KATEDRA INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ INSTRUKCJE ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH

Transkrypt

1 KATEDRA INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ INSTRUKCJE ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH Operacje i techniki sorpcji desorpcji w układach cieczciało stałe / ciecz-ciecz w rozdzielaniu składników mieszanin / grup składników technikami chromatografii Ćwiczenia LC-1 i LC-2 Technika elucyjnej kolumnowej i cienkowarstwowej chromatografii w rozdzielaniu mieszanin Przedmiot: Techniki Rozdzielania Kierunek studiów: Technologia Chemiczna, sem. II, stud. II-go stopnia Opracowali: prof. dr hab. inż. Marian Kamiński mgr inż. Joanna Głazowska, Zatwierdził: prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Gdańsk,

2 Wprowadzenie do ćwiczeń LC-1 i LC-2 Zrozumienie mechanizmów fizykochemicznych retencji i selektywności w RP-HPLC i NP-HPLC, HILIC, IExC, GPC/SEC a także problematyki rozdzielania grupowego wieloskładnikowych mieszanin związków chemicznych o bardzo skomplikowanym składzie, na przykładzie rozdzielania grupowego niskolotnych produktów naftowych z zastosowaniem NP-HPLC. Operacje i techniki sorpcji desorpcji / chromatografii w układach ciecz - ciało stałe / ciecz - ciecz w rozdzielaniu składników mieszanin / grup składników mieszanin technikami elucyjnymi - kolumnowymi (LC, HPLC, UPLC PLC, P-HPLC) / cienkowarstwowymi (planarnymi) - (TLC, HP-TLC, P-TLC)), w skali analitycznej / w celu: modelowej (semi-preparatywnej) / preparatywnej / procesowej, w odwróconych układach faz (RP), w normalnych układach faz (NP), z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej (IExC), z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC), z wykorzystaniem chromatografii wykluczania sterycznego (GPC/SEC) w warunkach lipofilowych / hydrofilowych rozdzielania składników / grup składników mieszaniny i wyznaczania parametrów retencji i selektywności i innych ważnych parametrów związanych z rozdzielaniem składników / grup składników mieszaniny oznaczenia składu, otrzymania frakcji czystych składników / grup składników do badań strukturalnych, mikrosyntez, badań właściwości użytkowych, otrzymania wzbogacenia wsadu / próbki do analizy technikami sorpcji - desorpcji (m.in., z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej" (SPE), tzn., sorpcji - desorpcji wykonywanej w sposób "wsadowy", cieczowej elucyjnej chromatografii kolumnowej (HPLC) w różnej skali rozdzielania, elucyjnej chromatografii cienkowarstwowej (TLC). 2

3 4. 5. Kod ćwiczenia: LC 1 Operacje i techniki sorpcji desorpcji w układach ciecz - ciało stałe w rozdzielaniu składników mieszanin / grup składników technikami chromatografii cieczowej w normalnych (NP), odwróconych (RP) układach faz Sorpcja desorpcja / elucyjna kolumnowa / cienkowarstwowa (planarna) chromatografia w układach ciecz ciało stałe; Techniki i metody rozdzielania mieszanin w układach ciecz ciało stałe na powierzchni fazy stałej - w normalnych (NP), odwróconych (RP), układach w skali analitycznej / preparatywnej; Charakterystyka retencji i selektywności, dyspersji masy i innych parametrów wypełnienia / kolumny w układach ciecz ciało stałe/ ciecz dynamicznie wytwarzana ciekła faza A. Technika kolumnowej (LC ), wysokosprawnej (HPLC)/ cienkowarstwowej (TLC) chromatografii cieczowej w normalnych (NP) układach faz, w warunkach elucji izokratycznej. B.Technika kolumnowej (LC ) wysokosprawnej (HPLC) )/ cienkowarstwowej (TLC) chromatografii cieczowej w odwróconych (RP) układach faz z elucją izokratyczną / gradientową; M K / J G ł / R Ł stacjonarna Rozdzielanie szczegółowe /grupowe mieszanin nisko/średnio/względnie wysoko polarnych związków chemicznych techniką wysokosprawnej kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej (HPLC) w skali analitycznej/semipreparatywnej/preparatywnej w normalnych (NP)/odwróconych (RP) układach faz, w warunkach oddziaływań hydrofilowych, z detekcją UV-VIS/DAD/RID, w warunkach izokratycznych/gradientowych, z/bez przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie bez/ze stężeniowym (masowym) przeładowaniem powierzchni sorpcyjnej kolumny, po uprzednim wykonaniu testu kolumny; Rozdzielanie dotyczy związków chemicznych/grup związków chemicznych, w różnych układach rozdzielczych (w różnych warunkach operacyjnych ), techniką kolumnowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) / chromatografii cienkowarstwowej (TLC) - składników mieszanin modelowych / produktów syntezy - składników / grup składników : ropy naftowej, produktów ropopochodnych, ekstraktów roślinnych, z zastosowaniem detekcji UV-VIS- DAD / RID, ew. FLD oraz wizualizacji i detekcji na płytkach TLC w świetle UV (254, 360 nm); Wyznaczenie, odpowiednio, dla testowanej kolumny oraz dla poszczególnych składników / grup składników rozdzielanej mieszaniny : Rf, hrf, k, α, R, H, h, u, γ/pe, N, As, K, Φ oraz odpowiednich zależności funkcyjnych, na których wykonanie pozwalają dane uzyskane podczas doświadczeń, a także, stopnia przeładowania masowego i objętościowego kolumny oraz oznaczenie/szacunkowa ocena zawartości składników / grup składników; Pokój nr 8, Hala Technol og. p.16, Chemia "C" Kod ćwiczenia: LC 2 Operacje i techniki wykluczania sterycznego (GPC-SEC) oraz sorpcji desorpcji w układach ciecz ciało stałe / ciecz ciecz na powierzchni ciała stałego - wykluczania jonowego (IExclC) / wymiany jonowej (IExC), w rozdzielaniu składników mieszanin/grup składników technikami chromatografii cieczowej w warunkach chromatografii wykluczania (GPC- SEC), oddziaływań hydrofilowych (HILIC), w jonowymiennych (IExC) i w innych układach faz Sorpcja desorpcja / elucyjna kolumnowa chromatografia cieczowa; Techniki i metody rozdzielania mieszanin w układach ciecz ciało stałe / ciecz ciecz na powierzchni fazy stałej w, jonowymiennych (IEx) układach faz, w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILC), wykluczania sterycznego (GPC/SEC), w skali analitycznej / semi-preparatywnej ; Charakterystyka retencji i selektywności, dyspersji masy, parametrów wypełnienia kolumny w tych układach rozdzielczych - każda podgrupa A. Technika elucyjnej kolumnowej wysokosprawnej chromatografii (HPLC) w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) z elucją izokratyczną / gradientową i w warunkach wykluczania jonowego (IExclC); B. Technika elucyjnej kolumnowej wysokosprawnej (HPLC) chromatografii jonowymiennej (IEx) kationowymiennej (SCX / SA) / anionowymiennej (SAX / SB); C. Technika chromatografii wykluczania (GPC-SEC) w charakterystyce polidyspersyjności / rozdzielaniu polimerów i innych substancji / grup substancji pod względem wielkości cząsteczek / cząstek testuje kolumnę i rozdziela składniki mieszanin w innych warunkach / układach rozdzielczych. Rozdzielanie szczegółowe /grupowe mieszanin względnie wysoko polarnych / jonowych, zwłaszcza organicznych związków chemicznych, techniką wysokosprawnej kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej (HPLC) w skali analitycznej / semi-preparatywnej w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) / wykluczania jonowego (IExclC), z detekcją RID / UV-VIS-DAD, w warunkach izokratycznych / gradientowych: - rozdzielanie cukrów, słodzików, środków konserwujących itp. - rozdzielanie detergentów, polarnych składników ekstraktów roślinnych itp., M K / J G ł / R Ł Rozdzielanie szczegółowe / grupowe mieszanin jonowych związków chemicznych, techniką wysokosprawnej kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej (HPLC) w skali analitycznej / semi-preparatywnej w jonowymiennych (IEx) układach faz, z detekcją RID / UV-VIS/DAD, w warunkach izokratycznych / gradientowych, bez/ z przepływem zwrotnym eluentu w kolumnie; -Rozdzielanie jonów nieorganicznych - anionów/ kationów - Rozdzielanie jonów organicznych - anionów / kationów Otrzymanie chromatogramów w warunkach GPC/SEC roztworu niskodyspersyjnych wzorców polistyrenów w eluencie / chromatogramu granulatu polimeru; Wyznaczenie rozkładu masy cząsteczkowej polimeru z zastosowaniem krzywej kalibracyjnej lg(m)=f(ve); Opis polidyspersyjności badanego polimeru / Wydzielenie frakcji nisko-dyspersyjnej polimeru, charakterystyka jej polidyspersyjności. Charakterystyka sprawności, przepuszczalności, hydrofobowości kolumny GPC/SEC. Rozdzielanie w warunkach idealnych z adsorpcją. Prowadzący : MK prof. M. Kamiński (p.9. Ch.C), GB dr G. Boczkaj (p.26. Ch.D), JG mgr Joanna Głazowska (p.8. Ch.C), NO słuchacze I-go roku SD Osoby asystujące: Pokój nr 8, Hala Technol ogiczna p.16 Chemia "C" 3

