(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int. Cl. G01N33/68 ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2007/45 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Rozpoznawanie stanu przedrzucawkowego (30) Pierwszeństwo: GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/03 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 03/2008 (73) Uprawniony z patentu: UNIVERSITY COLLEGE LONDON, London, GB (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 SAVVIDOU Makrina, London, GB HINGORANI Aroon, London, GB VALLANCE P., London, GB NICOLAIDES Kypros, London, GB (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Pietruszyńska-Dajewska Elżbieta Warszawa skr. poczt. 335 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Opis Dziedzina wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rozpoznawanie podatności na stan przedrzucawkowy i zapobieganie rozwojowi stanu przedrzucawkowego i wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu płodu (IUGR). Stan techniki Stan przedrzucawkowy jest częstym zaburzeniem, występującym w 3-5% ciąż u człowieka i odpowiadającycm za 40% jatrogennych porodów w Wielkiej Brytanii. Należy do grupy zaburzeń związanych z nadciśnieniem, obejmującej rzucawkę, utajone przewlekłe nadciśnienie idiopatyczne, choroby nerek i przemijające nadciśnienie w ciąży. Zaburzenie to typowo definiuje się jako ostre nadciśnienie z nieprawidłowym białkomoczem, rozwijające się po 20 tygodniu ciąży u kobiety nirmotensyjnej (Davey DA i wsp., Am J Obstet Gynecol 1988; 158: 892-8). Typowo towarzyszy mu także obrzęk płuc, sinica, upośledzenie czynności wątroby, nieprawidłowości ze strony wzroku lub mózgu, ból w okolicy nadbrzusza lub prawego górnego kwadrantu, zmniejszenie liczby płytek krwi, wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu płodu (intrauterine growth restriction - IUGR) lub skąpomocz. Obecnie patogeneza stanu przedrzucawkowego jest słabo poznana, co ogranicza możliwości opracowania wiarygodnego testu predykcyjnego lub skutecznej profilaktyki.

3 3 Podsumowanie wynalazku Asymetryczna dimetyloarginina (ADMA) jest endogennym inhibitorem syntazy tlenku azotu (NOS), współzawodniczącym o wiązanie z naturalnym substratem - L-argininą. Powstaje z reszt metylowanej argininy w białkach przy u- dziale metylotransferaz białkowych (PRMT)i jest metabolizowana przez enzym dimetyloaminohydrolazę dimetyloargininy (DDAH). ADMA wytwarzane jest w jednostce płodowo-matczynej, zawierającej duże ilości DDAH II. Twórcy wynalazku wykazali po raz pierwszy, że u kobiet, u których w późniejszym okresie rozwija się stan przedrzucawkowy, a u ich dzieci IUGR, poziom ADMA jest podwyższony. Według niniejszego wynalazku zapewnia się zatem sposób stwierdzania, czy dana kobieta ciężarna narażona jest na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego, i czy jej płód narażony jest na ryzyko rozwoju wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu (IUGR), przy czym sposób ten obejmuje: a) oznaczanie ADMA w próbce płynu pobranego od kobiety ciężarnej w stadium ciąży między 4 a 25 tygodniem; i b) określanie, czy poziom ADMA w próbce płynu przekracza 2,0 µmol/l, co pozwala stwierdzić, czy kobieta narażona jest na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub czy jej płód narażony jest na ryzyko rozwoju IUGR. Opis figur Fig. 1 przedstawia zależne od przepływu rozszerzenie (flow-mediated dilatation - FMD) tętnicy ramiennej w tygodniu ciąży w różnych grupach kobiet w zależności

4 4 od obecności lub nieobecności obustronnych wcięć i od rozwiązania ciąży. Linie poziome oznaczają średnie FMD w każdej grupie. Fig. 2 przedstawia poziom ADMA w osoczu w dwóch grupach kobiet ciężarnych (z obustronnymi wcięciami tętnicy macicznej w badaniu dopplerowskim i bez takich wcięć). Linie poziome oznaczają średni poziom ADMA w każdej grupie. Fig. 3 przedstawia wykres rozrzutu, ilustrujący związek między zależnym od przepływu rozszerzeniem a poziomem ADMA w osoczu w grupie kobiet ciężarnych, u których w tygodniu ciąży stwierdzano obustronne wcięcie tętnic macicznych i u których w końcu doszło do stanu przedrzucawkowego. Stwierdzono istnienie znamiennej korelacji odwrotnej (r= -0,8, p=0,005). Fig. 4 przedstawia syntezę ADMA z metylowanych reszt argininowych w białkach w wyniku działania metyloarginaz białkowych (PRMT) i jego metabolizm do cytruliny pod wpływem dimetylodiaminohydrolaz dimetyloargininowych I i II (DDAH I i II). Szczegółowy opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób stwierdzania, czy kobieta ciężarna jest narażona na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub czy jej płód jest narażony na ryzyko rozwoju IUGR. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem rozpoznawanie podatności kobiety ciężarnej na stan przedrzucawkowy i rozpoznawanie podatności płodu na IUGR. Kiedy mowa jest o kobiecie ciężar-

