. [Plasmid 29: (1993)]; bezpromotorowy wektor ppsv do selekcji promotorów według Matsushita i wsp., 1994, Plasmid ; plazmidy wahadłowe pjir146 i pjir147, opisane przez Lyrasa i wsp., 1988, Plasmid 39, oraz wektor wahadłowy pak1, opisany przez Kim i wsp., 1989, Appl. Environ Microbiol, Usunięcie początku replikacji C. perfringens przekształca wektor wahadłowy w wektor samobójczy. [0061] Na przykład, jednym z plazmidów wahadłowych jest pjir418, opisany przez Sloan i wsp., 1992, Plasmid 27, [0062] Izolaty dające 4 transformantów na mikrogram plazmidowego DNA i które są wrażliwe na marker antybiotykowy np. chloramfenikol lub erytromycynę, są potencjalnymi kandydatami dla delecji. Genomowy DNA ze szczepów - kandydatów stosuje się następnie jako matrycę do reakcji PCR o dalekim zasięgu dla genu plc (toksyny alfa) i sekwencji flankujących ze szczepów - kandydatów. Na przykład, jak przedstawiono dla przykładu poniżej, chromosom szczepu 13 C. perfringens zastosowano do identyfikacji starterów do amplifikacji genu kodującego toksynę alfa. Startery zastosowano następnie do klonowania genu toksyny alfa z innego szczepu, który był izolatem CP6 z drobiu. [0063] Po subklonowania produktów PCR gen toksyny alfa i regiony flankujące poddano sekwencjonowaniu i mapowaniu restrykcyjnemu. Zsyntetyzowano nowe startery oligonukleotydowe z flankującymi miejscami restrykcyjnymi i produkty z dwóch oddzielnych amplifikacji sklonowano do odpowiedniego plazmidu samobójczego (początek replikacji C. perfringens został usunięty), np. jak przedstawiono dla przykładu poniżej, jako plazmid , w celu wytworzenia żądanego szczepu szczepionkowego z delecją. [0064] Dostarczony(e) wektor(y) samobójczy(e) swoisty(e) dla izolatu(ów) wprowadza się do odpowiedniego szczepu zwierzęcego C. perfringens dowolną standardową metodą znaną w tej dziedzinie. Na przykład, 13

15 1 dokonuje się tego przez elektroporację. Gdy wektor samobójczy (bez początku replikacji C. perfringens) wprowadza się do C. perfringens, jest on niezdolny do replikacji w cytoplazmie i przeżycia, o ile nie włączy się z powodzeniem do chromosomu bakteryjnego. Jedynymi organizmami, które będą rosły w obecności antybiotyku odpowiadającemu nowo wprowadzonemu genowi markera antybiotykowego, są integranty. [006] Można zastosować dowolny znany w tej dziedzinie gen markera selekcyjnego, chociaż w wektorach przedstawionych przykładowo poniżej użyte są markery: chloramfenikol i/lub erytromycyna. [0066] Te zdarzenia rekombinacyjne są wynikiem homologii genu plc typu dzikiego z genem plc z delecją w DNA plazmidowym. Uzyskane rekombinowane bakterie są nazywane integrantami. Integrant zawiera kopię wprowadzonego wektora z homologią, który jest włączony w locus genu plc. Zatem uzyskany w rezultacie integrant zawiera dwie kopie genu plc, oryginalną kopię prawidłową i wprowadzoną wersję z delecją. Wprowadzone geny oporności na antybiotyki znajdują się między dwiema kopiami genu plc. Między dwiema kopiami genu plc mogą pojawić się rzadkie zdarzenia rekombinacji losowej. To zdarzenie rekombinacji może dać jeden z dwóch wyników. W obu przypadkach zostaje usunięty DNA znajdujący się między dwiema kopiami genu plc (w tym geny odporności). Jako pierwszy wynik, odtworzony zostaje gen plc prawidłowy lub typu dzikiego, w rezultacie czego następuje odzyskanie wyjściowego szczepu rodzicielskiego bez markerów antybiotykowych. Jako drugi wynik, gen plc typu dzikiego jest zastępowany przez kopię z delecją, dając pożądany konstrukt dla toksyny alfa z delecją bez markerów antybiotykowych. [0067] Usunięcie antybiotyków z pożywki hodowlanej umożliwia tym bakteriom, w