4 INFORMACJE WPROWADZAJĄCE, ZASADY WYKONANIA ĆWICZENIA i OPRACOWANIA WYNIKÓW BADAŃ Grupa zostaje podzielona na 2-3 podgrupy. Każda z podgrup otrzymuje zadanie: 1. Wykonania "testu" sprawności, retencji, selektywności, rozdzielczości, przepuszczalności kolumny (każda podgrupa innego rodzaju kolumny HPLC/P-HPLC) w warunkach standardowych dla określonego układu rozdzielczego / warunków rozdzielania i dla wskazanej modelowej mieszaniny rozdzielnych składników. Podania charakterystyki użytkowej testowanej kolumny, po obliczeniu odpowiednich parametrów oraz wyznaczeniu odpowiednich zależności funkcyjnych, 2. Zastosowania kolumny / cienkiej warstwy do rozdzielania składników / grup składników wskazanej mieszaniny związków chemicznych, w różnych warunkach rozdzielania z elucją izokratyczną, albo gradientową w skali modelowej - analitycznej / semipreparatywnej i określenie parametrów retencji selektywności rozdzielczości, z ewentualnym zbieraniem frakcji eluatu i określeniem czystości zebranych frakcji, ewentualnie, stopnia obciążenia sorbentu (kolumny) mieszaniną i poszczególnymi składnikami - określenie "stopnia przeładowania", "produktywności" / "wydajności" rozdzielania i ewentualnie, zaproponowania / podania korzystnych warunków rozdzielania / warunków detekcji składników badanej mieszaniny. Ćwiczenie obejmuje: w części LC1-A - technikę kolumnowej (LC ), wysokosprawnej (HPLC) / cienkowarstwowej (TLC) chromatografii cieczowej w normalnych (NP) układach faz, w warunkach elucji izokratycznej, HPLC i cienkowarstwową - TLC; w części LC-1-B - Technika kolumnowej (LC ) wysokosprawnej (HPLC)/ cienkowarstwowej (TLC) chromatografii cieczowej w odwróconych (RP) układach faz z elucją izokratyczną, ewentualnie, gradientową w części LC-2-A - Technika elucyjnej kolumnowej wysokosprawnej chromatografii (HPLC) w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) z elucją izokratyczną / gradientową w części LC-2-B - Technika elucyjnej kolumnowej wysokosprawnej chromatografii (HPLC) w warunkach wykluczania jonowego (IExclC w części LC-2-C - Technika elucyjnej kolumnowej wysokosprawnej (HPLC) chromatografii jonowymiennej (IEx) kationowymiennej (SCX/SA)/ anionowymiennej (SAX / SB) w części LC-2-D - Technika chromatografii wykluczania (GPC-SEC) w charakterystyce polidyspersyjności / rozdzielaniu polimerów i innych substancji / grup substancji pod względem wielkości cząsteczek / cząstek Część pokazowa ćwiczenia dotyczy - z powodu braku czasu podczas trwania ćwiczeń LC- 1/LC-2, możliwość zademonstrowania w dniach "odrabiania" - na życzenie - w przypadku zainteresowania Studentów: techniki TLC-FID w zastosowaniach do rozdzielania grupowego niskolotnych produktów naftowych / powęglowych, techniki adsorpcji desorpcji w normalnych (NP) / odwróconych (RP), lub jonowymiennych układach faz (IEx), albo w warunkach HILIC z wykorzystaniem kolumienek lub membran SPE (ekstrakcja do fazy stałej (SPE) do wydzielenia frakcji zawierającej określoną grupę składników mieszaniny, z wykorzystaniem kolumn semi-preparatywnych, lub preparatywnych HPLC / LC w 4

5 celu dokonania rozdzielenia grupowego w warunkach elucji skokowej z grawimetrycznym oznaczaniem, lub przygotowania wsadu / próbki do dalszego rozdzielania (tzn., wydzielenia grupy składników nisko-polarnych / średnio-polarnych / wysoko-polarnych, albo zdolnych do dysocjacji elektrolitycznej, np., dla adsorpcji desorpcji grup węglowodorów z zastosowaniem polarnego / hydrofobowego adsorbentu, albo jonowymiennej chemisorpcji / chemi-desorpcji; Wydzielenie określonej grupy składników, albo określonych składników ekstraktu / ługu / oleju / niskolotnej frakcji lub produktu naftowego / asfaltu i inne zastosowania.) ======================================================== Obliczenia parametrów charakteryzujących kolumnę i układ chromatograficzny W sprawozdaniu z części eksperymentalnej należy: Opisać w sposób standardowy chromatogramy - Chromatogramy z opisem każdego wg zasady opisu chromatogramów, tzn., nr rys., warunki rozdzielania próbka/wsad rozdzielany, rozpuszczalnik próbki/wsadu, objętość dozowania, eluent lub program elucji, natężenie przepływu, detektor, parametry detekcji, znaczenie pików (nazwa składnika lub inna informacja). Jeśli jest wiele podobnych chromatogramów można na/pod kolejnymi napisać, na czym polega różnica w stosunku do nr-u wcześniej dokładnie opisanego, lub odwołać się do odpowiedniego chromatogramu, gdzie dane warunki rozdzielania zostały opisane. (Uwaga Nie zanotowanie odpowiednich warunków i parametrów operacyjnych podczas ćwiczenia, nie zwalnia od wykonania poniższych obliczeń. Trzeba brakujące dane uzupełnić!) należy wyznaczyć / obliczyć / oszacować wartości "doświadczalne" oraz "teoretyczne" następujących parametrów / wielkości: dla poszczególnych kolumn, warunków rozdzielania i odpowiednich pików chromatograficznych (LC, HPLC) // płytek TLC i plamek na płytce cienkowarstwowej, odpowiednio (symbolika zgodna z wykazem dla ćwiczenia nr 2, poniżej): o Lc, dc, dp, w, ɳ, t o, V o (V M ), t r, V r, k, R f, hr f, α, R, u, H, N, h, ƴ, K, Ø, ɛ t, ɛ m/z, ɛ w/z oraz zależności w/w parametrów (jeśli dotyczy) od natężenia przepływu eluentu (w) i od wartości liniowej prędkości przepływu eluentu w kolumnie / prędkości migracji czoła eluentu w TLC (u ce ), a także, zależności szybkości migracji czoła eluentu / środka plamek rozdzielanych składników mieszaniny (u i ), prędkości poruszania się w kolumnie stref rozdzielanych składników mieszaniny (u i ), ew. zmian wartości współczynnika retencji (k), współczynników rozdzielenia (α), wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP) oraz liczby półek teoretycznych (N), rozdzielczości kolumny (R, (R s )). w cienkiej warstwie TLC w funkcji czasu (τ), drogi migracji (l ce ), prędkości przepływu eluentu (u) (tzn., zależności funkcyjnych najważniejszych parametrów operacyjnych od natężenia przepływu eluentu przez kolumnę (w), liniowej prędkości przepływu eluentu (u) / średniej szybkości poruszania się czoła eluentu (u cz )), o "teoretyczne" wartości R (Rs), h, H (HETP) i porównanie z wartościami otrzymanymi doświadczalnie, o wartości "obciążenia" sorbentu / wypełnienia kolumny (m mix / m w, m i / m w ), produktywności (P t ) i wydajności kolumny (R h ) dla poszczególnych chromatogramów, 5