5 5 nej, dotyczy to osoby ludzkiej. Płód jest płodem ludzkim. Poddawane diagnostyce kobieta i płód mogą znajdować się w pierwszym, drugim lub trzecim trymestrze ciąży. Kobieta lub płód znajdują się w stadium ciąży od 4 do 25 tygodnia ciąży. Kobieta lub płód mogą znajdować się w stadium ciąży od 23 do 25 tygodnia ciąży. Korzystnie, kobieta lub płód znajdują się w stadium ciąży od 10 do 25 tygodnia ciąży, korzystniej, od 15 do 25 tygodnia ciąży. Typowo, u kobiety nie występuje stan przedrzucawkowy lub nie wykazuje ona objawów stanu przedrzucawkowego. Sposób według niniejszego wynalazku można jednak wykorzystywać u kobiet, u których występuje stan przedrzucawkowy, lecz nie zostały one przebadane pod tym kątem. Sposób można zatem wykorzystywać u kobiet wykazujących wstępne objawy stanu przedrzucawkowego. Typowo, u płodu nie występuje IUGR lub nie wykazuje on objawów IUGR. Sposób według niniejszego wynalazku można jednak wykorzystywać u kobiet, u których płodów występuje IUGR, lecz nie zostały jeszcze wykonane badania pod kątem IUGR. Sposób można zatem wykorzystywać u kobiet, których płody wykazują wstępne objawy IUGR. Niniejszy wynalazek obejmuje oznaczanie ADMA u kobiety. Typowo oznacza się poziom lub stężenie ADMA. Według niniejszego wynalazku, podwyższony poziom ADMA w porównaniu z prawidłowym poziomem występującym w ciąży wskazuje na podatność kobiety na rozwój stanu przedrzucawkowego lub istniejące u niej ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego, albo na podatność jej płodu na IUGR lub istniejące u niego ryzyko rozwoju IUGR. Prawidłowym po-

6 6 ziomem występującym w ciąży jest typowo poziom ADMA, występujący u kobiety niewykazującej objawów stanu przedrzucawkowego lub u kobiety, której płód nie wykazuje objawów IUGR przez cały okres ciąży. Prawidłowym poziomem w ciąży jest typowo poziom występujący w równoważnym stadium ciąży. Średnie stężenie ADMA w osoczu u zdrowej populacji, niebędącej w ciąży, wynosi typowo około 0,82 µmol/l. Ogólnie, średnie stężenie ADMA w osoczu u zdrowej kobiety w ciąży jest mniejsze niż u zdrowej osoby niebędącej w ciąży i pozostaje względnie stałe przez cały okres ciąży. Prawidłowy poziom ADMA w osoczu u kobiety w 4, 10, 15 i 25 tygodniu ciąży wynosi typowo około 0,3-0,6 µmol/l, na przykład 0,52 µmol/l. W niniejszym wynalazku, podwyższony poziom ADMA w osoczu, związany ze zwiększoną podatnością na stan przedrzucawkowy lub zwiększonym ryzykiem powstania stanu przedrzucawkowego, albo ze zwiększoną podatnością na IUGR lub zwiększonym ryzykiem powstania IUGR, wynosi powyżej około 2,0 µmol/l. Według niniejszego wynalazku, poziom/stężenie ADMA u kobiety jest, korzystnie, podwyższony co najmniej 4-krotnie w porównaniu z prawidłowym poziomem w ciąży. Poziom/stężenie ADMA jest typowo zwiększony 3-7-krotnie w porównaniu z prawidłowym poziomem w ciąży. Symetryczna dimetyloarginina (SDMA) jest biologicznie nieczynnym stereoizomerem ADMA. SDMA nie jest metabolizowana przez DDAH, ale wydalana jest drogą nerkową. Stosunek L-arginina/ADMA stosuje się typowo jako wskaźnik

7 7 hamowania NOS. Stosunek ADMA/SDMA typowo odzwierciedla aktywność DDAH. Niniejszy wynalazek może również obejmować ocenę stosunku ADMA/SDMA w celu ustalenia ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego. Według niniejszego wynalazku, podwyższony stosunek ADMA/SDMA w porównaniu z prawidłowym stosunkiem w czasie ciąży wskazuje na podatność kobiety na rozwój stanu przedrzucawkowego lub ryzyko powstania u niej stanu przedrzucawkowego albo na podatność jej płodu na IUGR lub ryzyko powstania u niego IUGR. Prawidłowym stosunkiem w ciąży jest stosunek ADMA/SDMA u kobiety niewykazującej objawów stanu przedrzucawkowego lub kobiety, której płód nie wykazuje objawów IUGR przez cały okres ciąży. Prawidłowy stosunek ADMA/SDMA odpowiada typowo równoważnemu stadium ciąży. Prawidłowy stosunek ADMA/SDMA w osoczu u kobiety w 4, 10, 15 i 25 tygodniu ciąży wynosi typowo od około 1:1 do 1,3:1, na przykład 1,3:1. W niniejszym wynalazku, podwyższony stosunek ADMA/SDMA w osoczu, związany ze zwiększoną podatnością lub zwiększonym ryzykiem stanu przedrzucawkowego lub IUGR w tygodniu wynosi typowo około 6,8:1. Według niniejszego wynalazku, stosunek ADMA/SDMA u kobiety jest, korzystnie, podwyższony co najmniej 5-krotnie, korzystniej, co najmniej 6-krotnie w porównaniu z prawidłowym poziomem w ciąży, na przykład w tym samym stadium ciąży. Stosunek ADMA/SDMA jest typowo zwiększony 5-8-krotnie w porównaniu z prawidłowym poziomem w ciąży. Według niniejszego wynalazku stosunek ADMA/SDMA powyżej 95% przedziału ufności dla prawidłowego