których nastąpiła rekombinacja, przeżycie i replikację. Rekombinowane klony delecyjne identyfikuje się przez wzrost na agarze z krwią, bez hemolizy normalnie wykazywanej przez C. perfringens, który wyraża toksynę alfa typu dzikiego. Zwierzęta do szczepienia 2 3 [0068] Zwierzęta, dla których można wytworzyć szczepionkę z atenuowanym C. perfringens i dla których można wyizolować przydatne szczepy C. perfringens typu dzikiego, obejmują ogólnie, dowolne zwierzęta, dla których zakażenie C. perfringens stanowi problem. Kręgowce będące przedmiotem zainteresowania obejmują ptaki, ssaki i ryby, a zwłaszcza zwierzęta ważne w gospodarce i/lub rolnictwie. Poniższa lista zwierząt to te, które jak się uważa, odniosą korzyść ze szczepionki z C. perfringens, i/lub od których można uzyskać izolaty C. perfringens typu dzikiego. Chociaż możliwe jest czasami, że takie szczepionki zawierają składnik (żywy lub nieżywy), który został pierwotnie wyizolowany z tego samego rodzaju lub gatunku zwierzęcia, który ma być szczepiony, nie stanowi to wymogu. [0069] Nieograniczająca lista takich zwierząt obejmuje te z rodzin ptaków, bydła, owiec, itd., jak również zwierząt wodnych, np. które mogą być poddane akwakulturze i/lub zbierane ze środowiska naturalnego i utrzymywane przy życiu w zbiornikach przez czas przed sprzedażą. Obejmuje to ryby, takie jak pstrąg lub łosoś i inne gatunki hodowane lub zbierane dla korzyści ekonomicznych. Zwierzęta wodne inne niż kręgowce obejmują homary, kraby, mięczaki, np., kalmary, ośmiornice, małże, ostrygi, ślimaki, przegrzebki i tym podobne. Określenie ptasi ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, kury, indyki,, gęsi, kaczki itp. Określenie bydlęcy ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, bydło, wołowina, cielęcina itp. Określenie owczy ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, jagnię, itp. [0070] Dla celów niniejszego wynalazku, termin ryba ma być rozumiany, jako obejmujący, ale nie wyłącznie,, zgrupowanie ryb Teleosti, tj. doskonałokostnych. W obrębie ugrupowania Teleosti zawarty jest zarów- 14

16 no rząd Salmoniformes (który obejmuje rodzinę Salmonidae), jak i rząd Perciformes (który obejmuje rodzinę Centrarchidae). [0071] Przykłady potencjalnych ryb - biorców obejmują m.in. rodzinę Salmonidae, rodzinę Serranidae, rodzinę Sparidae, rodzinę Cichlidae, rodzinę Centrarchidae, rybę z rodziny luszczowanych (Parapristipoma trilineatum) i plekostomusa niebieskookiego (Plecostomus spp.). Rodzina Salmonidae NAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWA Coregonus clupeaformis Sieja amerykańska Coreqonus hoyi Ryba siejowata Oncorhynchus keta Keta (gatunek łososia) Oncorthynchus gorbuscha Gorbusza Oncorhynchus kisutch Kiżucz (łosoś srebrny) Oncorhynchus masou Sima Oncorhynchus nerka Nerka Oncorhynchus tshawytscha Czawycza(łosoś królewski) Prosopium cylindraceum Koniek, wałek Oncorhynchus clarki Łosoś Clarka Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy Salmo salar Łosoś szlachetny, łosoś atlantycki Salmo trutta Troć wędrowna Salmo trutta X S. fontinalis Hybrydowy pstrąg tygrysi Salvelinus alpinus Golec zwyczajny Salvelinus confluentus Pstrąg byczy Salvelinus fontinalis Pstrąg źródlany Salvelinus leucomaenis Kundża Salvelinus malma Malma Salvelinus namaycush Palia jeziorowa, palia amerykańska Thymallus thymallus Lipień pospolity Niektórzy przedstawiciele rodziny Serranidae NAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWA Centropristis ocyurus ang. Bank sea bass Centropristis philadelphicus ang. Rock sea bass Centropristis striata strzępiel czarny Diplectrum bivittatum ang. Dwarf sandperch