6 o zależności funkcyjne retencji / selektywności (k / lg(k), R, α) od składu eluentu wyrażonego ułamkiem molowym (X), albo ułamkiem objętościowym (Ø) składnika o wyższej sile elucyjnej w dwuskładnikowym eluencie (jeśli dotyczy); o wartości wariancji tzw. rozmycia poza-kolumnowego dla poszczególnych aparatów wykorzystywanych w czasie ćwiczenia oraz skorygowane wartości H (HETP) dla wybranych pików chromatograficznych i porównać je z "teoretycznie" osiągalnymi wartościami h, H, N, N o (na podstawie równania Knox a, dla korzystnych wartości parametrów A, B, C) oraz sformułować wnioski dotyczące stopnia zgodności wartości tych parametrów / właściwości zastosowanych kolumn, z możliwymi do osiągnięcia wartościami teoretycznymi a także - wnioski dotyczące działań, jakie należałoby podjąć by wartości H / N otrzymywane doświadczalnie, były w większym stopniu zgodne z wartościami obliczonymi na podstawie zależności "teoretycznych". Grupa, jako całość, w zakresie części doświadczalnej, powinna: zapoznać się z metodyką badań / eksperymentów oraz z wynikami otrzymanymi przez wszystkie podgrupy, dokonać ich analizy oraz sformułować dodatkowe wnioski, wynikające z analizy porównawczej w/w wyników (oczywiście, porównując "porównywalne"). Na koniec grupa powinna też sformułować wnioski, lub sugestie dotyczące ewentualnych modyfikacji / modernizacji ćwiczenia, w ten sposób, aby było jak najbardziej przydatne w trakcie przyszłych studiów, badań oraz ewentualnej pracy zawodowej. W sprawozdaniu z części "pokazowej" ćwiczenia grupa jako całość powinna krótko opisać przedstawione techniki i metodyki rozdzielania pod względem celu stosowania, wykorzystywanych zasad fizykochemii, ewentualnych odmian metodycznych, technicznych, korzystnych (optymalnych) warunków stosowania w poszczególnych odmianach. W razie niejasności dodatkowych informacji dotyczących przygotowania sprawozdania można uzyskać w Wytycznych do sprawozdań. Uwagi Zaleca się "usilnie", by nad przygotowaniem sprawozdania pracowały całe podgrupy wykonujące określony moduł ćwiczenia, a nad sprawozdaniem podsumowującym - cała grupa laboratoryjna. Na stronach tytułowych poszczególnych części sprawozdania powinny zostać wpisane czytelnie nazwiska osób wykonujących określony moduł ćwiczenia wraz z odręcznymi podpisami, a na stronie tytułowej sprawozdania podsumowującego całej grupy - wszyscy studenci wykonujący tego dnia ćwiczenie + odręczne podpisy. Podpis oznacza, że określona osoba brała udział, tak w pracy eksperymentalnej podczas trwania ćwiczenia, jak i, w pracy nad przygotowaniem sprawozdania i jest współautorem (współ-odpowiada treść, zamieszczone\ wyniki i wnioski). ======================================================== W związku z przygotowaniem merytorycznym, realizacją doświadczeń oraz sprawozdania z ćwiczeń LC-1 i LC-2, studenci powinni opanować podstawy doboru optymalnych warunków stosowania w praktyce, a także charakteryzowania użytkowych parametrów kolumn / wypełnień kolumn / warstw porowatych wysokosprawnej (HPLC) / klasycznej (LC), kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej w skali analitycznej (A-), modelowej (M-) lub semi-preparatywnej (SP), preparatywnej (P), procesowej (Proc), a także chromatografii cienkowarstwowej (TLC) oraz technik sorpcji - desorpcji (w tym techniki SPE, sorpcyjnego oczyszczania / wzbogacania w układach ciecz - ciało stałe / ciecz - ciecz, jako bardzo ważnych 6

7 i powszechnie wykorzystywanych technik rozdzielnia złożonych mieszanin składników w bezwodnych układach faz normalnych (NP) /w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) / w odwróconych układach faz (RP) / w warunkach jonowymiennych (IExC/IC), a także z wykorzystaniem wykluczania sterycznego ("żelowych" GPC/SEC) do rozdzielania składników i grup składników, przygotowania wsadu / frakcji techniką SPE / LC / HPLC, w kolumnach z różnymi wypełnieniami o różnej średnicy, sprawności, w warunkach elucji izokratycznej, lub gradientowej, z wykorzystaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie, z eluentami o różnych składach i różnej sile elucji, z zastosowaniem różnych prędkości przepływu eluentu w kolumnie / różnej temperatury rozdzielnia, a także stosowania chromatografii cienkowarstwowej o różnych sorbentach do wstępnego doboru optymalnych warunków rozdzielania, albo w zastosowaniach analitycznych. Należy też zdawać sobie sprawę, że jedno- lub dwu-wymiarowa chromatografia cienkowarstwowa (planarna chromatografia cieczowa - TLC) w odwróconych (RP), normalnych (NP), czy jonowymiennych (IExC) układach faz, lub w warunkach HILIC, w skali analitycznej, modelowej, lub preparatywnej, może i powinna być w praktyce stosowana jako "technika pilotowa" dla doboru optymalnych warunków w technice kolumnowej rozdzielania składników i grup składników przygotowania wsadu / wydzielania lub wzbogacania frakcji techniką SPE, a także - korzystnie w sposób "ortogonalny" - jako technika kontroli czystości frakcji otrzymanych techniką kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej; Literatura Literatura podstawowa 1. M. Kamiński (red.), Chromatografia cieczowa, CEEAM Gdańsk 2004, (rozdziały dotyczące przedmiotu ćwiczenia)., 2. M. Kamiński (red) Materiały informacyjne oraz pomocnicze do ćwiczenia nr 2., 3. Ven R. (red), Encylopedia of Separation Technology, vol. 1 i 2, J. Wiley, Cooke, MPoole., C. FWilson., I. D., Encyclopedia of Separation Science, Academic Press (2000)., 5. Seader J. D., Henley E. J., Separation Process Principles, John Wiley and Sons, Inc (2006)., 6. Berek D., Dressler M., Kubin M., Marcinka K.Chromatografia żelowa PWN Warszawa 1989, Literatura uzupełniająca\ 1. Konopacka-Łyskawa D. (red.) Podstawy Inżynierii Chemicznej i Procesowej (2012). 2. Serwiński M., Zasady Inżynierii Chemicznej i Procesowej, WNT (1982). 3. Hostettman K., Morston A., Preparative Chromatography Techniques Applications, Springer Verlag, Cazes J. (red) Encyclopedia of Chromatography, New York, Marcel Dekker, Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, Warszawa, WNT, Mersman A., Crystallization Technology Handbook, 2nd Ed., Mercel Dekker, Inc, (2001).m, 7. Cannel R. J. P. (red.) Natural Products Isolation, Humana Press, Inc (1998), 8. Moyers G., Rousseau R., W., Cristalization Operation in Handbook of Separation Process Technology, Wiley (1987). 9. Pigoń K., Róziewicz Z., Chemia fizyczna, PWN (2005) 7

8 CZEŚĆ TEORETYCZNA - ćwiczenia LC-1i LC-2 Charakterystyka retencji, selektywności, sprawności i przepuszczalności kolumny sorpcyjnej w układach ciecz ciało stałe: RP-HPLC / NP-HPLC / IExC / HILIC / IExclC / GPC/SEC "Test kolumny" / aparatury do wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC Cel tej części ćwiczenia: Charakterystyka właściwości i parametrów użytkowych kolumny chromatograficznej do elucyjnej chromatografii cieczowej, w zakresie retencji, selektywności i sprawności rozdzielania oraz przepuszczalności kolumny, z uwzględnieniem właściwości aparatu chromatograficznego, tzn., określenia poza-kolumnowej dyspersji stref i pozakolumnowych oporów przepływu eluentu w elementach aparatury chromatograficznej, a na tej podstawie - skorygowanej sprawności kolumny, skorygowanej (dla każdego piku) o dyspersję poza-kolumnową. Szczegółowe informacje dotyczące testu kolumny zarówno w warunkach adsorpcyjnych jak wykluczania sterycznego znajdują się w Materiałach uzupełniających, rozdział dotyczący parametrów kolumny. Wprowadzenie Współczesny aparat do wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej (HPLC), a zwłaszcza, do ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UPLC/UPC), to swego rodzaju podsumowanie ponad 40-letniego rozwoju nowoczesnej aparatury oraz metodologii efektywnego stosowania wysokosprawnej chromatografii cieczowej do rozdzielania mieszanin - w analityce / w skali semi-preparatywnej lub preparatywnej - do otrzymywania w postaci czystej, składników, albo grup składników wieloskładnikowych mieszanin. W modułach wykonawczych nowoczesnej aparatury HPLC / UPC zgrupowano najbardziej udane rozwiązania techniczne i wnioski ze stosowania w przeszłości całego wachlarza różnych rozwiązań i pomysłów, z których tylko niektóre okazały się rzeczywiście trafione, tzn., skuteczne i efektywne. W ten sposób nowoczesna aparatura tego typu zapewnia szybciej, taniej oraz z lepszą rozdzielczością i czułością, niż miało to miejsce w przeszłości, uzyskiwać rozdzielenia i oznaczania składu mieszanin, albo otrzymywać frakcje eluatu zawierające czyste składniki lub grupy składników wieloskładnikowych mieszanin. Rozdzielanie z wykorzystaniem sorpcji i chromatografii w układach ciecz ciało stałe lub ciecz ciecz, albo ciecz - ciecz generowana w sposób dynamiczny na stałej powierzchni porowatego wypełnienia, jest obecnie szczególnie efektywne, z zastosowaniem monolitycznych kolumn chromatograficznych, albo kolumn pakowanych kulistymi wypełnieniami CSP Core Surface Particles - sorbenty o porowatej warstewce sorpcyjnej na nieprzenikliwym "rdzeniu" kulistym. Podwyższone ostatnio, nawet do 120 MPa, maksymalne ciśnienie pompowania eluentu przez tego rodzaju kolumny w aparaturze UPC, przy jednoczesnym skróceniu długości wypełnienia kolumny (dzięki podwyższeniu sprawności kolumny - niższe wartości wysokości równoważnej półce teoretycznej - HETP/H), umożliwia uzyskiwanie bardzo wysokich liniowych prędkości przepływu eluentu - na poziomie nawet do 0.1 m/s i jednocześnie wysokich wartości liczby pólek teoretycznych (N). To umożliwia obniżenie czasu rozdzielania substancji o względnie niskich masach molekularnych (do rzędu 1000 Da) - nawet do kilkunastu sekund, gdy skład rozdzielanej mieszaniny nie jest zbyt skomplikowany. Z drugiej strony, szeregowe połączenie kilku kolumn o wysokiej sprawności 8