8 8 stosunku w ciąży związany jest ze zwiększonym ryzykiem rozwoju stanu przedrzucawkowego lub IUGR. Wynalazek polega na przeprowadzeniu testu in vitro z próbki pobranej od kobiety. Próbka typowo próbka obejmuje płyn ustrojowy kobiety. Próbką jest, korzystnie, próbka krwi, osocza, surowicy lub moczu, lecz może to być próbka płynu owodniowego. Próbkę typowo przed badaniem poddaje się obróbce, na przykład przez odwirowanie. Próbkę można również typowo przechowywać przed wykonaniem badania, korzystnie, w temperaturze poniżej -70 C. Do oznaczenia poziomu ADMA można stosować standardowe sposoby znane ze stanu techniki. Sposoby te typowo obejmują zetknięcie próbki z przeciwciałem zdolnym do wiązania się z ADMA. Do takich sposobów należą testy paskowe oraz test immunoenzymatyczny (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay - ELISA). Typowo paski zawierają jedno lub więcej niż jedno przeciwciało lub białko, wiążące się swoiście z ADMA. Jeżeli obecne jest więcej niż jedno przeciwciało, przeciwciała mają, korzystnie, różne, nieposiadające elementów wspólnych, determinanty, tak że mogą jednocześnie wiązać się z ADMA. ELISA jest heterogennym testem fazy stałej, wymagającym rozdzielenia odczynników. Test ELISA typowo wykonuje się techniką sandwichową lub technikami kompetycyjnymi. Technika sandwichowa wymaga dwóch przeciwciał. Pierwsze z nich wiąże się swoiście z ADMA i jest związane z podłożem stałym. Drugie przeciwciało związane jest z markerem, typowo, z koniugatem enzymu. Substrat enzymu stosuje się do ilościowego oznaczania kompleksu ADMA-

9 9 przeciwciało, czyli ilości ADMA w próbce. Również test kompetycyjnego hamowania antygenu typowo wymaga przeciwciała skierowanego swoiście przeciwko ADMA, związanego z podłożem. Koniugat ADMA-enzym dodaje się do badanej próbki (zawierającej ADMA). Kompetycyjne hamowanie między koniugatem ADMA-enzym a niewyznakowaną ADMA umożliwia ilościową ocenę zawartości ADMA w próbce. Podłoża stałe do reakcji ELISA, korzystnie, zawierają studzienki. W niniejszym wynalazku można również wykorzystywać sposoby oznaczania ADMA bez stosowania przeciwciał. Korzystnie, jako sposoby oznaczania poziomu ADMA stosuje się wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) i detekcję fluorescencyjną. Można stosować opisywane uprzednio urządzenie i metody HPLC (Tsikas D i wsp., J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1998; 705: 174-6) Rozdzielanie w czasie HPLC typowo prowadzi się na podstawie wielkości lub ładunku. Przed HPLC, do badanych próbek typowo dodaje się endogenne aminokwasy i wewnętrzny standard L- homoargininę, po czym całość poddaje się ekstrakcji fazowej na wkładach CBA (Varian, Harbor City, CA, USA). Z zawartych w próbkach aminokwasów, korzystnie, wytwarza się pochodne za pomocą o-ftaloaldehydu (OPA). Dokładność i precyzję testu, korzystnie, określa się w obrębie próbek kontroli jakości dla wszystkich aminokwasów. Niniejszy wynalazek można stosować do potwierdzenia podatności u kobiet, u których już podejrzewa się istnienie ryzyka, lub które typuje się jako predysponowane do rozwoju stanu przedrzucawkowego. Niniejszy wynalazek można również stosować do potwierdzenia podatności u pło-

10 10 dów, u których już podejrzewa się istnienie ryzyka, lub które typuje się jako predysponowane do rozwoju IUGR. Do czynników ryzyka, zwiększających podatność na stan przedrzucawkowy lub IUGR, należą przynależność do rasy czarnej z pochodzeniem etnicznym z rejonu Karaibów, pierwsza ciąża w życiu lub pierwsza ciąża z danym partnerem, wiele ciąż w wywiadzie, nadciśnienie, cukrzyca, predyspozycja genetyczna lub dodatni wywiad rodzinny w kierunku stanu przedrzucawkowego lub rzucawki, otyłość, hipercholesterolemia i palenie tytoniu. Niniejszy wynalazek można stosować do ustalania podatności na rozwój stanu przedrzucawkowego u kobiet palących. Niniejszy wynalazek można również stosować do ustalania podatności płodu kobiety palącej na rozwój IUGR. Niektóre wykonania wynalazku obejmują dodatkowe testy diagnostyczne, służące ustalaniu podatności na stan przedrzucawkowy lub IUGR. Korzystnie, stosuje się zależne od przepływu rozszerzenie tętnicy ramiennej i(lub) dopplerowską analizę kształtu fali z tętnic macicznych. Te testy diagnostyczne przeprowadza się typowo przed oznaczeniem poziomu ADMA u kobiety ciężarnej, w tym samym czasie, co to oznaczenie, lub po tym oznaczeniu. Zależne od przepływu rozszerzenie (FMD) tętnicy ramiennej jest znaną nieinwazyjną metodą oceny rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka. Metoda ta typowo obejmuje pomiar zmian średnicy tętnicy ramiennej w odpowiedzi na zwiększony przepływ z zastosowaniem aparatu ultrasonograficznego o dużej rozdzielczości. Można stosować uprzednio opisane aparaty i metody ultrasonograficzne (Sav-