Diplectrum formosum Strzępiel piaskowy Epinephelus flavolimbatus Granik strojny Epinephelus morio Granik morio Serranus phoebe ang. Tattler Serranus tortuqarum ang. Chalk bass Niektórzy przedstawiciele rodziny Sparidae NAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWA Archosarqus probatocephalus Sparus owczarz Archosarqus rhomboidalis Sparus jednoplamy Calamus penna ang. Sheepshead porgy Laqodon rhomboides ang. Pinfish Pagrus Major Pagrus japoński Sparus aurata Dorada Stenotomus chrysops Skap Niektórzy przedstawiciele rodziny Cichlidae NAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWA Aequidens latifrons Akra błękitna Cichlisoma nigrofasciatum Pielęgnica zeba Crenichichla sp. ang. Pike cichlid Pterophyllum scalare Skalar 1

17 Tilapia mossambica Tilapia mozambicka Oreochromis spp Tilapia Sarotherodon aurea Tilapia złota Niektórzy przedstawiciele rodziny Centrarchidae NAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWA Ambloplites rupestris Bass czerwonooki Centrarchus macropterus Bass pawik, okoń pawik Okoń moczarowy Elassoma okefenokee ang. Okefenokee pigmy sunfish Elassoma zonatum Okończyk paskowany Enneacanthus gloriosus Bassek diamentowy Enneacanthus obesus Bassek zielony Lepomis auritus Bass różowy Lepomis cyanellus Bass zielony Lepomis cyanellus X L. qibbosus Bass zielony x bass słoneczny Lepomis gibbosus Bass słoneczny, słonecznica pstra Lepomis gulbsus ang. Warmouth Lepomis humilis ang. Orange-spotted sunfish Lepomis macrochirus Bass pręgowany, bass błękitnoskrzelny, bass niebieski Lepomis megalotis ang. Longear sunfish Micropterus coosae ang. Shoal bass Micropterus dolomieui Bass małogębowy Micropterus punctulatus ang. Spotted bass Micropterus salmoides Bass wielkogębowy, okoniopstrąg Pomoxis annularis Bass biały Pomoxis nigromaculatus Bass czarny [0072] W dalszym wykonaniu, zwierzęciem jest zwierzę do towarzystwa lub człowiek. Dla celów niniejszego wynalazku, termin zwierzę do towarzystwa ma być rozumiany jako obejmujący wszystkie zwierzęta - konie (koniowate), koty (kotowate), psy (psowate) i gryzonie, w tym,gatunki myszy, szczurów, świnek morskich, królików oraz ptaki, takie jak gołębie, papugi, i tym podobne. [0073] Ptaki otrzymujące takie szczepienie mogą być związane bądź z komercyjną, bądź z niekomercyjną hodowlą ptaków. Obejmuje to np. Anatidae, takie jak łabędzie, gęsi i kaczki, Columbidae, np. gołębie (ang. doves and pigeons), takie jak gołębie domowe, Phasianidae, np. kuropatwę, głuszcai indyki, Thesienidae, np. kury domowe, Psittacines, np. papużki, ary i papugi, np., hodowane jako zwierzęta domowe lub markery dla zbiorników. Kury zilustrowano poniżej. Źródła izolatów typu dzikiego 1 [0074] Atenuowane organizmy C. perfringens według wynalazku można wytwarzać, na ogól, rozpoczynając od C. perfringens typu dzikiego, który został pierwotnie wyizolowany z dowolnego zakażonego zwierzęcia będącego przedmiotem zainteresowania, jak omówiono powyżej, i/lub ze środowiska. Środowisko obejmuje dowolny materiał, który zawiera żywotne organizmy C. perfringens i/lub żywotne spory C. perfringens, w tym na przykład, zanieczyszczoną żywność, glebę, wodę, ściółkę zwierzęcą, odchody i tym podobne. [007] Justin i wsp. [Biochemistry 41, (02)] scharakteryzowali toksyny alfa z różnych szczepów C. perfringens, które są niemal identyczne pod względem sekwencji i właściwości biochemicznych. Jednakże Justin i wsp. opisują również szczep, który został wyizolowany ze źródła ptasiego (łabędzia), który 16