9 i dobrej przepuszczalności, umożliwia uzyskiwanie bardzo wysokich sprawności rozdzielania, nawet ponad 100 tys. półek teoretycznych (nawet do miliona półek teoretycznych), co umożliwia przy jednocześnie dobrej selektywności współczesnych wypełnień kolumn, rozdzielać nawet mieszaniny zawierające tysiąc i więcej składników, zwłaszcza z zastosowaniem wielokolumnowych układów kolumn, systemów przełączania kolumn, albo warunków chromatografii dwu-wymiarowej (2D-HPLC/UPC), z wykorzystaniem elucji gradientowej w obu kolumnach rozdzielczych. Podwyższeniu uległa też czułość detektorów typu UV-VIS (pozom szumów na poziomie 10-5 AU, a częstotliwość próbkowania do 100 Hz (T=10 milisekund), zapewnia dostatecznie dokładne cyfrowe odwzorowanie pików o czasie trwania tylko 0.1 sek. Wysoka czułość detekcji zapewnia także możliwość detekcji i oznaczania składników obecnych w mieszaninie na bardzo niskich poziomach stężeń, w tym, kontrolę czystości bardzo niskich zawartości zanieczyszczeń w zbieranych frakcjach, a także, kontrolę czystości bardzo czystych produktów izolacji składników, dokonywanej z wykorzystaniem chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej. Do analityki w warunkach UPC, stosuje się obecnie kolumny o mniejszej średnicy dc w zakresie 1mm do 3.3 mm, niż klasyczne kolumny analityczne (4.0, lub 4.6 mm i.d. inner diameter) oraz, jak dotychczas - tzw. gradient wysokociśnieniowy (czyli programowanie składu eluentu z zastosowaniem dwóch do czterech równocześnie pracujących pomp, a także, termostatowanie nie tylko kolumny, ale i eluentu przed wprowadzeniem do kolumny, w zakresie od 5C do 80C (niektórzy producenci - do 120C). Jednakże, efektywne wykorzystanie tych zalet nowoczesnej HPLC / UPC, zwłaszcza w skali analitycznej, wymaga nie tylko maksymalizacji sprawności kolumn (wysokich wartości N kolumny, dzięki minimalizacji wartości H), ale także - eliminacji do możliwego do uzyskania w praktyce minimum - tzw. poza kolumnowej dyspersji stref rozdzielanych składników mieszanin. To, natomiast można uzyskać jedynie dzięki obniżeniu średnic i długości wszystkich przewodów łączących w obrębie: dozowanie detekcja, stosowania minimalnej objętości mieszalnika w systemie do elucji gradientowej, z uwzględnieniem dodatkowo, automatycznej eliminacji wpływu opóźnienia transportowego i objętości mieszalnika na przebieg realizacji programu elucji. Cel ćwiczenia Zrozumienie problematyki dyspersji stref rozdzielanych substancji w kolumnie HPLC / UPC / PLC i w elementach poza kolumną oraz zbadanie i obliczenie wartości najważniejszych parametrów wypełnienia kolumny oraz aparatu chromatograficznego, dzięki zbadaniu i obliczeniu dla badanej kolumny, na podstawie przebiegu pików rozdzielanych składników mieszaniny : -- wartości parametrów retencji, selektywności i rozdzielczości kolumny dla składników badanej mieszaniny, -- sprawności i przepuszczalności kolumny razem z dyspersją w przewodach łączących i innych elementach aparatu chromatograficznego usytuowanych między zaworem dozującym i wylotem z naczyńka detektora / wlotem do kolektora frakcji, -- wartości poza-kolumnowej dyspersji stref oraz dokonania skorygowania sprawności kolumny o dyspersję poza kolumnową, -- wartości oporu przepływu eluentu w aparacie ( w kolumnie i przewodach oraz elementach łączących, przez samą kolumnę i przez same przewody łączące czujnik ciśnienia z wylotem z detektora, a także przepuszczalności właściwej kolumny. 9

10 Streszczenie przebiegu ćwiczeń 1. Zapoznanie się studentów z budową, zasadą działania, schematem ideowym gradientowego aparatu HPLC, wykorzystywanego w sposób izokratyczny, albo w warunkach programowania składu dwuskładnikowego eluentu, albo wykorzystaniem eluentu jednoskładnikowego, w postaci tzw. premiksu, tzn., gdy składniki eluentu zostały a priori zmieszane w określonej proporcji; 2. rozdzielanie w warunkach RP / NP HILIC / IExC - dla różnych prędkości przepływu eluentu / eluentów o różnych składach / z zastosowaniem różnych kolumn - modelowej mieszaniny rozdzielanych składników, zależnie od charakteru zadania laboratoryjnego, przekazanego przez prowadzącego do wykonania; 3. Zarejestrowanie przez każdą podgrupę studentów - w przypadku każdej podgrupy - w innych warunkach: chromatogramu / chromatogramów testu kolumny w warunkach elucji izokratycznej, z zastosowaniem modelowej mieszaniny składników rozdzielanych i wyznaczenie doświadczalnie / obliczenie dla badanej kolumny, stosowanego eluentu i wypełnienia kolumny, a także dla zastosowanej aparatury : czasu martwego, objętości martwej oraz porowatości całkowitej wypełnienia, współczynników retencji k dla poszczególnych pików, a także współczynników selektywności α i rozdzielczości R, sąsiednich pików, sprawności kolumny w formie wartości wysokości równoważnej półce teoretycznej H i liczby półek teoretycznych (N), dla poszczególnych pików mieszaniny testującej, na podstawie szerokości pików w połowie wysokości i na podstawie szerokości pików przy podstawie, a także, współczynników asymetrii As 0.5 i As 0..1, pików chromatograficznych przepuszczalności K i zredukowanej przepuszczalności Ф, kolumny, poza-kolumnowej dyspersji stref na tej podstawie ocena otrzymanych wartości wysokości półki teoretycznej i liczby półek teoretycznych wypełnienia kolumny (po uwzględnieniu tzw. ekstra-kolumnowej dyspersji masy), obliczenie zredukowanej prędkości przepływu eluentu w kolumnie ν (tzn. wartości dyfuzyjnej liczby Peckleta Pe ) oraz rzeczywistej i teoretycznej wartości zredukowanej wysokości równoważnej półce teoretycznej kolumny łącznie z dyspersją poza-kolumnową i po uwzględnieniu ( odjęciu ) dyspersji poza-kolumną (h rzecz. ) oraz dla samej tylko kolumny (h kol ), a także wartości teoretycznej zredukowanej wysokości półki teoretycznej h teor, porównanie tych wartości i sformułowanie wynikających stąd wniosków wobec stosowanej kolumny i aparatu chromatograficznego. 4. Sformułowanie wniosków na podstawie otrzymanych wartości w/w parametrów, otrzymanych doświadczalnie, lub obliczonych na podstawie zależności teoretycznych. 5. Określenie w sposób przybliżony składu grupowego badanego produktu technicznego / zbadanych produktów technicznych, z zastosowaniem tzw. normalizacji prostej. 6. Porównanie wartości parametrów retencji, selektywności i sprawności rozdzielania wyznaczonych techniką HPLC i TLC, jeśli w rozdzielano tę samą mieszaninę składników w kolumnie HPLC i z zastosowaniem TLC, w tym samym układzie chromatograficznym (RP, lub NP., z zastosowaniem tego samego typu sorbentu, nawet wówczas, gdy skład eluentu, a nawet składniki eluentu były inne. 7. Podczas trwania ćwiczenia, albo w ramach konsultacji, jest też możliwe przedyskutowanie przez Studentów z prowadzącym postępowania, zapewniającego optymalne rozwiązanie / zapobieganie / eliminację - niektórych problemów spotykanych w praktyce stosowania nowoczesnej techniki HPLC / UPC, dotyczących: 10