11 11 vidou MD i wsp., Ultrasound Obstet Gynecol 2000; 15: 502-7; Dorup I i wsp., Am J Physiol 1999; 276: H821-5). Aparat typowo zawiera głowicę liniową (z przetwornikiem typu LAT linear array transducer). Końcoworozkurczowe obrazy tętnicy można zapisywać w formacie cyfrowym. Średnicę tętnicy typowo określa się półautomatycznym algorytmem wykrywania krawędzi. Wyjściową średnicę naczynia typowo oblicza się jako średnią wszystkich pomiarów z pierwszej minuty zapisu. FMD tętnicy ramiennej definiuje się jako procentowe zwiększenie średnicy naczynia w czasie reaktywnej hiperemii spowodowanej nadmuchaniem mankietu, założonego dystalnie od miejsca zapisu, do 300 mmhg na 5 minut, i następnie szybkim spuszczeniem powietrza. Zmianę przepływu (hiperemia reaktywna), wskaźnik bodźca przepływowego dla rozszerzenia, typowo oblicza się jako [(przepływ krwi 15 s po spuszczeniu powietrza z mankietu-wyjściowy przepływ krwi)/ wyjściowy przepływ krwi] X 100%. Jako kontrolę można stosować niezależne od śródbłonka rozszerzenie w odpowiedzi na podjęzykowe podanie trójazotanu glicerylowego (GTN). FMD tętnicy ramiennej u zdrowych kobiet w ciąży wynosi typowo 8,59 ± 2,76% (n=43). Według niniejszego wynalazku, znamienne zmniejszenie FMD w połączeniu z podwyższonym poziomem ADMA wskazuje na podatność na stan przedrzucawkowy lub ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego. FMD tętnicy ramiennej zmniejszone jest, korzystnie, dwukrotnie lub, korzystniej, co najmniej dwukrotnie. Badanie metodą Dopplera jest rutynową metodą oceny kształtu fal z tętnic macicznych. Metodę tę typowo sto-

12 12 suje się do stwierdzenia obecności lub nieobecności wczesnych wcięć rozkurczowych w kształcie fali z tętnicy. Wcięcia te mogą być jednostronne lub obustronne. Według niniejszego wynalazku, obecność wcięcia jednostronnego lub wcięć obustronnych w połączeniu z podwyższonym poziomem ADMA wskazuje na podatność na stan przedrzucawkowy lub IUGR. Diagnostykę sposobem według niniejszego wynalazku można prowadzić w połączeniu z innymi badaniami lub testami genetycznymi w celu udoskonalenia przewidywania ryzyka. Poniższy przykład ilustruje wynalazek: Przykład 1. Metody Uczestniczki badania U wszystkich kobiet zgłaszających się na rutynowe wizyty w okresie ciąży do King s College Hospital wykonywano kolorowe badanie dopplerowskie tętnic macicznych w tygodniu ciąży (system Acuson Aspen, Kalifornia, USA). Określano kształt fal dopplerowskich z tętnic macicznych w sposób opisywany uprzednio (Albaiges G i wsp., Obstet Gynecol 2000;96:559-64). Po uzyskaniu trzech podobnych kolejnych kształtów fal odnotowywano obecność wczesnego wcięcia rozkurczowego i obliczano średni indeks pulsowania (pulsatility index - PI) obu naczyń. Nieprawidłowości kształtu fal dopplerowskich z tętnic macicznych (obecność wczesnego wcięcia rozkurczowego) wykryto u 43

13 13 kobiet ciężarnych; włączano je do badania naukowego (w kolejności zgłaszania się) bezpośrednio po wykonaniu badania dopplerowskiego i dobierano pod względem wieku, przynależności etnicznej i palenia lub niepalenia tytoniu z analogiczną grupą 43 kobiet ciężarnych z prawidłowym wynikiem badania kształtu fal dopplerowskich z tętnic macicznych. W momencie włączania do badania u wszystkich kobiet stwierdzano ciążę pojedynczą; były to kobiety zdrowe, nieprzyjmujące żadnych leków, z ujemnym wywiadem indywidualnym i rodzinnym w kierunku przedwczesnych chorób układu krążenia; rozwój płodu był odpowiedni w stosunku do wieku ciąży. Odnotowywano wiek matki, jej przynależność etniczną, palenie/niepalenie tytoniu, liczbę u- przednich ciąż i porodów, częstość akcji serca i ciśnienie tętnicze. Ciśnienie tętnicze mierzono w pozycji siedzącej pacjentki, na prawym ramieniu, za pomocą ambulatoryjnego monitora ciśnienia krwi (SpaceLabs Medical 90207, WA, USA). Ciśnienie mierzono trzy razy i obliczano wartość średnią. Badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję bioetyczną; wszystkie uczestniczki udzieliły pisemnej świadomej zgody na udział w badaniu. Ocena czynności śródbłonka matki Badanie ultrasonograficzne prawej tętnicy ramiennej wykonano za pomocą głowicy liniowej typu LAT o częstotliwości 7 MHz i systemu Aspen Acuson (Kalifornia, USA), jak to opisano uprzednio, w tygodniu ciąży (Celermajer DS i wsp., Lancet 1992; 340: ; Savvidou MD i wsp., Obstet Gynecol 2000; 15: 502-7). Co 3 sekundy