18 miał toksynę alfa wykazującą duży stopień zmienności sekwencji i zmienioną specyficzność substratową w porównaniu z innymi szczepami. Z tego powodu uważa się, że większość izolatów będzie, po przekształceniu w postać atenuowaną, wzbudzać ochronną odporność na toksynę alfa z wielu innych szczepów C. perfringens występujących naturalnie. Niemniej jednak, z uwagi na możliwość różnic w toksynie alfa między izolatami, często korzystne będzie izolowanie i atenuacja organizmów C. perfringens z gatunków zwierząt, dla których pożądana jest szczepionka anty-c. perfringens. Izolat przedstawiony przykładowo poniżej został wyizolowany od kury i badany w tym gatunku. 1 2 Szczepionki [0076] Atenuowane organizmy C. perfringens według wynalazku zwykle formułuje się jako farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje szczepionkowe. Kompozycje szczepionkowe formułuje się zgodnie z drogą podawania i są one kompatybilne z aktywnym czynnikiem antygenowym. Aktywnym czynnikiem antygenowym jest, na przykład, jeden lub więcej szczepów atenuowanych organizmów C. perfringens typu A według wynalazku. Ewentualnie, kompozycja szczepionkowa może również zawierać jeden lub więcej typów nietoksycznego białka toksyny alfa, w kombinacji z atenuowanymi organizmami C. perfringens typu A. [0077] Na przykład, zasadniczo wszystkie atenuowane organizmy C. perfringens typu A wchodzące w skład szczepionki są żywe i żywotne, chociaż w pewnych specyficznych sytuacjach, np. do immunizacji niektórych ludzi lub zwierząt o upośledzonej odporności, szczepionka będzie zawierać wyłącznie zabite atenuowane organizmy C. perfringens typu A. [0078] Kompozycja szczepionkowa zawiera fizjologicznie kompatybilne bufory i/lub sole, ewentualnie w kombinacji z adiuwantami i/lub ewentualnymi czynnikami wzmacniającymi lub stymulującymi odporność (podawanymi jednocześnie lub podawanymi w seriach, np. przed lub po szczepieniu). [0079] Odpowiednie immunostymulatory obejmują, ale nie wyłącznie, cytokiny, czynniki wzrostu, chemokiny, supernatanty z hodowli komórek limfocytów, monocytów, komórki z narządów limfoidalnych, preparaty komórkowe lub ekstrakty komórkowe (np. Staphylococcus aureus lub preparaty lipopolisacharydowe), mitogeny lub adiuwanty oraz farmaceutyki o niskiej masie cząsteczkowej. Czynnik immunostymulujący można podawać in ovo w dowolnym czasie podczas inkubacji. W konkretnym aspekcie, czynnik immunostymulujący podaje się w pożywce zawierającej atenuowane organizmy C. perfringens typu A. Sposoby podawania szczepionki 3 [0080] Opisane powyżej szczepionki podaje się, na przykład, przez wstrzyknięcie lub zaszczepienie przez jedną lub kombinację następujących dróg: doustnie, donosowo, pozajelitowo, podskórne, przez zadrapanie skóry i/lub podanie domięśniowe, w dowolnej odpowiedniej formulacji znanej w tej dziedzinie, np. w kompatybilnym buforze i/lub dopuszczalnej fizjologicznie soli, w ewentualnej kombinacji z adiuwantami i/lub czynnikami wzmacniającymi lub stymulującymi odporność (podawanymi jednocześnie lub podawanymi w seriach, np. przed lub po szczepieniu). Dla szczepionek/sposobów szczepienia podawanych doustnie, można łatwo zastosować dowolny z fizjologicznie odpowiednich buforów lub środków zawieszających, które są znane w tej dziedzinie. Ponadto, kompozycja może być włączona, np. zmieszana z wodą do picia lub rozpylona na granulki pożywienia, lub posypana lub rozpylona na kukurydzę lub inne ziarna i tym podobne. 17