11 doboru optymalnego składu eluentu / programu elucji w warunkach chromatografii w odwróconych (RP-HPLC), / normalnych (NP-HPLC - w warunkach bezwodnych) układach faz; doboru optymalnych wartości parametrów retencji i selektywności, a także sprawności rozdzielania oraz rozdzielczości i przepuszczalności kolumny, a także praktyki w zakresie minimalizacji tzw. poza-kolumnowej dyspersji stref, dozowania bardzo małych / bardzo dużych objętości roztworu mieszaniny rozdzielanych substancji i doboru rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny, doboru właściwej techniki detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy dla najważniejszych detektorów stosowanych w HPLC (z zastosowaniem technik detekcji : UV-VIS, RID), problemów spotykanych podczas praktycznej realizacji rozdzielania warunkach programowania składu eluentu i sposobów ich eliminacji / minimalizacji: o o o o problemu zanieczyszczenia składników eluentu, obecności rozpuszczonego powietrza w cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałości systemu synchronizacji pracy zaworów proporcjonujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednich parametrów mieszalnika, demiksji składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy, wytrącania się składników rozdzielanej mieszaniny w początkowym eluencie o niskiej sile elucyjnej w przypadku zastosowania dobrego rozpuszczalnika składników próbki i innych; Zakres materiału i wymagania do sprawdzianu z ćw. LC-1: HPLC wiadomości podstawowe oraz sorpcja i chromatografia w układach ciało stałe ciecz / ciecz ciecz - pojęcia, podziały, definicje, wielkości fizykochemiczne, parametry i miary Chromatografie w normalnych i odwróconych układach faz (NP-HPLC, RP-HPLC) HPLC aparatura i wyposażenie Parametry układu chromatograficznego, wypełnienia kolumny sorpcyjnej / chromatograficznej / warstwy porowatej w układach ciecz - ciało stałe, ciecz ciecz Chromatografia cienkowarstwowa RP-TLC / RP-HPTLC, NP-TLC / NP-HPTLC - w odwróconych (RP), normalnych (NP) układach faz, w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) Przykłady zastosowania technik chromatograficznych a analityce przemysłowej Chromatografia w skali preparatywnej i procesowej CZEŚĆ DOŚWIADCZALNA - ćwiczenie LC-1 MATERIAŁY, APARATURA, OPROGRAMOWANIE Składniki eluentu / elunty: RP-HPLC woda acetonitryl, albo woda metanol, w proporcjach objętościowych podanych przez prowadzącego, zarówno w opcji elucji izokratycznej jak i gradientowej; NP-HPLC n-heksan, albo izomeryzat i ich mieszaniny z CH 2 Cl 2, IzoOH, AcCN itp. 11

12 Kolumna i sorbent wypełnienia kolumny : RP-HPLC kolumna analityczna /semi-preparatywne (modelowa) / preparatywna o średnicy wypełnienia (dc=3.3, 4.0, lub 4.6 mm, do 32 mm), długości Lc od 5 mm do 250 mm, z wypełnieniem typu RP 18, albo RP- 8, SB-Aq NP-HPLC Si-60, albo NH 2, albo DIOL, albo CN albo wypełniona innym sorbentem, o średniej wielkości ziaren wypełnienia dp [μm] oraz o rozkładzie granulometrycznym podanym przez prowadzącego (należy zapytać!!!) Składniki rozdzielane i rozpuszczalniki rozdzielanej mieszaniny: roztwory substancji wzorcowych, najkorzystniej rozpuszczone w stosowanym eluencie, o stężeniach poszczególnych składników podanych przez prowadzącego / zapisanych na etykiecie. Niektóre podgrupy (jeśli wystarczy czasu), będą też rozdzielały składniki tzw. próbki rzeczywistej, tzn., ekstraktu z liści / roztworu oleju bazowego / parafiny technicznej / tzw. gaczu parafinowego w eluencie, roztworu asfaltu drogowego w dichlorometanie, cieczy Benfielda, lub inne. Aparatura, wyposażenie, oprogramowanie: Modułowy chromatograf cieczowy MERCK HITACHI, z tzw. gradientem nisko-ciśnieniowym, stosowanym w przypadku tego ćwiczenia do programowania stałego składu eluentu, lub z elucją gradientową albo wykorzystywanym jednokanałowo, z eluentem dwuskładnikowym, tzw. premiksem ; dozownik manualny zawór dozujący sześciodrogowy, dwupołożeniowy, albo dozownik repetycyjny (tzw. autosampler ), kolumna jw., z wypełnieniem ziarnistym, termostat kolumny i podgrzewacz eluentu, detektor UV-VIS/DAD, interface D-6000 (przetwornik A/C i karta GPIB (IEE 488), komputer, oprogramowanie HSM; Wykonanie ćwiczenia oraz opracowanie wyników- ćwiczenie LC-1 (TLC) Rozdzielaniu w warunkach TLC będzie podlegała mieszanina substancji wzorcowych, np. o-, m-, p-nitro-aniliny, albo o-, m-, p-nitrobenzenu, z dodatkiem innych składników, albo mieszanina składników ekstraktu roślinnego z trawy lub z liści. W warunkach NP-TLC zostaną zastosowane płytki pokryte żelem krzemionkowym o średniej wartości średnic porów wewnątrz-ziarnowych 60A (6nm), typu Si-60 F-254 z fluoresceiną związaną z żelem krzemionkowym. Jest to fluoresceina, która pod wpływem światła UV o długości fali 254 nm wykazuje luminescencję w zakresie światła białego lub zielonkawo żółtawego. W warunkach RP- TLC - płytki RP-18-F-254, a więc z fazą stacjonarną C18, związaną na powierzchni żelu krzemionkowego za pomocą kowalencyjnych wiązań siloksanowych, zawierająca także nieaktywną sorpcyjnie fluoresceinę, świecącą pod wpływem światła UV o długości fali 254 nm. Zadaniem studentów będzie naniesienie możliwie małych plamek na powierzchnię dolnej części płytki, w punkcie zaznaczonym ołówkiem, w odległości ok. 10 mm od dolnego brzegu płytki, ok. 10mm od brzegów bocznych, i w odległości ok. 7-8 mm między plamkami. Podczas powolnego nanoszenia plamek za pomocą strzykawki na powierzchnię płytki TLC należ zastosować wentylator, albo w inny sposób wykonywać nadmuch na płytkę w punkcie styku igły z płytką TLC. Ma to celu zapewnienia szybkiego odparowywania rozpuszczalnika roztworu nanoszonego na płytkę i zapewnienie małej powierzchni plamki. Jest to szczególnie ważne, gdy rozpuszczalnik jest względnie mało lotny. W przypadku nanoszenia roztworów wodnych lub mieszanina wody i innego rozpuszczalnika polarnego, podczas nanoszenia plamek powinien mieć miejsce nadmuch podgrzanego powietrza. Bardziej korzystne jest zastosowanie nadmuchu podgrzanym azotem, co zmniejsza ryzyko utlenienia składników mieszaniny nanoszonych na płytkę, gdy charakteryzują się łatwą utlenialnością. W przypadku nanoszenia na płytkę roztworu w bardzo lotnym rozpuszczalniku, jak np., eter dietylowy, pentan, dichlorometan, nie należy stosować podgrzewania powietrza podczas nadmuchu, gdyż może to powodować odparowywanie rozpuszczalnika na końcu igły strzykawki i wytrącanie się tam osadu!!! Po naniesieniu na płytkę plamek mieszaniny rozdzielanych składników powinny ewentualnie, 12