14 14 rejestrowano końcoworozkurczowe obrazy tętnicy i zapisywano je w formacie cyfrowym. W odniesieniu do każdego obrazu określano średnicę tętnicy za pomocą półautomatycznego algorytmu wykrywania krawędzi. Obliczano wyjściową średnicę naczynia jako średnią wszystkich pomiarów z pierwszej minuty zapisu. FMD tętnicy ramiennej definiowano jako procentowe zwiększenie średnicy naczynia w czasie hiperemii reaktywnej, spowodowanej nadmuchaniem mankietu, założonego dystalnie od miejsca rejestracji, do 300 mmhg na 5 minut, i następnie szybkim spuszczeniem powietrza. Zmianę przepływu (hiperemię reaktywną), wskaźnik bodźca przepływowego do rozszerzenia naczynia, obliczano jako [(przepływ krwi 15 s po spuszczeniu powietrza z mankietu-wyjściowy przepływ krwi)/ wyjściowy przepływ krwi] X 100%. Wszystkie pomiary przeprowadzał doświadczony operator; dane FMD były analizowane w ciągu 24h od badania. Zmienność pomiarów FMD zależna od obserwatora w laboratorium twórców wyniosła 1,02±0,6% (95% granice zgodności: -1,7-2,4%) (Savvidou MD i wsp., Obstet Gynecol 2000; 15:502-7). Poza sytuacją ciąży, jako kontrolę stosuje się niezależne od śródbłonka rozszerzenie w odpowiedzi na podjęzykowe podanie trójazotanu glicerylowego (glyceryl trinitrate - GTN), ale w niniejszym badaniu unikano stosowania GTN. U- przednie badanie wykazało jednak, że ciąża nie powoduje zmiany rozszerzenia wywoływanego przez GTN (Dorup I i wsp., Am J Physiol 1999; 276: H821-5).

15 15 Analiza poziomu asymetrycznych i symetrycznych dimetyloarginin i L-argininy w osoczu Przy wykonywaniu badań naczyniowych z oznaczaniem poziomu w osoczu ADMA, SDMA i L-argininy pobierano próbkę krwi (5 ml) do probówek z cytrynianem. Zgodę na pobranie krwi wyraziło 38 kobiet z grupy kontrolnej i 40 kobiet z obustronnymi wcięciami tętnicy macicznej. Po odwirowaniu osocze przechowywano w temperaturze -70 C do momentu przeprowadzenia testów. Endogenne aminokwasy i L-homoarginina, stanowiąca standard wewnętrzny, dodawane do 0,5 ml porcji próbek osocza (w stężeniu 10 µmol/l) były ekstrahowane na fazie stałej, na wkładach CBA (Varian, Harbor City, CA, USA), przeprowadzane w pochodne przez dodanie o-ftaloadehydu (OPA); a pochodne OPA rozdzielano w HPLC i monitorowano przez detekcję fluorescencyjną, jak to opisywano uprzednio (Tsikas D i wsp., J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1998; 705:174-6). Pochodne OPA L-argininy, L-homoargininy, SDMA i ADMA eluowały, odpowiednio, po 8,8±0,1, 10,9±0,1, 14,8±0,2 i 16,3±0,2 min. (średnie SD, n=6). Dokładność i precyzję oznaczano w obrębie zestawu sześciu próbek kontroli jakości, poddawanych równolegle obróbce; stwierdzono, że wynosiły one, odpowiednio, blisko 100% i poniżej 7,3% dla wszystkich aminokwasów. Definicja rozwiązania klinicznego W odniesieniu do wszystkich kobiet uzyskano informacje na temat przebiegu ciąży, w tym wieku ciążowego, sposobu rozwiązania ciąży i masy urodzeniowej noworodka. Opieka kliniczna nad kobietami biorącymi udział w badaniu