19 [0081] Przewód żołądkowo-jelitowy jest częstym miejscem zakażenia C. perfringens, a zatem podawanie doustne jest rozważane jako jeden ze sposobów inokulacji. Rozważa się możliwość, że obecność żywych atenuowanych organizmów C. perfringens według wynalazku w przewodzie pokarmowym będzie wywoływać miejscowe ochronne reakcje odpornościowe zlokalizowane w warstwie błony śluzowej przewodu żołądkowojelitowego i może również działać konkurencyjnie zapobiegając następującej potem kolonizacji C. perfringens typu dzikiego. [0082] Dla ptaków, takich jak drób, w tym kur, kaczek, gęsi, itp., najbardziej przydatnymi drogami szczepienia są sposób doustny lub wstrzykiwanie in ovo. Droga in ovo jest podana jako przykład tu poniżej i daje aktywną immunizację i ochronę przed prowokacją u wyklutych kurcząt. Ekspresja obcych genów przez C. perfringens [0083] Stosując techniki opracowane w poprzednich przykładach, dowolny gen niewystępujący naturalnie, tj., obcy dla C. perfringens, może być ewentualnie wstawiony do chromosomowego DNA C. perfringens. Dla ekspresji obcych białek, można wytworzyć fuzje genowe, które zabezpieczają sekwencje flankujące gen toksyny alfa, promotor toksyny alfa i jej sekwencję sygnałową. W jednym wykonaniu, większość sekwencji kodującej genu plc jest zastąpiona przez obcy gen. Pozostałe nukleotydy genu plc poniżej wstawionego genu są poza ramką odczytu, a zatem nie jest wytwarzana funkcjonalna toksyna alfa. Alternatywnie, obcy gen można wprowadzić w ramce do sekwencji nukleotydowej kodującej muteinę toksyny alfa, tworząc fuzję białkową toksyna alfa-obce białko. [0084] Startery oligonukleotydowe dla obcego genu można zsyntetyzować np. z N-końcową sekwencją znacznika FLAG i odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi. Produkty PCR można wklonować do wektora samobójczego; znacznik FLAG i obcy gen są wstawione w ramce z sekwencją sygnałową toksyny alfa. Obce białko ulega ekspresji pod kontrolą promotora toksyny alfa i jest kierowane do sekrecji przez sekwencję sygnałową plc. Wydzielane obce białko można wykryć w supernatancie hodowlanym przez analizę Western przy użyciu przeciwciała anty-flag. [008] W ten sposób można wstawić do genomu C. perfringens dowolny odpowiedni obcy gen. Obejmuje to, na przykład, DNA kodujący antygeny z patogenów przewodu żołądkowo-jelitowego, w tym, np. białka antygenowe z bakterii, takich jak E. coli, gatunki Salmonella, gatunki Campylobacter, gatunki Lawsonia i tym podobne; białka antygenowe pasożytów, takich jak gatunki Eimeria, gatunki Isospora, gatunki Cryptosporidium i tym podobne oraz białka antygenowe wirusów, takich jak rotawirusy, koronawirusy i tym podobne, w celu immunizacji zwierząt traktowanych takim rekombinowanym C. perfringens. Inne białka, które mogą być wyrażone przez taki rekombinowany C. perfringens obejmują białka lub peptydy terapeutyczne. Ewentualnie, obejmują one peptydy, które są endogenne dla przewodu żołądkowo-jelitowego, obejmując czynnik trójlistny lub dowolny typ cytokiny znany w tej dziedzinie, np. kurzą IL-18 i tym podobne. [0086] Jeden z takich konstruktów C. perfringens wyraża kurze białko IL-18. Podawanie żywych bakterii zawierających fuzję genową umożliwi dostarczenie terapeutycznych dawek IL-18 do jelita, będąc jednak stosunkowo nieszkodliwymi dla zwierzęcia-gospodarza ze względu na brak wytwarzania toksyny alfa. Za pomocą tego systemu można również uzyskać ekspresję innych środków leczniczych. [0087] Poniższe konkretne przykłady są włączone dla celów ilustracji i nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku, o ile nie wskazano, że jest inaczej. 18