13 zostać obok naniesione poszczególne związki chemiczne które są prawdopodobnymi składnikami mieszaniny w takiej samej objętości i o podobnych stężeniach (najlepiej o nieco wyższym i nieco niższym stężeniu), co umożliwia tak identyfikację, jak i ewentualną kalibrację oraz oznaczenie zawartości wybranych składników w badanej mieszaninie. Na to jednak, nie będzie czasu podczas trwania ćwiczenia. Płytki z naniesionymi i wysuszonymi plamkami, należy ostrożnie przy pomocy pincety zanurzyć dolnym brzegiem w eluencie, znajdującym się na dnie komory TLC. Poziom eluentu musi być niższy od dolnych krawędzi naniesionych na płytkę TLC, plamek! Następnie, obserwować elucję, tzn., rozwijanie chromatogramu TLC. Po osiągnięciu przez czoło eluentu wysokości wskazanej przez prowadzącego ćwiczenie (najlepiej delikatnie zaznaczyć tę linię ołówkiem), płytkę należy wyjąć z komory TLC i wstawić do suszarki, w celu wysuszenia (usunięcia wszystkich składników eluentu zarówno z przestrzeni międzyziarnowych, jak i z porów wewnątrz ziaren wypełnienia, a także z powierzchni sorpcyjnej. Jeśli stosujemy względnie mało lotne składniki eluentu, należy odpowiednio przedłużyć czas suszenia płytki, albo podwyższyć temperaturę suszenia. W przypadku stosowania warunków typowych dla NP- TLC, z bezwodnymi stosunkowo lotnymi cieczami organicznymi, jako składnikami eluentu, takimi, jak: heksan, heptan, dichlorometan, chloroform, etery alifatyczne, czterowodorofuran, aceton, metanol, izopropanol itp. wystarczy by temperatura suszarki wynosiła ok. 70 C i czas suszenia może wynosić od 5 do 10 minut, zależnie od grubości warstwy na powierzchni płytki TLC (tzw. płytki preparatywne mogą mieć warstwy o grubości nawet 2 mm!). W przypadku stosowania wody jako składnika eluentu (warunki RP, HILIC, NP-w), temperatura suszarki powinna być wyższa od 100 C, np. 125 C, albo należy odpowiednio przedłużyć czas suszenia płytki. Zawsze należy też uwzględniać sprawę lotności, albo podatności na sublimację składników rozdzielanej mieszaniny. W przypadku, gdy rozdzielane składniki są średnio lotne, albo podatne na sublimację, należy stosować niskie temperatury suszenia płytek TLC, przedłużając czas suszenia. Oczywiście, technika TLC nie nadaje się do rozdzielania substancji lotnych (gdy temperatura wrzenia jest niższa od ok. 200 C. Wówczas stosujemy po prostu chromatografię gazową, albo technikę HPLC, lub SFC. Jednak, wówczas, gdy temperatura wrzenia rozdzielanych substancji jest bliska 200 C, i gdy do suszenia płytki stosujemy podwyższoną temperaturę, lub długi czas suszenia, to zależnie od lotności rozdzielanych składników mieszaniny, należy liczyć się z częściowym lub nawet całkowitym ich odparowaniem podczas suszenia płytki!!! Podobnie ma się sprawa ze składnikami ulegającymi łatwo sublimacji, zwłaszcza, gdy wykazują niewielkie powinowactwo sorpcyjne do fazy stacjonarnej, np., naftalen na żelu krzemionkowym. Kolejno należy dokonać wizualizacji plamek, najpierw w świetle widzialnym, obwodząc widoczne w ten sposób plamki za pomocą ostro zaostrzonego ołówka liną ciągłą, następnie pod lampą UV-254 nm, obwodząc wszystkie plamki tym samym ołówkiem - linią punktową, a następnie pod lampą UV-360 nm, obwodząc widoczne plamki tym samym ołówkiem, np. kółeczkami, lub krzyżykami. Płytki należy delikatnie owinąć, najlepiej folią aluminiową, ewentualnie kartką białego papieru. Należy zawsze pamiętać, aby płytki po rozwinięciu chromatogramu były jak najkrócej naświetlane, także światłem widzialnym! Należy je zabrać do domu i tam opracować otrzymane wyniki badań, tzn., obliczyć wartości R f i hr f dla wszystkich plamek składników / grup składników rozdzielanej mieszaniny, poza tą która pozostała w punkcie startu, na tej podstawie obliczyć orientacyjne wartości k, α, a także R (Rs) dla sąsiadujących z sobą plamek, albo niekoniecznie dla plamek sąsiadujących, ale dla tych których retencję i selektywność rozdzielania zamierza się opisać. Można także znaleźć w literaturze zależności dla obliczania sprawności rozdzielania w TLC, tzn., wartości HETP (H) i liczby półek teoretycznych - N, dla poszczególnych plamek (tylko dla składników całkowicie rozdzielanych) oraz obliczyć sprawności rozdzielania techniką TLC, którą można następnie porównać z otrzymaną w innym module ćwiczenia LC-1 ze sprawnością kolumn HPLC. 13

14 W sprawozdaniu, w części wnioski - zarówno dla techniki TLC, jak i HPLC, tak NP, jak RP, należy wyjaśnić : dlaczego ma miejsce rozdzielanie i dlaczego otrzymano taką, jak otrzymano - kolejność elucji rozdzielanych substancji, ocenić, czy zastosowany układ rozdzielczy jest selektywny i ewentualnie, zaproponować warunki układ rozdzielczy i warunki rozdzielania, które by zapewniły lepszą selektywność. W przypadku, gdy te same substancje były rozdzielane w warunkach TLC i HPLC, w tym samym układzie rozdzielczym (NP, lub RP), nawet z eluentami o różnych składach, należy porównać wartości k, otrzymane techniką TLC i HPLC. Wówczas gdy to jest możliwe (gdy grupa laboratoryjna dysponuje odpowiednimi danymi, otrzymanymi podczas ćwiczenia), należy także wyznaczyć zależności funkcyjne k od składu eluentu i wartości współczynników A i B dla zależności: - w warunkach RP : lg(k) = f(x v ) gdzie: X v udział objętościowy składnika o wyższej sile elucyjnej w dwuskładnikowym eluencie, - w warunkach NP : lg(k) = f(x m ) gdzie: X m udział molowy składnika o wyższej sile elucyjnej w dwuskładnikowym eluencie Z teorii retencji i selektywności w TLC/HPLC wynika, że powyższe zależności funkcyjne powinny być liniowe, odpowiednio: dla RP i NP. Wskazane jest by wartości k były wyższe od 0.5 By wykazać, czy dla badanego układu rozdzielczego i określonej substancji podlegającej retencji, odpowiednia zależność jest liniowa, powinny istnieć co najmniej 3 punkty pomiarowe. W przypadku dysponowania tylko dwoma punktami, można wyznaczyć ( oszacować ): współczynnik kierunkowy oraz wyraz wolny dla tych zależności funkcyjnych dla poszczególnych rozdzielanych substancji, a także dla grup substancji, zakładając z góry zależność liniową. Następnie należy sformułować wnioski dotyczące rozdzielania mieszanin techniką TLC, wynikające z wykonanych badań i obliczeń, a także uwzględniające problemy, z którymi wykonawcy ćwiczenia spotkali się w czasie jego wykonywania. Będę też wdzięczny za wnioski i sugestie, dotyczące ulepszenia procedury przebiegu ćwiczenia, które w tym kształcie jest realizowane po raz pierwszy. MATERIAŁY (TLC) Składniki eluentu / elunty: Mieszaniny heksan: izopropanol, w różnych stosunkach objętościowych (np. 93:7, 90:10, 85:15 v/v) Kolumna i sorbent wypełnienia kolumny : Płytki chromatograficzne pokryte żelem krzemionkowym, z dodatkiem czynnika fluorescencyjnego. 14