16 16 pozostawała w rękach położników, którym udzielono informacji na temat wyników zapisów kształtu fali z tętnic macicznych w tygodniu ciąży 23-25, lecz nie udzielono im informacji na temat FMD tętnicy ramiennej ani wyników o- znaczeń metyloargininy. Stan przedrzucawkowy definiowano zgodnie z kryteriami International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy [Międzynarodowe Towarzystwo Badań nad Nadciśnieniem w Ciąży] (Davey i wsp., Am J Obstet Gynecol 1988; 158: 892-8). Zgodnie z tą klasyfikacją, stan przedrzucawkowy definiowano jako nadciśnienie (jednorazowy pomiar ciśnienia rozkurczowego krwi 110 mmhg, lub dwa kolejne pomiary ciśnienia rozkurczowego krwi, w odstępie co najmniej czterech godzin, 90 mmhg, w połączeniu z białkomoczem (białko całkowite w dobowej zbiórce moczu 300 mg lub, jeżeli to badanie jest niedostępne, białkomocz 2+ w metodzie paskowej w dwóch kolejnych oznaczeniach w odstępie co najmniej czterech godzin), rozwijające się po 20 tygodniu ciąży u kobiet, u których uprzednio ciśnienie tętnicze było prawidłowe (normotensyjne). IUGR definiowano jako masę urodzeniową poniżej 5. percentyla w stosunku do wieku ciążowego i płci noworodka (Gardosi J i wsp., Lancet 1992; 339: 283-7). Analiza statystyczna Normalność dystrybucji danych ciągłych badano testem Shapiro-Wilk. W odniesieniu do danych o dystrybucji innej niż normalna wykonywano przekształcenie logarytmiczne. Dane opisowe przedstawiano jako średnie ± SD lub jako me-

17 17 dianę [zakres międzykwartylowy] w odniesieniu do danych o dystrybucji normalnej i danych o dystrybucji innej niż normalna. Do porównania zmiennych u kobiet z obustronnymi wcięciami i bez wcięć stosowano test t-studenta. Porównań wielu grup dokonano, stosując jednostronną analizę wariancji i następnie test post hoc (Tukey-Kramer). Do porównania zmiennych kategorycznych między grupami zastosowano test chi-kwadrat (χ 2 ). Do odpowiednich danych stosowano analizy liniowe i wieloczynnikowe. Analizy statystyczne wykonano z zastosowaniem pakietu Statistical Package for Social Sciences (wersja 8). 2. Wyniki Charakterystyka wyjściowa uczestniczek badania U żadnej z kobiet z prawidłowym kształtem fal dopplerowskich z tętnic macicznych nie doszło do rozwoju stanu przedrzucawkowego; a wszystkie urodzone przez nie dzieci miały prawidłową masę urodzeniową. Kobiety z wcięciami obustronnymi tętnic macicznych w tygodniu (n=43) klasyfikowano na trzy grupy w zależności od rozwiązania ciąży; grupa bez powikłań (n=19, 44,2%), grupa z IUGR u noworodków (n=14, 32,6%) i grupa ze stanem przedrzucawkowym (n=10, 23,2 %), w tym cztery przypadki IUGR. Cechy demograficzne i kliniczne, uzyskane na początku badania, w funkcji rozwiązania ciąży, przedstawiono w tabeli 1. Pomiędzy grupami nie stwierdzano statystycznie znamiennych różnic w odniesieniu do wyjściowych

18 18 cech demograficznych. Wśród kobiet, u których później doszło do rozwoju stanu przedrzucawkowego, większy był odsetek kobiet palących, ale różnica nie była znamienna statystycznie (p=0,43). Ciśnienie skurczowe i rozkurczowe było znamiennie wyższe u kobiet, u których później doszło do rozwoju stanu przedrzucawkowego, pozostając jednak w granicach normy. U kobiet, u których później doszło do rozwoju stanu przedrzucawkowego, stwierdzano znamiennie wyższe PI tętnic macicznych i urodziły one noworodki mniejsze w porównaniu z kobietami, u których nie wystąpiły żadne powikłania ciąży. Zależność między FMD u matki a rozwiązaniem ciąży U wszystkich kobiet dokonano rejestracji FMD; a wyniki przedstawiono w tabeli 2 w zależności od rozwiązania ciąży. U kobiet, u których później doszło do rozwoju stanu przedrzucawkowego, FMD było znamiennie niższe (3,58±2,76%) niż u kobiet, u których nie stwierdzano wcięć obustronne, a rozwiązanie ciąży było prawidłowe (8,59±2,76%, p<0,0001) i u kobiet, u których stwierdzano wcięcia, lecz rozwiązanie ciąży było prawidłowe (8,15±4,32%, p=0,0001, Fig. 1). Również u kobiet, u których ciąża była powikłana IUGR, FMD było mniejsze niż u kobiet, u których nie stwierdzano wcięć obustronnych, a rozwiązanie ciąży było prawidłowe (6,17±2,82% w porównaniu z 8,59±2,76%, p=0,004). U kobiet ciężarnych z prawidłowym rozwiązaniem ciąży FMD było podobne, niezależnie od nieobecności lub obecności wcięć (8,59±2,76% w porównaniu z 8,15±4,32%, p=0,92). W anali-