20 1 2 3 Przykład 1 WEKTOR W OPARCIU O HOMOLOGIĘ DLA TOKSYNY ALFA C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0088] Wytworzono wektor plazmidowy w oparciu o homologię, przydatny w konstrukcji toksyny alfa C. perfringens z delecjami. Plazmid zawiera wiele ważnych elementów; region replikacji z plazmidu E. coli puc18; geny oporności na chloramfenikol (catp) i erytromycynę (ermbp) C. perfringens (obydwa podlegają również ekspresji w E. coli); i gen toksyny alfa (plc) C. perfringens inaktywowany przez konkretną delecję 9 aminokwasów. Plazmid został wytworzony w kilku etapach, jak następuje. [0089] Najpierw sklonowano gen plc z ostatniego ptasiego izolatu C. perfringens (szczepu CP6). Do zaprojektowania starterów oligonukleotydowych do zastosowania w klonowaniu genu plc wykorzystano sekwencję szczepu 13 C. perfringens (GenBank NC , SEK. ID. NR: 2). Te i wszystkie kolejne startery otrzymano komercyjnie z Sigma Genosys, Woodlands. Starter sensowny, położony w obrębie genu yplc (CPE003), AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEK. ID. NR: 14), odpowiada nukleotydom szczepu 13 (SEK. ID. NR: 2). Starter antysensowny, położony w obrębie genu cobw (CPE0037), 'GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEK. ID. NR: 1), jest komplementarny do nukleotydów szczepu 13. Startery te zastosowano wraz z genomowym DNA ze szczepu CP6 C. perfringens w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o szerokim zasięgu. Produkt o długości 29 par zasad, od leżącego po stronie genu yplc do leżącego po stronie 3 genu cobw, przewidziano ze znanej sekwencji szczepu 13 (jak pokazano na Fig. 1). Promotor toksyny alfa, sekwencja sygnałowa i sekwencja kodująca genu plc (CPE0036) są zawarte w tym fragmencie, tj. między leżącym powyżej genem yplc i leżącym poniżej 3 genem cob W. Fragment PCR złożony z 29 par zasad wklonowano następnie do wektora do klonowania, pcr-blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), otrzymując plazmid Z tego fragmentu określono sekwencję nukleotydową regionu kodującego plc złożonego z 29 par zasad ze szczepu CP 6 (SEK ID NR: 22, a odpowiedni polipeptyd to SEK. ID. NR: 23) i wykazano, że jest zasadniczo homologiczny do tego w genie plc ze szczepu 13 C. perfringens (SEK. ID. NR: 2). [0090] Następnie sklonowano region replikacji E. coli i geny oporności C. perfringens z plazmidu wahadłowego pjir418 (Sloan i wsp., 1992, Plasmid 27, 7-219; GeneBank M77169)). Plazmid pjir418 strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i SpeI i końce wypełniono przy zastosowaniu polimerazy Klenowa. Ligacja dużego fragmentu wytworzyła plazmid i odtworzyła miejsce restrykcyjne BamHI. Plazmid ten zachowuje region replikacji E. coli, ale w przeciwieństwie do pjir418, nie zawiera początku replikacji C. perfringens. Plazmid jest zatem zdolny do autonomicznej replikacji w E. coli, ale nie w C. perfringens. [0091] W następnym etapie, C-końcową połowę genu plc wklonowano do plazmidu pośredniego Trawienie plazmidu BamHI i EcoRI uwolniło fragment złożony z 1742 par zasad zawierający C- końcową część genu toksyny alfa, od unikatowego miejsca BamHI znajdującego się w obrębie genu plc poprzez leżący poniżej gen cobw do miejsca EcoRI znajdującego się w miejscu wielokrotnego klonowania zgrupowaniu miejsc do klonowania plazmidu rodzicielskiego. Fragment złożony z 1742 par zasad wklonowano między miejscami BamHI i EcoRI położonymi w obrębie miejsc wielokrotnego klonowaniaplazmidu W uzyskanym plazmidzie , C-końcowa połowa genu plc jest w tej samej orientacji transkrypcyjnej co geny catp i ermbp plazmidu rodzicielskiego. [0092] W końcowym etapie, N-końcową połowę genu plc wklonowano do unikatowego miejsca BamHI plazmidu Osiągnięto toprzez utworzenie fragmentu PCR pochodzącego z genu toksyny alfa, subklonowanego w plazmidzie Starter sensowny, ' ggatccagctgcataagcaaaagttccaactc 3' (SEK. ID. NR: 16), był identyczny z wcześniej wymienionym starterem yplc (SEK ID NR: 4), z tą różnicą, 19