15 CZEŚĆ TEORETYCZNA - ćwiczenia LC-2 - uzupełnienie Chromatografia jonowymienna (Ion Exchange Chromatography - IExC) oraz jonowa (IC) uzupełnienie informacji Chromatografia jonowymienna ( Ion-Exchange Chromatography IEC ) jest odmianą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, stosowaną do rozdzielania, oznaczania otrzymywania w postaci czystej substancji, które można przeprowadzić do postaci jonowej. Chromatografia jonowa jest "podzbiorem" chromatografii jonowymiennej oraz dotyczy rozdzielania i oznaczania (analityki) jonów nieorganicznych z wykorzystaniem specjalnego typu faz stacjonarnych (wymieniaczy jonowych) o niewielkich wartościach powierzchni właściwej, zdatnych w zakresie ph od ok. 0.5 do 13.5, najczęściej z wykorzystaniem tzw. supresji jonowej Podstawowe informacje dot. mechanizmu rozdzielania w chromatografii jonowymiennej. Technika ta rozdzielania opiera się na sorpcji i desorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym cząsteczek analitu oraz przeciwnie naładowanymi fragmentami fazy stacjonarnej. Rozdzielanie i oznaczanie nieorganicznych, albo organicznych kationów, albo/i anionów, a także aminokwasów, peptydów, białek, nukleotydów, sacharydów, amin i innych wysoce polarnych i obdarzonych ładunkiem jonizowalnych, albo trwale spolaryzowanych oraz silnie polaryzowalnych substancji. Obecnie technika chromatografii jonowymiennej jest stosowana do preparatywnego rozdzielania peptydów i białek. Mechanizm rozdzielania w chromatografii jonowymiennej, zgodnie z nazwą, polega na wykorzystaniu procesów wymiany jonów, lub tylko na wykorzystaniu oddziaływań jon indukowany - jon indukowany między powierzchnią fazy stacjonarnej, a fazą ruchomą i jonowymi, lub jonizowalnymi składnikami roztworu substancji rozdzielanych. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu pakowane kolumny, a bardzo rzadko już dzisiaj cienkowarstwową fazę stacjonarną (np. w formie celulozowej bibuły, gdzie proces rozdzielania ma często także jonowymienny charakter, przy słabych oddziaływaniach jonowymiennych. W chromatografii jonowymiennej ma miejsce równowagowa reakcja wymiany jonów obecnych na powierzchni fazy stacjonarnej z jonami analitów. Poniżej przedstawiono przykładową reakcję równowagi mającą miejsce w przypadku anionowymiennego rozdzielania jonów chloru na żywicy aminowej: K ŻYWICA-NH + 3 OH - + NaCl ŻYWICA-NH + 3 Cl - + NaOH gdzie K to współczynnik równowagi definiowany jako: = [ ] [ ] [ ] [ ] gdzie: [OH - ] s,r stężenie jonów hydroksylowych w fazie stacjonarnej i ruchomej [X - ] s,r stężenie jonów analitu w fazie stacjonarnej i ruchomej Na kolejność elucji poszczególnych jonów w chromatografii jonowymiennej główny wpływ mają takie właściwości jonów jak: Ładunek Im wyższy ładunek jonu tym wyższa retencja Np. t R (Cl - ) < t R (SO 2-4 ) Wyjątkiem są jony fosforowe (np H 2 PO - 3 i HPO 2-3 ), które występują w stanie 15

16 równowagi w roztworze i nie jest możliwe ich rozdzielenie za pomocą chromatografii jonowymiennej Rozmiar jonu Im większy promień jonowy tym większa retencja danego jonu Np. t R : F < Cl < Br << I t R : Na + < K + < Rb + < Cs + Polaryzowalność Im większa polaryzowalność danego jonu tym większa jest jego retencja. Np. t R (SO 2-4 ) < t R (S 2 O 2-3 ) t R (amina) < t R (monoetyloamina) Ma to związek z hydrofobowością atomów wchodzących w skład jonu, im wyższa tym wyższy czas retencji oddziaływań o charakterze wymiany jonowej oraz adsorpcyjnych Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii jonowymiennej Wymieniacze jonowe (jonity) stosowane w jonowymiennej chromatografii, to ciała stałe o rozwiniętej powierzchni, nierozpuszczalne w wodzie i w innych rozpuszczalnikach, posiadające zdolność wymiany jonów z roztworem. W zależności od rodzaju grup wymiennych dzielimy je na dwie grupy (tab. 1): kationity - jonity wymieniające kationy z roztworu w eluencie; anionity - jonity wymieniające aniony z roztworu w eluencie. Znane są też wymieniacze amfoteryczne, które w zależności od ph roztworu mają zdolność wymiany anionów lub kationów, a także wymieniacze bipolarne, które mogą jednocześnie wymieniać obydwa rodzaje jonów. Nie znalazły one dotychczas szerszego zastosowania w praktyce, chociaż ciągle trwają badania nad rozwojem ich zastosowań. Faza stacjonarna: -R-SO - 3, -R-COO - Faza ruchoma: H +, Na +, K +, Ca 2+ +, RNH 3 Kationit wymienia kationy (K + ) z fazą ruchomą i składnikami rozdzielanej mieszaniny chromatografia kationowymienna Faza stacjonarna: -R-NH 3 +, -R-NH 3 + Faza ruchoma: SO 4-2, -R-COO -, OH -, Cl - Anionit wymienia aniony (A - ) z fazą ruchomą i składnikami rozdzielanej mieszaniny chromatografia anionowymienna Rys.1. Schematyczne przedstawienie budowy jonitów stosowanych w chromatografii jonowymiennej. Właściwości wymieniaczy jonowych są różne w zależności od pochodzenia jonitu. Według kryterium pochodzenia wymieniacze jonowe można podzielić na następujące grupy: Jonity naturalne Są to głównie kationity pochodzenia mineralnego czyli glinokrzemiany. Największe zastosowania znalazły zeolity o składzie Na 2 O CaO Al 2 O 3 nsio 2 mh 2 O. Jonity półsyntetyczne Najpopularniejsze z nich to tzw. węgle sulfonowane o nazwach handlowych Permutyt-H, Zeocarb HJ,Wofatit-X. Jonity syntetyczne Pierwszymi wymieniaczami z tej grupy były syntetyczne związki typu glinokrzemianów - żele i permutyty, jednak ze względu na znikomą zdolność 16

17 nastąpić hydroliza wiązania Si w praktyce Uwaga Fazy ruc nastąpić hydroliza wiązania Si w praktyce Uwaga Fazy ruc nastąpić hydroliza wiązania Si w praktyce Uwaga! Fazy ruc zastosowania. Mocne kationity w po Mocn krzemionkowego, lub innego Słabe kationity Słabe anionity czy związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si w praktyce Fazy ruchome stosowane w chromatografii zastosowania. Mocne kationity w po Mocn krzemionkowego, lub innego Słabe kationity Słabe anionity czy związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si w praktyce home stosowane w chromatografii zastosowania. Mocne kationity w po Mocne anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego Słabe kationity Słabe anionity związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si w praktyce home stosowane w chromatografii zastosowania. Mocne kationity w po e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego Słabe kationity Słabe anionity związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si home stosowane w chromatografii zastosowania. Mocne kationity w po e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego Słabe kationity Słabe anionity związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si home stosowane w chromatografii zastosowania. Mocne kationity w po e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego Słabe kationity Słabe anionity związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si home stosowane w chromatografii Mocne kationity w po e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si home stosowane w chromatografii Mocne kationity w po e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si home stosowane w chromatografii Mocne kationity w postaci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego związana na powierzchni nośnika. nastąpić hydroliza wiązania Si-O home stosowane w chromatografii staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej krzemionkowego, lub innego związana na powierzchni nośnika. O-C- home stosowane w chromatografii staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej związana na powierzchni nośnika. - home stosowane w chromatografii staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej typu nośnika. związana na powierzchni nośnika. home stosowane w chromatografii staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej typu nośnika. związana na powierzchni nośnika. home stosowane w chromatografii powinowactwa jonów rozdzielanych do powierzchni wymieniacza jonowego. Dobierając staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej typu nośnika. -C8), albo arylowych (alklo home stosowane w chromatografii jonow - staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej typu nośnika. C8), albo arylowych (alklo jonow staci sprotonowanej e anionity w postaci hydroksylowej typu nośnika. C8), albo arylowych (alklo jonow e anionity w postaci hydroksylowej C8), albo arylowych (alklo jonowymiennej C8), albo arylowych (alklo ymiennej C8), albo arylowych (alklo ymiennej C8), albo arylowych (alklo ymiennej C8), albo arylowych (alklo C8), albo arylowych (alklo-fenylowych, albo fenylowych związane wiązaniem kowalencyjnym z powierzchnią polimerowego, albo fenylowych, albo fenylowych -, albo arylosulfonowe 8.7, ponieważ może fenylowych, albo fenylowych, albo arylosulfonowe -, albo tetraarylo 8.7, ponieważ może fenylowych, albo fenylowych, albo arylosulfonowe, albo tetraarylo 8.7, ponieważ może - divinylobenzenu, fenylowych, albo fenylowych, albo arylosulfonowe, albo tetraarylo 8.7, ponieważ może divinylobenzenu, fenylowych, albo fenylowych siłą jonową eluentu. Dla mocnych kationitów i anionitów można stwierdzić, ogólnie, że i, albo arylosulfonowe, albo tetraarylo -7), 10. Przy 8.7, ponieważ może divinylobenzenu, fenylowych, albo fenylowych -jonu, ph i, albo arylosulfonowe, albo tetraarylo 7), 10. Przy 8.7, ponieważ może divinylobenzenu, fenylowych, albo fenylowych jonu, ph i, albo arylosulfonowe, albo tetraarylo 10. Przy 8.7, ponieważ może divinylobenzenu, fenylowych, albo fenylowych jonu, ph i 17, albo arylosulfonowe, albo tetraaryloamoniowa związana wiązaniem kowalencyjnym z powierzchnią polimerowego, albo 10. Przy 8.7, ponieważ może divinylobenzenu, fenylowych, albo fenylowych jonu, ph i m a 17, albo arylosulfonowe Przy 8.7, ponieważ może divinylobenzenu, jonu, ph i m a