19 19 zie metodą wielokrotnej regresji stwierdzono, że znamiennymi czynnikami predykcyjnymi FMD była wyjściowa wielkość naczyń (p=0,002), przynależność do podgrupy zdefiniowanej przez rozwiązanie ciąży (p<0,001) i palenie/niepalenie tytoniu (p<0,001). Różnica w FMD między grupami pozostawała znamienna nawet po korekcie pod kątem palenia/niepalenia tytoniu. Poziom dimetyloarginin i L-argininy U kobiet z wcięciami obustronnymi poziomy ADMA były znamiennie wyższe w porównaniu z kobietami z prawidłowym kształtem fal dopplerowskich z tętnic macicznych (odpowiednio, 2,4 [1,97-3,14] µmol/l w porównaniu z 0,81 [0,49-1,08] µmol/l, p<0,0001, Fig. 2). U kobiet, u których doszło później do rozwoju stanu przedrzucawkowego, poziom ADMA był znamiennie wyższy w porównaniu z kobietami z ciążą prawidłową (odpowiednio, 2,7 [2,21-3,21] µmol/l w porównaniu z 0,81 [0,49-1,08] µmol/l, p<0,0001, tabela 3). Przy poziomach obserwowanych u kobiet, u których doszło później do rozwoju stanu przedrzucawkowego, ADMA kompetycyjnie hamuje enzymatyczną syntezę NO z L-argininy i hamuje rozluźnienie zależne od śródbłonka. ADMA zapewnia mechanizm rozwoju stanu przedrzucawkowego i stanowi powiązanie między zwiększeniem oporu naczyniowego w łożysku a nadciśnieniem u matki, będącym skutkiem ogólnoustrojowego zaburzenia czynności śródbłonka u matki. Poziomy symetrycznej dimetyloargininy (SDMA; stereoizomer ADMA pozbawiony wpływu na syntezę NO) były we wszystkich grupach podobne,

20 20 wskutek czego stosunek molowy ADMA/SDMA był znamiennie wyższy u kobiet z wcięciami obustronnymi i stanem przedrzucawkowym (tabela 3). Stężenie L-argininy i stosunek molowy L-argininy/ADMA były nieznacznie, lecz znamiennie wyższe u wszystkich kobiet z wcięciami obustronnymi i stanem przedrzucawkowym w porównaniu z kobietami bez wcięć i bez stanu przedrzucawkowego. Co ciekawe, mimo najniższego FMD, u kobiet, u których rozwijał się później stan przedrzucawkowy, poziom L-argininy nie był najniższy, lecz najwyższy (tabela 3). Korelacja ADMA z czynnością śródbłonka W grupie kobiet z prawidłowym kształtem fal dopplerowskich poziomy ADMA nie wykazywały znamiennej korelacji z FMD. Istniała jednak niewielka, lecz znamienna korelacja odwrotna między poziomami ADMA w osoczu a FMD w grupie kobiet z obustronnymi wcięciami tętnicy macicznej (r = -0,35, p=0,02). W celu dokładniejszego zbadania tego powiązania, twórcy wynalazku przeprowadzili analizy jednostronne między poziomem ADMA a FMD w trzech podgrupach kobiet z wcięciami obustronnymi (przydział do danej podgrupy następował na podstawie odmiennego rozwiązania ciąży). Tylko w grupie kobiet ciężarnych, u których później doszło do rozwoju stanu przedrzucawkowego, stwierdzano silną korelację odwrotną między ADMA a FMD (r= -0,8, p=0,005, Fig. 3).

21 21 Tabela 1: Charakterystyka demograficzna i kliniczna matki i noworodka w poszczególnych grupach kobiet, według rozwiązania ciąży Charakterystyka Wcięcia nieobecneprawidłowe rozwiązanie (n=43) Wcięcia obecneprawidłowe rozwiązanie (n=19) Wcięcia obecne - rozwój IUGR (n=14) Wcięcia obecne - rozwój PE (n=10) Wiek ciążowy w okresie skriningu (tygodni) 23 (23-25) 24 (24-25) 24 (24-25) 24 (24-25) Wiek matki (lat) Kobiety palące 29±5,3 27,1± 5,8 26,3±6,2 28,2±4,7 7 (16,3%) 2 (10,5%) 4 (28,6%) 3 (30%) Pierwsza ciąża w życiu 22 (51,2%) 10 (52,6%) 12 (85,7%) 7 (70%) Częstość akcji serca (uderzeń/minutę) Ciśnienie skurczowe (mmhg) Ciśnienie rozkurczowe (mmhg) Średnie PI tętnic macicznych 83,1±10,1 77,5±13,1 80,2±10,6 79,5±11,4 113,9±8,9 114,2±7,2 114,7±9,6 125,6±7,2* 66,7±6,8 64,2±16 66±5,9 75,4±9 0,81±0,23 1,49±0,6 1,85±0,7* 1,69±0,5.

22 22 Wiek ciążowy przy urodzeniu (tygodni) 39,4±1,6 40±1,7 38,6±4 34,8±3,5* Masa ciała urodzeniowa (g) 3326± ± ±727* 2074±723* *p<0,0001, p<0,001 Wszystkich porównań dokonano w stosunku do grupy kobiet bez obustronnych wcięć w badaniu. Tabela 2: Charakterystyka naczyń matki w poszczególnych grupach kobiet według rozwiązania ciąży Charakterystyka Zależne od przepływu rozszerzenie (FMD; %) Wyjściowa średnica naczynia (mm) Wyjściowy przepływ krwi (ml/min) Hiperemia reaktywna(%) Wcięcia nieobecne - prawidłowe rozwiązanie (n=43) Wcięcia obecne - prawidłowe rozwiązanie (n=19) Wcięcia obecnerozwój IUGR (n=14) Wcięcia obecne - rozwój PE (n=10) 8,59±2,76 8,15±4,32 6,17±2,82* 3,58±2,76 3,1±0,35 3,17±0,38 3,3±0,52 3,2±0,4 182,2 (90,3-278) 473 ( ) 181,5 (82,5-210,6) 614,5 ( ) 128,6 (86-319) 605,5 ( ) 194,4 ( ) 381,3 ( )