18 zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP Rys 2.Chromatogram rozdzielania ph 8,0 (A), K Chroma zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP Rys 2.Chromatogram rozdzielania ph 8,0 (A), K Chroma zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP Poni Rys 2.Chromatogram rozdzielania ph 8,0 (A), K Chroma zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP Poni Rys 2.Chromatogram rozdzielania ph 8,0 (A), K Chroma zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP Poniżej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania ph 8,0 (A), K 2 HPO zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania HPO zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania HPO 4 zdysocjowane (ph(eluentu) > albo ph (eluentu) < pkb spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania zdysocjowane (ph(eluentu) > pkb spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania zdysocjowane (ph(eluentu) > pkb spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania zdysocjowane (ph(eluentu) > spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład Rys 2.Chromatogram rozdzielania zdysocjowane (ph(eluentu) > pka spektrometrem absorpcji ato wzbudzeniem plazmowym (ICP żej przedstawiono przykład pka wzbudzeniem plazmowym (ICP- żej przedstawiono przykład pka żej przedstawiono przykład żej przedstawiono przykład AES i ze spektrometrią mas (HPIC chromatogram AES i ze spektrometrią mas (HPIC chromatogram AES i ze spektrometrią mas (HPIC chromatogram AES i ze spektrometrią mas (HPIC chromatogram AES i ze spektrometrią mas (HPIC chromatogram AES i ze spektrometrią mas (HPIC chromatogramu - AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i -MS). AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i l MS). AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i -3min 0 l AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i 3min 0 AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i 3min 0% B, 3 AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i % B, 3 AES i ze spektrometrią mas (HPIC wraz z warunkami rozdzielania i % B, 3-30min 75% B. Linią y stacjonarnej! AES i ze spektrometrią mas (HPIC-ICP/AES wraz z warunkami rozdzielania i 30min 75% B. Linią y stacjonarnej! ICP/AES wraz z warunkami rozdzielania i 2 HPO 30min 75% B. Linią y stacjonarnej! z detekcji ICP/AES wraz z warunkami rozdzielania i HPO 30min 75% B. Linią cje były y stacjonarnej! z detekcji ICP/AES- wraz z warunkami rozdzielania i HPO 4 10 mm, 30min 75% B. Linią cje były y stacjonarnej! z detekcji -MS). wraz z warunkami rozdzielania i 10 mm, 30min 75% B. Linią 18 cje były y stacjonarnej! z detekcji na MS). wraz z warunkami rozdzielania i 10 mm, 30min 75% B. Linią 18 cje były y stacjonarnej! z detekcji na MS). wraz z warunkami rozdzielania i 10 mm, 30min 75% B. Linią

19 oraz biotechnologicznym, m. in. w: Oznaczanie anionów, kationów w wodach (pitnych, mineralnych, morskiej, powierzchniowe) i ściekach (z reaktorów atomowych, petrochemicznych, galwanizerskich itp.) Oznaczanie anionów i kationów w płynach fizjologicznych, lekach i żywności Oznaczanie aminokwasów, peptydów, białek, cukrów, RNA, DNA, nukleotydów w materiałach pochodzenia biologicznego Oczyszczanie mieszanin post-syntetycznych. W czasie procesów rafineryjnych ropy naftowej generowane są znaczne ilości gazów bogatych w siarkowodór. Sposobem usunięcia H 2 S z gazów jest tzw. mycie aminowe, w którym wykorzystywane jest powinowactwo siarkowodoru do amin organicznych - alkanoloamin, tj. monoetanoloaminy (MEA), dietanoloaminy (DEA), metylodietyloetanoloaminy (MDEA) itp. Jednym z objawów procesu degradacji termicznej tego typu absorbentu, w wyniku której powstają aniony kwasów karboksylowych, m.in. mrówczany, octany, które "kompleksując" żelazo powodują wzrost szybkości korozji instalacji. Powstają też jony amonowe, które zmniejszają efektywność "odsiarczania" gazów procesowych. Z tych powodów istnieje potrzeba oznaczania zawartości odpowiednich jonów w "aminie", a także zawartości samej "aminy". Ważne jest też monitorowanie obecności wspominanych substancji, a także innych zasad i kwasów organicznych i nieorganicznych w ściekach po-procesowych przed i po oczyszczaniu. Zakres materiału i wymagania do sprawdzianu z ćw. LC-2 HPLC wiadomości podstawowe oraz sorpcja i chromatografia w układach ciało stałe ciecz / ciecz ciecz - pojęcia, podziały, definicje, wielkości fizykochemiczne, parametry i miary HPLC aparatura i wyposażenie Parametry układu chromatograficznego, wypełnienia kolumny sorpcyjnej / chromatograficznej / warstwy porowatej w układach ciecz - ciało stałe, ciecz ciecz Chromatografia wykluczania - (żelowa) - SEC/GPC Chromatografia jonowymienna - IExC i jonowa (IC) Chromatografia wykluczania jonowego IexC Układy oddziaływań hydrofilowych HILIC Dodatkowo: Mechanizm rozdzielania jonów techniką chromatografii jonowymiennej Stosowane wymieniacze jonowe i ich krótka charakterystyka Stosowane eluenty (fazy ruchome) i ich wpływ na retencję i rozdzielanie jonów. Supresja jonów eluentu definicja i rodzaje Detektory stosowane w chromatografii jonowymiennej. Zasada działania. Przykłady zastosowań chromatografii jonowymiennej w badaniach, analityce, preparatyce. 19

20 CZEŚĆ DOŚWIADCZALNA - ćwiczenia LC-2 WYKONANIE ĆWICZENIA LC-2 Ogólne założenia przebiegu ćwiczenia: Przygotować surowe próbki wykonując seryjne rozcieńczenia próbki pierwotnej otrzymanej od prowadzącego Wykonać wzorcowanie przy użyciu mieszaniny kalibracyjnej otrzymanej od prowadzącego ćwiczenie Po ustabilizowaniu warunków oznaczania, identycznych jak te, które stosowano podczas wzorcowania, dozować do kolumny roztwór próbki i rozpocząć zbieranie danych. Z uzyskanego chromatogramu odczytać czas retencji (czas położenia maksimum piku) oraz powierzchnię, a także wyznaczyć inne dane dla pików chromatograficznych, w tym, do charakterystyki retencji, selektywności i sprawności rozdzielania, takie jak cza i objętość retencji, szerokości pików przy podstawie, w połowie wysokości, parametry do obliczenia asymetrii pików i inne. Należy dokładnie spisać warunki prowadzenia procesu chromatograficznego: Kolumna Eluent oraz jego ph Objętościowe natężenie przepływu eluentu Temperatura prowadzenia procesu Objętość dozowanej próbki Typ stosowanej detekcji Podczas wykonania ćwiczenia należy dokładnie wypełniać tabele warunków rozdzielania chromatograficznego. Ponadto studenci zobowiązani są do: wykonania kalibracji metodą krzywej kalibracyjnej (opcjonalnie) wykonanie testu sprawności i przepuszczalności kolumny jonowymiennej na podstawie jednego z chromatogramów kalibracyjnych oznaczenie zawartości jonów wskazanych przez prowadzącego w cieczy procesowej sformułowanie wniosków Wariant A chromatografia HILIC CEL ĆWICZENIA Określenie wpływu temperatury oraz struktury badanych cukrów na ich retencję w układzie oddziaływań hydrofilowych. MATERIAŁY I SPRZĘT Roztwory wzorcowe cukrów redukujących i nieredukujących (mieszaniny oraz pojedyncze substancje) 20