23 23 *p=0,004, porównanie z kobietami bez wcięć i z prawidłowym rozwiązaniem. p<0,0001, porównanie z kobietami bez wcięć i z prawidłowym rozwiązaniem. p<0,0001, porównanie z kobietami bez wcięć i z prawidłowym rozwiązaniem. Tabela 3: Poziomy ADMA, SDMA i L-argininy w poszczególnych grupach kobiet według rozwiązania ciąży Charakterystyka ADMA w osoczu (µmol/l) SDMA w osoczu (µmol/l) L-arginina w osoczu (µmol/l) Wcięcia nieobecneprawidłowe rozwiązanie (n=38) 0,81 (0,49-1,08) 0,61 (0,43-0,76) 21,9 (19,4-25,8) Wcięcia obecne- prawidłowe rozwiązanie (n=16) 1,99* (1,69-2,38) 0,51 (0,18-0,69) 23,5 (22,2-27,6) Wcięcia obecne rozwój IUGR (n=14) 3,04* (2,39-3,54) 0,54 (0,34-0,7) 28,3 (23,6-33,7) Wcięcia obecne - rozwój PE (n=10) 2,78 (2,21-3,21) 0,51 (0,27-0,77) 31,1* (24,6-35) 1,27 (0,97-1,68) Stosunek molowy ADMA/SDMA Stosunek molowy L- arginina/adma 31,1(21,4-39,7) 4,6* (3,1-13,5) 11,09* (8,85-15) 5,65* (3,97-8,87) 8,93* (7,36-14,17) 6,8* (3,92-8,72) 11,27* (8,74-15,17) *p<0,0001, p<0,005 Wszystkich porównań dokonano w stosunku do grupy kobiet bez obustronnych wcięć w badaniu.

24 24 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób stwierdzania, czy kobieta ciężarna jest narażona na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub czy jej płód jest narażony na ryzyko rozwoju wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu (IUGR), obejmujący: a) oznaczanie asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) w próbce płynu pobranej od kobiety ciężarnej w stadium ciąży od 4 do 25 tygodnia ciąży; i b) stwierdzanie, czy poziom ADMA w próbce płynu jest większy niż 2,0 µmol/l, przez co stwierdza się, czy kobieta jest narażona na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub jej płód jest narażony na ryzyko rozwoju IUGR. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kobieta ciężarna znajduje się w stadium ciąży od 10 do 25 tygodnia ciąży. 3. Sposób według zastrz. 2, w którym kobieta znajduje się w stadium ciąży od 15 do 25 tygodnia ciąży. 4. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym stwierdzanie, czy kobieta jest narażona na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub stwierdzanie, czy jej płód jest narażony na ryzyko rozwoju IUGR obejmuje stwierdzanie, czy poziom ADMA u kobiety przekracza przynajmniej 3-krotnie poziom prawidłowy dla ciąży. 5. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym stwierdzanie, czy kobieta jest narażona na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub stwierdzanie, czy jej płód jest narażony na ryzyko rozwoju IUGR obejmuje

25 25 stwierdzanie, czy wzrost stosunku ADMA/symetryczna dimetyloarginina (ADMA/SDMA) u kobiety jest większy, niż stosunek prawidłowy dla ciąży. 6. Sposób według zastrz. 5, obejmujący stwierdzanie, czy stosunek ADMA/SDMA jest co najmniej 5- krotnie większy niż stosunek prawidłowy dla ciąży. 7. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym istnieje podejrzenie, że kobieta ciężarna jest narażona na ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego lub jej płód jest narażony na ryzyko rozwoju IUGR. 8. Sposób według zastrz. 7, w którym kobieta jest osobą palącą. 9. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., obejmujący ponadto przeprowadzanie analizy kształtu fal dopplerowskich z tętnic macicznych i(lub) analizę zależnego od przepływu rozszerzenia tętnicy ramiennej u kobiety. University College London Pełnomocnik:

26 17/P21872PL00 26 EP B1 Fig. 1 p<0,0001 p=0,004 Rozszerzenie zależne od przepływu (%) Wcięcia Wcięcia Wcięcia Wcięcia nieobecne obecne- obecne- obecneprawidłowe rozwój rozwój rozwiązanie IUGR PE

27 17/P21872PL00 27 EP B1 Fig. 2 p<0,0001 ADMA (µmol/l) Wcięcia nieobecne Obustronne wcięcia

28 17/P21872PL00 28 EP B1 Fig. 3 Rozszerzenie zależne od przepływu (%) p=0,005 r=-0,8 LnADMA w osoczu

29 17/P21872PL00 29 EP B1 Fig. 4 Arginina Cytrulina + NO Reszty metylowanej argininy w białkach Cytrulina